CN110133136A

CN110133136A - 一种bpde加合靶蛋白的鉴定方法

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Publication number: CN110133136A
Application number: CN201910428945.6A
Authority: CN
Inventors: 郑金平; 王丹; 吕懿; 曹彬; 穆箭兵
Original assignee: Shanxi Medical University
Current assignee: Shanxi Medical University
Priority date: 2019-05-22
Filing date: 2019-05-22
Publication date: 2019-08-16

Abstract

本发明涉及BPDE加合靶蛋白的鉴定领域，具体是一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法。该方法包括1）收集细胞及提取蛋白；2）细胞裂解物的染毒及蛋白酶消化；3）质谱前样品准备；4）LC‑MS/MS分析：取肽段进行色谱分离；肽段分离后用质谱仪进行DDA质谱分析；5）质谱数据库检索：下载蛋白质数据库，根据质谱分析数据获得BPDE靶蛋白。该方法可直接鉴定蛋白裂解物中可与BPDE加合的靶蛋白，并且在检测过程中不需要对小分子进行化学修饰、不会影响到小分子原有的活性、不受任何细胞和组织类型限制、不要求使用纯蛋白质，甚至可以使用全细胞裂解物，可广泛应用于小分子加合靶蛋白的鉴定。

Description

一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法

技术领域

本发明涉及BPDE加合靶蛋白的鉴定领域，具体是一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法。

背景技术

苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene，B[a]P)是最常见的环境和职业污染物。近年来研究表明神经系统异常如认知功能障碍，学习困难，副交感神经失调和短期记忆丧失均与B[a]P暴露有关。B[a]P暴露后的大鼠在Morris水迷宫测试时表现出短期学习和空间记忆能力受损以及长时程增强(Long-term potentiation,LTP)减弱；人群流行病学调查结果显示，B[a]P职业暴露的焦炉工人表现出学习记忆能力降低，与B[a]P接触水平之间存在剂量-反应关系。但B[a]P神经毒性分子机制仍然不清楚。B[a]P在体内转化成高诱变性的活性代谢物7,8-二氢二醇-9,10-环氧苯并芘(BPDE)被认为是在细胞内的终毒物，其除了可与DNA形成加合物外，也能够与蛋白形成加合物。小分子物质与细胞内靶标的相互作用，是其发挥作用的基础。由于蛋白质在神经信息处理过程中扮演重要的角色，因此明确BPDE的加合靶蛋白，有助于深入研究B[a]P神经毒性损伤的作用机制，而直接识别小分子化合物的有益或有害作用的靶蛋白一直都是研究的重点和难点，以往报道的B[a]P或代谢物BPDE在蛋白质组水平上的作用则主要是通过蛋白质表达差异做出的推测。传统的鉴定小分子加合靶蛋白的方法，需对小分子化合物进行化学修饰，如添加琼脂糖小球、生物素标签或进行荧光标记、光亲和标签等，并需要进行大量的结构-活性关系(SAR)研究以确保添加的小分子标签不会损害到药物原本的生物活性。然而在小分子化学修饰的过程中，不可避免地会影响到其原有的活性或阻碍其与真正靶蛋白的结合，影响靶标鉴定的真实性。因为需要合适的标签，可鉴定的小分子药物也受到很大限制。

现有技术的主要缺点：

1.对于BPDE的加合靶蛋白，以往常通过含量或者功能改变来进行推测，并无直接证据。

2.其他小分子化合物加合靶蛋白的鉴定方法，需对小分子化合物进行化学修饰，如添加生物素或荧光素等生物标签，修饰过程可能会改变小分子的活性。

3.不需要对小分子化合物进行修饰的加合靶蛋白鉴定方法，如基于小分子亲和性的蛋白稳定性的靶蛋白鉴定方法要么可鉴定的分子靶标数量有限，要么实验条件、操作技术方面要求很高，很难达到条件，要么只能鉴定某种特定的蛋白。

研究者又基于药物亲和响应目标稳定性(drug affinity responsive targetstability，DARTS)的原理开发出不需要对小分子药物进行修饰的靶标筛选新方法。即当靶蛋白与小分子药物加合后会表现出稳定性的改变，从而对蛋白酶水解的敏感性改变。与传统方法相比，基于这种原理建立的加合靶蛋白筛选技术，不需要对小分子进行任何修饰标记，保存了与靶蛋白结合的原始特性又独立于药物的任何生物效应，避免了对小分子药物进行化学修饰从而对原有活性产生的任何影响，因此特别适用于像BPDE这种结构复杂、无法进行化学修饰的药物的靶标识别，但是在方法中，需要将蛋白酶消化后的蛋白通过SDS-PAGE电泳分离后，切取差异条带，对差异条带胶内酶解进行鉴定，只能鉴定到少数个别的加合靶蛋白，使得鉴定到的蛋白信息大打折扣。因此，就鉴定BPDE加合靶蛋白的目的而言，目前尙缺少一种既不需要对小分子进行化学修饰，又可大批量鉴定BPDE加合靶蛋白的方法。

