JP2002535646A - 化学物質および微生物の検出のためのラマンオプトロードプロセスおよび装置 - Google Patents
化学物質および微生物の検出のためのラマンオプトロードプロセスおよび装置Info
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Abstract
Description
は、検体(例えば、環境汚染物質、薬物、爆薬、毒素、病原体、生物学的サンプ
ル構成要素、ならびに化学戦薬剤および生物戦薬剤)の、定性的および/または
定量的な、検出および同定のためのプロセスおよびデバイスに関する。この検体
は、単離され、収集され、そしてバイオコンセントレーター(bioconce
ntrator)によって濃縮され、次いでラマン分光法技術を用いて分析され
る。
(wet)化学分析手順の使用を伝統的に必要としてきた。これらの手順はしば
しば、入念な、時間がかかり、そして労力を要し、高度に訓練された技術者およ
び高性能の高価な機器を必要とする、サンプルの収集工程、調製工程、分析工程
およびデータ解釈工程を含む。
行うように設計される専用のモニタリング装置としての使用に適合させて、結果
を得るために必要とされる労力の量および時間を削減することが可能であった。
例えば、赤外(IR)分光法を時々用いて、汚染物質について煙道ガス放出をモ
ニタリングし得る。均質な物質を通して光を伝搬させる場合、一部の光は吸収さ
れ、一部はその物質を透過する;IR分光技術は、分子振動に起因する、IR窓
における光吸収/透過を測定する。分子構造が変化するにつれてIRスペクトル
は変化する。すなわち、IRスペクトルは、その化学組成に独特のその物質の「
指紋」である;化学組成が変化する場合、指紋IRスペクトルは変化する。それ
ゆえ、煙道ガスの組成が変化する場合、その変化は、IRスペクトルのある部分
をモニタリングすることによって検出され得る。しかし、物質の内容物がより複
雑になるかまたは変動するにつれて、多くの異なる化学物質のスペクトルが互い
に重複することに起因して、指紋における変化の原因を正確に決定することはさ
らに難しくなる。それゆえ、指紋機器(例えば、IR分光計)でさえ、多くの検
出適用(特に、複雑なサンプル中の微量のレベルの検体の検出を必要とする検出
適用)には用いられ得ない。さらに、IR分光法は通常、水性媒質中に溶解また
は懸濁した検体の直接検出には不適合である。
透過し、一部はまた種々のプロセスによって散乱される。IRのように、散乱プ
ロセスの一つ、すなわち、ラマン散乱もまた、分子振動に起因する。しかし、振
動周波数を吸収強度に関する情報と共に記載するIRとは異なり、ラマンは、散
乱断面積についての情報を生じる。IRおよびラマンは、基本的に異なる物理的
プロセスに依存する。IRは、振動サイクルの間の吸収種の双極子モーメントの
変化に依存する。非対称種は、より対称な種よりも大きな双極子モーメントを有
するので、強いIRスペクトル特徴は、分極基および対称基の逆対称性振動から
生じる。
ち、核振動変位に関連した電子分極率の変化から生じるラマン周波数に依存する
。従って、対称種および分極性原子(例えば、硫黄)を含む基の対称振動モード
は、強く散乱する傾向がある。分子の三次元構造および分子内−分子間相互作用
は、基準振動の周波数および形態を決定する。それゆえ、ラマン効果において観
察される周波数、強度および分極状態を分析することにより、分子構造が決定さ
れ得る。このような分析に基づくラマン分光法は、固有の指紋情報を作成する際
に、IRと同等に強力である、それほど周知ではない分析技術であるが、この2
つの有意差に起因して、有意に異なる情報を生じるだけでなく、水性サンプルな
らびに非水性サンプルと適合し、そして固体または表面を何のサンプル調製をも
伴わずに分析し得るという利点をも有する。例えば、ラマン効果において観察さ
れる周波数、強度および分極状態を分析することによって、たとえ、生物学的高
分子のように複雑であっても、化学物質の分子構造が決定され得ることが公知で
ある。タンパク質のコンホメーション変化、電荷効果、結合ひずみおよび化学的
転位は、200〜2000cm−1の領域で研究され得、そしていくつかは10
0〜4000cm−1の範囲で研究され得る。同様に、ラマンは、DNAおよび
RNAのホスホジエステル骨格のジオメトリーを研究するために用いられている
;そして現在もさらに、膜、個々の生細胞および組織におけるインサイチュでの
生物学的高分子および複合体の化学およびコンホメーションを解明するために用
いられている。水溶液との適合性によって、ラマン分光法は、ネイティブな(す
なわち、可溶化された)形態での生体物質の化学を研究するために用いられ得る
いくつかの技術のうちの一つである。
製される。ラマン散乱は、単色放射の狭く強いビームによって生じ、そしてその
ビームに対して直角で観察される場合、最良に試験され、その結果、励起ビーム
の強度は、ずっと低い強度のラマン散乱放射にかぶさらない。それゆえ、レーザ
ーは、ラマン散乱を励起するためにほぼ排他的に用いられる。ラマンスペクトル
、すなわち、散乱波長およびそれらの相対強度は、サンプルの分子構造に特有で
、物質特異的である。ラマンスペクトルの指紋は所定の化合物に対して固有であ
るので、ラマンを用いて、サンプルからの、波長がシフトした散乱光と、「既知
の」物質からのラマンスペクトルの特徴との比較によって、「未知の」サンプル
を同定し得る。近年、ラマン散乱分光法は、水モニタリング系における使用のた
めに調査されている。
RS)分光法は、比較的弱いシグナルを生じ、それゆえ、NRSに基づく任意の
分析手順またはモニターは比較的不十分な感度を有する。しかし、2つの異なる
現象(すなわち、共鳴ラマン散乱(RRS)および表面増強ラマン散乱(SER
S))を利用して、ラマン分析の間にさらなる感度を獲得し得る。
場合に生じる。しかし、RRSでは、励起周波数は、その分子の電子吸収周波数
に近づくかまたは一致する。(共鳴する分子部分はしばしば、「発色団」と呼ば
れる。なぜなら、大部分のレーザー光は、スペクトルの可視部分における共鳴を
励起するからである。)このような共鳴条件下で、発色団または隣接基の原子の
振動モードに起因する線は、通常、増強された線がラマンスペクトルにおいて観
察される唯一の線である点まで、選択的かつ有意に増強される;RRS技術はラ
マンシグナルを、103〜106倍増強することが公知である。RRSは、NRS
を超える1つのさらなる利点を有する。すなわち、発色団からの唯一の線が見ら
れるので、RRSスペクトルはNRSスペクトルよりもずっと単純であり、かつ
ずっと少ない線を有する。例えば、生物学的物質は例外的化学的複雑さを示し、
そしてそれらのラマンスペクトルは相応じて複雑である。RRSは、これらの複
雑なスペクトルを単純化し、それにより、生物学的物質の活性部位および化学的
反応を突き止め、そしてラマン線を生物学的高分子または複合体内の官能基およ
び結合に帰属させるために有用であると証明された。
単層が、NRSシグナルの109倍程度に高く増強されたラマンシグナルを示す
ことを発見した。この現象は、「表面増強ラマン散乱(SERS)」と呼ばれて
いる。1980年代にSERSについて行われた大部分の研究は、表面増強現象
についての化学的および物理的根拠を調べることを標的としていた。例えば、表
面増強効果が、粗雑化した金属表面と直接接触しているかまたは極めて近接して
いる分子または部分に制限されることが現在公知である。これは、周囲の大量の
媒質からのシグナルは検出されるには弱すぎ、吸着された分子を分析することを
より容易にするという点で有利であり得る。しかし、極めて大きな分子部分(例
えば、多くのタンパク質)は、それらのラマンシグナルの任意の有意な増強を生
じるためには金属表面からは遠すぎる。例えば、吸着された高分子のSERRS
において表面および共鳴の増強が及ぶ、電極からの距離は、約16nmであるこ
とが示されている;電極の表面に直接結合しているかまたは表面から5もしくは
6残基以内のアミノ酸からのシグナルは、タンパク質分子内の他の残基からのシ
グナルよりも強力に増強される。それゆえ、粗雑化された金属電極を用い、そし
て電極の電位を変更することにより、高分子の配向を、高分子内の選択された部
分に属するシグナルの増強を最大にするように変更することが可能である。それ
ゆえ、生体物質のような大きく、複雑な高分子内の基または残基を選択的に研究
するために、電極電位ならびに共鳴技術を使用することが可能である。
共鳴(SERRS)]、感度を、NRSシグナルの1011〜1013倍程度も高く
増強し得る、すなわち、完全なスペクトルが、107未満の分子を用いて作製さ
れ得ることがいまや公知である。それゆえ、SERRSは、検出プロセスおよび
デバイスにおける可能な使用について利用可能な最も感度の高い技術のうちの1
つであり得る;それゆえ、研究者は、SERSおよびSERRSの実用的適用を
、すなわち、微量成分の分析のために、より強いラマンスペクトルのシグナルを
生成するために、分析されるサンプルの物質を、粗雑化された金属表面上に直接
蒸着することにより、調査し始めた。例えば、特許第4,674,878号「P
ractical Substrate and Apparatus for
Static and Continuous Monitoring by
Surface Enhanced Raman Spectroscopy
」,T.Vo−Dinhは、有機化合物の微量分析のためにSERSを利用する
装置および方法論を記載する。
はSERRSシグナルを用いてさえ、IR分光法と同じ制限を受ける。すなわち
、これは、比較的純粋であるか;検体の存在/非存在が主に変動して比較的一定
の組成であるか;比較的高い濃度の検体を有するか;または例えば、クロマトグ
ラフィー技術の使用によって、他のサンプル構成要素から単離するため、処理さ
れているサンプルまたは物質について用いられなければならない。あるいは、検
体からの指紋シグナルは、サンプル中のより多数かまたは濃縮された種の全ての
指紋によって混乱させられ、それにより、不十分な感度および特異性、ならびに
多数の誤った応答となる。このようなプロセスまたは機器を新たな環境における
使用または新たな媒質もしくはサンプル組成について適合させるためには、かな
りの努力および再設計が必要とされる。例えば、SERSを微量分析のために用
いる場合、金属表面に適用された任意のサンプル中の全ての化合物からのシグナ
ルが増強される;それゆえ、より少量のサンプル容量が用いられ得るが、このア
プローチによって生成される複雑な、重複するシグナルは、微量のレベルの検体
を検出または同定することを不可能にする。RRSは発色団分子由来のシグナル
のみを選択的に増強するので、レーザー励起波長の賢明な選択を通して特異性を
得るための試みが行われた。しかし、事前共鳴(pre−resonance)
効果は、サンプル中の、より濃縮された種のシグナルを、ずっと低い濃度で存在
する、微量検体からの強力に増強されたRRSシグナルでさえ、より多数の種か
らの、より弱いシグナルの組み合わせによって依然として覆われるという点まで
増強し得る。大部分のサンプルマトリクスは、RRS単独が、微量の検体のモニ
タリングのために十分な特異性を達成するとしても稀にしか達成し得ない、充分
な複雑さのマトリクスである。それゆえ、ごく近年では、検体を特異的に捕獲し
、検体を溶液から取り出し、そしてこれを(これのみを)SERS活性コーティ
ングと接触させて、他のサンプル構成要素を大量の媒質中に残す(その媒質中で
は、これらは、SERS効果によってシグナルが増強されるには表面から遠すぎ
る)ために用いられ得るコーティング(例えば、ポリマーまたはクラウンエーテ
ル)を同定するための研究が開始された。しかし、今日までに同定されたコーテ
ィングは、大部分の分析、検出またはモニタリング適用に必要な特異性を提供し
ていない。
順は、2つの広範なカテゴリーのうちの一方に入る。(1)生存微生物の分析は
、種々の栄養培地および/または色素培地中での細胞の培養、予備富化工程、お
よび(しばしば、視覚的検鏡と組み合わせた)他の湿式化学技術を含む。あるい
は、(2)サンプルは処理されて、任意の細胞物質が破壊され、遊離された核酸
内容物が酵素の混合物によって消化され、核酸フラグメントがクロマトグラフィ
ー技術(例えば、ウェスタンブロットまたはサザンブロットなど)によって処理
され、次いで、例えば、放射性同位体標識、蛍光標識または酵素標識を用いてタ
グ化したプローブと反応させ、次いでこの標識を検出し得る。このような分析は
、完了するには数日間までを必要とする。
物を同定し得ることを提唱した。例えば、細菌の振動スペクトルは、非常に再現
性が高く、そして異なる細菌について典型的な、指紋様のパターンである。イン
タクトな細胞が含まれるので、スペクトルは、細胞の総化学組成(タンパク質、
膜、細胞壁、核酸など)の集積された「画像」である。細胞構成要素の数の多さ
によって、重なったスペクトルバンドは、スペクトル範囲全体を通して観察され
る。すなわち、このスペクトルは、別個のピークではなく、幅広でかつ複雑な外
形を示す。個々の細胞構成要素についての情報の多くは、スペクトルの形の下に
「隠される」;いくつかのバンドが、別個の官能基または化学下部構造に帰属さ
れ得るが、大多数は帰属され得ない。それゆえ、従来のスペクトル同定アルゴリ
ズムを用いては、細菌のスペクトルを分類できない。しかし、他の型のアルゴリ
ズム(例えば、パターン認識技術)が用いられている。例えば、ドイツの会社は
、パターン認識アルゴリズムを利用する、フーリエ変換IR(FTIR)の原型
を導入して、種へと、そして通常は株および/もしくは血清群(serogro
up)および/または血清型、レベルに分化する、300を超える多様なグラム
陽性細菌およびグラム陰性細菌をそれらの振動スペクトルのみに基づいて同定し
た。それにもかかわらず、IRは、いくつかの理由により、複雑なサンプル中の
微生物の検出および同定のため(例えば、環境サンプルまたは臨床標本中の病原
体の同定のため)の単独の機構としては用いられ得ない。第1に、各々数十万の
異なる細菌種ならびに数百万の種の藻類、酵母およびカビ、芽胞、ウイルスおよ
び花粉(無数の他の粒状夾雑物をいうのではない)からの単一参照スペクトルか
ら構成される参照ライブラリーを通して分別して、所定の未知の特異的同定を確
実にするために必要とされるアルゴリズムは極めてわずらわしい;このようなデ
ータベースを開発するために必要とされる努力および費用は非常に高価である。
さらに、この問題は、それよりもさらにより複雑である。多くの種は、複数の株
(いくつかは病原性であり、そしていくつかは病原性でない)から構成されるが
、全て異なるスペクトルを示す。それゆえ、多くの参照スペクトルは、大部分の
微生物種について必要とされる。さらに、同一の細菌懸濁物の異なるアリコート
から得られるスペクトルは本質的に同一であるが、所定の株が異なる条件下で増
殖する場合にスペクトルにおける変動性は増加する;それゆえ、各細菌株につい
て、複数の参照スペクトルが必要である。従って、ドイツのFTIRを開発する
ために何年もかかっている;そしてその使用は、単離された細菌を非常に特異的
なセットの条件下で培養して、細胞構成要素が、参照スペクトルを開発するため
に用いられた微生物の細胞構成要素と一致すること確実にすることに基づく。第
2に、病原検出器は、純粋な培養物を分析するという贅沢さを有さない;これは
、任意の可能な組み合わせの全ての任意の可能な濃度で可能なサンプル構成要素
の全てのシグナルの混合物において病原体の特徴を検出し得なければならない。
この要件は、アルゴリズムをなおさらに実質的に複雑にする。実際、パターン認
識アルゴリズムは、混合物を分析するためにはほとんど適切ではない。なぜなら
、これらは、定量的でないからである。ドイツのシステムは、個々の細胞から培
養された純粋なコロニーのみを分析するように設計されている。第3に、妥当に
迅速な応答時間を達成するために、検出器は、培養が必要でない十分な感度を提
供しなければならない。微生物技術を用いてさえ、ドイツFTIRは、直径40
〜80μmのマイクロコロニーを必要とする(40μmのスポットは、約104
の細菌細胞に対応する)。このバイオマスの要件は最少であるが、これらは依然
として、好気性生物については6〜8時間の、そしてゆっくりと増殖する嫌気性
生物についてはさらに長い、インキュベーション時間を引き起こす。ウイルスは
容易には培養されないので、これらは、FTIRアプローチによっては全く検出
され得ない。そして、第4に、IR分析は、水と適合しない;細菌細胞内の最少
量の水でさえ、特異的同定に必要とされる重要なIR窓をマスクするに充分であ
る。それゆえ、このドイツプロトコルは、乾燥工程を含む。
ンは、細菌同定の単独の根拠としておよび/またはIR分析と組み合わされた補
助的な方法として役立ち得ることが示唆されている。ラマンの使用は、水からの
妨害の問題を克服する。それにもかかわらず、ラマンは、IRと同様に、IRが
使用され得ないのと全く同じ理由で、複雑なサンプル中の微生物の検出および同
定に用いられ得ない。IRのように、微生物のラマン同定について今日まで行わ
れた研究は、厳密に制御されたセットの研究条件下で増殖させ、精製された微生
物培養物を利用した。微生物内の異なる分類マーカーを選択的にプローブして、
生物の正体についてのさらなる詳細を提供し、そしてさらなる特異性を獲得する
ために共鳴ラマン技術が用いられ得ることもまた示唆された。例えば、242n
m、251nmおよび257nmの励起では、ヌクレオシド、核酸、キノンおよ
びジピコリネートからのシグナルが選択的に増強される。231nmおよび22
2nmの励起では、スペクトルは、ほとんど排他的にタンパク質芳香族アミノ酸
ピークおよびプロリンピークを反映する。しかし、これらの研究は、微生物の同
定のためのラマンの使用に固有の別の問題を強調した。いくつかの細菌細胞構成
要素は、増殖周期における異なる時点の間で、または異なる環境条件に起因して
、相対含量が広範に変化する。例えば、RNA含量は、増殖速度の関数であるの
で、培養物の増殖周期の初期に励起されるスペクトルは、より後期の培養物から
励起されるスペクトルよりもずっと強い核酸ピークを示す。同様に、特定の培養
条件によってもたらされる芽胞形成は、選択された波長での細菌細胞のRRSス
ペクトルに著しく影響を与え得る;内生胞子コアにおけるジピコリネートからの
シグナルは、例えば、242nm、251nmおよび257nmの励起での、芽
胞形成しているB.subtilisのスペクトルを特色付ける。所定の種のス
ペクトルにおいて見出されるバリエーションが多くなるほど、参照ライブラリー
中に含まれなければならないモデルスペクトルが多くなり、そしてパターン認識
アルゴリズムがより複雑になる。さらに、有用な分類マーカーをプローブするた
めに目的のものであり得る多くのレーザー波長は、このアプローチについては用
いられ得ない。なぜなら、この波長は、強い蛍光を誘導し、この蛍光は、ずっと
弱いラマンシグナルを覆うからである。これらの問題に対する解決策は、提案さ
れていない。ラマンまたはIRのいずれかによる微生物の同定は、純粋なコロニ
ーの培養、続いて非常にわずらわしいデータベースの労力を要する分析を依然と
して必要とし、このプロセス全体は達成するために数日を必要とする。
出に必要とされる特異性を達成し得ると考える。バイオセンサーは、全ての他の
デバイスおよびプロセスとは、これらが生物学的成分(例えば、酵素、抗体また
はレセプター)を利用するという点で異なる。バイオセンサーでは、生物学的成
分は、検体と結合し、そしてこうすることによって、「生物学的シグナル」を生
じる。生物学的成分は、この「生物学的シグナル」を検出し得、そして電気シグ
ナルへと変換し得る変換器と連結される。次いで、この電気シグナルを用いて、
警告などの出力を生じ得る。理論的には、生物学的成分が検体を結合する際に示
す例外的特異性は、同じ程度の特異性を有するバイオセンサーデバイスを生成し
得る。
グする「非特異的」変換器を利用する。言い換えると、この変換器は、検体と直
接関連しているかまたは検体自体によって引き起こされるシグナルを検出せず、
むしろ、生物学的活性(例えば、基質の酵素触媒作用、イオンの通過を可能にす
るかもしくは妨害するレセプターチャネルの開口もしくは閉口、検体とタグ化さ
れた分子もしくは標識された分子との間の、抗体活性部位での結合についての競
合)によって引き起こされるシグナルを検出する。各々の場合、非特異的変換器
は、添加された試薬または二次的な化合物もしくは物質のいくつかの特徴をモニ
タリングする;これは、検体自体に特有であるかまたは固有の何らかの局面を測
定も検出もしない。実際、変換器は、極めて非特異的なシグナルを検出するか、
多くのサンプル構成要素はいくつかのシグナルを生じ得るか、または生物学的活
性によって生じるシグナルのレベルを変更し得る。非特異的変換器は、違いを見
分けることができず、そしてこれらの非特異的妨害に起因した誤った応答を与え
る。
バイオセンサーを例に挙げる。これらのデバイスでは、変換器は、消費された酵
素基質、形成された酵素反応生成物または基質の消費もしくは反応生成物の形成
によって引き起こされるいくつかのさらなる試薬における変化(例えば、基質消
費または反応生成物形成に起因するpHの変化に起因する、色素の色の変化)に
さえ起因するシグナルの変化を測定する。インヒビター、すなわち、検体が存在
する場合、これは、酵素の活性部位を占め、その酵素がその基質を触媒するのを
防止し、これは次いで、pHの変化を防止し、それゆえ、色の変化を防止する。
非特異的変換器は、色が変化しないことを「見」て、そしてこのことが、検体が
存在することを意味すると「仮定する」。しかし、この検体自体は、色の変化を
引き起こさず、さらに酵素に結合した検体は色を変化させない。同時に、検体に
全体として関連しない他のサンプル構成要素はpHを変化させ得、それにより色
を変化させるか;溶液を緩衝化し得、それによりpHにおける変化および続く色
における変化を防止するか;基質もしくは反応生成物を加水分解し得、色におけ
る変化を引き起こすかもしくは予防するか;またはそれ自体がさらに着色され得
る。変換器は、変換器は色を測定するだけであるので、差を区別できない。
受性である。これらのデバイスにおいて、例えば、検体は、チャネルレセプター
に結合し得、そのチャネルを開けるかまたは閉じ、それによりチャネルを通るイ
オンの流れに影響を及ぼす。バイオセンサーは、検体ではなく、イオン流中の変
化を検出するレセプターに基づく。例えば、トランスデューサーは、電気容量を
検出する。レセプターの周囲の膜のピンホールは、開かれたレセプターチャネル
の場合、正確に同じシグナルを生成し、検体がレセプターに結合したかのように
、非特異的なトランスデューサーの応答を引き起こす。
渉物に対して感受性である。免疫センサーは、通常、検体ではなく標識を検出す
るトランスデューサーを用いて、抗体上の結合部位に対して、標識アナログと検
体との間で競合を確立する。例えば、標識は、蛍光団およびトランスデューサー
(蛍光検出器)であり得る。検体が存在する場合、より少量の標識アナログが抗
体に結合し得、そしてそのトランスデューサーは、より低いレベルの蛍光を「調
べる」。次いで、トランスデューサーは、高い検体濃度と低い蛍光濃度を等しく
する。しかし、多くの化合物は、自然に蛍光性であり;これらが抗体の近くの任
意の表面上に吸収する場合、実際に検体が存在する場合、このトランスデューサ
ーは蛍光を検出し、そしてこのことを検体の不存在として解釈する。あるいは、
多くの化合物が蛍光を消光し;これらが抗体の近くに結合または吸着する場合、
これらは、トランスデューサーが蛍光タグを検出することを妨げ、トランスデュ
ーサーを「だまし」、検体が存在しない場合に、検体が存在するかのように応答
させる。
イオセンサーを困らせ、バイオセンサーデバイスの感度、特異性、および誤り検
出比に影響を及ぼす。
するサンプル成分)はまた、非特異的な伝達バイオセンサーに対して問題を引き
起こし得る。ほとんどの生物学的成分は、ただ1種類の検体ではなく、多くの構
造的に類似の化合物と結合または相互作用する。例えば、酵素コリンエステラー
ゼ(これは広範に研究され、そして神経ガスの検出のために使用される)は、目
的のたった3種類の神経ガスではなく、およそ300種類の異なる有機リンおよ
びカルバメート化合物により阻害され得る。任意のインヒビターは、酵素活性に
影響し、これにより、トランスデューサーにより検出されるシグナルに影響する
。たとえインヒビターが存在しても、トランスデューサーが検出するシグナルは
同じであり、シグナルの強度またはシグナルの強度が変化する割合のみ、異なり
得る。従って、非特異的なトランスデューサーは、1種類以上のインヒビターが
存在することを決定し得るが、サンプルに存在し得るインヒビターの種類、また
は異なるインヒビターの数をでさえ、決定し得ない。同様に、いくつかの異なる
毒素は、レセプターチャネルの開閉に影響し得、キャパシタンストランスデュー
サーは、影響された流れを決定し得るが、応答し得る毒素または毒素の混合物の
種類を決定し得ない。同様に、抗体は、1を超える抗原またはハプテンと「交差
反応」し得、免疫蛍光バイオセンサーは、存在する抗原またはハプテンの種類、
またはサンプル中に複数の交差反応性種が存在するか否かをさえ、識別し得ない
。
体について異なるトランスデューサーならびに異なる生物学的成分を使用するこ
となく、1種類を超える検体を検出および同定し得るバイオセンサーを設計する
ことは、不可能であり、各々についての異なるトランスデューサーおよび生体物
質を使用することなく、1種類以上の検体を定量し得るバイオセンサーを設計す
ることは、不可能である。それゆえ、所定のサンプルまたは材料内で同定および
/または定量されなければならない検体数が増加するにつれて、バイオセンサー
のサイズおよび複雑性が増加する。
に曝される場合に、検体が水溶液に存在することが必要とされ、そして生物学的
成分は、溶液または溶媒中で連続的に存在する。それゆえ、バイオセンサーが風
媒性の蒸気またはエアロゾルを検出するために使用される場合、サンプル気体は
、始めに、水性の収集流体中に洗い込まれ、そして次いで、この流体は、生物学
的成分に取り入れられる。液体洗浄は、任意の自動化システムの複雑性および費
用を増加し、そしてシステムは、十分な水の供給の近くで使用されることが必要
とされる。さらに、バイオセンサー装置の有効期限または作動期限は、限定され
得る。なぜならば、生物学的成分は、しばしば乾燥した場合よりも溶媒和された
場合のほうが安定性が劣るからである。
に起因する。多くの生物学的成分(特にタンパク質(例えば、酵素および抗体)
および複合体(例えば、レセプター))は、種々の機構により容易に変性(すな
わち分解または不活性化)される。この機構としては、熱、pHの変化、機械的
摂動、または非水性溶媒、界面活性剤もしくはプロテアーゼの存在が挙げられる
。多くのバイオセンサーは、生物学的成分を固定するための手法としての単純な
吸着に依存し、表面が任意の時間水に浸された場合に、吸着された生物学的成分
は、表面から浸出し得る。今日までに、認識されるか、研究されるか、または特
許にされた任意のバイオセンサー技術を用いて、バイオセンサーの応答がこれら
の機構のいずれかにより影響されてきたのか否かを決定することは不可能であり
、すなわち、生物学的成分が浸出したか否か、熱的もしくは化学的もしくは生物
学的に変性されたか否か、あるいはpHの局在的な変化または補助因子の存在も
しくは不在などにより改変されるその結合速度論を有したか否かを決定すること
は不可能である。検出されない生物学的活性の損失は、誤った応答の原因となる
。
化が破壊試験を実施することなく、首尾よく完了したか否か(すなわち、正確な
量の生体物質が固定されたか否か、固定された調製物が全て反応性であるかまた
は部分的に反応性であるか、そして/または、生体物質が正確な配向で存在する
か否か)を決定することは、不可能ではないが通常困難である。同様に、任意の
時間保存された生物学的成分の反応性は、破壊試験を実施することなく評価また
は決定され得ない。従って、製造または保存されたバイオセンサー生成物のロッ
トを評価するための唯一の方法は、生成または保存される固定された生体物質の
各々のバッチに対して無作為抽出を行い、そして制限された数の固定した生物学
的な品目について破壊試験を実施することである。
化および/または固定化)で処理される場合、生物学的活性の一部または全ては
、失われるかまたは破壊され得る。それゆえ、多段階プロセス中の各々の工程で