发明内容

本发明为了实现靶蛋白的鉴定，提供了一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法。在该技术方法中，不需要对药物修饰添加标签，特别适用BPDE这种结构复杂不利于进行标签修饰的小分子药物的靶蛋白鉴定，同时简便易行。但在蛋白酶不同的消化条件下，鉴定的加合靶蛋白结果并不完全一致，由于消化条件的差异，部分加合靶蛋白的信息会被遗漏(因为不同的蛋白对蛋白酶的水解敏感性不同，导致部分蛋白可能消化不足，而部分蛋白被过度消化)。在该BPDE加合靶蛋白鉴定方法中，主要目的在于尽可能多的筛选出可与BPDE加合的靶蛋白，因为实验本身导致的靶蛋白信息差异仅在少数且任何方法都难以避免，并不影响我们鉴定BPDE加合蛋白的目的。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法，包括以下步骤：

1)收集细胞及提取蛋白

2)细胞裂解物的染毒及蛋白酶消化

蛋白样品分为两份，其中一份加入BPDE的DMSO溶液，另外一份加入等体积的DMSO溶剂，室温下静置孵育，孵育后的样品分别转入两个PCR管中，分别加入嗜热菌蛋白酶，在37℃条件下进行消化，然后分别加入4℃条件下预冷的蛋白酶抑制剂；

3)质谱前样品准备

加入蛋白酶抑制剂后的样品中分别加入尿素裂解液，4℃条件下离心，收集上清液；然后分别加入二硫苏糖醇，37℃条件下静置；然后冷却至室温后分别加入吲哚乙酸，室温避光下振荡；分别加入碳酸氢铵溶液以及胰蛋白酶，37℃条件下孵育；再分别加入三氟乙酸溶液，终止反应；酶解后的肽段分别使用C18Cartridge固相萃取柱脱盐，真空冻干，用0.1％甲酸水溶液复溶，肽段浓度测定，以备LC-MS/MS分析；

4)LC-MS/MS分析

取肽段进行色谱分离；肽段分离后用质谱仪进行DDA质谱分析；

5)质谱数据库检索

下载蛋白质数据库，根据质谱分析数据筛选出两份蛋白样品间的差异蛋白，获得BPDE靶蛋白。

作为本发明技术方案的进一步改进，步骤1)包括：收集细胞，加入4℃条件下预冷的PBS缓冲液，然后在液氮中速冻1min，取出后在25℃水浴中摇晃解冻，液氮速冻以及解冻步骤循环4次；然后在20000×g、4℃条件下离心20min，吸取上清液置于新的离心管中，弃去沉淀，即为所提取的蛋白样品。

作为本发明技术方案的进一步改进，步骤1)在提取获得蛋白后，测定蛋白样品中的蛋白质浓度，在步骤2)中加入嗜热菌蛋白酶时按照每10μg蛋白加入1μg嗜热菌蛋白酶的比例。

作为本发明技术方案的进一步改进，步骤3)在收集获得上清液后测定上清液中蛋白样品的浓度，然后加入胰蛋白酶时按照每120μg蛋白加入4μg胰蛋白酶的比例。

作为本发明技术方案的进一步改进，步骤4)的色谱分离采用纳升流速Easy nLC1200色谱系统进行，其中缓冲液的A液为0.1vol％甲酸溶液，B液为甲酸乙腈水溶液，其中甲酸乙腈的含量为0.1vol％，甲酸与乙腈的体积比为15:85。

作为本发明技术方案的进一步改进，步骤4)的色谱分离时，色谱柱以95％的A液平衡。

作为本发明技术方案的进一步改进，步骤4)的蛋白样品在进行梯度分离时，液相梯度设置为：0min-2min，B液线性梯度从5％-8％；2min-90min，B液线性梯度从8％-23％；90min-100min，B液线性梯度从23％-40％；100min-108min，B液线性梯度从40％-100％；108min-120min，B液维持在100％。

作为本发明技术方案的进一步改进，步骤4)的过程中温度不高于37℃。

本发明所述的BPDE加合靶蛋白的鉴定方法主要优点在于：

1、该方法可直接鉴定蛋白裂解物中可与BPDE加合的靶蛋白，以往报道的B[a]P或代谢物BPDE在蛋白质组水平上的作用则主要是通过蛋白质表达差异做出的推测，在该方法中，检测到的BPDE加合靶蛋白为BPDE与靶蛋白之间的直接作用，可广泛应用于小分子加合靶蛋白的鉴定。不需要任何标记的配体，不受合成化学的限制。

2、不需要修改药物，独立于药物的任何生物效应(保存与靶蛋白的结合)，不受药物对系统的任何影响。

3、可以鉴定任何小分子的加合靶蛋白，不受任何细胞或组织类型限制。

4、不需要大量的纯蛋白质，甚至可以使用全细胞裂解物。

5、可鉴定上百种蛋白的基于组学的高通量筛选方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明所述BPDE加合靶蛋白的鉴定方法的流程示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

下面结合附图对本发明的技术方案进行详细的说明。

在本发明全文中，所有的“预冷”均是在4℃条件下进行的。

PBS缓冲液：8gNaCl，0.2gKCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24gKH₂PO₄，溶于800mL蒸馏水中，用HCl调整浓度至7.4，加入蒸馏水定容至1L即可。

TNC缓冲液：500mM Tris-HCl(pH＝8.0)，500mM NaCl，100mM CaCl。

8M尿素裂解液：8M尿素，150mM Tris-HCl(pH＝8.0)。

实施例：

实施例提供的在人神经瘤母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)裂解物中BPDE加合靶蛋白的鉴定方法(方法流程见图1)及结果，包括以下步骤：

步骤1、SH-SY5Y细胞培养及提取蛋白

将神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y在37℃、5％CO₂条件下培养，传代(2-3天/次)，待细胞融合度达到80％～85％时，倒掉培养基，用5mL预冷PBS缓冲液洗涤细胞2次，加入胰蛋白酶消化收集细胞，1000rpm离心5min，重悬于5mL预冷的PBS缓冲液中，离心后弃上清(重复循环洗涤细胞3次)，加入100μL预冷的PBS缓冲液悬浮细胞，在液氮中速冻1min，取出后在25℃水浴中摇晃解冻(重复此冻、融循环4次)，20000×g(重力加速度)、4℃条件下离心20min，吸取上清液置于新的离心管中，弃去沉淀，即为所提取的蛋白样品。

步骤2、细胞裂解物的染毒及蛋白酶消化

移取部分蛋白样品于新的离心管中，使用Bradford法测定样品中蛋白质浓度，加入10×TNC缓冲液(按9(蛋白)：1(TNC缓冲液)的比例)并将蛋白浓度调整为6g/L(用预冷的PBS缓冲液)，将调整浓度后的裂解物平均分为两份，分别与20mmol/L的BPDE溶液(溶剂为DMSO)和等体积的溶剂(DMSO)，按照每100μL裂解物加入30μLBPDE溶液的比例进行适度混匀(混匀过程中应避免剧烈振动或涡旋)，室温静置孵育2h。孵育完成后每例各取100μL，加入嗜热菌蛋白酶(按照每10μg裂解物中加入1μg嗜热菌蛋白酶的比例)，在37℃条件下消化20min，每管加入3μL预冷的50×蛋白酶抑制剂，混匀置于冰上。在本发明中，可采用任意的能够抑制嗜热菌蛋白酶的蛋白酶抑制剂，优选可质谱的蛋白酶抑制剂，本实施例实际操作过程中采用了碧云天生产的50×蛋白酶抑制剂。

步骤3、质谱前的样品准备

用嗜热菌蛋白酶处理后的样品中，分别加入适量的8M尿素裂解液，低温超声处理后，4℃、16000×g离心15min，收集上清，使用Bradford法进行蛋白定量，每例各取120μg进行酶解(每例样品中分别加二硫苏糖醇至10mM(二硫苏糖醇的浓度)，37℃，2h，然后冷却至室温加入适量吲哚乙酸至50mM(吲哚乙酸的浓度)，600rpm振荡1min，避光室温30min，加入100mM碳酸氢铵溶液稀释6倍，加入4μg胰蛋白酶，600rpm振荡1min，37℃孵育16-18h，最终样品中加入适量1％三氟乙酸溶液，终止反应。)酶解后的肽段使用C18Cartridge固相萃取柱脱盐，真空冻干，用0.1％甲酸水溶液复溶，进行肽段浓度测定，以备LC-MS分析。