時折、得られた調製物の生物学的活性を測定することが必要である。従来の生物
学的活性のアッセイのいくつかとしては、分光学的技術(例えば、蛍光タグの結
合がモニターされる免疫アッセイ、または色のある反応生成物の形成がUV−可
視吸光度により測定される酵素アッセイ)が挙げられる。他の生物学的活性のア
ッセイとしては、例えば、放射性タグが挙げられる。生物学的活性を測定するた
めのほとんど全ての従来のアプローチが破壊的であり、すなわち調製物の各々の
ロットのアリコートがアリコート中の生体物質を消費または汚染する試験に供さ
れる。例えば、固定された酵素調製物の生物学的活性を決定するために、基質が
固定された酵素のアリコートに加えられ、そして基質が反応性生物の転換される
速度が決定され、抗体調製物の結合能を決定するために、タグをつけられた抗体
または標識抗原が抗体のアリコートに加えられ、そして抗体に結合する標識の量
が測定される。多くの他の、よりさらに骨の折れる技術がまた、アミノ酸配列決
定、クロマトグラフィー、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動などを含む
、生物学的産物の製造の間の種々の段階で、生体物質の状態を評価するために使
用され得る。全てのこれらの手順は、時間がかかり、そして非常に熟練した技術
者を必要とする。
抗体を惹起する能力、およびバルクにおいて比較的容易かつ廉価に、均一な物理
的特徴および化学的特徴を有するモノクローナル抗体(MoAb)を生成する能
力に起因して、バイオセンサーにおける使用のためにますます普及しつつある。
しかし、検体に対する抗体の高い親和性は、主要な不利点ならびに利点である。
ほとんどの免疫センサーは、競合結合スキームを使用し、ここで検体(例えば、
コカイン)は、抗体結合部位についてタグ化したアナログ(例えば、蛍光標識し
たコカイン)と競合する。一旦、いずれかのリガンドが抗体の活性部位に結合す
ると、この抗体は、再使用され得ない。各々、全てのサンプルについて、抗体お
よびタグ化したアナログの両方が消耗され、そして放棄および置換されなければ
ならない。
らびに供給計画を複雑にする。これにより、抗体が再使用され得るように、結合
検体および/または標識アナログを除去するための効率的かつ実際的な方法を見
出すことに、顕著な労力が費やされている。現在研究中であるこのアプローチは
、2つの広範なカテゴリーに分割され得、1つは抗体の再生に基づき、他方は、
抗体結合の可逆性に基づく。
スして除くことにより、再生され得ることは、長い間から既知であった。カオト
ロピック剤は、抗体の局所的な環境において劇的な変化を引き起こすことにより
、抗体、リガンド、またはその両方において顕著なコンフォメーション変化を誘
導する。最適な抗体活性は、一般的にpH6〜8の範囲で生じるため、媒体のp
Hまたはイオン強度を変化するカオトロピック剤は、抗体の可変Fab領域を「
開ける(unzip)」。効果的なカオトロピック剤としては、グアニジン塩酸
塩、チオシアン酸カリウム、HCl、エチレングリコール、ドデシル硫酸ナトリ
ウム/尿素、およびプロピオン酸が挙げられる。リガンドが放出され、そして洗
い流された後、この抗体は、中性pHで再生することにより本来のコンホメーシ
ョンに回復する。より最近の研究は、抗体を再生するための温度摂動のできる限
りの使用、またはバルク溶媒の極性を減少することにより、リガンド結合に対す
る疎水性効果の寄与を減少することに焦点を当ててきた。両方のこれらの後者の
アプローチはまた、抗体における顕著なコンフォメーション変化を引き起こし、
そしてそれらが使用された後、この抗体は、処理を逆行させること(すなわち、
冷却することか、または溶媒の極性を増加すること)により再生されなければな
らない。不運にも、たとえどのアプローチが使用されても、顕著な量の抗体の結
合能が各々の解離/再生サイクルで失われ得る。通常、十分な能力が失われるの
で、この抗体調製物は、6〜10サイクルごとに廃棄および置換されなければな
らない。さらに、能力の損失は、サイクルごとに、予測不可能に変化する傾向に
ある。先行技術のバイオセンサーは、各々のサイクルがどの位の効果を抗体能力
に対して有するかを決定し得ないので、再生プロセスは、検体の定量化において
、確度または精度を必要とする任意の適用に使用され得ない。
位が始めに標識リガンドで事前に飽和されている場合、検体を含むサンプルは引
き続いて導入され、標識アナログは、検体により「置換」されることは、既知で
ある。1つの置換のアプローチ(「バイオアフィニティー」と呼ばれる)では、
事前に飽和された抗体は、半透膜(すなわち、高分子量の標識アナログに対して
ではなく、低分子量の検体分子に対して透過性である膜)内に囲まれる。非標識
検体を含むサンプルが導入される場合、この検体は、この膜を通って拡散し、そ
して抗体結合部位から標識アナログを置換する。置換された標識は、膜により抗
体の近位に保持され、そして検体の濃度が連続して低下する場合、標識アナログ
が抗体の結合部位に対してより有効に競合し、そして結合検体が次第に置換され
るにつれて、それはこの膜を通って拡散し、この結果、全ての検体が通過し、そ
して全てのアナログが結合されるまで、よりさらに濃度を低下する。トランスデ
ューサーは、結合し続ける標識か、または置換される標識のいずれかからのシグ
ナルをモニターし得る。バイオアフィニティーのアプローチは、いくつかの魅力
的な特色を提供する。例えば、抗体も標識リガンドも分析の間は消耗されず、こ
れにより、消耗物を大きく減少し、較正条件を単純化し、そして所望ならば、「
リアルタイム」のモニターを設計することを可能にする。しかし、検体が膜を通
って拡散するために必要な時間は、応答時間および回復時間の両方を増加する。
さらに、半透膜に対する必要性のために、バイオアフィニティーデバイスは、比
較的低分子量の検体の検出のみに対して適切である。最後に、バイオアフィニテ
ィーセンサーは、任意の他の免疫センサーのアプローチとして、同じ宿主の非特
異的な干渉物および特異的な干渉物に対して感受性である。
れる新たな可逆的抗体技術が、発明された。検体の不在下では、アナログ部分は
、抗体の活性部位を占有する。検体を含むサンプルが導入される場合、この検体
はアナログを置換し、それはバイオアフィニティーセンサー中でも同様に起こり
、そしてバイオアフィニティーセンサー中のように、このアナログは決して系か
ら漏れない。しかし、バイオアフィニティーセンサーと異なり、このアナログは
、膜によるのではなく、フレキシブルな連結により抗体の近位に保持される。周
囲の媒体中の検体の濃度が減少する場合、「捕獲性」のアナログは、抗体の結合
部位に対して再度、効率的に競合し得、いかなる部分的または一時的な抗体変性
を伴わずに、検体結合を逆進させ、これによりいかなる抗体能力の負の影響も伴
わずにベースラインに対してセンサーを修復する。この新たなアプローチは、「
Reversible Competitive Recognition U
nit(RCRU)」(特許第5,156,972号、1992年10月20日
、「Analyte Specific Chemical Sensor w
ith a Ligand and an Analogue Bound o
n the Sensing Surface」、D.Issachar)と呼
ばれ、種々の非特異的な形質導入免疫センサー(例えば、免疫蛍光技術)の使用
について提案されてきた。これはまた、RCRU構想が他のタイプの生物学的成
分(例えば、他のタイプのタンパク質(レクチン、抗体フラグメント、ポリペプ
チド、合成ペプチド、およびレセプター))を使用することを明示する。従って
、抗体の使用では検出され得ない非常に低分子量のハプテンを含む、広範な検体
の特異的な検出のためにRCRUベースのバイオセンサーを設計することは可能
である。そして半透膜が存在しないため、高分子量の検体の検出についても同様
に可能である。しかし、RCRUのアプローチは、バイオアフィニティーに関連
するいくつかの制限(例えば、応答時間および回復時間ならびに分子量制限)を
排除し、そしてまた検出され得る異なる検体の数を拡張するが、RCRUのアプ
ローチは、先行技術の非特異的な形質導入に対する非特異的な干渉物および特異
的な干渉物の影響に関連する問題を被る。
ロセスは、−従来の器具使用(例えば、IR分光法またはラマン分光法)、また
はより新規なバイオセンサー技術のどちらに基づこうと−サンプル体積に関して
検体を濃縮し得るサンプリングシステムまたはサンプリングプロセスと組み合わ
され得る。例えば、固体吸着剤システム(例えば、活性炭、テナックス(ten
ax)、もしくは石英ファイバー束)または液体洗浄システムは、気体サンプル
を濃縮するために使用され得る。固体吸着剤が使用される場合、始めに、大きい
体積の気体が、固体吸着剤を通して吸引され、検体が吸着剤の表面上に吸着する
ことを可能にする。次いで、サンプリング気体を遮断し、そして小さな体積の加
熱された気体が固体吸着剤を通して流され、検体を脱着し、そして検出器へのサ
ンプル伝達ラインを通して、濃縮された検体分子を流す。しかし、このようなサ
ンプリングシステムまたはサンプリングプロセスは、これら自身の多くの欠点を
有する。吸着の間に検体分子を収集するときに固体吸着剤を効果的にするこれら
の同じ特質はまた、吸着の間、表面に検体を保持させ、そして首尾よく追い出さ
れた「粘着性」分子は、サンプル伝達ラインの壁上に再吸着する傾向にあり、決
してトランスデューサーに到達しない。このことは、減少された全体的な感度の
原因となる。さらに、表面吸着は、比較的非特異的な機構であるので、多くの他
のサンプル成分が濃縮され、そして検体に加えてトランスデューサーに輸送され
、バックグラウンドの「ノイズ」を増加し、そして誤った警告および感度のさら
なる減少に寄与する。干渉物が持続的に付着し得、表面を次第に汚染し、そして
検体に吸着させず、そして標準検体を用いる頻繁な較正のみがこの特異的な問題
を検出し得る。液洗浄装置は、煩雑であり、消耗物−例えば水−を必要とし、そ
して暑く湿気の多い気候では、オーバーフローする傾向がある。固体吸着剤と同
様に、液体洗浄装置は非特異的である。すなわち、これらは、検体に加え、数百
の他の成分を収集しそして濃縮し、これによりバックグラウンドのシグナルまた
はノイズを増加し、そしてさもなければ清澄なサンプルを用いて達成される感度
を減少する。固体吸着剤をよび液体洗浄装置の両方は、バッチサンプラーであり
、これは、検出器が低い検体濃度よりも高い検体濃度にもはや素早く応答し得な
いことを意味する。両方とも「ゴースト」(すなわち、1回のサンプリングサイ
クルで収集された高濃度の検体のによりサンプラーまたは伝達ライン中に残った
、残渣の検体)を生成する。次いで、これは、続くサンプリングサイクルで流し
出され、誤った警告を生成する。いずれの設計の高体積のサンプラーも大きく、
そして操作のために有意な量の電力を必要とする傾向にある。
的な同定を提供する方法論および装置に対して必要性が存在することは、明らか
である。
れ、濃縮されそして単離される、ラマン分光法に基づく改良されたプロセスおよ
び装置に対して必要性が存在することはまた、明らかである。
量のために、モニターされている「生物学的シグナル」または二次シグナルより
もむしろ、検体自体が検出され、そして特異的に同定されるバイオセンサー技術
に基づく改良されたプロセスおよび装置に対して必要性が存在することはまた、
明らかである。
るために、生物学的成分自体が直接的にモニターされるバイオセンサーに基づく
改善されたプロセスおよび装置に対して必要性が存在することはまた、明らかで
ある。
学的調製物(例えば、固定化生物学的産物)の直接的な非破壊分析を提供する方
法論および装置に対する必要性もまた、存在することはまた、明らかである。
の前に他のサンプル成分から分離される特定のサンプル濃縮アプローチに対して
必要性がまた、存在することもまた、明らかである。
びリガンド自体の分子内−分子間相互作用に対する影響と一緒に、生体物質およ
びリガンドのラマンスペクトルにおいて観測可能であるような両方の物質の通常
のモードの振動の周波数および形態に対して生じる影響において反映されるよう
に、ラマンスペクトル情報と生物学的物質の構造および化学との間の固有の相関
が、検体の存在を検出するためのかなり特異的なプロセスおよびデバイスのため
の基準として使用され得る。ここで、所定の検体を検出するために、その検体が
リガンドである生体物質(すなわち、その活性部位でその検体を結合し、従って
、生体物質−検体(生体物質−リガンド)複合体を形成し得る生体物質)を使用
することが可能であることが見出された。その生体物質の適切な選択によって、
ラマン分光法技術および計装の思慮深い選択と共に、この検体の存在によって誘
導されるこの生物学的物質のラマンスペクトルにおける変化は、検体が存在する
ことを決定するために使用され得る。実際に、ラマン効果において観測される周
波数、強度、および分極状態を分析することによって、単一の所定の生物学的物
質と相互作用し得る複数の検体(リガンド)のそれぞれが、個々に、かつ特異的
に同定される。例外的なサイズおよび多くの生体物質の複雑性、ならびにそれら
のスペクトルの生じた複雑性にも関わらず、所定の検体は、所定の生体物質のラ
マンスペクトルに対する著しい影響を有し得る。この影響は高度に再現性があり
、そして生体物質の活性部位に結合される検体に完全に固有である。生体物質に
結合し得る複数の検体(および交差反応性電位干渉物(cross−react
ive potential interferents))は、そのサイズが
非常に小さい場合においてさえ、各検体の結合は、固有の化学物質の生体物質−
検体複合体を生じ、従って、固有のラマンスペクトルを生じる。この寄与は、検
体の検出および同定において種々の方法で使用され得ることがここで見出された
。例えば、生体物質のベースラインスペクトルが得られ得る。次いで、生体物質
が、分析される物質(すなわち、検体を含む)と接触されると、ラマンスペクト
ルがモニタされ、ベースラインスペクトルに対して比較される。ベースラインス
ペクトルにおける変化は、生体物質に結合し得る1つ以上の物質が存在すること
を意味する。この物質が、単一検体の存在または量によってのみ異なり得ること
が知られているならば、生体物質のスペクトルの変化は、検体が存在するに違い
ないことを示す。特定の同定(および、特に、組成が広範囲に変化し得る物質で
の使用において)に対して、参照スペクトルが得られ得、その後分析が開始され
る。これらの参照スペクトルは、例えば、複数の生体物質−検体複合体のスペク
トルを含み得る。次いで、生体物質は、分析される物質に曝露され、そしてその
スペクトルが、上のようにモニタされる。スペクトルの変化が観測される場合、
この新しいスペクトルは、参照スペクトルのライブラリーに対して比較される。
この新しいスペクトルが、参照スペクトルの1つと適合する場合、特定の生体物
質−検体複合体が、規定によって、形成されたに違いなく、従って、特定の検体
が、物質中に存在しなければならない。
は、例えば、酵素−インヒビター複合体に場合には、検体残基))の存在に単に
起因して、ラマンスペクトルに存在する新しい線を生じる。このような線に関連
する波長がモニタされ得、線が出現する場合、検体の存在および/または同一性
が推論され得る。加えて、生体物質と検体(または、例えば、酵素−インヒビタ
ー複合体の場合においては、検体残基)との間に形成された結合は、その検体の
検出および分析において使用され得るラマンスペクトル中の新しい線の形成によ
って反映されることが見出された。さらに、生体物質自体中の結合または部分に
関連するラマン線は、所定の検体に結合することによって、固有に影響され得、
従って、生体物質中のラマン線が、検体を検出し、そして同定するためにモニタ
され得ることがここで見出された。同様に、所定の生体物質は、生体物質に結合
した検体または検体残基のラマンスペクトルに対して影響を有し得、そして結合
された分析部分内の結合または部分に関連したラマン線が、結合していない検体
、生体物質中または生体物質と検体との間の結合または部分に関連した線の代わ
りに、またはそれに加えて、モニタされ得ることが見出された。
、そして複雑な化学物質であると考えられ得、そして、それ自体、完全に固有な
ラマンスペクトルを保有する。このような細胞に結合し得る生体物質およびラマ
ン技術および計装の思慮深い選択によって、生体物質−細胞複合体のラマンスペ
クトル分析を使用して、複合体内に結合された細胞の存在を検出し、そしてその
細胞を固有に同定し得ることがここで見出された。あまり複雑でない検体におけ
る場合のように、生体物質に関連したラマンスペクトル線、生体物質と細胞との
間の結合に関連した線、および/または細胞自体に関連した線は、検出および同
定プロセスにおいて使用され得る。生体物質−検体複合体のラマンスペクトル分
析を使用して、通常、「細胞」を含まないと考えられるウイルス、胞子、および
花粉のような他のタイプの微生物を同定し得ることがここで見出された。
マン分光法技術を使用して、生体物質と相互作用した検体、モニタされるラマン
スペクトルの部分が、検体内の結合、検体と生体物質との間の結合、または生物
学的物質自体内の全体の結合に関連するかどうかの定量的測定を実施し得ること
が見出された。
得;スペクトルが、純粋な液体、溶液、結晶、多結晶性粉末、繊維、および表面
フィルムから得られ得ることが知られている。生物学的物質が溶媒和され、部分
的に水和され、または実質的に乾燥していようといまいと、検体が生物学的物質
と相互作用し、そして生物学的物質によって結合され;そして、そうしている間
に、完全に溶媒和した生体物質と相互作用する場合のように、生体物質が本質的
に乾燥している場合、検体は、生体物質のベースラインラマンスペクトルに対し
て、同じタイプの変化を生じることがここで発見されている。従って、本質的に
乾燥した、または部分的に水和した生体物質が、風媒性の蒸気または微粒子の直
接検出および分析において使用され得、ならびに、溶媒和した生体物質が、溶解
または懸濁された検体の直接検出および分析において使用され得ることがここで
見出された。
は、検体(単数または複数)、分析される物質、所望される情報に依存する。広
範囲の技術および計装(例えば、RRSおよびマイクロプローブ技術を含む)を
効率的に使用して、所望の特異性および感度を獲得し得ることが示されている。
生物学的物質が、適切に固定化される場合、それらの結合活性を保持し、そして
この固定化状態にいる間、検体と相互作用および結合し、そして生体物質−検体
複合体が、生物学的物質が溶液または懸濁液中にある場合のように、固定化され
た生体物質で形成される場合、ベースラインラマンスペクトルにおいて同じ種類
の変化を示すことがここで見出された。さらに、生体物質が、金属表面上に、適
切に固定化される場合、生体物質および生体物質−検体複合体は、表面増強現象
に起因する、ラマンシグナルの増強を示すことがここで発見された。従って、S
ERSおよびSERRS技術を使用して、生物学的物質に結合し、そして捕獲さ
れた検体の検出および同定において、感度および特異性を獲得し得る。
とが見出された。上記のように、RRSは、微生物内の選択分子の調査し、そし
てそれによって、特異性を得るための非常に強力な道具であり得る。また、多く
のレーザー波長が、微生物分析のために使用することができない。なぜなら、そ
れらは、蛍光を激しく誘導するために、強いRRSシグナルでさえ圧倒してしま
うからである。蛍光を消光するためにSERSを使用することによって、同時に
RRSシグナルを増強しながら、非常に広い範囲の波長を使用して、非常に広い
範囲の細胞構造および成分における共鳴を誘起し得ることがここで見出された。
少なくとも、SERSは、可視領域で励起された病原体からの強い、蛍光のない
ラマンシグナルの生成を可能にし得、ここで、レーザーは、小さく、低出力であ
り、容易に利用可能であり、丈夫であり、そして高価ではない。第2に、上記の
ように、いくつかの細菌細胞構築物は、増殖サイクルにおける異なるポイント間
に、または異なる環境条件に起因して、相対的な含量が広く変化する。このよう
な可変性は、細胞壁または細胞膜からのスペクトル寄与よりもむしろ細胞質構築
物からのスペクトル寄与において、主に観測され;スペクトル情報が、細胞表面
マーカーからの寄与に限定される場合、可変性の多くが排除され得るために、ス
ペクトルシグナルが、細胞表面マーカーおよび可変性細胞質構築物の両方からの
寄与の組み合わせである場合、スペクトルは、増殖/環境条件の段階に依存し得
る。SERS効果が、粗い金属表面に極端に近接した分子に制限されるので、S
ERSは、細胞表面構造を選択的にプローブすることが見出された。例えば、2
51nmでの励起を使用して、ジピコリネートにおける共鳴を誘起することなく
、キノンからの表面増強共鳴散乱(SERRS)スペクトルを生成し得;そして
222および/または218nmでの励起を使用して、RNA含有物からの混同
を導入することなく、タンパク質からのSERRSスペクトルを生成し得ること
がここで見出された。可変性の細胞質構築物からのスペクトル寄与を排除するこ
とによって、本発明は、潜在的に誤った応答の1つの源を排除し、そして複合体
混合物またはサンプル中の微生物の信頼のおける同定において必要とされるデー
タベースを単純化する。
の変化を使用して、生体物質および/または生体物質−検体複合体の配向を調節
し得、それによって、表面に最も隣接した部分を調節し、それによって生体物質
および/または生体物質−検体複合体内の部分からのシグナルの増強の程度を調
節することがここで見出された。従って、電極を使用して、検体検出および分析
プロセスの感度および特異性の両方を、検体の存在および/または同一性に固有
な選択されたラマンバンドの増強を最大にするように電位を設定することによっ
てか、または電位をサイクルさせ、そして種々の電極電位において生成する参照
スペクトルのライブラリーに対する比較のために、多重スペクトル(すなわち、
いくつかの電極電位のそれぞれにおいて生成されるスペクトル)を生成するかの
いずれかによって、増強し得る。
たは化学的に変性された形態、および固定化された形態の所定の生体物質は、異
なる三次構造および分子内相互作用を有する、本質的に異なる化学物質であるこ
とが、公知である;従って、十分に反応性の形態、熱的または化学的に変性され
た形態、および固定化された形態の所定の生体物質は、異なりかつ独特のラマン
スペクトルを有する。ラマン分光学は、変性、化学的な改変、凍結乾燥、および
結晶化の結果として生じるコンホメーション変化を試験するために非常に有用で
あることが公知である。しかし、生体物質のコンホメーションと、リガンドと結
合または複合体化するための生体物質の能力(本明細書中以降「反応性能力」と
よばれる)との間の直接的な相関性は、以前に全く注目されなかった;代わりに
、リガンドと複合体化する生体物質の能力の評価についての全ての先行技術は、
複合体形成の実測(すなわち、上記に議論されるような、破壊的生物学的活性ア
ッセイを介する)に基づいていた。しかし、生体物質のラマンスペクトルとその
反応性能力との間には、実際に直接的な相関性が存在し、そしてこの反応性能力
分析が、生体物質の潜在的生物学的活性の予測について、および潜在的生物学的
活性の変更に対して寄与する原因となる因子の決定についての両方の有用な非破
壊的機構であることが、現在示されている。実際、反応性能力分析は、「検体」
(すなわち、原因となる因子)の検出のための4工程プロセスであるとみなされ
得る。第1に、生体物質を、「検体」との接触させる。この「検体」は、例えば
、生体物質と「複合体化」し得る(すなわち、変性した生体物質、変更された酸
化状態、変更された凝集状態、変更されたペプチド骨格構造などの特徴である化
学変化が誘導されるような様式において、生体物質と相互作用し得る)熱または
化学物質であり得る。化学物質または微生物の検体に関して、生体物質における
これらの化学変化は、生体物質のラマンスペクトルにおいて反映され、そして「
生体物質−検体の複合体」の特徴であり、そしてこれらに独特である(すなわち
、熱的もしくは化学的に変性された生体物質または酸化もしくは還元された生体
物質の特徴であり、そしてこれらに独特であるなど)。従って、目的の生体物質
からのラマンスペクトル情報の作成、およびその後の、既知の生物学的活性の生
体物質(すなわち、生物学的活性が従来の活性アッセイを使用してその後に測定
された、部分的または完全に変性された生体物質)のモデル参照スペクトルのラ
イブラリーとの情報の比較を通じて、「複合体」を形成した「検体」(すなわち
、生体物質を部分的または十分に変性させた因子)を同定して、それによって、
サンプル材料の潜在的生物学的活性を予測することが可能である。
の複数の別々の形態)の各々を検出し、そして定量し得ることが、現在見出され
ている。化学物質および微生物の検体に関して、生体物質の状態を変性させるか
または変更する因子は、独特なスペクトルを有する生体物質の形態を生じる。同
じ生体物質のいくつかの異なる形態が存在する場合であっても、それらは、それ
らのラマンスペクトルを通して、個別に同定され、そしてさらに定量され得る。
従って、材料における条件は、いくつかの生体物質が完全に変性され、そしてい
くつかが十分な生物学的活性を保持するようである場合でも、ラマン反応性能力
分析は、存在する各形態の量、それによって、混合物の全体的な反応性能力(す
なわち、全体的な潜在的生物学的活性)を決定するために使用され得る。
分析の間に、バイオセンサープロセスまたはデバイスにおいて生物学的成分自体
を非破壊的にモニターするために使用され、生体物質が十分に反応性であり、そ
してそれらの検体を結合し得るか否かを決定し得る。例えば、参照スペクトルは
、生体物質−検体の複合体からのみではなく、変更した反応性能力を示す種々の
形態の生体物質からもまた、得られ得る。次いで、ベースラインのラマンスペク
トルが、材料の分析の間(例えば、空気の連続的モニタリングの間)、モニター
されているので、このベースラインスペクトルにおいて観察される任意の変化は
、種々の生体物質−検体の複合体の参照スペクトルに対してのみではなく、種々
の形態の生体物質の参照スペクトルに対してもまた比較され得る。ベースライン
スペクトルが、変性もしくは部分的に変性されたもの、またはそうでなければよ
り反応性が小さい形態の生体物質に対応するスペクトルに変化する場合、この情
報は、生物学的活性における変化の影響を和らげるために使用され得る(例えば
、サンプリング速度の調整、検体を定量するために使用される数学的操作の改変
、またはさらに生体物質の置換)。それ故に、本発明に従って、生体物質自体の
ラマン反応性能力分析は、先行技術のバイオセンサーで遭遇する最も深刻な問題
のうちの1つ(すなわち、生物学的物質の相対的脆弱さ)を修正するために使用
され得る。
バルク(bulk)媒質の環境(すなわち、周囲の溶液または空気)とは非常に
異なり得ることが公知である。従って、生体物質のラマン散乱スペクトルをモニ
ターし、そして反応性能力分析を実行することによって、生体物質の状態につい
て(すなわち、生体物質における微小環境およびその微小環境の影響について)
例えば、バルク媒体のpH、温度、またはイオン濃度をモニターすることによっ
て達成され得るよりも、はるかに多くの情報を得ることが可能であることが、現
在、見出されている。従って、ラマン反応性能力分析は、生物学的活性に有害に
影響する所望されない環境因子を同定するために(および修正するために)使用
され得る。例えば、ラマン反応性能力分析は、高いpHに起因する減少した生物
学的活性に特徴的な生体物質の形態を検出し得、一方、材料は、検体についてモ
ニターされている;いくつかの酸または緩衝液は、最適な生物学的活性に適切な
レベルにpHを調整するために添加され得る。
以外の時間およびそれ以外の方法にて使用され得ることが、留意されるべきであ
る。例えば、これは、生体物質がバイオセンサーでの後での使用に意図されるか
否かおよびこのバイオセンサーがラマン変換器を利用するか否かにかかわらず、
合成調製物、抽出調製物、精製調製物、凍結乾燥調製物、結晶化調製物、および
/または固定化調製物を含む生物学的調製物の製造および貯蔵の間に使用され得
る。例えば、固定化された酵素調製物は、所定の反応生成物を合成するそれらの
能力を予測するために分析され得る(この実施例において、「検体」は、生体物
質を固定するために使用されるプロセスである)。モデル参照スペクトルのライ
ブラリーは、生物学的活性が従来の酵素活性アッセイ技術を使用して決定されて
いる、多数の異なる固定化調製物から調製される。分析されるべき固定化された
調製物は、適切な波長の照射に曝され、その得られたラマンスペクトルは、収集
され、そして処理され、次いで、この調製物の測定されたスペクトルは、この調
製物の反応性能力を決定するために、モデル参照スペクトルのライブラリーに対
して比較される。この反応性能力分析は、例えば、調製物のバッチをスクリーニ
ングして、不適切に処理されている調製物を同定するか、または貯蔵の間に分解
した生物学的調製物を検出するために使用され得る。同様に、反応性能力分析は
、抽出、精製、化学的な改変、合成もしくは生合成、凍結乾燥、および結晶化の
手順(所望の場合には、インサイチュ)をモニターして、収量を最適化するため
に、不適切に処理された調製物を同定するためにバッチをスクリーニングするた
めに、貯蔵の間に分解した調製物を検出するためなどに使用され得る。
されている。先行技術のバイオセンサー技術は、しばしば、単一の型の生物学的
成分に制限される。例えば、ほとんどの蛍光バイオセンサー技術は、抗体を用い
て使用され得るのみである;それらは、酵素、レセプター、または核酸を用いて
使用され得ない。ほとんどの電極バイオセンサー技術は、特定のカテゴリーの酵
素を用いて使用され得るのみである;それらは、他の型の酵素、または抗体もし
くは核酸もしくはレセプターを用いて使用され得ない;など。しかし、生体物質
と複合体化した検体の検出および同定のためのラマン散乱スペクトル分析は、記
載されるように、実質的な任意の生体物質(タンパク質およびタンパク質複合体
、核酸材料、アクセプターおよびレセプター、ペプチド、レクチン、サッカリド
、糖質、脂質および脂質複合体、他の生物学的高分子および複合体、リガンド(
例えば、抗原、ハプテン、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト)な
らびに膜、オルガネラ、細胞、および組織でさえも含む)を用いて使用され得る
ことが現在示されている。同様に、ラマン反応性能力分析(すなわち、ラマンス
ペクトル情報からの、リガンドとの複合体を形成するそれらの潜在的能力の予測
)は、この広範な範囲の生体物質に対して実行され得ることが現在発見されてい
る。
よび同定、定性および/または定量のためのプロセスおよび装置である。第1工
程において、検体と、いくつかの検体がバイオコンセントレーターに結合し得る
かまたはそれと複合体化し得るような様式において、適切な「バイオコンセント
レーター」(すなわち、本発明に従って使用される生物学的成分)とを接触させ
る。第2工程において、このバイオコンセントレーター−検体の複合体は、1以
上の所定の波長の照射に曝されて、ラマン散乱スペクトルバンドを生成する。第
3工程において、ラマン散乱スペクトルバンドの少なくとも一部は、ラマン分光
器によって収集され、そして処理され、そして電気シグナルへと変換される。最
終的に、第4工程において、この電気シグナルは、ベースラインスペクトルの1
以上の電気シグナルに対して比較して、検体を検出および/または同定、定性お
よび/または定量することによって分析される。このベースラインは、例えば、
分析されるべき材料と接触させる直前に、生体物質から取得したスペクトルであ
り得る。このベースラインはまた、モデル参照スペクトルのライブラリー(すな
わち、既知のバイオコンセントレーター−検体の複合体を用いて以前に生成され
、次いで比較の目的のためにメモリーに適切に保存されたスペクトル情報)であ
り得る。
たは他の型の生体物質において使用され得る。この場合、生体物質が「複合体化
」する「検体」は、例えば、この生体物質を変性し得る熱または化学物質、この
生体物質の酸化状態またはスピン状態または凝集状態あるいはペプチド骨格構造
を変更し得る環境因子などであり得る。前と同様に、このベースラインは、「検
体」と接触させる直前の生体物質から取得したスペクトルであり得る。ライブラ
リーは、十分に活性かつ部分的または完全に変性したかまたはそうでなければ分
解したバイオコンセントレーターのモデル参照スペクトルを含み得る。このバイ
オコンセントレーター自体が分析される場合、反応性能力分析の結果は、本発明
に従って、バイオコンセントレーターが関与する検体の検出および分析に対して
標的化されたプロセスに影響するかまたは変更させるかまたは最適化するために
使用され得る。ラマン反応性能力分析が生体物質の他の型に実行される場合、得
られる情報は、生体物質が関与するプロセス(例えば、生体物質自体の抽出また
は化学的な改変または精製)を調整または最適化するために使用され得る。
はバイオセンサー技術として公知の技術に属すると考えられ得る。ラマン散乱分
光法は光学技術であり、そして用語「オプトロード」は光学的変換に基づくバイ
オセンサのために使用されるため、本発明はここで「ラマンオプトロード」技術
といわれる。あるいは、しかし、本発明に含まれるベースとなる工程ならびに基
本的なプロセスおよび現象でさえ、有意にバイオセンサ先行技術と異なるため、
本発明はその代わりに、ラマン分光法に基づく検出または分析またはモニタリン
グプロセスまたはデバイスによる使用のための高度に特異的なサンプリングプロ
セスまたはデバイスであることが想定され得る。それ故に、固体吸収剤もしくは
液体スクラバーのような、他のサンプル濃縮プロセスまたはデバイスにわたる有
意な改良であるというアプローチにおいて、実質的に、特に検体を収集し濃縮す
るように機能するという認識下で、本発明に使用されるような生物学的成分は、
ここで「バイオコンセントレーター」と呼ばれる。
が存在する。例えば、バイオコンセントレーターが検体と結合する工程およびラ
マン分光法およびエレクトロニクスが分光学的情報を生成し分析する工程が独立
して行なわれ得、たとえ異なる時間(数時間または数日間あけて)においてさえ
、および/または異なる位置においてさえも、実施され得る。例えば、バイオコ
ンセントレーターは1箇所において検体と結合または収集しそして濃縮するため
に使用され得、次いでこのバイオコンセントレーター−検体複合体が第2の位置
に輸送され、この第2の位置において、ラマン分光分析および検体検出/同定が
実施される。しかし、バイオコンセントレーターおよびラマン分光法およびエレ
クトロニクスは、確実に、同時に、および所望される場合、完全に自動的にでさ
えも実施される検体収集およびシグナル変換および分析で単一のデバイス内に一
体化され得る。本発明に従って設計されたラマンオプトロードデバイスは、この
デバイスが無人で作動し得、検体が検出されるとき自動的に警告を発し得、検出
される検体の同一性および量に関する情報を示す視覚的表示および/またはハー
ドコピー印刷を生成し得、任意の「使用済み(spent)」バイオコンセント
レーター(すなわち、反応容量が任意の機構(例えば、検体結合、交差反応干渉
結合、変性などを含む)によって有意に減少されるバイオコンセントレーター)
を自動的に交換し得、および/またはさらなるプロセシング(例えば、プロセス
コントロール機能)のための情報をコンピューターに送り得る十分なエレクトロ
ニクスおよびソフトウェアを有し得る。
複合体、およびフラグメントのいずれかであり得、酵素、抗体、抗体フラグメン
ト、他の生物学的に活性なタンパク質(例えば、血液タンパク質)、ペプチド(
合成ペプチドを含む)、他の生物学的分子(例えば、グリコスフィンゴ脂質、レ
クチン、脂質、リン脂質、核酸)、または病原体吸着因子、複合体(例えば、レ
セプター、またはレセプターサブユニット、または膜、オルガネラ、または細胞
)、または組織もしくはこれらの成分を含む複合体が挙げられるが、これらに限
定されない。さらに、特に検体自体が生物学的である場合(例えば、酵素、抗体
、レセプター、核酸など)である場合、このバイオコンセントレーターは、この
ような生物学的検体に正常に結合する広範な種々のリガンドのいずれかであり得
、この「リガンドバイオコンセントレーター」は、酵素基質、補因子、またはイ
ンヒビター、抗原、抗原アナログ、またはハプテン、アゴニストまたはアンタゴ
ニスト、糖などを含むリストから選択されるが、これらに限定されない列挙から
選択される。このバイオコンセントレーターは、多くの実践的基準(特に検出さ
れるべき検体の型および数;所望される特異性および親和性で検体と結合するか
または補足するためのバイオコンセントレーターの能力、その安定性、その有用
性、およびそのラマン散乱分光特性;バイコンセントレーター成分を製造するコ
スト)に基づいて選択され得る。
らタンパク質および核酸まで、レセプターおよびオルガネラのような生物学的複
合体までのサイズ、分子量および複雑さの範囲にわたる任意の化学的検体(分子
を含む)を実質的に検出するために使用され得ることを注意すべきである。さら
に、本発明は化学化合物または複合体の検出および同定に限定されず、微生物(
例えば、ウイルス、バクテリア、リケッチア目細菌、菌門、花粉、胞子、藻類、
珪藻類など)、および他の型の生物または細胞(例えば、疾患細胞または感染細
胞)、異なる型の血液細胞などを検出および同定するために使用され得ることに
注意すべきである。本発明は細胞下の成分および構造を検出および同定するため
に使用され得ることにも注意すべきである。本発明は、生育不可能な生物および
「生きた」生物と「生きていない」生物との間の差異を検出し;毒性形態の化学
物質または生物学的高分子と毒性形態の化学物質または生物学的高分子(例えば
、毒素とトキソイドとの間)との間の差異を検出するために使用され得ることに
さらに注意すべきである。
解または保有される)中にあるか、または風媒性(すなわち、蒸気、エアロゾル
、または粒子である)のいずれかである非検体を直接に検出および/または同定
および/または定量するために使用され得ることにも注意すべきである。さらに
、バイオコンセントレーターは、風媒性検体に対する曝露の間、または次の変換
の間に可溶化または溶媒和される必要はない。乾燥または部分的に水和した生物
学的成分は、空気サンプルに直接に曝露され得、そして風媒性の検体の蒸気、エ
アロゾル、または粒子と直接に反応する。しかし、このバイオコンセントレータ
ーは、確実に溶液中にあり得るか、または表面上に固定化され得、この表面は使
用中に液体でコートされるか、または浸漬され;そしてラマンオプトロード発明
は、バイコンセントレーターと結合する前に、サンプルが溶液中にあるかまたは
溶液にスクラブされるプロセスおよびデバイスをカバーする。
程のいずれかの間、基材に固定されてもよいし固定されなくてもよいことにさら
に注意すべきである。用語「基材」は、例えば、このバイコンセントレーターの
運動を制限するタンパク質またはポリマーフィルムまたは多孔性材料のようなマ
トリクス内への組み込みまたはそのマトリックスによる捕捉を通して、固体また
は多孔性の支持表面上にこのバイオコンセントレーターが支持されない場合でさ
え、このバイオコンセントレーターが固定される(すなわち、媒体を通したその
自由な運動が制限される)という意味の広い定義を有する。このバイコンセント
レーターは、本発明に従って固定される必要はないが、その代わりに、液体媒体
に溶解され得るか、または溶媒和され得;あるいはそれ自体固体の形態にあり得
る(例えば、検体に曝露され検体と結合し、および/または続いてラマン散乱ス
ペクトルの生成のための励起光に曝露される場合に、結晶化されるかまたは粉末
化される)。このバイコンセントレーターは、収集/検出/モニタリング/分析
プロセスにおける任意の点で、固定することなく、溶媒和されたまたは溶解され
た生物学的材料として、あるいは粉末化された材料または結晶性の材料として残
存し得る。しかし、このバイコンセントレーターは、検体結合工程およびラマン
分析工程を通じて、確実に、固体または多光性の支持表面上に、あるいはフィル
ムまたは多光性の媒体内に、固定され得る。あるいは、このバイオコンセントレ
ーターはまず、自由な(すなわち固定されていない)形態にある間、検体に対し
て曝露され得、続いて、ラマンスペクトル生成工程および分析工程のために固定
され得る(例えば、固体の支持体または表面または多孔性材料またはフィルムま
たは媒体上に吸着されるかまたは捕捉される)。
広範な種々の機構(例えば、吸着、架橋、架橋と結合した吸着、共有結合、捕捉
などを含む)のいずれかによって固定され得、そして表面上に、または膜(生物
学的成分自体から全体的にかつ単独に形成される膜を含む)内に固定され得る。
基材上に固定される場合、バイオコンセントレーターが固定化される基材(また
はフィルムまたはその中の材料)上の表面は、バイコンセントレーター、検体(
単数または複数)およびサンプル(単数または複数)が物理的にかつ化学的に適
合性である実質的に任意の材料からなり得、そして広範な種々の形態(例えば、
バッジ、チケット、ディップスティック、紙上の小さな斑点、プラスチック、ポ
リマー、布、または他の材料、光ファイバーまたは結晶、小さなビーズ、スライ
ドガラス、チューブ、金属フィルム、紙テープまたはプラスチックテープなど)
のいずれかをとり得る。所与の適用に使用されるべき表面またはフィルムまたは
材料、およびその形状は、この適用に最適であると考慮されるサンプリング手順
によって決定される。
トロードプロセスまたはデバイスは、単一の検体の検出に使用され得る。あるい
は、このバイオコンセントレーターは、複数の検体と複合体化し得る単一の生物
学的成分であり得、そしてラマンオプトロードは、バイオコンセントレーターと
複合体化し得る少なくとも幾つかの化合物または微生物を検出かつ同定するため
に使用され得る。なお別の代替において、このバイオコンセントレーターは、複
数の生物学的成分の混合物であり得、各々が1つ以上の異なる検体と複合体化し
得、それによって広範に多様な物理的特性および化学的特性を有する大多数の検
体および/または複数の検体を検出、分析、そしてモニターすることを可能にす
る。ラマンオプトロードはまた、例えば、固体支持体の1つ以上の領域上に、ま
たは膜内に1つ以上のバイコンセントレーターが固定されるサンプリングシステ
ムまたはサブシステムを有し得;ラマン分光計測器は、同時にまたは連続的にの
いずれかでこれらの異なる領域内の種々の位置から個々のスペクトルを収集する
ように設計され得、それによってまた、異なる位置において異なるバイコンセン
トレーターと結合し得る複数の検体を検出かつ分析することを可能にする。
、この光源としては、深UV、近UV、可視、および/または近赤外のスペクト
ル範囲において作動する1つ以上のレーザー、および他の適切な光源が挙げられ
るが、これらに限定されない。共鳴ラマン技術が使用される場合、バイオコンセ
ントレーター内の結合、検体内の結合、または複合体中のバイオコンセントレー
ターと検体との間で形成する新しい結合内の共鳴を励起する光源が選択され得る
。このバイオコンセントレーターは、継続的にまたは定期的な間隔のいずれかで
、サンプルまたはサンプル流に対する曝露の間そして曝露にわたって、励起光か
らの照射に対して曝露され得、それによって、サンプルまたは媒体または環境の
迅速または継続的な検出および分析または「リアルタイム」のモニタリングを可
能にする。あるいは、このバイオコンセントレーターはまずサンプルに対して曝
露され得、次いで後に、次の分析のために、レーザーが、ラマン分光器デバイス
と結合され得るかそのデバイスに挿入され得るかまたはそのデバイスによって走
査され得る。
波長を利用し得る。あるいは、1つ以上の光源によって生成される1つ以上の励
起光の波長が、本発明に従うプロセスまたはデバイスに使用され得る。例えば、
2つ以上のレーザー波長(各々はバイオコンセントレーター−検体の複合体内の
異なる結合の共鳴を誘導し得る)は、RRSスペクトルを生成するために連続的
に使用され得、このスペクトルは「三次元スペクトル」を生成するために連続的
に収集され、処理され、そして分析される。別の実施例として、NRSスペクト
ルは、バイオコンセントレーター自体の状態をモニターするためにある波長で生
成され得、その間、共鳴は、所与の検体の感受性のあるRRS検出のための別の
波長において複合体化された検体部分に導入され得る。しかし、所望される場合
、単一の波長が確実に使用され得る。
形態または構成が、ラマン分析工程の間、本発明に従って使用され得、これには
、通常のラマン散乱(NRS)、共鳴ラマン散乱(RRS)、表面増強ラマン散
乱(SERS)、表面増強共鳴ラマン散乱(SERRS)、電極と結合されたS
ERSまたはSERRS、干渉性アンチストークスラマン分光法(CARS)、
刺激ラマン利得(SRG)、逆ラマン分光法(IRS)、分子光学レーザー検査
器(MOLE)またはラマンマイクロプローブまたはラマン顕微鏡法または共焦
点ラマン顕微分光法、三次元(3−D)ラマンまたは走査ラマン、ラマン飽和分
光法、時間分解共鳴ラマン、ラマンデカップリング分光法、UV−ラマン顕微鏡
法、および/または超ラマン散乱が挙げられるが、これらに限定されない。同様
に、ラマン分析工程の間に利用されるラマン分光ハードウェアおよび成分は、方
法またはプロセスまたは装置またはデバイスのための所望されるパラメータ(例
えば、所望される感度、特異性、精度、および応答時間、使用されるべきレーザ
ー波長およびモニターされるべき得られる周波帯(waveband)、使用さ
れるべきバイオコンセントレーターの数および検出されるべき検体の数、所望さ
れるサイズ、重量、およびシステムの耐久性、標的調達コストおよび/または作
動コストなど)によって課せられる制約に依存して、バンドパスフィルターシス
テム、フィルター−グレーティングまたはプリズム−グレーティング分散システ
ム、マルチチャンネルシステム、走査マルチチャンネルシステム、またはマルチ
プレックス分光器(例えば、Hadamard変換システムまたはFourie
r変換システムまたは定常変換システム)、音響−光学システムもしくは一体型
光学音響−光学システム、画像システム、またはマイクロプローブシステムもし
くは顕微鏡システム、またはファイバー光学システムを含むが、これらに限定さ
れない列挙から選択され得る。各々の場合において、ラマン分光器システムまた
はサブシステムは、バイオコンセントレーターまたはバイオコンセントレーター
−検体複合体または生物学的物質から発せられた放射をその入力として受容し、
それを処理し、そしてその出力を集束し、光学シグナルを電気シグナルに変換し
得る検出器(単数または複数)上に当てる。好ましい形態はマルチプレックス設
計またはマルチチャンネル設計であり得、これらのラマン分光器設計は優れた応
答時間および感度を提供し得る。別の好ましい形態は画像化設計であり得、これ
らのラマン分光器設計は多くの異なる検体の同時検出および同時同定のためのバ
イコンセントレーターのアレイの使用を可能にする。超微量検体検出に対して、
好ましい形態はまた、画像化ラマン分光器システムに組み込まれようとなかろう
と、マイクロプローブまたは微顕微鏡法技術および装置の使用を含み得る。それ
にも関わらず、他の適用に対して、はるかに単純でかつ低コストのアプローチが
好ましくあり得る。例えば、単一の検体が重要であり分析されるべきサンプルが
比較的清浄でありその組成において一貫している場合、たった1つまたは幾つか
の周波帯がモニターされるべきであり、バンド−パスフィルターが選択の設計で
あり得る。例えば、チャコールフィルターを通して分解する窒素マスタードの検
出のためのラマンオプトロードにおいて、バンドパスまたは光学フィルター設計
が使用され得、バイコンセントレーターとしてDNAを使用し、1492cm-1 および1530cm-1のスペクトルラインをモニターする。
ナルは、生成したベースラインスペクトルと比較され、後に、バイコンセントレ
ーター、または前もって調製されこのような比較のためにラマンオプトロードの
メモリに保存された参照ラマンスペクトルのライブラリ、またはその両方と材料
を接触させる。本発明に従って、このライブラリは、例えば、完全に反応性のバ
イコンセントレーター、分解されたまたは変性されたバイオコンセントレーター
、種々のバイオコンセントレーター−検体複合体(定量的分析で種々のバイコン
セントレーター/検体濃度比であり得る)、および/またはバイオコンセントレ
ーター−干渉物複合体からのスペクトルを含み得る。このスペクトル比較は、バ
イオコンセントレーターに結合した任意の検体を検出および/または同定および
/または定量するため、ならびに/あるいはバイオコンセントレーターまたは生
物学的物質自体の状態の任意の部分的または完全な変性、位置決め、または変化
を決定するための基礎として使用される。
3または第4の誘導スペクトル、または選択された波長モニタリング、または当
業者に公知である手動での適用に適切な他の型の操作および計算を含み得ること
に注意すべきである。好ましい形態において、差スペクトルは、一般的に、他の
形態の分析よりスペクトルの小さな変化に対してより感受性であるため、差スペ
クトルが使用される。異なるラマンコンフォメーションマーカーが、それらが互
いから器械的に分解され得ない点に重なり合う場合、例えば、デコンボリューシ
ョン、Fourierデコンボリューション、極大エントロピー、またはMon
te Carlo法のような操作が使用されこのようなバンドの分離を向上する
かまたは分解されたスペクトルをシミュレートし得る。本発明に従うスペクトル
分析は、当業者に公知である任意の適切なアルゴニズムまたはアルゴニズムの組
み合わせを使用して実施され得、これらには、例えば、類似性、相関、および距
離測定、確率ベースの整合のようなライブラリ探索法、適切なピーク探索、およ
び主成分分析、非線形人工神経回路網アプローチ、ファジー理論、またはデータ
融合、線形、古典的最小二乗法、主成分回帰、部分最小二乗法、多変量分析また
はパッチ多変量分析、あるいは標準加算技術などが挙げられるが、これらに限定
されない。
よびデバイスに対して、種々の較正手順が使用され得る。例えば、外部「標準」
が使用され得、この標準内の1つ以上のスペクトルバンドの強度はバイオコンセ
ントレーター−検体複合体のラマンスペクトルの1つ以上のラインの強度と比較
される。特に、この目的のために2つの検出器を利用するラマン分光器設計にお
いて、分割参照ビームまたは参照セルもまた、使用される。バイオコンセントレ
ーターの幾つかの部分が保護され得、その結果、それがサンプル/検体に対して
暴露され、そして曝露されるバイオコンセントレーターのスペクトルの1つ以上
のラインとの比較のために保護されたバイオコンセントレーターのスペクトルの
1つ以上のラインが使用される。なお別のアプローチにおいて、サンプリングお
よび分析の間、不変のままであることが既知であるバイコンセントレーターのス
ペクトルの1つ以上の波長が、検体との結合または変性または位置決めの際に変
化することが既知である1つ以上の1つ以上のラインと比較され得る。さらに、
バイオコンセントレーターおよび/またはバイコンセントレーター−検体複合体
のスペクトル内のラインは、本発明に従って、サンプルに加えられた内部標準の
スペクトルのラインと比較され得、および/または特定の目的のためにバイコン
セントレーターと共に固定され得る。
応容量分析に対して、種々の較正手順が使用され得る。例えば、外部「標準」が
使用され得、この標準内の1つ以上のスペクトルバンドの強度が、測定された生
物学的物質のラマンスペクトルの1つ以上のラインの強度と比較される。分割参
照ビームまたは参照細胞はまた、特に本目的のための2つの検出器を利用するラ
マン分光器設計において使用され得る。分析の間不変であることが既知である生
物学的物質のスペクトルの1つ以上の波長は、変性、酸化またはスピンまたは凝
集状態の変化、ペプチド骨格構造などの変化の際に変化することが既知である1
つ以上のラインと比較され得る。さらに、測定された生物学的物質のスペクトル
内のラインは、本発明に従って、特定の目的のために、サンプルに加えられた内
部標準および/または生物学的物質と共固定された(調製物が固定化された調製
物である場合)内部標準のスペクトルのラインと比較され得る。
l and uncommon)同位体を含有する分子を検出するために使用さ
れ得、すなわちこのラマンオプトロードが異なる化学種間を区別し得ることに加
えて、標識された分子と標識されていない分子との間を区別し得る。これらの同
位体は、放射性同位体、重水素または炭素−13のような「安定な標識」、また
はそれらの組み合わせであり得る。異なる化学物質の分析のように、異なる同位
体的に標識された種のラマンオプトロード分析は定量的かつ定性的であり得る。
したがって、このラマンオプトロード技術は、合成された標識調製物の純度を分
析するための迅速かつ単純な手段として使用され得る。ラマンオプトロード技術
はまた、分子内の正確な位置に標識が挿入されたことを確実にするために使用さ
れ得る。
ラマンスペクトルが得られ得ることに注意すべきである。ラマンオプトロードプ
ロセスおよびデバイスは、ラマンオプトロードプロセスまたはデバイスのために
意図される適用、および所望される情報の量に依存して、「完全な」スペクトル
、1つ以上の部分スペクトル、僅かなスペクトルバンド、または単一のスペクト
ルラインを生成し、モニターし、または分析するために設計され得る。さらに、
このプロセスおよびデバイスは、(a)検体のスペクトルの追加による新たなラ
インまたはバンド;(b)検体とバイコンセントレーターの活性部位との間で結
合することによって引き起こされるバイオコンセントレーター自体のベースライ
ンスペクトルの変化(例えば、三次元コンフォメーションの変化またはバイオコ
ンセントレーターの分子内相互作用によって引き起こされるスペクトルの変化)
;(c)検体がバイコンセントレーターと結合する際に形成される新たな結合ま
たは部分からのラマン散乱によって引き起こされる新たなスペクトルバンド;(
d)バイオコンセントレーターとの結合によって引き起こされる検体自体のスペ
クトルの変化;または(e)それらの幾つかの組み合わせ、をモニターし得る。
物学的物質と相互作用し得る因子であり、それによってその生物学的物質が部分
的にまたは完全に変性されるか、またはその酸化もしくは凝集もしくはスピン状
態が変更されるか、またはペプチド骨格構造が変化されるか、または生物学的物
質が固定されるなどの場合、生物学的材料またはその成分は、ラマン反応容量分
析技術を使用して分析される任意のプロセスまたはデバイスを含む。化学検体ま
たは微生物検体を伴う場合、乾燥し、粉末化され、結晶性の、粒子上の、部分的
または完全に水和されるかまたは可溶化され、懸濁され、または溶解される生物
学的物質について実施され得る。さらに、分析は、単一の生物学的物質または複
数の生物学的物質、および広範な種々の生物学的物質についてラマン反応性容量
分析が実施され得る。さらに、ラマン反応容量分析は、生物学的物質がその状態
または潜在的生物学的活性に影響を及ぼし得る1つ以上の因子と相互作用する場
合に実施され得;そして相互作用の程度(すなわちどのくらいの量の生物学的物
質が得られる形態の各々で存在するか)が定量的に測定され得る。
ントレーターの反応容量の変化に起因するラマンオプトロード応答に対する任意
の他の悪影響が自動的に調整されるように、設計され得る。スペクトル分析は、
バイオコンセントレーター調整物が不適切に製造されるか、または貯蔵と共に分
解するか、または使用中に変性し、もしくは消耗し、もしくは表面から浸出する
ことが示される事象において警告を生じ得る。さらに、ラマンオプトロードは、
化学検体または微生物検体の検出の間、スペクトル分析が変更された反応容量を
示す場合、そのサンプリング速度を自動的に調節し;結合動態が変更される事象
における定量的分析結果を調節するために数学的操作を自動的に実行し(すなわ
ち、部分的変性または部分的阻害または競合的結合またはpHの変動によるバイ
オコンセントレーター反応容量の変化を明らかにする);反応容量が受容可能な
最小値未満である事象において所定の多数または一部のバイコンセントレーター
を自動的に交換し;および/または例えば、pHまたはイオン濃度を調節するこ
とによってバイオコンセントレーターを取り囲む微小環境を変更するように、設
計され得る。本発明のこの局面は、ラマンオプトロードの誤りの警告速度および
信頼度の改良におよぼす主な影響を有し;また、生産、製造、および貯蔵手順を
単純化および改良する。
イオコンセントレーターであろうと、別の適用のために調整された生物学的物質
(例えば、他の型のバイオセンサーにおける使用もしくは生物学的成分を含む他
の型の検出プロセスにおける使用のために意図された生物学的物質、または製薬
および生体物質のような他の型の適用のために意図された他の型の生物学的調製