步骤4、LC-MS/MS分析

每例样品取适量肽段使用纳升流速Easy nLC 1200色谱系统进行色谱分离。其中缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为85％)。色谱柱以95％的A液平衡。样品进样到Trap Column(100μm*20mm,5μm，C18，Dr.Maisch GmbH)后经过色谱分析柱(75μm*150mm,3μm，C18，Dr.Maisch GmbH)进行梯度分离，流速为300nL/min。液相梯度设置如下：0min-2min，B液线性梯度从5％-8％；2min-90min，B液线性梯度从8％-23％；90min-100min，B液线性梯度从23％-40％；100min-108min，B液线性梯度从40％-100％；108min-120min，B液维持在100％。

肽段分离后用Q-Exactive Plus质谱仪(Thermo Scientific)进行DDA(数据依赖采集)质谱分析。分析时长为120，检测模式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，一级质谱分辨率：70,000@m/z 200，AGC target：1e6，一级Maximum IT：50ms。肽段二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后触发采集20个最高强度母离子的二级质谱图谱(MS2scan)，二级质谱分辨率：17,500@m/z 200，AGC target:1e5，二级Maximum IT：50ms，MS2ActivationType:HCD，Isolation window：1.6Th，Normalized collision energy：27。注意：在步骤3和4的整个过程中，温度都不高于37℃。因为嗜热菌蛋白酶的最佳反应温度为70℃，在pH范围5-9.5之间具有相当大的稳定性。若温度过高，则嗜热菌蛋白酶的消化能力增强，足以完全消化所有裂解物中的蛋白，导致质谱鉴定失败。

步骤5、质谱数据库检索

采用的质谱数据库检索软件为MaxQuant1.6.0.16；使用蛋白质数据库来源于uniprot Protein Database，物种为Homo Sapiens(人)，共174301蛋白质序列，下载于2018年9月17日。其中MaxQuant搜库软件分析参数设置如表1-1所示。

表1-1.MaxQuant软件分析参数表

含有BPDE加合靶蛋白的蛋白样品与不含BPDE加合靶蛋白的蛋白样品比对，筛选出两者间的差异蛋白，通过该鉴定方法，共鉴定出428种BPDE加合靶蛋白，具体结果见附表1。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）收集细胞及提取蛋白

2）细胞裂解物的染毒及蛋白酶消化

3）质谱前样品准备

加入蛋白酶抑制剂后的样品中分别加入尿素裂解液，4℃条件下离心，收集上清液；然后分别加入二硫苏糖醇，37℃条件下静置；然后冷却至室温后分别加入吲哚乙酸，室温避光下振荡；分别加入碳酸氢铵溶液以及胰蛋白酶，37℃条件下孵育；再分别加入三氟乙酸溶液，终止反应；酶解后的肽段分别使用C18 Cartridge固相萃取柱脱盐，真空冻干，用0.1%甲酸水溶液复溶，肽段浓度测定，以备LC-MS/MS分析；

4）LC-MS/MS分析

5）质谱数据库检索

2.根据权利要求1所述的一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法，其特征在于，步骤1）包括：收集细胞，加入4℃条件下预冷的PBS缓冲液，然后在液氮中速冻1min，取出后在25℃水浴中摇晃解冻，液氮速冻以及解冻步骤循环4次；然后在20000×g、4℃条件下离心20min，吸取上清液置于新的离心管中，弃去沉淀，即为所提取的蛋白样品。

3.根据权利要求1所述的一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法，其特征在于，步骤1）在提取获得蛋白后，测定蛋白样品中的蛋白质浓度，在步骤2）中加入嗜热菌蛋白酶时按照每10µg蛋白加入1µg嗜热菌蛋白酶的比例。

4.根据权利要求1所述的一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法，其特征在于，步骤3）在收集获得上清液后测定上清液中蛋白样品的浓度，然后加入胰蛋白酶时按照每120µg蛋白加入4µg胰蛋白酶的比例。

5.根据权利要求1所述的一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法，其特征在于，步骤4）的色谱分离采用纳升流速Easy nLC 1200色谱系统进行，其中缓冲液的A液为0.1vol%甲酸溶液，B液为甲酸乙腈水溶液，其中甲酸乙腈的含量为0.1vol%，甲酸与乙腈的体积比为15:85。

6.根据权利要求5所述的一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法，其特征在于，步骤4）的色谱分离时，色谱柱以95%的A液平衡。

7.根据权利要求6所述的一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法，其特征在于，步骤4）的蛋白样品在进行梯度分离时，液相梯度设置为：0min-2min，B液线性梯度从5%-8%；2min-90min，B液线性梯度从8%-23%；90min-100min，B液线性梯度从23%-40%；100min-108min，B液线性梯度从40%-100%；108min-120min，B液维持在100%。

8.根据权利要求1所述的一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法，其特征在于，步骤4）的过程中温度不高于37℃。