物)であろうと、製造および/または貯蔵および/または使用の間に生物学的物
質をモニターし、そして製造もしくは貯蔵を調節もしくは変更するか、任意の悪
影響を緩和するための条件を使用するために使用され得る。この生物学的物質は
、生合成された材料もしくは抽出物であり得、または乾燥され、精製され、凍結
乾燥され、結晶化され、または固定された調製物であり得る。例えば、デバイス
が製造ラインを終結し、そして任意の欠陥デバイスが拒絶される際に、最終「検
査(check−out)」の一部としての完成されたバイオセンサーデバイス
内の生物学的物質について自動的にラマン反応容量分析が実施され得;または製
造プロセスが満足に進行するかどうかを決定するために悪状態を検出し、悪状態
を変更または緩和するための手段を開始し、製造プロセスにおける所与の工程の
終点を検出し、そして全体の収率を改良および/またはコストを減少させるため
に製造プロセスにおける1つ以上の点で行なわれ得る。所望される場合、本発明
に従うラマン反応容量分析プロセスまたはデバイスは、生物学的物質の製造を自
動化および/または最適化するためにプロセス制御デバイスに入力を提供するた
めに使用され得る。
バイスまたはプロセス、または従来のバイオセンサーであろうと、種々の理由の
ために、先行技術の全てに対して優れている。
たは液体中の微量なレベルの検体の検出および同定のために、はるかに少ないリ
ソース(すなわち、より少ないトレーニング、より少ない工程、より少ない試薬
および化学物質、より少ない装備、および分析を完了するために必要とされるよ
り少ない時間)を必要とするという点で優れている。本発明は、例外的特異性(
バイオコンセントレーター結合特異性、ラマンスペクトルフィンガープリント、
および使用される場合、RRSおよび/またはSERSおよび/または3−D技
術のような追加の特異性を付与するラマン技術によって寄与される)を提供し得
るため、たとえあったとしても、僅かなサンプル調製が、従来技術による大規模
なサンプル精密検査を必要とする適用に必要とされる。SERS、RRS、SE
RRS、ラマンマイクロプローブまたはラマン顕微鏡法、刺激ラマン利得、また
は逆ラマンが利用される場合、ラマンオプトロード発明は、検出および分析に対
する従来のアプローチのいずれかによって達成される得る感度よりしばしばはる
かに良好な、同様にはるかに優れた感度を提供し得る。
プルの分析、または微量なレベルの検体の検出のための従来のラマン分光器の使
用に対して顕著に優れている。従来のラマン分光器は、分析のためのサンプルを
収集または濃縮する方法を有しない;それは、サンプルと接触するプローブまた
はサンプリング付属品のみを有するが、サンプルに含まれる成分と意図して相互
作用し得ない。よくても、ラマン機器は、サンプル中の成分を濃縮するための固
体吸収剤のような従来のサンプリングデバイスと結合され得る。しかし、上で議
論されるように、このような先行技術の吸収剤は多くのまたは大部分のサンプル
成分を濃縮し、それによって高いバックグラウンドノイズ、低下した感度、およ
び増加した誤りの警告速度を引き起こす。しかし、ラマンオプトロード発明は、
それが検体と特異的に相互作用し得、検体(バルク媒体から検体を物理的に分離
することを通して、または同様のシグナルを生成し得ない成分から検体を「単離
」する独特のシグナルの生成を通して)を単離し得、そして所望される場合、は
るかにより感受性であり特異的かつ迅速な検出および分析のために検体を特別に
収集し濃縮し得るバイオコンセントレーターを有するという点で、優れている。
本発明に従うデバイスは、このバイコンセントレーターがラマンオプトロードデ
バイス内の欠かせない成分であるように設計され得;またはこのバイオコンセン
トレーターがサンプルコレクターとして使用される別個のアイテムまたはデバイ
スであり、このサンプルコレクターが、バイオコンセントレーターによって収集
されるサンプルの後の分析のためのラマン分光器デバイスに後に取りつけられる
か、または挿入されるか、または保持されるように、設計され得る。
るが、それは検体が金属フィルム上に吸着するか、金属フィルムと完全に接触し
て保持されるいかなる様式も有しない。よくても、検体を含むサンプルは、金属
フィルムに適用されるが、金属上に吸着するかまたはその表面の数ナノメーター
内にある検体の一部からのシグナルのみが増強される。一般に、検体のバルクは
、バルク媒体中にとどまり、そこでその非増強シグナルは検出され得ない。さら
に、サンプル中の全ての他の成分は、同時に金属表面に適用され、そしてそれら
のラマンシグナルは同様に増強され;多くのこのような成分が微量な非検体のは
るかに過剰の濃度で存在するようであるため、それらのシグナルは、微量の非検
体からのシグナルははるかに過剰に増強され、それによって非検体シグナルに覆
い重なる。しかし、このラマンオプトロード発明において、バイオコンセントレ
ーターは、サンプルからの非検体の大部分または全てを収集しかつ濃縮するため
に使用され得、それは金属表面と接触するかまたは接近し、それによって非特異
的で可逆的な吸着に依存する従来のアプローチより、表面増強技術からの非常に
より高い感度を利得する。ラマンオプトロード発明において、非検体を除くサン
プル成分は、バルクサンプル媒体中に残存し、ここでそれらの不変のシグナルは
検出され得ない。先行技術のアプローチとして、検体を吸着させるためのポリマ
ーまたはクラウンエーテルコーティングの使用を含み、それを金属表面近傍に保
持し、幾つかの改良された感度および特異性を利得する。このラマンオプトロー
ドサンプリングアプローチは、生物学的物質と検体との間の結合、ポリマーまた
はクラウンエーテルが示すより検体に対してはるかに特異的でかつはるかに高い
親和力を有するプロセスを利用するという点で優れている。さらに、ある程度の
非特異的な吸着および/または吸着が合成コーティングと共に経られ;一方、ラ
マンオプトロードのバイオコンセントレーターコーティングは他のサンプル成分
による金属上への吸着を妨害し;そして当業者に公知の技術はバイオコンセント
レーター上への吸着を妨害するかまたは最小化するために使用され得る。
検体内の共鳴を発生するレーザーのみが感度および/または特異性を改良するた
めに選択され得る。しばしば、サンプルは検体と化学的に同様である他の成分を
含み;検体中の共鳴を誘導するレーザーはこれらの関連種内の共鳴または予備共
鳴を誘導することが予想され得る。これらの他の種からのより強力なシグナルの
発生は、バックグラウンドを増加させ、感度を減少させ、誤りの警告速度を増加
させる。他のサンプル成分がしばしば微量の検体より高い濃度で存在するため、
これらのより濃縮された成分からの共鳴または予備共鳴シグナルは、検体からの
共鳴シグナルに覆い重なることが予想され得る。本発明は、それが検体自体に誘
導される共鳴の代わりに、バイオコンセントレーターおよび/またはバイオコン
セントレーター−検体複合体に誘導される共鳴を利用するという点で優れている
。このバイオコンセントレーターはサンプルに含まれる種と化学的に非常に異な
る場合(しばしば、例えば、環境サンプル、工業的プロセスサンプル、現場空気
サンプル中にある場合)、バイオコンセントレーターおよび/またはその複合体
中の共鳴を誘導する波長は、他のサンプル成分中の共鳴または予備共鳴を誘導す
る可能性がない。さらに、3−D技術が本発明に使用される場合、ラマンオプト
ロードは、検体とバイオコンセントレーターおよび/またはバイオコンセントレ
ーター−検体複合体との両方において共鳴を誘導し得;従来のラマンアプローチ
と共に使用され得る付随のアプローチは存在しない。さらに、ラマンオプトロー
ドは、バイオコンセントレーターの活性部位で結合することによってのみ引き起
こされるバイオコンセントレーターのスペクトルの変化をモニターするように設
計され得るという点で優れており;この属性は、ラマンオプトロードが応答する
未知のものが実際に目的の検体であり、インターフェラント(interfer
ant)ではないという並外れた信頼性を提供する。
振動スペクトル分光法を使用する先行技術に対して優れている。第1に、ドイツ
のFTIRプロトタイプ微生物分析器および微生物を同定するための方法を開発
するための任意の他の努力は、サンプルを収集、精製および処理するための任意
の一体化された機構を考慮していない。全ての先行技術は、単離されたコロニー
をプレーティングおよび培養し、次いでこれらの単離された「精製された」コロ
ニーを分析のためにスペクトロメーターに移すというような扱いにくく時間消費
型の手順に依存する。このラマンオプトロードは、複雑なサンプルからの標的微
生物を本質的に収集および濃縮するためにバイコンセントレーターを使用し、そ
れによって任意のプレーティングおよび培養なしに、複雑なサンプルの迅速な分
析を可能にする。
の機構を提供しないため、一旦、標的検体の存在を検出するために所与のサンプ
ルの全ての微生物がプレーティングおよび培養されると、それらは分析されなけ
ればならない。他方で、ラマンオプトロードは、バイオコンセントレーターと結
合し得る微生物のみを単離し、それ故に、微生物と結合し得る微生物のみが分析
される必要がある。第3に、先行技術は、任意の所与の型の微生物を特異的に単
離する任意の方法を提供しないため、振動スペクトル分光器(IRまたはラマン
のいずれか)に提示される任意の微生物のスペクトルは、所与のサンプル中に存
在し得る実質的に全ての微生物の参照スペクトルに対して比較されるべきである
。非常に複雑かまたは高度に可変性のサンプル(例えば、環境サンプルまたは臨
床標本)の場合、存在し得る異なる微生物の数は、数十万程度である。このよう
なデータベースを開発するために必要とされる試みは過大である一方で、「未知
の」サンプルの比較のための参照データベースを通して分類することが必要とさ
れるアルゴリズムが極度に複雑化される。高い信頼性で「未知」である」と同定
する適切なアルゴニズムが開発され得ることが考えることは困難である。このラ
マンオプトロードは、それが、例えば捕捉抗体の使用を通して、最も複雑化され
可変性のサンプルからでさえ少量の微生物のみを特異的に単離するための機構を
提供するという点で非常に優れている。従って、ラマンオプトロードのための参
照スペクトルデータベースは、バイオコンセントレーターによって捕捉され得る
それらの微生物のスペクトルを含むことのみを必要とし;そしてこのラマンオプ
トロードははるかにより容易に開発され得、従ってそのアルゴニズムははるかに
より単純であり得る。第4に、先行技術は、微生物のプレーティングおよび培養
、ならびに数十万の参照スペクトルに対して数千の「未知」の得られるスペクト
ルの精緻な比較に依存するので、単一の複合サンプルの分析は、作業に多くの日
数または週をとり得る。このラマンオプトロードは、バイオコンセントレーター
の「組込み(built−in)」サンプリング/収集/濃縮/精製効果によっ
て、高度に複雑なサンプルの分析でさえも、非常に迅速にかつ容易に達成され得
るという点で優れている。第5に、分析を行うために、先行技術の方法は、分光
器内の単一の点において、濃縮された標的検体の、シグナルを発生するのに十分
なバイオマスを必要とする。それを達成するための唯一の方法は、プレーティン
グおよび培養である。これは、追加の時間、労力、化学物質、および装置を単に
必要とするだけではなく;これは容易に培養されない特定の型の微生物、特に多
くのウイルスが検出または同定され得ないことを意味する。精緻な手動の精製/
分類工程なしに、花粉のような他の検体は同定され得ない。胞子のようなさらに
他の型の検体は、この胞子の発芽、後の培養によってのみ同定され得る。このラ
マンオプトロードは、それが不可欠なバイオマスを収集し濃縮するためにバイオ
コンセントレーターを使用し得;ウイルスのような頑強な検体の検出および同定
、および手動の分類または強制された発芽なしに花粉および胞子のような他の検
体の直接の検出および同定において使用され得る。
頼性を増強するための幾つかのさらなるアプローチを提供するといった点でドイ
ツのFTIR発明より優れている。幾つかの細菌成分は、分類学的にはるかに重
要な情報を提供せず、一方で、他の成分の存在および濃度は非常に広範囲に変化
し得る。IRは全てのサンプル成分(微生物または他)からの重なる寄与の合わ
さったスペクトルフィンガープリントを提供するため、個々の細菌からの寄与は
分解され得ず、それ故に、可変性成分は、スペクトルの可変性を引き起こし得、
この分析を複雑化し得る。ラマンオプトロードは、それがRRS、3−D分光法
、および/またはSERS、を個々にまたは集約的に開発し得、重要でない細胞
成分由来の「無意味」なスペクトルバックグラウンドを除去し得、異なる分類学
的に重要なマーカーからの重なる寄与を分解し得、そして感度を有意に増強し得
るという点で優れている。RRSは、膜、細胞、および組織内の個々の生物学的
高分子の選択的プロービングを可能にし、それによってラマンオプトロードの特
異性および感度を増強する。ドイツのFTIR微生物検出器のようなシステムに
使用され得る付随の技術は、存在しない。ラマンオプトロードはまた、各生物か
らの1つ以上の二次元スペクトルを生成するために1つ以上のレーザー波長を使
用するために設計される得る。例えば、1つのレーザー波長は、NRSスペクト
ルを発生するために使用され得、検体からの総括的「複合した」フィンガープリ
ントを提供し;第2に、核酸内の共鳴を誘導するために使用され得;そして第3
に、続いて、タンパク質残基内の共鳴を誘導するために使用され得る。従って、
ラマンオプトロードは、重要な分類学的マーカーを選択的にプローブし、効率的
に重なり合うスペクトル情報の幾つかを「分解」し、それによってIRをベース
とするアプローチにおいて有効でない特異性の追加の層を提供するように設計さ
れ得る。さらに、ラマンオプトロードは、SERS現象を利用して、感度および
特異性を増強し得、そして同様にスペクトルの可変性を減少させ得るという点で
優れている。上で議論されるように、RNAおよびジピコリネート(dipic
olinate)のような幾らかの細菌細胞成分は、増殖サイクルにおける異な
る点の間、または異なる環境条件に起因して、相対含量が広範囲に変化し得る。
このような可変性は、細胞壁または膜からのスペクトル寄与より、細胞質成分か
らのスペクトル寄与に主に観察される。ラマンオプトロードは、それがSERS
を利用して、細胞表面構造からのシグナルを選択的に増強し得、それによってス
ペクトル可変性の主な原因を除去するという点で、優れている。ドイツの発明と
共に使用され得る付随の技術は存在しない。さらに、微生物の同定のためのSE
RSの使用をさらに含むラマン分析を利用する先行技術は存在しない。そして最
終的に、ラマンオプトロードは、ラマンオプトロード分析が完全に水と適合性で
あり、従って溶媒和種/懸濁種および乾燥された生物の直接的検出のために使用
され得るという点で、ドイツのFTIR発明より優れている。
する(すなわち、ラマンオプトロードが検体に対して特徴的かつ独特のシグナル
をモニターする)という点でバイセンサの分野における先行技術より優れている
が、先行技術は、検体の化学物質または構造と直接相関性を有さない非特異的シ
グナル(例えば、二次的な化学物質または試薬によって生じるシグナル)をモニ
ターする。さらに、従来のバイオセンサー技術は、警告を誘発するための単一の
シグナルの増加または減少をモニターする。本発明のラマン変換器は、検体自体
の化学物質から直接に出るまたは直接に影響されるシグナルをモニターし得るの
みならず、多くのこのようなシグナルをモニターし得(すなわち、本発明に従う
プロセスまたはデバイスは、複数の参照または「既知」のバンドに対して「未知
」からの複数のバンドを比較し得る)、そして「未知」のバンドの各々およびそ
れぞれの全てが警告または正の応答が誘発される前に参照バンドに対する相対強
度および波長の両方に対応することを要求し得る。このことは、ラマンオプトロ
ードが先行技術に属するバイオセンサーより実質的に優れた特異性およびはるか
に低い誤った警告速度を有することを意味する。
出しないような、存在する検体を同定し得;そして検体が生物学的成分の活性部
位において結合することをさらに確証し得る(先行技術は確証し得ない)という
点で優れている。このことは、ラマンオプトロード発明が、単一のバイオコンセ
ントレーターを使用して、複数の検体を検出および同定および定量し得;他のバ
イオセンサー技術が、複数の検体を同定および定量するために、全ての検体のた
めの異なる生物学的成分を利用しなければならないことを意味する。さらに、ラ
マンオプトロードは、1つ以上のバイオコンセントレーターと組み合わせた単一
の変換器を使用して、複数の検体の検出および同定および定量をし得;先行技術
のバイオセンサーが複数の検体のための定量的情報を生成するために各検体のた
めの別個の変換器を必要とする。さらに、検体を実際に同定するための能力は、
変換器応答においてより優れた特異性およびより高い信頼性を生じる。試薬また
は標識されたアナログが変換のために必要とされないため、ラマンオプトロード
バイオセンサー検出プロセスは、はるかにとり単純かつ迅速であり得;このプロ
セスは温度変化による変動の可能性を減少し得る。さらに、生成されるシグナル
のために試薬は必要とされないため、水の必要性がなく;従ってラマンオプトロ
ードプロセスは、空気から直接に蒸気を採取するために使用され得る。
オプトロードを較正することが可能であり;先行技術はこのような可能性を提供
しないという点で全ての先行技術のバイオセンサよりも優れている。これは、正
確かつ精密な定量的情報を提供する間、ラマンオプトロードが真に独立した操作
のために設計されることが可能であり;そして検出およびモニタリングデバイス
、および複数の個別のサンプルの迅速かつ信頼性のある分析のためのシステムま
たはプロセスの、設計および操作を大きく単純化するために使用され得る。
は、特許番号4,411,989号(1983年10月25日、「Proces
ses and Devices for Detection of Sub
stances such as Enzyme Inhibitors」,A
.Growに示されるプロセスである。このプロセスは、変換器としてIR分光
器に連結される、1種以上の酵素インヒビター(すなわち、検体)を捕捉するた
めに酵素を利用する。他のバイオセンサー変換器の先行技術と異なり、IR変換
器は、酵素活性を測定しないか、または反応生成物もしくは基質の存在をモニタ
ーしない。その代わりに、この変換器は、酵素それ自体のIR吸収スペクトルを
モニターし、そしてそのスペクトルまたは個々のスペクトルバンドの変化を「探
し出す」。これらの変化は、酵素−インヒビター複合体と直接関連している(す
なわち、特異的に検体それ自体との結合に起因する)。この特許は、IR/酵素
の発明が、いかなる理論によっても束縛されないが、IR光の吸収で観察される
変化は、酵素および検体の両方と異なる第3の物質の形成に起因しており、この
第3の物質は、特有のIR吸収スペクトルで反射されるそれ自体の同定可能な特
性を有すると考えられることに注目する。本発明者は、独特のスペクトルが、各
々の酵素−検体複合体に対して生成され得ると考えた。なぜならば、インヒビタ
ーは、酵素部分と永続的な1以上の共有結合を形成し得、このことにより、実質
的に酵素分子全体の化学特性を変化し得るからである。IR/酵素プロセスの発
明は、以前のバイオセンサーの先行技術を超える多数の利点を提供し、ここでこ
の変換器は、特有であり、そして酵素のスペクトルを変化させるために酵素と検
体との結合を必要とするが、この発明は、その能力および適用において厳格に限
定される。最も重要なことには、多くの化合物は、任意の公知の酵素を阻害しな
い;従って、このIR/酵素プロセスを使用して、大部分の化学検体を検出し得
ない。微生物は、酵素を阻害しない;従って、このIR/酵素プロセスを使用し
て、微生物を検出し得ない。さらに、IR変換器は、酵素ににおいて、全ての非
対称的な結合の情報を発生するので、酵素−検体複合体から産生されるIRスペ
クトルは、多くのバンドが重なり合って極度に複雑である。このバンドからは、
間接的にまたは数学的に解析され得ない。この酵素−インヒビター複合体におい
て選択された部分または結合を精査する方法は、存在しない。従って、多くの適
用のために必要な特異性を得るために、酵素−検体スペクトルおよび酵素−干渉
物スペクトルが十分に異なる酵素を見出すことは、困難であり得る。さらに、I
R吸収変換器の制限された感度に起因して、このIR/酵素プロセスは、多くの
トレース検体検出適用に所望される感度のレベルを有さないかもしれない。水は
、幅広い波長領域に渡ってIRスペクトルと干渉するので、水性サンプルを分析
するためのその有用性は、厳しく制限され、そしてこのIR/酵素発明の意図さ
れる主要な適用は、空中の蒸気の直接の検出である。最後に、IR分光法は、光
の吸収に基づいているので、IR光は、このIRが放出と検出との間で酵素−イ
ンヒビター複合体以外の、いかなる強く吸収する物質も通過しないような方法で
、酵素−インヒビター複合体に導入されなければならない。非常にわずかな物質
は、IR照射を透過する。従って、非常にわずかな物質は、IR光をサンプルと
接触するようにするためのシステムを設計するのに使用され得る。一般に、IR
分光計によって分析されるべき任意の物質は、最後に、下地を施され、臭化カリ
ウムと混合され、そして薄いフィルムに圧縮され、これにIR光が照射される。
あるいは、少量の異なる塩は、IRスペクトルのいくつかのウインドウで透過さ
れ、そしてMIRプレートとして(すなわち、プレート上にコーティングされた
物質の分析において)使用され得る。しかし、適切な塩結晶は、非常に脆性であ
り容易に壊れる。そのためにこの結晶は、例えば、光ファイバーに使用され得な
い。さらに、適切な塩の多くは、容易に水に溶解され、このために、分析される
べき物質は、非極性有機溶媒中でMIRプレートに塗布され、次いで乾燥されな
ければならない。従って、IR/酵素プロセスに基づいた任意のバイオセンサー
用に可能な構成は、極度に限定される。
Rおよびラマン分光法が基礎とされる基本現象は、顕著に異なり、同様に2タイ
プのスペクトル情報を得るために使用される手順および機器も顕著に異なる。従
って、ラマンオプトロードは、得られ得る情報のタイプ、実施され得る分析のタ
イプ、および構成されそして使用され得る方法は、基本的に異なる。例えば、ラ
マンオプトロード発明は、生体物質と検体との間の共有結合に依存しないが、こ
のような結合は、必ず生じ得る;その代わりに、ラマンオプトロードは、生体物
質とそのリガンドとが相互作用する場合に生じ得る、種々の分子内相互作用およ
び分子間相互作用を活用する。この相互作用には、生体物質のペプチド骨格、ス
ルフィド結合、水素結合、アミノ酸残基の微小環境などの主な変化が挙げられる
。この変化は、活性部位またはリガンドからかなり離れており、IR分光法によ
って検出され得ない。従って、IR/酵素発明は、酵素インヒビターの検出にお
ける酵素の使用に限定されるが、このラマンオプトロードは、実質的に任意の検
体の検出において、バイオコンセントレーターのような実質的に任意のタイプの
生体物質を利用し得る。これらの製品には、所望であれば、化学物質および微生
物の両方、ならびにさらに死んだ微生物、および/または微生物のフラグメント
または非細胞成分が挙げられる。ラマンオプトロードはまた、水性サンプルをモ
ニタリングまたは分析するのに容易に使用され得る際に優れている。なぜならば
、水は、ラマン分光法とは干渉せず、IRとは干渉するからである。より重要な
ことは、2つのタイプの分光法の間の基本的な違いのために、ラマンオプトロー
ド発明は、得られるスペクトルを単純化および明確化および増強するための多数
の異なる技術を活用し得、個々の結合および官能基を精査し、これによって優れ
た特異性を提供する。例えば、ラマンオプトロードは、表面エンハンスメント、
共鳴、表面増強共鳴(surface−enhanced resonance
)、および3次元分光法を利用し得;IR/酵素バイオセンサーでの使用に利用
可能な比較可能な技術は存在しない。さらに、表面エンハンスメントおよび共鳴
の有効度に起因して、ラマンオプトロードは、しばしば数オーダーの規模および
IR/酵素技術よりも著しくより感受性であり得る。ラマンオプトロードは、さ
らにIR/酵素バイオセンサーよりも、ラマンオプトロードが、構成(例えば、
リモートサンプリングまたはサンプリングアレイを含む)のために光ファイバー
成分を利用する点で優れている。長距離(すなわち、数キロメータおよびさらに
数十キロメータ)を超えるラマンシグナルを送信し得る広範囲の光ファイバーが
、利用可能である。同様に、広範囲の強壮で安価な水溶性光導波管物質が、ラマ
ンでの使用に利用可能である。さらに、ラマンオプトロードは、光吸収現象でな
く光散乱現象に基づくので、ラマンオプトロードサンプリングは、バイオコンセ
ントレーター表面を直接、およびさらに離れて照会する(query)工程を包
含し得る;そしてこのようなラマンオプトロードは、IR/酵素バイオセンサー
で使用するには困難かまたは不可能である多くの構成で設計され得る。
手段(すなわち、バイオコンセントレーター)、ならびに生物学的成分の任意の
部分的または完全な変性、阻害、損失または破壊に起因する誤った警告または警
告の失敗が存在しないことを確実にするための手段を提供する。ラマンオプトロ
ードは、上記の点で、IR/酵素発明を含むバイオセンサー分野における全先行
技術よりも優れている。先行技術のバイオセンサー発明はどれも、上記の能力を
有さない。さらに、ラマンオプトロードは、(例えば、溶媒または補因子または
プロテアーゼの存在下または非存在下でのpHまたは温度の変化に起因する)バ
イオコンセントレーターの反応容量の変化を検出する能力において、特有である
。このことにより、正確または明確な定量測定が必要とされる場合はいつでも、
ラマンオプトロードが、これらの因子を考慮に入れることを可能にする。他のバ
イオセンサー技術は、生物学的活性の変化を計算するか、または特に、標的の検
体の存在以外の因子に起因して、生物学的成分の生物学的活性の変化が存在する
ことをさらに検出するために、定量分析の間に成される計算を自動的に調節する
ことが不可能である。
おいて使用される、各々および全バイオコンセントレーターは、生成の間および
使用の間に非破壊的に検査され得、バイオコンセントレーター調製物が完全に活
性であることを確実にする。上記の点で、ラマンオプトロード技術はまた、他の
全タイプのバイオセンサーまたは関連するアッセイよりも信頼できる。任意の固
定化が首尾良く実施され、所望でない夾雑物または副産物は存在せず、そして有
意な分解または混入は保存の間発生せず、同様にサンプルの環境が、バイオコン
セントレーターの実施においていかなる有害な効果も有さないことを確実にする
。バイオセンサー生物学的成分の他のタイプは、製造プロセスの成功および/ま
たは保存に起因する任意の分解を評価するためのバッチサンプリングおよび破壊
テストに依存することに焦点が当てられており、使用の間、モニタリングされ得
ない。
オプロロードは、抗体再生技術および可逆性技術の両方でかなりより効果的に使
用され得る。再生技術が使用される場合、このラマンオプトロードは、抗体の状
態をモニターするように設計され得、従って、定量検体分析の結果を調整し、こ
れによって、各々の再生サイクルにおいて変性される抗体の量の変化に起因する
任意の可変性を排除し;そしたまた、これにより抗体調製物が、置換されなけれ
ばならない点まで分解されるときを決定する。先行技術に基づくバイオセンサー
は、どちらもすることが不可能であり;従って、これらの結果は、各再生サイク
ルで受ける抗体分解の可変量に起因して、変化し;そしてこの抗体調製物は、そ
の容量が完全に分解されるかなり前の時点で処分されなければならず、このサイ
クルのいずれもが、分解されすぎる抗体を抗体を利用しないことを確実にする。
はまた、可逆性技術と非常に効率的に連結され得る。このラマンオプトロードは
、バイオアフィニティー(bioaffinity)技術と連結させた場合、先
行技術よりも優れている。ここで、他のバイオアフィニティーセンサーは、さら
なる費用および標識した高い重量のアナログを生成するのに付随した複雑性を必
要とする。このラマンオプトロードは、スペクトルの差を通じて、この検体と高
い重量のアナログとを区別することがすでに可能であり、そして付着されるべき
特定の標識を必要としない。同様に、RCRUベースのラマンオプトロードは、
さらなる複雑性および開発の費用ならびに結合したアナログを標識するためのプ
ロトコールを使用することを必要としない。なぜならば、このラマンオプトロー
ドは、すでに、結合したアナログまたは検体それ自体が、バイオコンセントレー
ターに結合されるかどうかを、ラマンスペクトル情報を通じて決定することが可
能であるからである。この検体それ自体が、アナログとして使用される場合でも
、このリンクを検体に付着するにより、検体の化学的性質(それ故、そのラマン
スペクトル)を変化させる。
ている。ここで、このラマンオプトロードは、任意の細胞の増殖または前濃縮(
pre−enrichment)または培養を必要とせず;そして分析は、先行
技術の技術によって必要とされる数時間〜数日でなく、数秒内で完了され得る。
さらに、ラマンオプトロードは、死んだ細胞または細胞の一部、ならびに生細胞
を検出し得、さらに、生きた検体と生きていない検体とを区別し得、このことは
、先行技術では、実行不可能である。
の先行技術よりも優れている。ここで、ラマンオプトロード分析は、生物学的活
性を測定するのではなく生体物質の反応能力を決定する。ラマンオプトロードの
反応能力の決定は、非破壊的であり、それ故に、生物学的活性を測定するための
手順または技術が異なる。ラマンオプトロード反応能力分析は、個々のサンプル
またはアリコートの代わりに、生体物質の全ロットまたはバッチで実施され得る
。さらに、ラマンオプトロード反応能力分析は、生体物質の処理の間中、連続的
に「実時間」バイアスで実施され得る;これに対して、生物活性を測定するため
の先行技術は、時間がかかりそして面倒であり、そしてこの結果は、数時間また
はさらに数日かけて利用可能ではない。さらに、ラマンオプトロード反応能力分
析は、生物学的活性を測定するための先行技術のような、いかなるさらなる試薬
も必要としない。最後に、そしておそらく最も重要には、ラマンオプトロード反
応能力分析は、(潜在的な)生物学的活性の変化(例えば、変性が生ずる様式、
所与の生体物質の酸化状態、ヘムのスピン状態、および/または凝集状態の変化
、補助因子の損失、ペプチド骨格のなど変化、あるいはそれらのいくつかの組み
合わせ)の根拠の情報を提供し得るという点で優れおり、これにより正しい測定
が実施されるのを可能にする;一方で(実際の)生物学的活性を測定するための
先行技術は、変化が生じたことを単に決定するが、その原因または根拠のような
いかなるの情報も提供し得ない。
来の検出技術および/またはモニタリング技術および/または分析技術より優れ
ており、広範なサンプル構成が、本発明で可能でありる。先行技術を基礎とする
手順またはデバイスで通常可能であるよりも、かなり広範な適用でラマンオプト
ロードプロセスまたはデバイス(特に、他のバイオセンサープロセスまたはデバ
イス)を設計し、そして従来のサンプリングアプローチよりも有意な利点を有す
るサンプリングアプロ−チを使用することが可能となる。ラマンオプトロードは
、例えば、クォーツファイバーバンドルのような従来の固体吸収体サンプリング
システムと外見上類似したサンプリング構成を利用し得る。好ましい実施形態に
おいて、例えば、ラマンオプトロードサンプリングシステムは、長い光ファイバ
ー導波管からなり得、SERS活性金属フィルムおよびバイオコンセントレータ
ーでのみ「覆われ」て、次いで、束ねられるかまたは巻かれる。本発明のこの構
成は、広い表面積および低い圧力ドロップ(drop)(例えば、クォーツファ
イバーバンドルによって達成されるもの)を最適の高容量のサンプリングに提供
する。しかし、ラマンオプトロードサンプリングシステムは、クォーツファイバ
ーバンドルよりも優れているが、ラマンオプトロード発明は、検体分子を特定の
結合メカニズム(すなわち、バイオコンセントレーターとの相互作用)により収
集しそして濃縮する。これにより、所望でない潜在的干渉物;クォーツファイバ
ーバンドルの濃度を最小にし、一方、非特異的な吸収メカニズムを利用し、そし
て多くのまたはほとんどのサンプル成分および検体を濃縮する。ラマンオプトロ
ード光ファイバーにおいて、レーザー光は、多重内部反射(MIR)のかすかな
波を介してファイバーを通って伝達し得、そして光ファイバー表面上のバイオコ
ンセントレーター−検体複合体と相互作用し得る。光が、MIRまたはかすかな
波を介してバイオコンセントレーター−検体複合体と12回またはさらに数百回
相互作用するので、感度が非常に増強され、さらに各相互作用でシグナルを増強
する;クォーツ光ファイバーについては、存在しない。ラマンオプトロードにお
いて、濃縮検体をファイバーの外にフラッシュし、またはその検体を検出器に移
動させる必要はなく(クォーツファイバーバンドルには必要である)、その代わ
りに、この検体は、そのバンドル形態で分析される。それ故、クォーツファイバ
ーバンドルに必須の脱着/フラッシュ工程の間に受けるような、ラマンオプトロ
ードでの収集の後の検体の損失は、存在しない。さらに、分析は、ラマンオプト
ロード光ファイバーコイルにおいて続けられ得、一方で、バッチサンプリング/
分析のみが、クォーツバンドルで可能である。そして、ラマンスペクトルを使用
して、ラマンオプトロードでのバイオコンセントレーターをモニターし得るので
、直接的または連続的にラマンオプトロードサンプリングシステムが、完全に反
応性であり、そして検体と結合し得るかどうかを決定することが可能であり;一
方で中毒または分解された吸着性能力は、較正のための外部分析物標準を使用し
ない従来のクォーツファイバーバンドルサンプリングシステムで決定され得ない
。
が、「スポット」のアレイでコーティングされ、バイオコンセントレーターを含
む各スポットは、粗い金属フィルム上で固定化される。このディップスティック
は、液体サンプル中に浸けられるか、または表面を塗布するために使用され、こ
れにより、ディップスティック上のバイオコンセントレーターとの複合体に対し
て、サンプル中または表面上で多数物を分析を可能にする。ディップスティック
は、実質的に、画像化ラマン分光計を含む読み出しシステムに挿入される。この
画像化ラマン分光計は、ディップスティック上のアレイにおいて、バイオコンセ
ントレーターの各々から個々のスペクトルを同時に収集し得る。これにより、こ
のラマンオプトロードディップスティックは、サンプル中に存在する各個々の構
成成分に関連する個々のスペクトル(他のサンプル構成成分からのスペクトル寄
与の干渉のない各個々のスペクトル)の同時収集および分析を可能にし、これに
より、単一サンプル内の多数の検体の同時の特異性検出および同定および定量を
得る。一方、従来のラマン分光計は、分光法の構成を使用したとしても、全ての
サンプルスペクトルの重なり合ったスペクトルから構成される非常に複雑な単一
のスペクトルの収集のみを可能にする。さらに、本発明の種々のバイオコンセン
トレーターの下に敷いた金属フィルムの各々を、金属組成および粗野特性の両方
で個々に作製し得、金属フィルム上に固定化されるバイオコンセントレーターに
対して選択的および特異的および個々にSERS現象に起因してシグナル増強を
調節する。これは、本発明が、シグナルサンプリングおよび分析事象の間に種々
の検体に対して広範な感度および特異性を示すことを可能とする。一方、SER
S分析に対する従来のアプローチは、単一の金属コーティング表面の使用を含み
、その結果1つのサンプル構成成分からのシグナルの増強が、別のサンプル構成
成分からのシグナルの増強と正確に同じ特徴を有する、正確に同じ金属表面によ
って影響される。
は、限定の意味ではなく例示を意図している。先行技術の方法およびデバイスよ
りも優れた能力および改善された遂行を提供する、より改善されたプロセスおよ
び装置が提供される。
。第1の工程は、サンプルをバイオコンセントレーターと接触させる工程、例え
ば、任意の検体がサンプル中に存在する場合、少なくともいくらかの検体がバイ
オコンセントレーターと結合し、これにより、バイオコンセントレーター−検体
複合体を形成するというような方法を含む。第2の工程において、バイオコンセ
ントレーターおよび/またはバイオコンセントレーター−検体複合体は、ラマン
散乱スペクトルを発生させるのに適した1以上のレーザー波長のような照射光に
曝露される。次いで、第3のラマン分光学的技術を使用して、スペクトルバンド
を収集しそして処理し、光シグナルを電子シグナルに変換するのに適した検出器
でこれらのバンドに焦点を合わせる。第4の工程(最終工程)において、電子シ
グナルを、1以上のベースラインスペクトルと比較して、検体の存在および/ま
たは同一性、ならびに所望であれば、量を決定する。さらに、所望であれば、こ
の比較はまた、バイオコンセントレーター自体についての情報(すなわち、バイ
オコンセントレーターが、十分に反応性であるか、または分析検体が改変されな
ければならない点もしくはバイオコンセントレーターが取り換えられなければな
らない点で分解されるかどうか)を提供し得る。次いで、この情報は、検体の検
出および分析に使用される手順を調節または改変するために使用される。ベース
ラインスペクトルは、サンプルをバイオコンセントレーターと接触させる直前に
バイオコンセントレーターのラマンスペクトルを単に取るだけで、検体検出と同
じ時間で作製され得る。あるいは、より多くの情報が所望される場合、このベー
スラインは、モデル参照ラマンスペクトルのライブラリであり得、このスペクト
ルは、反応性および非反応性または部分的に反応性の形態のバイオコンセントレ
ーターから、および「既知」のバイオコンセントレーター−検体複合体から予め
生成され得、そして次いでこのような比較のためのラマンオプトロードメモリー
に保存され得る。
サンプルをバイオコンセントレーターと接触させるための方法またはメカニズム
またはデバイス;光源(例えば、バイオコンセントレーターおよび/またはバイ
オコンセントレーター−検体複合体および/または検体からラマン散乱を発生さ
せるのに適切なレーザー);光学情報を処理し、その情報を電子シグナルに変換
するのに適切なラマン分光計;ならびにモデル参照スペクトルのライブラリを保
存し、そしてラマン分光計によって発生される「未知」のサンプルスペクトルを
比較しそして分析するのに適したシグナル分析装置または手順またはメカニズム
。この方法によって、複合検体を検出および/または同定および/または定量し
、そして/あるいはバイオコンセントレーター自体の状態を評価する。この発明
はまた、警告、ディスプレイ、プリントアウト、コンピュータまたは制御器への
シグナル、あるいはラマン分析の結果に対する告知または存在または送信または
応答のための他の形態を発生するための方法またはメカニズムまたはデバイスを
含む。付属成分またはサブシステムとしてはまた、所望されるかまたは必要な場
合、例えば、以下が挙げられ得る:温度、pH、湿度、固有圧(例えば、詰まっ
たフィルターの表示)などをモニタリングおよび/または調節するためのデバイ
スまたは成分;バッテリーまたは他の電力源;データを入力するためのキーパッ
トまたは他のメカニズム;運搬ケースまたはハウジング;較正手順のための内部
標準を追加または測定またはモニタリングするためのメカニズムまたはデバイス
など。
めに、本発明の好ましい形態を例示する。例示の目的のために、この形態として
は、水中のフェノールおよび/または置換フェノールの検出が挙げられるが、本
発明は、それらの被検体に限定されなく、溶解、懸濁または水和された被検体に
も限定されなく、示された配置にも限定されないことが理解される。
有する水は、機構(例えば、液体ポンプ25)により、本発明を通して汲み出さ
れ、この水は、まず水からの汚物、花粉および破片のような懸濁された微粒子を
第1に取り除くフィルター13を好ましく通過し、次いで、排出される前に、可
撓性テープ17を覆うか通るかまたは通りすぎる。可撓性テープ17(好ましく
は、多孔性であり、そして薄い、粗面な銀のフィルムで覆われる)は、巻き取り
リール21および供給リール22で支持される。バイオコンセントレーター15
(好ましくは、酵素NADPHのオキシドリダクターゼの形態である)は、この
テープ上の銀フィルム中に固定化される。被検体を含有する液体が、テープに接
触する場合、水中に溶解されたフェノール分子は、テープ上の酵素に結合し、そ
れによって、少なくとも幾つかの溶解されたフェノールをテープのバイオコンセ
ントレーター上に収集および濃縮させる。
こでは、568nm)の照射31をバイオコンセントレーター上に投射するよう
に配置される。レーザー照射が、バイオコンセントレーター15上に当たる場合
、ラマン散乱スペクトル32(酵素−被検体複合体に特有である)が、生成され
る。この特有の発光スペクトルの照射は、光学分光器サブシステムを通過し、こ
のサブシステムは、例えば、コード信号34を生じるアダマール変換性液体結晶
化空間光モジュレーター(概して33に示される);ラマンコード信号を収集お
よび集束するオプティクス(概して35に示される);およびディテクター(概
して37に示される)を備え得る。ディテクター37は、光コード信号を電気信
号に変換し、この電気信号は、ソフトウェアプロッセッサ−40に送信され、こ
のソフトウェアプロセッサーは、発光された照射と参照スペクトルモデルのライ
ブラリー(示されるように)とを比較し、発光された照射が、所与の酵素−フェ
ノール複合体のスペクトルモデルと適合するか否か決定し、生成されるべきこの
スペクトルを生じるフェノールを同定し、そして必要に応じてその量を決定する
。ディスプレイサブシステム(アラーム52および/またはディスプレイスクリ
ーン51(これは、特定のフェノールの同一性およびその相対的量を示す)の形
態であリ得る)は、プロセッサー40のアウトプットに接続される。必要に応じ
て、結果のハードコピーのプリントアウト53は、例示されるように、提供され
得る。この全体のアセンブリは、当業者に明らかなように、適切なパッケージに
収容され得る。
続性ベースまたは周期性ベース上のレーザー30の光に曝される。ソフトウェア
プロセッサー40によって実施された分析は、発光スペクトルの照射が酵素−フ
ェノール複合体のスペクトルと適合するか否かだけでなく、発光スペクトルの照
射が完全な活性バイオコンセントレーターのスペクトルと適合するか否かまでも
決定する。発光スペクトルの照射の分析が、バイオコンセントレーターが、分解
され、変性され、不活性化され、消化され、別の阻害物質に結合されるかさもな
ければ、フェノールを結合することを不可能にされるかまたは可能でなくされる
と決定する場合、テープ17は、バイオコンセントレーター15の新鮮な供給部
が、引き続く分析間隔の間、水の流れに曝されるように進めれられる。
トレーターと共に固定化されたSO4−2としてここで示される)が使用され得
る。ラマン分析の間、内標準67は、バイオコンセントレーターが照射される場
合と同じ時間でそして同じ光源により照射され、そしてバイオコンセントレータ
ー−被検体複合体からのラマン散乱スペクトル帯域が生成、収集および処理され
る場合と同じ時間でそして同じ計測器により、内標準67からのラマンの散乱ス
ペクトル帯域は、生成、収集そして処理される(示されるように)。内標準から
の981cm−1ラインの強度と被検体のスペクトルからのキーラインの強度の
比は、モデル参照スペクトルのこれらのラインの比と比較して、当業者に既知の
定量的スペクトル分析方法論の適用により捕集された汚染物質の量を定量化する
ために使用され得る。
々のラマンスペクトルが、特有であるので、ラマンオプトロードは、単一の酵素
が複数の被検体を捕集するために使用され、そして単一の光学分光器サブシステ
ムが生じたスペクトル情報を収集および処理するために使用される場合でさえ、
複数の被検体を同定し得る。例えば、図2は、酵素NADPHオキシドレダクタ
ーゼが、バイオコンセントレーターとして使用され、そしてレーザーが568n
mで作動する場合、フェノールおよび置換フェノールの検出および同定のために
設計されたラマンオプトロードのライブラリーに含まれ得るモデル参照スペクト
ルを図示する。これらの共鳴ラマン散乱スペクトルから容易に分かり得るように
、酵素によって捕集された「未知」のフェノールの同定は、この酵素−「未知」
インヒビター複合体が568nmで作動するレーザーによって照射される場合に
生成される特有のスペクトルと、ライブラリー中の「既知」のNADPHオキシ
ドリダクターゼ−フェノール複合体スペクトルとの比較によって決定され得る。
、このテープは、その代わりに、他の物質(非汚染物質でさえある)に特異的な
酵素で覆われ得る。このテープが複数の被検体を収集および濃縮する酵素で覆わ
れるように記載される一方で、このテープは、特に、単一の被検体を収集および
濃縮する酵素で覆われ得る。このテープはまた、置換フェノールのような密接に
関係した被検体より、化学反応および配置においてより広範に変化する複数の被
検体の検出のために、他の型のバイオコンセントレーター分子(例えば、抗体ま
たはヘムタンパク、あるいはその混合物)または非タンパク質性バイオコンセン
トレーターでさえも覆われ得る。バイオコンセントレーターおよび、抗体−抗原
複合体、抗体−ハプテン複合体、酵素−インヒビター複合体、酵素−基質複合体
、酵素−補酵素複合体、または他のタンパク質−リガンド複合体の各々に関する
ラマンスペクトルの特有の帯域の特異性のために、1つまたは複数の被検体は、
1度に検出、同定そして定量され得る。
本発明に従って、図1中に例示されるような検出デバイスまたは示されるような
他のラマンオプトロードデバイスもしくは配置の中のサンプリングサブシステム
として使用され得る。図3aは、入口面を例示し、図3eは、排出面を例示し、
そして図3b〜3dは、取り外し可能なカセットの断面を例示する。このカセッ
ト55は、モジュラーハウジング56中に取りつけられる。このカセット中に、
テープ供給スプール62および巻き取りスプール64が、示されるように、ある
。このカセット55は、テープ区画66の液体への曝露を可能にするサンプル窓
68、および排出チャンバ69(チャンバを通って液体がポンプによって汲み出
される)を備える。各カセットの入口面71(図3a中に示されるように)は、
微粒子体(例えば、汚物、花粉および懸濁された破片)を除去するためのフィル
ターエレメント73を備える。取り外し可能なカセットモジュールは、Oリング
シール76によりラマンオプトロードハウジングに封鎖され、そしてラマンオプ
トロードハウジングの中のカセットの適切な配向のために局所スロット78を備
える。
に取りつけられ、スプリングバイアス(spring biasing)手段8
1を備える支持ロッド80は、取り巻きリールを巻きこむ傾向がある。このロッ
ド80の他の末端は、回転インピーダー(impeder)82を備え、これは
、このロッドのノッチに適合する。インピーダーが解放される場合、このスプリ
ングは、窓68の下の各テープの新鮮な区画をもたらすように、ロッドに予め決
定された量を回転させる。示されるように、テープ供給スプールはまた、支持ロ
ッド84に支持される。
ームおよび可聴式アラームが誘発され、そしてテープは、回転インピーダー82
への信号により進められ、その結果、曝されていないバイオコンセントレーター
の新鮮な区画が、次のサンプリングサイクルのためにサンプリング窓68に動か
される。同様に、ラマン分析が、バイオコンセントレーターが、被検体で変性、
分解または飽和されることを示す場合、このテープは、進められ得、その結果、
完全に活性なバイオコンセントレーターを備えるテープの新鮮な区画がこの窓に
曝される。このテープのすべての区画が曝され、そしてすべてのバイオコンセン
トレーターが使用または消費される場合、オペレーターは、処分カセットを除去
し得、そしてそれを新しいカセットと置換し得る。
示される一方で、固定化バイオコンセントレーターの多重の帯状片またはバイオ
コンセントレーターのスポットのアレイが、単一のテープ上で使用され得、そし
て照射を拡散するように曝され得、その結果、全ての帯状片またはスポットが、
同じ照射波長へ同時に曝され、そしてすべての生じたラマン帯域が、同時に収集
および処理される(例えば、画像化ラマン分光法の使用を通して)ことが、明ら
かである。バイオコンセントレーターの複数の帯状片またはスポットを備えるテ
ープが、走査型ラマン分光器によって代わりに走査され得ること;そして多重テ
ープが、所望のように使用および走査され得、そして同じ進行機構を用いて同時
に進められ得るかまたは異なる進行機構を用いて異なる時に進められ得るかのい
ずれかであり得ることも、明らかである。参照化学物質(すなわち、内標準)を
含有する分離性および識別性の帯状片またはスポットが、定量分析/較正の際の
使用のために、テープの中に組み込まれて示される一方で、多重参照化学物質を
含有する多重帯状片または多重スポットが、代わりに使用され得;または内標準
が、バイオコンセントレーターと伴に混合され得;そして異なる参照化学物質が
、異なるバイオコンセントレーターと伴に使用され得、バイオコンセントレータ
ーで混合または相互固定化され得るかまたは1つ以上の分離性帯状片または分離
性スポット上に固定化され得るかのいずれかであることが、明らかである。
従って、それによって検出され得る被検体に対応する)カセット(例えば、バー
コード、電気的接触のパターン、突出ピン、など(示されない))をコードする
ための手段が、カセット中に組み込まれ得、そしてラマンオプトロード電子工学
およびソフトウェアは、ラマンオプトロードが、このコードを「解読」し得、そ
してこのカセットがラマンオプトロードハウジングの中にある場合、実施される
ラマン分析を自動的に調整、改変または変更し得、そしてディスプレイまたはそ
れに従う印刷物を変化させ得るように、設計され得る。例えば、「コードA」が
カセット上にある場合、NADPHオキシドリダクターゼが、テープ上に固定化
され、そして測定されたすべてのスペクトルが、酵素およびそのフェノール複合
体の参照スペクトルモデルに対して比較されることを示し得る。測定されたスペ
クトルとモデルスペクトルとの間の任意の「決定的な」一致は、対応するフェノ
ールの同一性をディスプレイ上に提示させる。しかし、「コードB」が、カセッ
ト上にある場合、例えば、酵素(コリンエステラーゼ)がテープ上に固定化され
、そして測定された全てのスペクトルが、その酵素およびその有機リン複合体ま
たはカルバメート複合体の参照スペクトルモデルに対して比較され;そして測定
されたスペクトルとモデルスペクトルの間の任意の「決定的な」一致が、対応す
る殺虫剤または神経薬剤の同定をディスプレイ上に提示させること、を示し得る
。ラマンオプトロードは、バイオコンセントレーター、被検体、テープの配置(
例えば、テープの上に固定化されたバイオコンセントレーターの帯状片の数)ま
たはさらに、おそらく分析されるべきサンプルの型(例えば、ヒトの血または飲
料水が、神経薬剤に対して分析されるべきか否か)に従って、コードを処理する
ようにさえ設計され得、その結果、レーザーが、テープを照射するための異なる
波長に調整され、ポンプが、異なるスピードで操作され、スペクトルが収集およ
び相互添付される場合にわたる間隔が、調整され、分光器が、走査モードまたは
3−D操作モードなどに切り替えられる。
ために適合可能なものと置換することにより、同様なカセットが、使用され得る
。さらに、所望の場合、加湿器が、非常に乾燥した環境において空気をサンプリ
ングするように意図されるそれらのデバイスのために、カセット中に組み込まれ
、最適結合動力学を確実にし得る。加湿器(示されない)が、水リザーバーと同
様に単純であり得、そして水リザーバーと接触し、水リザーバーから好ましくは
フィルター73までまたはサンプリング窓中のテープの区画までへと導く芯と同
様単純であり得る。
テムは、任意のいくつかの形態をとり得る。本発明に従って、この同じデバイス
またはハウジング(例えば、光源、光学機器、検出器、および/または電子工学
製品)の中に物理的に取りつけされないかまたは封入されない表面上のバイオコ
ンセントレーターを固定化することが可能である。サンプリング(すなわち、分
析されるべきマトリクスのある部分を、被検体の少なくともある部分がバイオコ
ンセントレーターに結合されるような様式で、バイオコンセントレーターに接触
させること)が、サンプリング工程およびラマン読み出し工程のための別々の処
理および/またはデバイスを用いて、起こり得るか、あるいはラマン読み出し(
すなわち、バイオコンセントレーター−被検体複合体の照射、生じるラマン帯域
の分光学的分析、および捕集された被検体の同定への移行)から別々にかつ独立
して実行され得る。
備えられる部位から遠くに取り外される位置で、別々のサンプリングプロセスま
たはデバイスを用いて収集され得;そして収集されるサンプルは、標識またはコ
ードされ得、そして分析される前にある期間保存される。図4a〜4eは、分散
した空気のサンプル収集するための手持ちサイズのサプリングシステム155を
例示する。本発明の好ましい形態において、この手持ちサイズのサンプリングデ
バイスは、図3中に示される取り外し可能なカセット55および別々のラマン読
み出しデバイス(示されない)を組み合わせて使用される。図4aは、手持ちサ
イズのサンプリングシステムの断面図を例示し、図4は、手持ちサイズのサンプ
リングシステムの上面図を、そして図4cは、手持ちサイズのサンプリングシス
テムの側面図を例示する。サンプリングシステム155は、サンプリング窓12
7、ファン131およびモーター133を備えるハウジング121を備え、そし
てガス通路128が、ガスのテープ区画68への流れおよびファンによって吸引
される場合の排出ポート129の外への流れを可能にする工程を包含する。サン
プリングシステムはまた、空間を有するキャビティ135および電力供給バッテ
リー141のためのコネクター132;周囲温度を測定するためのサーミスター
のような手段142;ファンおよびカセットの中のテープを進めるテープ回転イ
ンピーダーを制御するための電子工学143;サンプリングシステムをオンにす
るためのスライドスイッチ122のような手段および各々のサンプリングサイク
ルを始めるためのプッシュボタン123、を備える。このサンプリングシステム
はまた、取り外し可能なカセット55を維持するキャビティ136を備える。取
り外し可能なカセットモジュールは、キャビティ中の位置誘導108およびカセ
ット中の位置スロット78によってキャビティ136中の位置に誘導され、そし
てカセットキャビティ中のOリングシール106およびカセット中の76によっ
てサンプリングシステムハウジングに封鎖される。ドア125および126は、
バッテリーキャビティ135およびカセットキャビティ136の内容物をそれぞ
れ隠し、そして保護する。
、テープ上に固定化されたバイオコンセントレーターの型(すなわち、バイオコ
ンセントレーターによってサンプリングおよび収集され得る被検体の型、ならび
にバイオコンセントレーターに結合され得る被検体の型)を示す。図4bに示さ
れるように、サンプリングシステムは、コードによって示されるように、カセッ
トによってサンプリングされ得る被検体を示すディスプレイ151を備え;この
コードを解読しそしてそれに応じてディスプレイ151を改変するためのサンプ
リングシステム内の手段は、示されない。このサンプリングシステムはまた、サ
ーミスター142によって測定される場合の周囲温度を示すディスプレイ152
を備え、そして/またはバッテリー141中に残存する電力が、最低レベルより
低いという表示を与える。
でスライドスイッチ122を「オン」の位置へ動かすことによりサンプリングシ
ステムをオンにする。このオペレータは次いで、プッシュボタン161のような
手段を用いて、収集されるべきサンプルの適切な量を設定する。このプッシュボ
タン161は、例えば、サンプルが収集されるべき期間(示されない)、ファン
が作動する速さあるいはその両方に影響を及ぼし得る。オペレーターによって選
択された期間は、ディスプレイ153中に示され得、そして不正確であるかまた
は変更されるべき場合は、手段162を用いてリセットされ得る。一旦サンプリ
ングの容量が設定されると、オペレーターは、サンプルを収集する用意ができて
いる。サンプルは、サンプリング窓127がサンプリングされるべき空気供給源
に近位になるようにサンプリングシステムを配置し、そして「サンプル」プッシ
ュボタン123を押すことによって、収集され得る。「サンプル」プッシュボタ
ン123が押されると、サンプリングシステムは、自動的にファン(それによっ
て、サンプリング窓およびテープを通って空気を引き、そして被検体をテープ上
のバイオコンセントレーターと接触させる)を開始し、そしてファンがオペレー
ターによって設定された期間作動した後、再びファンをオフに切り換え、次いで
結合していないバイオコンセントレーターを有するテープ68の新鮮な区画が、
サンプリング窓127に入るサンプルに曝されるようにテープを進める。
用のために、加湿器がカセットそれ自身またはサンプリングシステムのいずれか
の中に組み込まれ得ることが、明らかである。手持ちサイズのサンプリングシス
テムが、ファン/モーターを液体ポンプに置換し、そしてサンプリング窓にない
テープの区画が水との接触から保護されるように(例えば、水は、テープの隣の
区画に「流れ」得ないかまたはテープスプールを収容および保護するカセット中
の区分に浸透し得ない)カセットを設計することによって、空気サンプルの代わ
りに液体サンプルを収集するように容易に設計され得ることも明らかである。さ
らに、可撓性プローブが、サンプル供給源からの空気または液体をサンプリング
窓に方向づけるかまたは汲み出すためにサンプリングシステムに追加され得るこ
とが、明らかである。
」システム(示されない)が位置する場所に戻る。ラマン読み出しシステムは、
テープの移動の制御、テープの各々の区画からのラマンスペクトル情報の解析お
よび被検体の結果の表示またはプリントアウトの提供のために、光源、光学分光
器、ならびに電子工学製品およびソフトウェアを備え;そしてサンプリング窓1
27中のテープ区画が個々にかつ連続して分析されるために、テープカセットを
正しい配列に維持するように設計されるテープカセット分析アクセサリもまた備
える。本発明の好ましい形態において、このテープカセット分析アクセサリは、
粉末、結晶、液体、マイクロリットル未満容量の液体、固体、可撓性材料、繊維
および気体の分析のための近代のラマン分析実験器具の使用について利用可能な
サンプリング補体と設計において同様であり得る。これらのサンプリングアクセ
サリは、通常、光学機器を整列するための必要性を最小化または完全に排除する
ために、動力学的取り付けピンを使用して、サンプル区分中の再現可能なアクセ
サリの位置決めで迅速なアクセサリ交換を可能にする。次いで、本発明の好まし
い形態において、ラマン読み出しデバイスは、市販のラマン実験機器であり、そ
してテープカセット分析アクセサリは、市販のラマン分光器サンプリングアクセ
サリと設計において同様である。さらに、本発明に従って、特定のソフトウェア
パッケージが、テープ上のサンプルの分析を制御し、各々の汚染物質の存在およ
び同定を決定し、各々の汚染物質の濃度を計算し、そして各々の分析が完了され
る場合、サンプルからサンプルへテープを進めるために、使用され得る。このソ
フトウェアはまた、分析のプリントアウトを生じさせ得、そして/または各々の
サンプル中の汚染物質の同定および定量化を分光器のディスプレイスクリーン上
に示すディスプレイを提供し得る。
プリングデバイスが、ラマン分光光度計を収容する実験室に戻されると、オペレ
ーターは、サンプリングシステム155からテープカセット55を取り出し、カ
セットを本明細書中に記載されるラマン読み出しアクセサリの中に挿入し、そし
てラマン分光光度計をプログラミングして自動的にテープの各々の区画を分析し
、そしてオペレーターが選び出す各々の分析からの、分光光度計が示す情報の型
を提供する。カセットが、テープ上にあるバイオコンセントレーター(そしてそ
のために、このテープを用いることにより、検出および同定され得る被検体)を
示すためにコードされる場合、ラマン分光光度計読み出しシステムはまた、コー
ドを解読するための手段(本発明の好ましい形態において、これは、ラマン分光
光度計サンプリングアクセサリに設計される)を備え;そして電子工学製品おお
よびソフトウェアは、ラマン分析が、自動的にそれに応じて適合され(例えば、
比較が、ライブラリー中の異なるセットの参照スペクトルモデルに対して行われ
、そして定量的測定が、異なる較正標準に対して行われる)そしてディスプレイ
またはプリントアウトが、異なる被検体を反映するように変更されるように、設
計される。
おいて使用され得る;例えば、バイオコンセントレーターは、適切な導波管材料
(例えば、ファイバー光学導波管、または光学導波管結晶もしくは光学導波管プ
レートなど)の表面上に固定化され得る。図5a〜5dは、この配置のいくつか
を概略的に例示し、ここにおいて、光学導波管材料は、本発明に従って使用され
得る。図5aに示されるように、バイオコンセントレーター223は、例えば、
ファイバー光学導波管のチップにまたはこのチップ上に固定化され得;そして励
起光が、光源221から光ファイバー222を通ってバイオコンセントレーター
223まで伝播し得、そして生じたラマンスペクトルの情報が、同じ光ファイバ
ー222を通ってバイオコンセントレーターから分光計224まで伝わる。ある
いは、このバイオコンセントレーターは、図5bに示されるように、光ファイバ
ーまたは光学導波管プレートもしくは光学導波管結晶の一部、大部分またはすべ
てに沿って固定化され得;そして励起光が、光源221からエバネセント波(e
vanescent wave)231のような導波管材料222を通って伝播
し得、そしてスペクトル情報が分光計224によって収集および分析される前に
、導波管表面上のバイオコンセントレーター223と1回以上相互作用し得る。
いずれのアプローチにおいても、金属フィルム228は、バイオコンセントレー
ターが金属上に固定化される前に、導波管表面上で覆われ得、その結果、励起光
は、バイオコンセントレーターと接触する前に、金属フィルムを透過する。バイ
オコンセントレーターが、単一の生物学的成分であり得るか、または複数のバイ
オテクノロジー製品の混合物であり得ることは、明らかである。光学導波管がプ
レートまたは平らな結晶の形態である場合、複数のバイオコンセントレーターが
、このプレートまたは結晶の表面に沿って帯状片中に(または、この光学導波管
プレートまたは結晶の表面上の金属フィルムの帯状片上に)固定化され得、そし
てバイオコンセントレーターの各々の帯状片からのラマンスペクトルが、別々に
かつ独立して収集および処理され得る。
の表面(例えば、剛直な支持表面)上に固定化され得、そして光ファイバープロ
ーブによって応答指令信号を送られ得る。本発明に従って、アクセスし難い場所
に到達するように、長い可撓性の光ファイバープローブ(直径が小さい)を使用
することが可能である。例えば、このプローブは、光ファイバー導波管222を
備え、その先端部に小さなテープカセット245を備え得る(図5c中に概略的
に例示される)。このプローブは、蒸気のサンプルまたは液体サンプルが、この
テープと接触するように設計される。なお別の形態において、図5dに示される
ように、バイオコンセントレーターは、テープ(例えば、小さなビーズ266(
これは、例えば、金網状ケージ268によってプローブのチップに維持される)
)の他のある表面上に固定化され得る。光ファイバー導波管が使用される場合、
光源221からバイオコンセントレーターまで伝播する励起光211およびバイ
オコンセントレーターから光学分光計224まで伝播するラマン散乱光214の
両方は、同じ光ファイバープローブを通って反対の方向で伝播し得るが、異なる
ファイバーは、所望の場合、使用され得る。
ド検出システムまたはモニタリングシステムの内および一部のサンプリングサブ
システムにおいて使用され得る。あるいは、その固体支持体上のバイオコンセン
トレーターは、別々のサンプリングデバイスまたはシステムであり得るか、ある
いは別々のサンプリングデバイスまたはシステムにおいて使用され得、そして時
間および空間の両方において別々にされる場合、ラマン読み出しデバイスまたは
システムからのサンプル/被検体と接触させられ得る。
はスワッブなどとして使用され得る、サンプリングデバイスの、それぞれ頂面図
および側面図を示す。一旦、サンプルが収集されると(すなわち、デバイス上の
バイオコンセントレーターが分析されるべき物質に適切に接触されると)、この
サンプリングデバイスは、次いで、捕捉した検体の分析(すなわち、バイオコン
セントレーターまたはバイオコンセントレーター−検体複合体の照射、ならびに
ラマンスペクトルの収集、処理、および分析)のために、図6dに一般的に示す
ように、ラマン読み出しシステムに挿入され得る。図6aおよび6bは、比較的
平坦な支持部材426の形態でのサンプリングシステム425を図示し、これは
、少なくとも1つの表面428を有し、ここに、バイオコンセントレーター44
1が固定される。このバイオコンセントレーターは、上述した任意の物質または
その任意の組合せであり得;そしてこの支持部材の表面に吸着されるか、架橋さ
れるか、共有結合するか、またはトラップされ得る。この支持部材は、剛性でも
可撓性でもよく、そして多孔性(例えば、金属化濾紙)であってさえよい;この
支持部材は、これが曝露される放射線に対して透明であり得(例えば、光学導波
管プレートまたは結晶)、これによってこの放射線が、このバイオコンセントレ
ーターの下側429から投影され得る。被覆430(例えば、種々の金属および
合金(Ag、Au、Cu、Pt、Li、Na、K、Al、In、W、AgBr、
AgClおよびTiO2)の1つ以上)が、使用され得る。粗い表面を提供する
ための好ましい様式は、図6cに示され、ここで、サンプリングシステム425
は、すでに記載した支持部材426を備える。ここで、支持部材の表面の少なく
とも一部は、複数のマイクロスフィア468を備える。これらのマイクロスフィ
アは、例えば、100Å〜数万Åの範囲の直径を有する、ポリスチレン、ポリビ
ニルトルエン、ポリブタジエン、テフロン(登録商標)、アルミニウム、白金、
またはジルコニウムであり得る;しかし、一般に、5〜500nmの粗さ突出が
好ましくあり得る。次いで、ビーズをつけた(beaded)表面は、スパッタ
堆積金属箔469(好ましくは、銀、銅、または金)で被覆される。次いで、バ
イオコンセントレーターが、すでに記載されたように、この粗い金属表面に固定
され得る。この形態のラマンオプトロードサンプリングシステムは、図6aに概
略で示すように、上述のような定量的分析の目的で、光学的に透明な非透過性カ
バー451を使用して、バイオコンセントレーターの一部と検体との接触を防止
し得る。この構成のサンプリングシステムを、例えば、線量計バッジ、使い捨て
ディップスティック、サンプリングスワッブ、サンプリングフィルターなどとし
て、使用し得る。固定されたバイオコンセントレーターは、少なくとも1つのサ
ンプルに曝露され得る。例えば、バッジはある期間着用され得;ディップスティ
ックは液体または懸濁液に挿入されるかまたはそれを撹拌するために使用され得
、スワッブ(液体ありまたはなしで)は表面を拭くかぬぐうか擦るかするために
使用され得;液体サンプルがサンプリングフィルターを通して排液され得る、な
どである。分析されるべき物質に曝露した後に、このサンプリングデバイスは、
所望であれば、標識またはコードされて、後の分析のために保存され得る。次い
で、この構成のサンプリングデバイスは、当業者に明らかであるように、図6d
に略図で示す、ラマン読み出しシステム内のサンプリング用付属物に分析のため
に挿入され得るか、または光ファイバープローブスキャナ(図示せず)を備える
ラマン読み出しシステムを使用して分析され得るなどである。このようなサンプ
リングデバイスは、受動的または能動的な線量測定、実地サンプル分析、血液ま
たは尿の分析、微生物汚染に関する表面モニタリングなどに、有用である。
使用し得る。このような設計の1つにおいて、複数のサンプリングサブシステム
は、光ファイバーケーブルアレイを介してラマン読み出しサブシステムに接続さ
れ得る。図7は、例えば、不法な薬物または爆発デバイスのような隠された密売
品を検出するための、乗客スクリーニングポータルとして使用され得る構成の模
式図である。このポータルは、例えば、ブース645およびオペレーターステー
ション635から構成され得る。複数のサンプリングサブシステム601(各々
が、例えば、取外し可能なテープカセットモジュールを備える)は、示すように
、ポータルの内部の周囲の個々のサンプリング部位において一列で配置され得る
。個々のファンが各サンプリングサブシステムと連携し得、その結果ブースの内
部からの空気が引かれて、テープカセットの各々のバイオコンセントレーターと
接触する。あるいは、単一のファンが、単一のファンが適切な量のブース空気を
カセットの各々を通して引き、そこに含まれるバイオコンセントレーターと接触
させるように、設計された空気排気アレイと接続され得る。各サンプリングサブ
システム601は、光ファイバーケーブルアレイ621を介して、オペレーター
ステーション635内に収容されるラマン分光計に接続され、この光ファイバー
ケーブルアレイが、ブース内の各サンプリングサブシステム内のバイオコンセン
トレーターからのラマンスペクトルシグナルを、オペレーターステーション内の
ラマン分光計へと運ぶ。所望であれば、1つ以上のレーザーのような中心光源が
、オペレーターステーション635内のラマン分光計と共動し得、そして励起光
が分散され得、そして光ファイバーケーブルアレイ621を通って個々のサンプ
リングサブシステム601へと運ばれ得る。あるいは、複数の光源(例えば、1
つ以上のレーザーの各々)が、サンプリングサブシステムと共動し得る。好まし
くは、種々のサンプリングサブシステムからオペレーターステーションへと移動
するラマンスペクトルシグナルが、ラマン分析が実施される前に、ラマン分光計
サブシステム内の適切な光学機器の使用を通して、単一の光シグナルに組み合わ
せられる。あるいは、複数のサンプリングサブシステムからの複数のラマンスペ
クトルが、個々におよび順番に分析され得る。
ン635はまた、コントロールパネル634、視覚的警報631および/または
可聴警報632、ならびに/あるいはあらゆる検出された密売品の存在/確認を
示すディスプレイ633を備え得る;そしてサンプリングブースは、「STOP
」ライト603および「GO」ライト604を備え得る。ディスプレイ633は
また、必要に応じて、内部診断情報を示し得る。
灯するまで待つ。次いで、その乗客は、ブース645に入り、そしてその内部6
02に立つ。次いで、オペレーターは、コントロールパネル634に見られる「
ON」ボタンを押す。これにより、「GO」ライト604を消灯させ、そして「
STOP」ライト603を点灯させる(これによって、待ち列にいる次の乗客に
信号を送る);これによって透明なドアを、このブースの入口および出口を覆う
位置にスライドさせ;これによって複数のサンプリングサブシステム601に位
置するファンをオンにし、これらがブース内の空気をバイオコンセントレーター
を通してサンプリングサブシステムへと引き;これによってまた、次いで、種々
のサンプリングサブシステムからのラマンスペクトルシグナルを分析させる。こ
の分析が密売品の存在を示す場合には、検出された密売品の確認がディスプレイ
スクリーンに示され得、視覚的警報および/または可聴警報が鳴り得、そして/
またはシグナルがセキュリティー本部の警告システムに送られ得る、などである
。このラマン分析が、この乗客が密売品を何も運んでいないことを示す場合には
、透明なドアが自動的に開き、その乗客にそのブースを去らせ、そして「STO
P」ライトをオフにして「GO」ライトを再度オンにし、列にいる次の乗客がブ
ースに入るようシグナルを送る。
る反応性能力分析のために設計された、ラマンオプトロードのライブラリーに含
まれ得る、モデル参照スペクトルを示す。これらのNRSスペクトルから容易に
見られ得るように、変性熱の存在は容易に検出され得る。すなわち、2つのNR
Sスペクトルを比較する場合に、熱的に変性されたリボヌクレアーゼは、未変性
のリボヌクレアーゼから容易に区別される。比I832/I852およびI1000/I97 2 の相対強度はまた、酵素反応性能力の決定において、使用され得る。
範囲を例示するために与えられ、本発明を実施するために使用され得る特定の技
術および特定の構成を含む。これらの特定の実施例は、本願に記載される本発明
の範囲を限定することを意図されない。
としてDNAを使用し、そして2つのベースライン周波数帯をモニタリングする
ためにNRS技術を使用して、本発明によって検出され得る。マスタード糜爛剤
は、核酸およびポリヌクレオチドをアルキル化し得ることが公知である;そして
また、グアニン塩基およびそのメチル化誘導体が、異なる区別可能なラマンスペ
クトルを有することが公知であり、メチル化誘導体は、ネイティブなグアニン塩
基に見られる1488cm−1の強いバンドを欠く。C(8)−HをC(8)−
Dに置換することによって、1488cm−1のバンドが1645cm−1にシ
フトする;このことから、1488cm−1のバンドはN(7)=C(8)二重
結合伸縮であることが結論付けられる。従って、ここで、ラマンN(7)=C(
8)二重結合伸縮バンドのシフトが、ポリヌクレオチドおよび核酸のグアニン部
分をアルキル化し得る検体を検出するために、使用され得ることがわかる。例え
ば、DNAがメチル窒素マスタードに曝露される場合は、1492cm−1のバ
ンドの強度が減少し、そして1530cm−1にシフトする;この変化は、マス
タードによるグアニン部分のメチル化に起因すると考えられ得る。この薬剤に曝
露されたDNAにおいて、他の塩基のラマンバンドの変化は、何も観察されない
。従って、本発明に従って、2つのNRS周波数帯(すなわち、1492cm−
1および1530cm−1)がモニタリングされて、サンプルにおけるこの薬剤
の存在が検出され得る。
、アゴニストおよびアンタゴニストを検出および同定し得る。アルカリ処理した
、Torpedo marmorata電気器官由来のサブシナプス膜フラグメ
ントには、ネイティブな機能性アセチルコリンレセプター(AcChR)が豊富
にあり、これは、カルバミルコリンのようなアゴニストおよび(+)−ツボクラ
リンのようなアンタゴニストを検出および同定するために、使用され得る。51
4.5nmに調節されたアルゴンレーザーを使用して、レセプター膜調製物を照
射し得、そしてラマン分光計を使用して、400〜1800cm−1の領域を走
査し得る。レセプター調製物が曝露されたサンプル中の、カルバミルコリンの存
在は、二重線I879/I1443の相対強度が減少し;二重線I702/I710の相対強
度が増加してピークが702/710から700/718へとシフトし;939
/961の二重線が942/967へとシフトし;1084cm−1のピークの
強度が増加して1086cm−1へとシフトし;そして510/525/540
の三重線に変化がない場合に、検出され得る。サンプル中の(+)−ツボクラリ
ンの存在は、二重線I879/I1443の相対強度が増加し;二重線I702/I710の
相対強度が増加してピークが700/719へとシフトし;939/961の二
重線が935/957へとシフトし;1084cm−1のピークの強度が108
8cm−1へとシフトしてより強くなり;そして510/525/540の三重
線がブロードになって520/551/565にシフトする場合に、検出され得
る。
顕微分光分析)を使用して、異なる型の白血球(例えば、異なる型の顆粒球)を
同定し得る。多くの顆粒(高度に特異的な酵素を含む)が、顆粒球細胞質の内部
に存在すること、および異なる型の顆粒球の酵素的成分が、各型に類手独特であ
ることが、周知である。従って、顆粒を含む顆粒球細胞の部分のラマンスペクト
ルが、ここで、顆粒球の型について独特であることがわかる。ラマンオプトロー
ドのこの特定の実施例において、白血球が、シリカ表面に固定された合成ペプチ
ドバイオコンセントレーターによって、捕捉される。しかし、白血球に対して特
異的な抗体が代わりに使用され得、そしてこれらは、この応用に対して好ましい
バイオコンセントレーターである。異なる型の白血球(例えば、好中球性および
好酸性顆粒球)を検出および同定するために、ヒト末梢血液のサンプルが、固定
された合成ペプチドバイオコンセントレーターに塗布され、次いでリンスされる
。種々の型の顆粒球の核からのスペクトルは、本質的に同一であり得る;スペク
トルが核よりむしろ細胞質から取られたことを確実にするために、1094cm
−1の線を、DNAの指標として使用し得る。すなわち、このスペクトルが10
94cm−1において強い性を示す場合には、マイクロプローブの焦点を移動さ
せる。しかし、細胞質からのスペクトルは、600〜1700cm−1のスペク
トルウィンドウにわたって顕著に異なる。捕捉された好中球性顆粒球は、645
cm−1のピークがより強い645/673の小さな二重線;757cm−1に
おける中程度に強いピークおよび828/854における中程度に強い二重線;
1004cm−1のピークが982cm−1のピークよりずっと強い982/1
004における二重線;1108cm−1における中程度に強いピーク;112
9/1208における二重線、1307/1332/1361における三重線、
1502cm−1における一重線;1590cm−1がブロードであり、161
4cm−1が小さなショルダーであり、そして1667cm−1に中程度のピー
クである、1542/1590/1614における三重線により、同定され得る
。捕捉された好酸性顆粒球は、622cm−1における小さなピーク;645c
m−1のピークがより弱い645/675の小さな二重線;758cm−1にお
ける非常に強いピーク;837/854/880における非常に弱い三重線;9
82cm−1におけるピークが1004cm−1におけるピークよりわずかに弱
い982/1004における比較的強い二重線;1078cm−1における小さ
なピーク;1119cm−1における中程度のピーク;1212cm−1におけ
る強いピーク;1307/1340における二重線;1520cm−1における
中程度のピーク;1547/1614における非常に強い二重線;および166
2cm−1における小さなピークによって、好中球性顆粒球から区別され得、そ
して同定され得る。
質の非常に複雑なスペクトルを提供することが公知である。しかし、RRSは、
発色団バンドからのシグナルを、これらがそのスペクトルの唯一の特徴である点
にまで増強し得る;従って、RRSスペクトルは、バンド数がより少なく、ずっ
と簡単である。発色団に直接関連する振動モードは、106にまで高い因子によ
って、その強度が有意に増強されている。従って、RRSにより生じるスペクト
ルはより簡単であり、そしてより高い選択性ならびに大いに改善された感度が得
られ得る。従って、多くの応用において、RRSは、ラマンオプトロードプロセ
スまたはデバイスにおいて使用するための、好ましい技術であり得る。
化フェノールのような環境の汚染物を検出し、同定し、そして定量し得る。先に
議論したように、図2に示すように、酵素NADPHオキシドレダクターゼを、
フェノールおよびパラ置換フェノール(例えば、p−メチルフェノール、p−ク
ロロフェノール、p−フルオロフェノール、およびp−ニトロフェノール)を検
出するためのバイオコンセントレーターとして、使用し得る。酵素−検体複合体
は、568nmで作動するレーザーで照射され得、そしてRRSスペクトルが収
集され得、そしてウィンドウ350〜1050cm−1で分析され得る。RRS
スペクトルへの寄与は、ほぼ全体的に、酵素に結合する汚染物の存在に起因する
。フェノールの存在は、例えば、547、604、623、761、785、お
よび834cm−1でのRRSピークの生成によって、;p−メチルフェノール
は、405、477、520、723、7411、および752cm−1のピー
クによって;p−クロロフェノールは、390、608、および650cm−1
のピークによって;p−フルオロフェノールは、475、520、731、76
0、および835cm−1のピークによって;そしてp−ニトロフェノールは、
386、523、605、625、645、835、および855cm−1のピ
ークによって、決定され得る。検出に加えて定量が所望される場合には、共に固
定されるSO4 -2の内部標準を使用し得、そしてこの内部標準の線の強度対検体
のスペクトルの主要な線の比を使用して、捕捉された汚染物の量を定量し得る。
汚染物を定量するために使用され得る主要なピークは、内部標準からの981c
m−1の線;フェノールからの547cm−1の線;p−メチルフェノールから
の477cm−1の線;p−クロロフェノールからの390cm−1の線;p−
フルオロフェノールからの475cm−1の線;およびp−ニトロフェノールか
らの645cm−1の線である。
用して、RRS分析により検出され得る。この実施例においては、441.6n
mにおいて作動するレーザーが使用される。この波長での照射は、大部分のタン
パク質の共鳴を励起しない;なぜなら、通常のラマン散乱のみが、これらの条件
下ではタンパク質自体から観察され、酵素カルボニックアンヒドラーゼのような
検体の比較的高い濃度が、通常、ラマンスペクトルを生じさせるために必要とさ
れるからである。しかし、発色団リガンドバイオコンセントレーター(すなわち
、この波長で作動するレーザーにより共鳴が生じ得るインヒビター)をバイオコ
ンセントレーターとして使用する場合には、非常に低い量の酵素カルボニックア
ンヒドラーゼの存在が、本発明に従って検出され得る。カルボニックアンヒドラ
ーゼは、多数のスルホンアミド誘導体によって阻害されることが公知である;そ
して441.6nmで作動するレーザーは、スルホンアミドの共鳴を誘導する。
従って、カルボニックアンヒドラーゼの存在は、スルホンアミドバイオコンセン
トレーターのRRSスペクトルの特定の変化をモニタリングすることによって、
決定され得る。例えば、バイオコンセントレーター4−スルホンアミド−4’−
ヒドロキシアゾベンゼンに対する酵素の結合は、4−スルホンアミド−4’−ヒ
ドロキシアゾベンゼンの925cm−1の線の922cm−1へのシフト;11
23cm−1のバンドの出現;およびI1413/I1388およびI1134/I1138の相
対強度の増加によって、検出され得る。これらの変化は、結合しているスルホン
アミドの構造の変化に起因すると考えられる。あるいは、バイオコンセントレー
ター4−スルホンアミド−4’−アミノアゾベンゼンに対する酵素の結合は、9
28cm−1から926cm−1への4−スルホンアミド−4’−アミノアゾベ
ンゼンの線のシフト;1125cm−1のバンドの出現;ならびにI1426/I13 95 およびI1152/I1145の相対強度の増加によって、検出され得る。両方のスル
ホンアミド誘導体が、活性基(すなわち、ヒドロキシおよびアミノ)を、酵素結
合部位から遠位の末端に有し、これは、インヒビターを固体基材上に共有結合的
に固定するために、容易に使用され得る;そして本発明の好ましい形態において
は、スルホンアミドバイオコンセントレーターは、共有結合的に固定される。
ーとして発色団ハプテンを使用し、そしてハプテンの共鳴を励起するために45
7.9nmで作動するレーザーを使用して、検出および特異的に同定され得る。
(SERS技術を使用しない限り、検体が蛍光をクエンチする前に、ヨウ化カリ
ウムが、サンプルと混合されなければならない。)さらに、抗Dnp抗体は、(
1)形成する新たなピークの増加する強度またはシフトするハプテンのピークの
減少する強度の、(2)抗体が結合するときに強度が変化しないハプテンのスペ
クトルの周波数帯の強度に対する比を測定することによって、定量され得る。例
えば、2,4−ジニトロアニリンを、バイオコンセントレーターとして使用する
場合には、マウス腫瘍抗体MOPC 315 IgAおよびMOPC 460
IgAの存在および同一性が、1337cm−1のハプテンの線(これは、MO
PC 315が結合すると1331cm−1にシフトするか、またはMOPC
460が結合すると1325cm−1にシフトする);および1279cm−1
でのハプテンの線(これは、MOPC 315が結合すると1268cm−1に
シフトするか、またはMOPC 460が結合するとブロードになるかのいずれ
かである)をモニタリングすることによって、決定され得る。1394および1
355cm−1のハプテンのRRS線は、いずれかの抗体が結合する場合に変化
せず、従って、内部較正および両方の定量のために、使用され得る。1つのみの
抗体検体が存在すると予測される場合には、1337および1279cm−1の
線の強度の損失が、それぞれの定量のために使用され得る;いずれかまたは両方
が存在する場合には、1331および1268cm−1の強度の増加を使用して
、MOPC 315を検出および定量し得、そして1325cm−1の強度の増
加を使用して、MOPC 460を検出および定量し得る。
イオコンセントレーターのRRS分析を使用して、同様に検出され得る。例えば
、MOPC 460由来のFab’フラグメントが、pH4.5でのIgAモノ
マーのペプシン消化によって、調製され得る。調製物中の活性フラグメントの量
を決定するために、1337、1327、1279、および1273cm−1の
周波数帯がモニタリングされる。活性抗体フラグメントは、2,4−ジニトロア
ニリンバイオコンセントレーターに結合する場合に、1337cm−1の線を1
327cm−1にシフトさせ、そして1279cm−1の線を1273cm−1
にシフトさせる。
てさらなる分析のために、固定された調製物を2,4−ジニトロフェノールのよ
うなアナログでリンスすることによって、再生され得る。ジニトロフェノールは
、抗体の活性部位での結合についてジニトロアニリンと競合し、これによってこ
の抗体をバイオコンセントレーターから解放し、そして抗体−アナログ複合体が
リンス除去されることを可能にする。溶解した複合体のいくらかの少量でさえ、
固定したバイオコンセントレーターの近位に吸着する場合には、この複合体のス
ペクトルは、バイオコンセントレーター−光源複合体の独特のスペクトルから容
易に区別され得る。
コンセントレーターとして働き得る。好ましい形態においては、溶液中のジニト
ロフェノールの「リアルタイム」のモニタリングに適切であり、バイオコンセン
トレーターは、アナログのリジン部分に付着した可撓性ポリペプチド結合を介し
てDnp−L−リジンと結合するマウス腫瘍抗体MOPC 315 IgAから
なる。前述のように、457.9nmで作動するレーザーが、ハプテンの共鳴を
励起するために使用され、そして必要であれば、蛍光をクエンチするために、ヨ
ウ化カリウムが添加される。サンプル流がジニトロフェニルを全く含まない場合
には、1382、1338、および1315cm−1のRRSピークを観察する
ことにより決定され得るように、結合したアナログが抗体の結合部位を占める。
1つ以上の検体の濃度が上昇するにつれて、アナログが置換され、そしてそのR
RSピークが消滅する。Dnp−NH2の存在は、消滅するアナログのRRSス
ペクトル、ならびに代わりに出現する1393、1354、1331、および1
268cm−1のピークによって決定され得る。検体Dnp−NHCH3は、1
371、1340、および1308cm−1のピークの出現を引き起こす;一方
で、Dnp−N(CH3)2は、1367、1323、および1306cm−1の
ピークの出現を引き起こす。
ーとして働いた。あるいは、膜自体が、バイオコンセントレーターであり得る(
例えば、異なる型のビリルビンを検出および同定するため)。例えば、リポソー
ム−ビリルビン複合体が514.5nmで照射され、そして得られるRRSスペ
クトルが800〜1600cm−1のウィンドウで分析される場合に、スフィン
ゴミエリンリポソームが、バイオコンセントレーターとして使用され得、そして
RRS技術が、IXa、IIIa、およびXIIIaのようなビリルビンを検出
および同定するために、使用され得る。
標識された分子の検出および定量において(すなわち、合成プロセスの成功を決
定するために)、使用され得る。酵素チミジル酸シンターゼ(TSase)は、
補因子5,10−メチレンテトラヒドロフォレート(CH2−H4フォレート)を
メチル化剤として使用して、2’−デオキシウリジレート(dUMP)のチミジ
レート(dTMP)への還元的メチル化を触媒する。ヌクレオチドアナログは、
TSase活性を効果的に阻害することが見出されている;特に、5−フルオロ
−2’−デオキシウリジレート(FdUMP)は、TSaseおよびCH2−H4 フォレートとともに共有結合性三重インヒビター複合体を形成することが示され
ている。RRS技術は、標識されていない補因子の存在下でさえも、同位体標識
されたCH2−H4フォレートのラマンオプトロード検出および定量において、バ
イオコンセントレーターとしてのTSaseおよび337nmで作動するレーザ
ーと組み合わせられ得る。例えば、補因子のp−アミノベンゾイルグルタメート
(paba−glu)部分のpaba−ベンゾイルの位置の13Cおよびpab
a環上の3,5−位のDの両方が、酵素と複合体形成した標識されていない補因
子のRRSスペクトルに、600〜1600cm−1のウィンドウ内で大きな変
化を生じさせる。
レーターとして使用される合成ポリペプチドを用いて、細菌(例えば、Rhod
opseudomonas capsulata、R.spheroides、
およびRhodospirillum tenue)のラマンオプトロード検出
および同定において、使用され得る。この実施例において、ポリリジン臭化水素
酸塩が、吸着によってガラス基材に固定される。細菌の水性懸濁液が、バイオコ
ンセントレーターに導入される;そしてRRSスペクトルが、このバイオコンセ
ントレーターによって捕捉された細菌の488nmにおける励起により得られる
。マイクロプローブラマンシステムは、本発明を使用して、単一の微生物細胞ほ
どに小さなサンプルからのスペクトルを、生成および処理し得る。R.caps
ulataは、953、1002、1059、1151、1189、1459、
1514、1586、および1628cm−1におけるバンド形成によって同定
され得る。.R.spheroidesは、956、1001、1153、11
89、1257、1389、1425、1515、および1585cm−1にお
けるバンド形成によって同定され得る。;そしてR.tenueは、957、1
002、1046、1087、1149、1187、1199、1282、13
55、1440、および1509cm−1におけるバンドにより同定され得る。
比較的特異的でないバイオコンセントレーター(例えば、合成ポリペプチド)は
、特定の状況下(例えば、サンプルが適度に良好に特徴付けられ、そして存在す
るかもしれない微生物のほんの少数の異なる種のみが存在する場合;または多く
の異なる微生物が存在し得、そしてラマンオプトロード分析がこれらのいずれか
または全ての検出および同定を意図される場合(すなわち、目的の細菌すべてに
対して異なるバイオコンセントレーターを使用することが非実際的である))に
おいてのみ好ましいことに、注意のこと。しかし、大部分の応用について、本発
明の好ましい形態は、細菌検体に対するバイオコンセントレーターとして、目的
の特定の微生物に対して惹起される抗体を使用することである。
は核酸成分と共鳴する波長で照射される場合に、独特のRRSスペクトルを示し
得る。例えば、捕捉されて514.5nmで照射される場合に、糸状バクテリオ
ファージfd、Ifl、IKe、Pfl、Xf、およびPf3は、600〜90
0cm−1のスペクトル領域の別個のラマンバンド(これらは、タンパク質の芳
香族側鎖の分子振動およびカプシド化した一本鎖DNAゲノムの分子振動に帰属
される)から、検出および同定され得る。ウイルス検体は、本ラマンオプトロー
ドの発明に従って、例えば、抗体、レクチン、または病原体接着因子バイオコン
セントレーターにより捕捉され得る。広範にわたるヒト、動物、および植物の病
原体(リッケチアならびに細菌性およびウイルス性のもの)に対して特異的であ
る、多くの異なる抗体が、Linscott’s Directory(「Li
nscott’s Directory」、40 Glen Drive、Mi
ll Valley、CA94941)に列挙されるもののような供給源から産
生され得る。本発明の好ましい形態においては、抗体が、固体支持表面に固定さ
れ、そして検体微生物を含む材料が、この表面と接触される。代替の形態におい
ては、抗体は、液体サンプルに添加されて混合され、ここでこれらの抗体が、任
意の標的検体微生物と結合する。次いで、この液体サンプルが、固体支持体表面
に固定されたプロテインAまたはプロテインGに通される;複合体化した抗体の
Fc部分が、固定されたプロテインAまたはプロテインGに結合し、これによっ
てまた、抗体に対して複合体化された微生物が捕獲される。あるいは、病原体接
着因子は、細菌性、ウイルス性、およびリッケチアの疾患の検出および分析にお
いて、バイオコンセントレーターとして使用され得る。
NRSと結合してSERSを生成しても、またはRRSと結合してSERRSを
生成しても、特定の応用に利点を与え得る。代表的に、SERSは、NRSと同
じ情報を提供するが、より良好なレベルの感度で提供する;文献の報告は、SE
RSが、109もの因子でラマンシグナルを増強し得ることを示す。この増強効
果は、粗い金属表面に比較的接近するか、または直接接触する分子に関連し、こ
れによって、バルク材料からのシグナルによる干渉を排除する。さらに、SER
Sは、クエンチしなければ特定の分子または混合物のラマン分析と干渉し得る蛍
光をクエンチし、さらなる検体を用いて、またはさらなるレーザー励起波長を用
いて、あるいはより広いスペクトルウィンドウにわたって、作動することを可能
にする。文献は、一般に、SERS活性な金属としては、Ag、Au、Cu、P
t、Li、Na、K、Al、In、W、AgBr、AgClおよびTiO2(こ
れらに限定されなくてもよい)が挙げられることを報告する;銀は、可視スペク
トルの青色/緑色領域にその最適な増強を有し、一方で金および銅は、赤色に最
適な増強を有する。理論的な計算は、大きな増強が紫外、可視、および近赤外ス
ペクトル領域にわたって達成可能であることを予測する。100Å〜数万Åの範
囲の表面突出が、SERS現象を起こす際に有効であり得る;しかし、一般に、
5〜500nmの粗さ突出が、強力に増強されたシグナルを生成するために最良
であり得る。これらの表面の全てが、本発明に従って使用され得る。しかし、本
発明の好ましい形態においては、銀が使用され、突出の粗さは約200nmであ
る。粗い表面を調製する好ましい形態は、支持表面(例えば、紙テープまたはA
TR結晶)に堆積されるマイクロスフィアの使用により、次いでスパッタ堆積し
た薄い金属箔で被覆される。このマイクロスフィアは、例えば、ポリスチレン、
ポリビニルトルエン、ポリブタジエン、テフロン(登録商標)、アルミニウム、
白金、またはジルコニウムから作製され得る。例えば、銀の最終的な厚みは、最
適な結果のためには、約2,000Åであり得る。しかし、他の程度の粗さおよ
び/または他の金属(特に、金、銅、タングステン、または白金)が、いくつか
の応用において優れた結果を提供し得る;そして粗い金属表面を作製するための
ほかの方法、他の種類の支持材料(例えば、プラスチック、金属、またはガラス
が挙げられるがこれらに限定されない)、ならびに他の構成(例えば、小ビーズ
、光ファイバー、または平行プレートが挙げられるがこれらに限定されない)が
、本発明に従って使用され得る。さらに、金属表面は、酸化物層の電気化学的形
成を引き起こすよう処理され得、これは、いくつかの状況下においてなおさらに
シグナルを増強し得る。SERSおよびSERRS、ならびにNRSおよびRR
Sを、本ラマンオプトロードの発明に従って、液体洗浄工程を何も必要とせずに
、空気中の物質を直接モニタリング/検出するために、使用し得る。
表面に、共有結合(好ましくは、チオール−ジスルフィド交換)によって固定さ
れるが、当業者に公知の他の任意の適切な固定化手順が、代わりに使用され得、
この手順としては、例えば、他の共有結合、吸着、架橋と組み合わせた吸着、ト
ラップなどが挙げられる。分子またはこの分子内の部分は、SERS効果を示す
ために、粗い金属表面と直接的に接触する必要はない。しかし、表面からの距離
が増加するにつれて、増強因子は鋭く減少する。すなわち、この表面の約5nm
以内で、増強因子は1桁減少することが公知である。例として、代表的なIgG
抗体は、約6nm×10nmである;従って、この抗体が、SERS活性表面と
この抗体のFc部分との間の共有結合によって固定され、そしてこの抗体が固定
後に「立ち上がる(stand upright)」場合には、抗体活性部位は
、最大のSERS効果の範囲から5nm外側にある。しかし、十分に間隔を空け
て固定される抗体は、「傾く(lean over)」傾向があり、従って、そ
の活性部位が表面近くに存在する得ことが、公知である;文献は、銀に吸収され
た免疫グロブリンについて計算された厚みが50Åであることを報告する。たと
えそうでも、いくつかの場合においては、抗体分子全体よりむしろ、抗体フラグ
メントを付着させることが好ましい。このことは、SERS効果を最適化するの
みでなく、これはまた、バイオコンセントレーター調製物の安定性を改善し得る
。F(ab)2’フラグメントは、ヒンジのすぐ下で抗体を切断するペプシン消
化によって調製され得、一方でFab’フラグメントは、パパイン消化によって
調製され得る。
細胞が、SERS分析および核酸プローブバイオコンセントレーターの使用によ
って、検出および同定され得る。粗い銀表面に吸着された一本鎖ポリ(A)は、
514.5nmで照射されると、SERSスペクトルに735および1334c
m−1の2つの強いバンドを生じることが、示されている。ポリ(U)の添加は
、二重螺旋の形成を導き、本質的に両方のバンドを排除する;しかし、ポリ(C
)[これは、ポリ(A)と二重螺旋を形成しない]の添加は、一本鎖ポリ(A)
のSERSスペクトルに最小の効果を有する。従って、一本鎖核酸が核酸プロー
ブと共に二重螺旋を形成する程度は、アデノシン塩基に関連するバンドを分析す
ることによって、決定され得る。一本鎖核酸に熱的に変性したSigmaからの
ウシ胸腺DNAは、734および1134cm−1での強いSERSシグナルを
生じる;二重螺旋のネイティブDNAは、より強度が低いバンドを生じる。次に
、ラマンオプトロードを、微生物または生存細胞の検出および同定のために使用
するために、一本鎖核酸プローブバイオコンセントレーターが、当該分野におい
て公知の方法によって、「既知の」微生物または細胞DNAから調製される;次
いでバイオコンセントレーターが、粗い銀表面に共有結合的に固定され、そして
これらのスペクトルが、ライブラリーに入る。「未知の」サンプル内の微生物ま
たは細胞物質を同定するために、このサンプルのアリコートが、任意の細胞内容
物を破壊するために適切な様式で処理され(例えば、全ての微生物または細胞を
溶解する)、次いで適切な制限エンドヌクレアーゼ酵素を使用して、当業者に公
知であるような手順を使用して、任意のサンプル核酸内容物を消化する。消化さ
れたサンプル調製物のアリコートが、粗い銀表面上に固定されたバイオコンセン
トレーター上に堆積されて、ハイブリダイズを可能にする。これは、目的の微生
物、開発されたプローブ、および分析されるべきサンプルの型に依存して、酵素
的消化により生成する核酸フラグメントを(例えば、クロマトグラフィー技術ま
たはブロット技術を用いて)分離してまたは分離せずになされ得る。サンプル由
来の一本鎖DNAが固定したバイオコンセントレーターと結合して二重螺旋を形
成する程度は、プローブ中のアデノシン塩基からのラマン線の強度の変化を測定
することによって、決定され得る。本発明の好ましい形態においては、分析が完
了した後に、微生物由来の一本鎖核酸が、固定された核酸プローブバイオコンセ
ントレーターから除去され、そして「再生された(renewed)」プローブ
が再度使用される。
ードの検出のためのラマンオプトロードアプローチの一例として、引用された。
NRSが使用される場合に、バイオコンセントレーターベースラインスペクトル
のうちの2つのバンドのみが影響を受け、そして例えば、メチル窒素マスタード
の存在を検出するためにモニタリングされ得る。荷電した銀電極を使用して固定
DNAを配向するSERS技術は、さらなる特異性ならびにさらなる感度を増加
させる手段として、好ましいアプローチであり得る。例えば、Ag/AgCIに
対する−0.2Vの吸収ポテンシャル(これは、高度に正に荷電した表面に対応
する)において、吸着されたDNAのSERSスペクトルは、負に荷電したリン
酸基の、正に荷電した銀表面との静電的相互作用に起因し得る、236cm−1
の強いバンドにより特徴付けられる。固定されたバイオコンセントレーターが中
性の銀表面上でモニタリングされる場合には見られない、このバンドは、DNA
がアルキル化剤と反応した後には、リン酸基と銀表面との相互作用の減少に起因
して、強度が減少する。メチル化DNAはまた、新たなSERSハンドを、65
6、700および1360cm−1に示し(これらは、メチル化グアニン残基の
特徴的な振動に対応する);そして1200cm−1および1300cm−1の
バンドの減少した強度(これは、改変されたグアニン−シトシン核酸塩基対の位
置でのDNAのコンホメーション変化に関連する)を示す。従って、正に荷電し
た粗い銀表面を使用することによって、糜爛剤を検出するために、影響を受け、
従ってNRS技術を使用してモニタリングされ得る2つのバンドの代わりに、本
発明に従って、6つのバンドがモニタリングされ得る。
場合、RRSまたはSERS単独により達成される増強に加えて増強要因を生じ
る。SERRSにより達成され得る異常な感度および特異性は、本発明のラマン
オプトロードのいくつかの適用に有意な利点を有し得る。
が、DNAを照射するために使用される場合、NRS散乱のみが生じる。従って
、SERS技術が利用される場合でも、この波長が励起のために使用される場合
の分析のために十分強いシグナルを生じるために、比較的大量の核酸が、使用さ
れなければならない。しかし、DNAバイオコンセントレーターに結合した被検
体において共鳴を誘導することにより、そして変換器としてラマン顕微鏡を使用
することにより、非常に少量のDNAが、バイオコンセントレーターとして使用
され得、そして例外的に低濃度の種々の抗腫瘍薬物が検出され得る。本発明のこ
の特定の実施例において、仔ウシ胸腺DNA(Sigma Chemical
Co.I型)のストック溶液を、リン酸緩衝化生理食塩水で調製する。仔ウシ胸
腺DNA懸濁液を、分析されるべきサンプルと混合し、次いで、新鮮な銀ヒドロ
ゾル凝集体懸濁液と混合する。1マイクロリットルの生じた吸着DNA/DNA
−被検体複合体懸濁液を、マイクロプローブ中のキャピラリー管に入れ;そして
SERRSスペクトルが、350〜2000cm−1の範囲で得られた。DNA
自身は、これらの条件下で感知可能なスペクトルを与えない。しかし、抗腫瘍薬
物アドリアマイシンが、1000塩基対当たり1分子未満の濃度でも、「未知」
サンプル中に存在する場合、アドリアマイシンの存在および正体は、353、4
48、1226、1255、1318、1464、および1642cm−1の波
長の強度における強い増加により決定される。「未知」が、ベレニル(bere
nil)(抗トリパノソーマ剤)を含む場合、この薬剤の存在および正体は、1
598、1473、1431、1398、1349、1309、1188、11
64、および770cm−1の強いピークの形成を検出することから決定され得
;一方、DNAに結合した抗腫瘍性エリプチシン(ellipticine)は
、1617、1406、1273、1027、878、587、481、および
380cm−1に強いピークを与える。抗腫瘍剤メタ−アムサクリン、ならびに
薬物ジスタマイシン(distamycin)およびミトキサントロンは、同様
に検出および同定され得る。
P−450は、その基質の1つである薬物ベンゾフェタミンの検出および同定の
際にバイオコンセントレーターとして使用される。ウサギ肝臓ミクロソームから
単離され、そして再構築され、そして粗い銀表面上のリン脂質膜において固定さ
れたタンパク質は、406nmで作動するレーザーを用いて照射される。「未知
」サンプルが、固定化タンパク質調製物に導入される場合、規制物質が、以下を
観察することにより検出され得る:254cm−1バンドの強度の増加;349
および384cm−1の2重線と比較して676cm−1のバンドの強度のわず
かな減少;720cm−1バンドの周波数における724cm−1へのシフト;
1491cm−1線に対する1500cm−1線の強度の相対的な減少;ならび
に1578cm−1のピークの1575cm−1への3cm−1の低周波数シフ
ト。さらに、酵素バイオコンセントレーターの酸化状態の変化もまた検出され得
る。406nmで照射される場合、酸化型P−450(Fe3+)は、1491
および1370cm−1の強いバンドにより同定され得るが、還元型P−450
(Fe2+)は、1343cm−1および1359cm−1のバンドにより同定
され得る。
態P−420に変換され、これは、酵素の任意の変性における第1段階と考えら
れる。514.5nmで照射される場合、粗い銀表面上に固定された活性形態お
よび不活性形態は、シトクロムP−420のスペクトルが1627cm−1の新
しいバンドを生じ、そしてシトクロムP−450の系特性である1400cm−
1のバンドの強度が大きく相対的に減少することで、明確に区別され得る。それ
故、シトクロムP−450バイオコンセントレーターの状態は、SERRSを基
本とするラマンオプトロードのベンズフェタミン検出の間、第2の波長(すなわ
ち、514.5nm)でバイオコンセントレーターを定期的に照射することによ
りモニターされ得る。
用してラマン散乱を励起するアプローチを記載する。しかし、いくつかの適用に
は、本発明の好ましい形態は、2つ以上のレーザー波長による照射により生成さ
れる2つ以上のスペクトルを収集して分析し、すなわち「3次元(3−D)スペ
クトル」を生成する。2つ以上のレーザーが使用され得;あるいは、単一レーザ
ーが使用され得、そしてスペクトル分析の間、2つ以上の異なる線に交互に調整
される。3−D分析は、特定の適用(例えば、例外的な特異性が所望される場合
、またはラマンオプトロードが、共通する多くの発色団を有していない低濃度の
複数の被検体を検出するように意図される場合)に多数の利点を提供する。
の処置に使用される薬物)の3−D RRS分析および検出のためのバイオコン
セントレーターとして使用され得る。ジヒドロ葉酸レダクターゼは、テトラヒド
ロ葉酸へのジヒドロ葉酸のNADPH関連還元を触媒する。メトトレキサート(
構造的に葉酸に類似し、そしてp−アミノベンゾイル基およびプテリジン基を有
し、これらの両方が、共鳴活性発色団である)は、この酵素を阻害する。共鳴は
、p−アミノベンゾイル基およびプテリジン基において324および350nm
でそれぞれ照射することにより励起され得る。このバイオコンセントレーターが
、324nmで照射される場合、メトトレキサートの存在は、1685cm−1
のラマンバンド損失により決定され得、このバンドは、NADPH−酵素二成分
複合体では観察され得るが、NADPH−メトトレキサート−酵素三成分複合体
には無い。照射光が350nmに変更される場合、この薬物の存在は、659c
m−1の強いバンドの存在により確認され得、このバンドは、薬物−酵素複合体
にのみ存在する。
陽性生物およびグラム陰性生物に対して有効な抗生物質)の高度に特異的な検出
のために核酸バイオコンセントレーターと組み合わされ得る。この薬物は、ヒト
に対して高度に毒性であり、そして転写プロセスを阻害することが公知である。
本発明のこの実施例では、薬物およびバイオコンセントレーターの両方のRRS
スペクトルにおける特定の変化がモニターされ、それにより捕捉された被検体の
正体における例外的な確信を提供する。第1に、300nmおよび280nmの
波長でのUV励起により、DNAバイオコンセントレーター中のアデニンの15
82cm−1線およびグアニンの1492cm−1線が、示され得る。アクチノ
マイシン−DNA相互作用が起こる場合、1492cm−1線の強度は、有意に
減少し、グアニン塩基がアクチノマイシンにより妨害されることを示し、一方1
582cm−1線は変化しないままである(従って、定量分析に使用され得る)
。次に、458nmでのレーザー励起が使用され、アクチノマイシン発色団にお
ける共鳴を励起する。この後者の波長において、非結合抗生物質は、共鳴−増強
ラマンバンドを、1505、1489、1405、1385、および1265c
m−1に与える。これらのうち1385、1489、および1505cm−1の
バンドは、DNAとの相互作用に敏感である。特に、アクチノマイシンDが、バ
イオコンセントレーターに結合する場合、大きな強度変化が、1489および1
505cm−1線に観測される。
出および同定のために抗体コンセントレーターと組み合わされ得る。Staph
ylococcus epidermidis(Caltag Laborat
ories Inc,San Francisco,CA)に対して惹起された
モノクローナルIgG抗体は、バイオコンセントレーターとして使用され得、ガ
ラススライド上に固定化され、そして2、3滴の分析されるべき液体サンプルが
、この表面に適用され、インキュベートされ、そしてラマン分析の前にリンスさ
れる。251nmおよび242nmでの照射が使用されて芳香族アミノ酸からの
寄与により主として細菌DNAにおいて共鳴を励起し得;231nmでの照射は
、主として細菌タンパク質のトリプトファンおよびチロシンのピークにおいて共
鳴を励起し得;そして223nmでの照射は、主として細菌タンパク質のアミノ
酸ピークにおいて共鳴を励起し得る。3つのRRSスペクトルが集められ得、そ
して捕捉された細菌の例外的に特異的な同定のための、モデル参照スペクトルの
ライブラリーに対する比較により、900〜1800cm−1の範囲より分析さ
れ得る。好ましい実施形態において、抗体は、光学導波管上の粗い金属表面上に
固定され;そして励起光が導入され、そして生じたスペクトルは、光学導波管を
通って集められる。すなわち、SERRSは、標的微生物の3−D分析における
より高い特異性および感受性のために使用される。それにより生物の分析は、単
純化され得、そしてその信頼性は、SERSの使用により改善され、表面分類マ
ーカーの選択的な問合せを可能にし、一方でまた広範囲のレーザー波長の使用を
可能にし、蛍光に妨げられることなしに広範囲の分類マーカーのシグナルを選択
的に増強する。さらに、所望される場合、熱死滅(heat−killed)S
.epidermidisは、生存細菌と同様に検出されそして同定され得、そ
して例えば、複合細胞の測定されたRRSスペクトルを、231nmの励起で得
られたモデル参照スペクトルと比較することにより、生存微生物と区別され得る
。S.epidermidis細菌由来の細胞フラグメントは、231nmおよ
び223nmで取られたスペクトルにおいて適切なアミノ酸の線が全く存在しな
いこと、ならびに251nmおよび242nmで取られたスペクトルにおいて細
菌DNAに伴う線の不在により検出され得る。
異的な一連の異なる種類のバイオコンセントレーターは、計量棒の表面上に固定
され得る。例えば、Bacillus anthracis(USAMRIID
)由来の胞子に対するモノクローナル抗体は、この計量棒の粗い金属表面上の1
つの位置に固定され得、E.electricus(Sigma)由来の酵素ア
セチルコリンエステラーゼは、第2の位置に、Torpedo marmora
taの電気器官由来の膜フラグメント中のアセチルコリンレセプターの富化調製
物は、第3の位置に、そしてガングリオシドGT1b(Calbiochem)
は、第4の位置に、固定され得る。次いで、この計量棒は、バイオエーロゾル(
bioaerosol)液体インパクターにより収集されたサンプル中に挿入さ
れ、リンスされ、そして画像化ラマンマイクロプローブ中に挿入され得る。抗体
に捕捉される炭疽菌胞子、アセチルコリンエステラーゼを阻害することにより捕
捉される化学戦用神経薬;アセチルコリンレセプターに結合した(+)−ツボク
ラリン(クラーレ中の活性成分)、および固定されたガングリオシドに結合した
ボツリヌス毒素は、画像化ラマンシステムにより検出され得、そして同時に同定
され得る。
オコンセントレーター、および部分的に変性されるか、または不活性化されるか
、または毒性化されるか、または廃活性のバイオコンセントレーターのスペクト
ルを含み;そして測定されたスペクトルは、反応性および部分的に変性されるか
、または不活性化されるか、または毒性化されるか、または廃活性のバイオコン
セントレーターのモデルスペクトルと比較され、十分に大きなパーセンテージの
バイオコンセントレーターが、反応性でそしてその被検体に結合し得るか否かを
決定する。バイオコンセントレーターの変性または不活性化は、温度変動、pH
における変化、または液体サンプル中の溶媒または界面活性剤の存在により起こ
り得、そして上記のように本発明に従うラマンスペクトル分析により決定され得
る。例えば、化学的に変性された(例えば、アルカリ溶液に曝された)IgG抗
体は、強度の減少を伴う、アミドIII線およびアミドI’線における、それぞ
れ1240cm−1から1248cm−1へのシフトおよび1667cm−1か
ら1656cm−1へのシフト;1573cm−1トリプトファンのバンドの強
度の増加、および1359cm−1および879cm−1のバンドでの強度にお
ける減少;チロシンのバンドの強度比(I856/I830)の10:7から9:10
への減少;ならびに939cm−1の強いピークの出現により検出され得る。
マン分光法技術を使用して、多様な生物学的成分およびバイオテクノロジー産物
にも実施され得る。
よび2次構造を有するポリぺプチドの合成において使用される。しかし、問題に
対面し得る;寄与している要因は、樹脂に連結された伸長するペプチド鎖(例え
ば、βシート形成)、および/または保護基の不完全な除去の間の相互作用であ
ると考えられる。固定された形態の合成生物製剤に起因して、従来のアプローチ
を使用して合成する間は、この鎖を分析することは不可能である。しかしラマン
オプトロード反応性容量分析は、本発明にしたがって使用され、合成反応の進行
と同時に2次構造および保護基の存在または非存在を追跡し、そしてそれにより
正しい手順が処理の間に実行されることを可能にし、インサイチュで合成プロセ
スをモニターし得る。例えば、伸長するポリリシン鎖のコンホメーションは、媒
質全体のpH、イオン濃度、および温度を測定することにより検出可能でないか
もしれない、pH、イオン濃度、および温度における局所的な微環境の変化によ
り影響を受ける。しかし、本発明にしたがって、RRS技術が使用され、ポリぺ
プチドを218nmで照射することにより、インサイチュで伸長するポリぺプチ
ドをモニターし得、そして制御し得る。ランダムコイル形態のポリリシンは、1
258、1386、1559、および1655cm−1の強いピークの観測によ
り検出され得、a−へリックス形態は、1548および1644cm−1の強い
ピーク、ならびに1275および1348cm−1の幅広で弱いピークにより検
出され得;そしてb−シート形成は、1244、1559、および1661cm
−1の強いピーク、ならびに1359および1400cm−1の中くらいの強さ
の二重線で検出され得る。定量分析は、内部標準としてNaClO4を使用し、
そしてポリリシンのスペクトル由来の基本となるバンドを、ClO4−由来の9
32cm−1のバンドと比較することにより達成され得る。合成プロセスにおけ
る代替の工程では、1064nmで作動するレーザーが、保護基の不完全な除去
のNRS検出のために、1025cm−1のバンドをモニターすることにより使
用され得る。
的変性(例えば、リゾチームのような酵素)の非破壊検出に用いられ得る。NR
Sおよび/またはRRS技術はこの酵素の反応容量をモニターするために用いら
れ得る。リゾチームの熱変性は、NRSスペクトルのアミドIバンド(加熱によ
りより高い周波数にシフトし、そして強度が非常に減少する)およびアミドII
Iバンド(より低い周波数にシフトし、そして強度が非常に減少する)をモニタ
ーすることにより測定され得る。側鎖の熱変性の影響は、水素結合ならびに親水
性および疎水性相互作用に関与する側鎖を主に崩壊させる。共有結合した側鎖ジ
スルフィド架橋は、熱処理により破壊されない;76℃に加熱した場合でさえ、
509cm−1におけるリゾチームS−S伸縮振動バンドは変化しない。したが
って、本発明に従って、この特定のバンドは、酵素の反応性容量の定量的アセス
メントにおいて用いられ得る。
が用いられ得る。リゾチームが231.5nmで照射された場合、熱変性による
減少した反応容量は、強度がわずかに減少し、1176cm−1へシフトした1
178cm−1ピーク;1248cm−1へシフトした1240cm−1ピーク
;1340cm−1のショルダーの消失;1461cm−1へシフトした145
6cm−1ピーク;および1681cm−1の小さなピークの消失、によって検
出され得る。
存して生じる。したがって、本発明に従って、リゾチーム変性の原因となる因子
は、生じたラマンスペクトルの適切な分析により決定され得る。例えば、リゾチ
ームの化学変性(例えば、ジメチルスルホキシド、グアニジン塩酸塩、尿素、ド
デシル硫酸ナトリウム、およびLiBrのような試薬に曝露して引き起こされる
ような)は、酵素のNRSスペクトル中の1240cm−1付近のアミドIII
バンドの強度に対する1260cm−1でのアミドIIIラマンバンドの強度(
すなわち、比率I1260/I1240)を測定することにより検出され得る。他の試薬
への曝露は、コンフォーメーションにおける単純な変更よりもむしろ実際の化学
修飾(例えば、ジスルフィド結合切断、これは507cm−1S−S伸縮振動バ
ンドの消失、ならびに1672cm−1から1660cm−1へのアミドIバン
ドにおける大きなシフト、および1254cm−1から1243cm−1へおよ
び1271cm−1から1263cm−1へのアミドIIIバンドにおける大き
なシフトにより決定され得る)を生じ得る。
貯蔵されたインスリンの熱変性はNRS技術によってモニターされ得る。本来の
インスリンは、1680cm−1にショルダーを伴った、1662cm−1の主
要なバンド;1270cm−1の主要なバンドならびに1288cm−1および
1239cm−1の幾分弱いショルダー;ならびに1303cm−1、1269
cm−1および1284cm−1のバンドを有する。変性インスリンは、167
2cm−1へシフトした本来の1662cm−1バンド;1230cm−1に出
現した新しいバンド;946cm−1および934cm−1の領域に出現した強
いバンド;515cm−1での本来のS−S伸縮振動の強度の増加;668cm
−1および680cm−1へ変化した670cm−1のC−S伸縮振動;および
、強度減少を伴う657cm−1へシフトした668cm−1での本来C−S伸
縮振動により検出され得る。516cm−1でのS−S伸縮振動は変化せず、そ
して、本発明に従って、定量分析に用いられ得る。従って、生じた貯蔵劣化の程
度は本発明に従って非破壊的に決定され得る。
びB)を有する小さな(5.7キロダルトン)タンパク質である。より低濃度で
インスリンは、その濃度、pH、結合するZn2+およびイオン強度に依存して、
異なった集合状態、単量体、2量体、4量体および6量体、で存在することが知
られている。集合状態は、本発明に従って、RRS技術により、容易に決定され
得る。例えば、溶液が218nmでの照射下でモニターされる場合、単量体が2
量体へシフトするにつれて、1605cm−1バンドと比較した場合、1617
cm−1バンドは強度が増加する。
ろ段階的アンフォールディングを介して進行することが知られている。熱変性は
、酵素のNRSスペクトルの比率I832/I852およびI1000/I972ならびに5
10cm−1付近のバンドをモニターすることより検出され得る。本来の、完全
反応性RNaseのNRSスペクトルは、1.0/0.8の比率I832/I852を
示すが、酵素が完全に変性されるまでは、比率は逆転する(すなわちI852/I8 32 が1.0/0.8)。同様に、1000cm−1付近の2つの強いバンドの相
対的強度は、酵素の熱変性が完全になるまで、逆転する。510cm−1付近の
バンドの周波数および半値幅の変化(バンドが変性の際に周波数においてシフト
ダウンしそしてより広くなる)はまた、酵素反応性容量を決定するのに用いられ
得る。
態の検体およびサンプルマトリックスの型と適合性がある。従って、本発明に従
ったプロセスまたはデバイスは多くの異なった形態および構成をとり得る。本発
明を実施するのに用いられ得るプロセスまたはデバイスのいくつかの実施例は以
下に与えられる。これらの特定の実施例は、本願に記載される本発明の範囲を限
定することを意図されない。
て有毒殺虫剤のような危険物質に対して特異的な抗体は、金属フィルムに固定さ
れ得る。バッジは工場労働者により受動線量計として着用されるように設計され
得る。バッジの一部は光学的に透明な、不浸透性のフィルムで覆われ得る。さら
に、各バッジは、バッジに対しておよび彼らに対してバッジが割り当てられた労
働者に対して独特である、特定の識別子でコードされ得る。労働シフトの始めと
終わりにおいて、そのバッジはラマン分光計読み出しシステム(光源、分光計な
らびに分析ハードウェアおよびソフトウェアを含む)の中へ挿入され得、そこで
定量的操作の間、曝露された抗体およびシールドされた抗体のスペクトルを比較
し得る。読み出しシステムは、また内部較正、バッジ識別コード読み取り手段、
特別メモリーおよび内部時計を有し得る。その日の始めに、ラマン読み出しシス
テムは、バッジのシールドしていないセクションの完全に反応性の抗体の量を測
定し、そして、フルシフトで着用されるバッジに対して不十分な活性である場合
、警告を与える。それは、識別コードに相関させて、そのバッジのスペクトルを
メモリーに保存する。その日の終わりに、ラマン読み出しシステムは新しいスペ
クトルを生成し、そしてメモリーにおけるスペクトルに対して比較する。モデル
参照スペクトルに対するスペクトルの差異を比較することによって、1日の間に
抗体に結合された殺虫剤の量が決定され得る。さらに、読み出しシステムは、曝
露が起こった時間の間隔を測定し得、そしてその日の殺虫剤への労働者の時間平
均曝露を計算し得る。さらに、その日のスペクトルは、また以前の日に得られた
スペクトルに対して(または同じ労働者により着用された他のバッジで生じたデ
ータに対して)比較され得、そしてそれによって個人の累積曝露ならびにその人
の時間平均の毎日の用量が計算され得る。
れる酵素が、光ファイバーの先端の粗い金属表面に固定され得る。操作の間、光
ファイバーのコートされた先端は、チャコールフィルター床に挿入され得る。励
起光はファイバーを通ってコートされた先端へ移動し得、そして散乱光はファイ
バーを通ってラマン分光計へ戻ってくる。従って、このデバイスは、チャコール
フィルター床における潜在的破過点を検出するのに用いられ得る。いくつかの異
なる神経薬剤がコリンエステラーゼと結合するが、結合する場合、各自は異なる
スペクトルを生じるので、デバイスは通過する薬剤を検出するのみならず、存在
する各々の神経薬剤の正体の情報をまた提供する。
中に固定されたレセプターを有する。水中の毒素(トキシン)の濃度が上昇する
場合、水がセルを通って流れるにつれて、毒素分子はレセプターに結合する。水
中の毒素の濃度が非常に減少する場合、レセプターは毒素分子を放出する。各毒
素の存在および正体および量が、デバイスに導入されたラマン分光計により決定
され得る;システムのソフトウェアは、各毒素の情報がLCDディスプレー上に
示されるために、すべての計算ならびにデータ判読および操作をし得る。デバイ
スは、例えば工業的プロセスプラントからの毒素流出液を測定するため、または
公共上水道の純度を測定するために用いられ得る。
され得る。ディップスティックは、血液または尿サンプルを含むバイアルの中へ
挿入され得、そして次いでラマン分光計デバイスの中へ挿入され得る。レクチン
−リガンド複合体のスペクトルが、次いで、サンプル中に存在する、グルコース
を含む種々の糖の量を検出するために得られ得る。
濃縮する液体スクラバーを有し得、微粒子に吸着されるかまたは微粒子を形成す
る任意の薬物を溶解する液体が、このスクラバーにより捕捉される。この液体は
周期的に徐々に排出され得、いくつかの異なるレセプター(異なるカテゴリーま
たは分類の薬物に対してそれぞれ特異的である)を含むゾル−ゲル溶液と混合さ
れ得る。混合された溶液は、次いでラマン分光計の貫流セルを通して循環され得
る。それは、すべてのレセプターのSERSスペクトルまたはSERRSスペク
トルにおける変化を測定し、それによって存在するすべての異なる薬物を同定す
るために必要であるオプティックスおよびソフトウェアを有する。
マンオプトロード技術を用いる実施例として、適切なプローブは、束になった光
ファイバーの先端に固定化され得る。ラマンオプトロードの使用のために、サン
プルは任意の細胞物質を溶解するために、およびDNAおよび/またはRNA含
有物を核酸フラグメントに酵素的に消化するために、処理され得る。ラマンオプ
トロードバイオコンセントレーター光ファイバー先端は、次いで予備処理された
サンプルの中に浸漬され得、そしてハイブリダイゼーションを起こさせ得る。光
ファイバーは光源および分光計に連結されている;励起波長は光ファイバーを通
ってその先端でプローブへ移動し、そして得られたスペクトルは光ファイバーを
通って分光計へ移動し、それは各ファイバーの末端でサンプルと各異なるプロー
ブとの間のハイブリダイゼーションを検出するためにスペクトルを収集し、処理
しそして分析する。一旦、分析が完了すると、光ファイバー先端は、一本鎖核酸
プローブを再生するために、リンスしながら加熱され得る。スペクトルは、プロ
ーブが完全に再生されそしてすべてのサンプル鎖が取り除かれることを確かにす
るために用いられ得るから、光ファイバープローブが安全に無期限に再使用され
得る。
TR)結晶表面上に固定化され得、そして血液サンプルがその表面に適用される
。血液サンプル中のウィルスは病原体吸着因子と結合する。2つ以上の励起光波
長は次いで連続して一列のATR結晶に送り出され得、そして得られた3−D
SERRSスペクトル情報が、エバネセント(evanescent)波現象を
通して取り込まれ得る。ウィルスコーティングおよび各属の核酸が、区別された
独特のスペクトルを生成するので、3−D SERRSスペクトルは次いで、ウ
ィルスの存在を検出するために、および各型を同定するために用いられ得る。
の集合または種々の位置からサンプルを収集するために用いられ得る。サンプリ
ングデバイスはスプール装着テープカセット、液体ポンプ、サンプリングプロー
ブ、電池およびサーミスタ、ならびにサンプル識別情報の入力および記録するた
めのハードウェアおよびソフトウェアを含み;そしてテープは、各々小片が異な
る金属フィルムならびに抗体フラグメント、酵素およびレセプターサブユニット
の異なる混合物でコートされている多くの異なる小片を保有し得る。オペレータ
ーはサンプルに関する情報を入力し、そして次いで分析されるべき水の中にサン
プリングプローブを浸漬し、そしてボタンを押し得る。ボタンを押すことにより
、サンプリングデバイスは、カセット窓中のテープのセクションを通して、所定
量の水をポンプでくみ上げ、そのときにサンプリング窓の中でバイオコンセント
レーターの小片の隣にあるテープのサンプル同定化情報を記録し、そして次いで
種々の小片を示す新しいセクションがカセットのサンプリング窓の中にあるため
にテープを前進させる。すべてのサンプルが収集された後で、オペレーターは研
究所に戻り得、そして多重チャンネル走査ラマン分光計の中にサンプリングアク
セサリーを配置し得る。テープカセット分析アクセサリーは、テープカセットに
適応するように設計される。次いでオペレーターはサンプリングデバイスからカ
セットを取り出し、そしてラマン分光計の中のアクセサリーの中へそれを挿入し
得る。多重チャンネル走査分光計は、1つ以上の連続したスペクトルバンドで小
片を走査するために;そして、強いシグナルが所定の小片上の特定の位置におい
て見られる場合、その位置に焦点を当て1つ以上の全SERSスペクトルを生成
し分析するために、プログラムされ得る。全SERSスペクトルがスペクトル参
照ライブラリー内の優先汚染物質(化学的または微生物的)のスペクトルに対応
する場合、ラマン分光計はサンプル同定化コード(実地でオペレーターにより入
力されるような)の次に、汚染物質の正体および量をプリントアウトするために
設計され得る。一旦、テープの与えられたセクションの分析が完了すると、ラマ
ン分光計テープカセット分析アクセサリーは、自動的にテープを次のセクション
に進めるように、および分析サイクルを再び経るように設計され得、テープのす
べてのセクションが分析されるか、または同定化を記録されたすべてのサンプル
が処理されるまで続く。
た光ファイバーケーブルに結合した、薄く、可撓性のあるコイルまたは束状の光
ファイバーの被覆されていない表面上に固定化され得る。ケーブルに沿って移動
する励起光は、多重内部反射のエバネセント波によりコイルを通って移動するた
めに、ある角度においてコイルの中に送り出され、それによりその光をコイルの
表面のバイオコンセントレーターと繰り返し相互作用させる。エバネセント波が
コイルの末端に到着する場合、それはラマン分光計への移動のためにケーブルの
中へ戻される。エバネセント波を用いることによって、例外的な感度が達成され
得る。このような構成は極端に希薄な検体濃度の遠隔サンプリング(例えば、地
下水モニタリング)に用いられ得る。本発明の好ましい形態において、抗体バイ
オコンセントレーターは「可逆競争認識ユニット(reversible co
mpetitive recognition units)」(米国特許第5
,156,972号、1992年10月20日、「Analyte Speci
fic Chemical Sensor with a Ligand an
d an Analogue Bound on the Sensing S
urface」、D.Issachar)であるように改変され、それにより、
地下水ボアホールにおいての連続「リアルタイム」のモニタリングを可能にする
。あるいは、温度摂動、カオトロピック剤または溶媒極性調整のような、より慣
習的な抗体再生プロセスは、適切な遠隔モニタリング適用に使用されると考えら
れ得る。
かの局面と同様に、地下水モニタリングシステムは光ファイバーアレイを有して
設計され得る。サンプリングデバイス(この場合、光ファイバーコイル)は種々
の地下水モニタリングボアホールに位置し、そして各ボアホール内で種々の深さ
に、また位置し得る。光ファイバーケーブルは励起光を各タンパク質で被覆され
たコイルへ移送するために、および得られたラマンスペクトルを各タンパク質で
被覆されたコイルから単一の集中化したラマン分光計へ移送するために用いられ
得る。この実施例において、処理および分析のためのスペクトルシグナルを組み
合わせる代わりに各コイルからのスペクトルシグナルは、連続的または同時的の
いずれかで、例えば、検出器アレイを備えた多重チャンネル分光計の使用によっ
て、収集され、分散されそして検出器アレイ中の検出器の行に集光された所定の
光ファイバーからのスペクトルシグナルを用いて、別々に分析される。バイオコ
ンセントレーター−リガンド複合体のスペクトルがバイオコンセントレーター−
汚染物質複合体のスペクトルに合致する場合には、集中化したラマン分光計はボ
アホールの位置および汚染物質が検出された深さを指摘する、警告シグナルを遠
隔オペレーターステーションへ伝達し得る。
充填されそしてグラスウールプラグによって適所に保持され得る。空気は管を通
して引かれ得、このとき任意の酵素インヒビターの蒸気が、バイオコンセントレ
ーターに結合する。キャピラリー管は研究所に戻され得、グラスウールプラグは
除去され、そして粉体化酵素は捕獲したインヒビターのラマン分析および検出お
よび同定のために代表的ラマン分光計粉体/固体サンプリングアクセサリーへ装
着される。
カルーセル;ニードルサンプルインジェクター;粗い金属フィルムおよび抗原の
固定相で内部をコートされた小さな透明ボートを含む第2カルーセル;ラマン分
光器サブシステム;およびプリンターを含み得る。血液サンプルを含むゴム栓で
シールされたバイアルは第1カルーセルに置かれ得る。ニードルサンプルインジ
ェクターは自動的に第1バイアルのゴム栓に穴を開け得、バイアルから一定量の
サンプルを取り出し、そして第2カルーセル上の第1SERS活性プレートへそ
れを移動し、そして次いで一定量のリンス液体を、次のバイアルの栓に穴が開け
られる前に廃棄リザーバーへ引きそして放出する。一方では、第1バイアルから
取り出されたサンプルの抗体は、第2カルーセルが回転する間、ボート内の固定
化された抗原層とともにインキュベートし、血液サンプルを含む第1のSERS
活性ボートをラマン分光計サブシステムへ運搬する。ボートがラマン読み出しス
テーションに到着する場合、血液抗体の検出および同定のための3−D SER
RS分析が起こり得、このとき励起光が抗原−抗体複合体と接触する前に、透明
なボートの底および金属フィルムを通って送り出され、そして得られたスペクト
ルるがエバネセント波現象を通して再び取り込まれる。分析が終わった場合、各
サンプルの抗体含有量を指摘する結果はプリントアウトして提供され得る。
クセサリーとしてのバイアルの導入のためのカルーセルを備えたラマン分光計サ
ブシステムからなり得る。インスリンは光学的に透明なバイアル中に貯蔵される
。インスリンが出荷されるべきである場合、バイアルはカルーセル中に最初に積
まれる。動くカルーセルは各バイアルを順に照射に対して曝露させる。貯蔵され
たインスリンの得られたラマンスペクトルは公知の活性の結晶性粉末インスリン
の参照モデルスペクトルに対して比較され得る。受容可能でない高い割合の変性
したインスリンを含むバイアルが検出される場合、ラマンシステムは警報を鳴ら
し、あるいは望まれるならば、カルーセルからそのバイアルを取り出すようにお
よび/またはその含有物の状態を指示するためにバイアルにマークするように設
計され得る。そのシステムはまた、そのバイアル中のインスリンが最後に分析さ
れた日付を示すような各バイアルにマークをつけるために設計され得る。
は、取り外し可能な光ファイバーのアレイからなり得る。各光ファイバーの表面
は、ポリペプチドが光ファイバーの表面上で成長するために、樹脂フィルムの接
着用に機能化された。照射光はポリペプチドに接触され、そして得られたラマン
スペクトルはエバネセント波現象により取り込まれる。ラマンオプトロードはス
ペクトル情報に基づいて処理工程を自動的に調整するように、例えば、脱保護化
が完了したことをスペクトル情報が指摘するまで、保護基の脱離のために試薬と
ともにインキュベートし続けるように、もしpHが変化する場合は酸、塩基また
は緩衝液を注入するように、などで設計される。
明を実行する種々の様式は上記詳細な開示に基づいて当業者に明白である。これ
らのおよび他の変形は本発明の範囲内であるとみなす。したがって、本発明はそ
の詳細な説明に限定されないことが理解される。
素バイオコンセントレーターによって捕捉された置換フェノールの検出および同
定に使用され得る。
の一部の断面および一部の立面の概略図である。
部の断面および一部の立面の概略図である。
概略的に図示する。
ッジ」または「ディップスティック」サンプリングユニットおよびそのラマン読
み出しシステムの一部の断面および一部の立面の概略図である。
ある。
によって変性され始めた酵素を検出するために、リボヌクレアーゼのラマン反応
容量分析において使用され得る。
Claims (35)
- 【請求項1】 ラマン分光法により、1以上の被検体の、少なくとも検出、
同定および定量のいずれか1つのための方法であって、該方法は、以下: 少なくとも1種の被検体と結合するバイオコンセントレーターを提供する工程
であって、少なくとも1種の被検体を該バイオコンセントレーターと接触させ、
該バイオコンセントレーター上への該少なくとも1種の被検体の結合を生じ、本
質的に該バイオコンセントレーターおよび該少なくとも1種の被検体からなる分
析されるべき媒質を形成し、そしてここで、該少なくとも1種の被検体の少なく
とも一部が該バイオコンセントレーターに結合される、工程、 該バイオコンセントレーターおよび該バイオコンセントレーターに結合した該
少なくとも1つの被検体を含む該媒質を、供給源からの光で照射する工程であっ
て、ここで該光が、該照射されたバイオコンセントレーターおよび該バイオコン
セントレーターに結合された該少なくとも1つの被検体からのラマン散乱を生じ
、ここで該ラマン散乱が、該バイオコンセントレーターまたは該被検体のいずれ
かに連結するレポーターにより発せられない、工程、 該バイオコンセントレーターおよび該バイオコンセントレーター上の該少なく
とも1種の被検体から放射する該ラマン散乱を収集し、そして処理する工程、な
らびに 該処理されたラマン散乱を分析し、該少なくとも1種の被検体の存在および/
または正体を決定する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項2】 請求項1に記載の方法であって、ここで前記バイオコンセン
トレーターは、支持部材上に配置され、そしてここで該バイオコンセントレータ
ーが、全て生物学的供給源由来である、分子、高分子、複合体、分子のフラグメ
ント、ならびに複合体のフラグメントおよびサブユニット;全て生物学的供給源
由来である、分子、高分子、複合体、分子のフラグメント、複合体のサブユニッ
ト、および複合体のフラグメントに結合するリガンド;からなる群から選択され
、 ここで該分子、高分子および複合体が、酵素、酵素補因子、補酵素、抗体、抗体
フラグメント、へムタンパク質、天然ペプチドおよび合成ペプチド、スフィンゴ
糖脂質、レクチン、脂質、リン脂質、炭水化物、糖、ガングリオシド、核酸、核
酸のフラグメント、病原体接着因子、レセプター、レセプターサブユニット、リ
ポソーム、膜、小器官、細胞、組織、該分子または高分子を含む複合体、からな
る群から選択され、そしてここで該リガンドが、酵素基質、酵素インヒビター、
抗原、抗原アナログ、ハプテン、レセプターアゴニスト、レセプターアンタゴニ
ストおよび糖質、からなる群から選択される、 方法。 - 【請求項3】 前記光がレーザーからである請求項1に記載の方法。
- 【請求項4】 前記収集して処理する工程が、該処理する工程においてラマ
ン分光計の使用を包含する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項5】 前記分光計が、画像化分光計である、請求項4に記載の方法
。 - 【請求項6】 請求項1に記載の方法であって、前記処理されたラマン散乱
を分析する工程が、前記バイオコンセントレーターおよび前記結合した被検体を
含む前記媒質のラマンスペクトルを、同じバイオコンセントレーターおよび結合
した被検体のラマンスペクトルに対応する既知のラマンスペクトルを有する参照
標準のラマンスペクトルに対して比較する工程を包含する、方法。 - 【請求項7】 前記被検体が溶液中にある、請求項1に記載の方法。
- 【請求項8】 前記被検体が空気中にある、請求項1に記載の方法。
- 【請求項9】 前記少なくとも1種の被検体が、複数の被検体を含む、請求
項1に記載の方法。 - 【請求項10】 前記複数の被検体が、1種のバイオコンセントレーターに
結合される、請求項9に記載の方法。 - 【請求項11】 前記複数の被検体が、前記バイオコンセントレーター上の
異なる場所に結合される、請求項10に記載の方法。 - 【請求項12】 前記工程が、同じ物理的位置で行なわれる、請求項1に記
載の方法。 - 【請求項13】 請求項1に記載の方法であって、ここで前記バイオコンセ
ントレーターと接触させる前記工程が、1つの位置で行なわれ、そして前記照射
する工程、収集する工程および分析する工程が、該バイオコンセントレーターと
接触させる該工程と異なる位置で行なわれる、方法。 - 【請求項14】 前記照射する工程が、前記少なくとも1種の被検体の実時
間分析のために連続的に行われる、請求項1に記載の方法。 - 【請求項15】 請求項1に記載の方法であって、ここで前記収集して処理
する工程が、以下からなる群から選択されるラマン分光計により実行される、方
法:分散分光計、多重チャネル分光計、フーリエ変換分光計、アダマール変換分
光計、定常変換分光計、音響光学チューナブルフィルター分光計、インテグレイ
テッドオプティック音響光学チューナブルフィルター分光計、ファイバーオプテ
ィック分光計、ファイバーオプティックアレイ分光計、顕微鏡分光計、画像化分
光計、および画像化顕微鏡分光計。 - 【請求項16】 請求項1に記載の方法であって、ここで前記ラマン散乱が
、以下からなる群から選択される、方法:通常ラマン散乱、表面増強ラマン散乱
、共鳴ラマン散乱、表面増強共鳴ラマン散乱およびラマン一過性波散乱。 - 【請求項17】 前記支持部材が、粗い金属表面を含む、請求項2に記載の
方法。 - 【請求項18】 前記バイオコンセントレーターが、静止して維持される、
請求項1に記載の方法。 - 【請求項19】 前記バイオコンセントレーターが移動される、請求項1に
記載の方法。 - 【請求項20】 請求項1に記載の方法であって、ここで前記バイオコンセ
ントレーターの一部が、前記被検体との接触に対して保護され、そして前記分析
工程が、該バイオコンセントレーターの保護された部分に関連する1つ以上の周
波帯を、該バイオコンセントレーターの非保護部分および前記結合された少なく
とも1種の被検体から放射する1つ以上の周波帯のラマンスペクトルシグナルと
、比較する工程を包含する、方法。 - 【請求項21】 請求項2に記載の方法であって、ここで既知のラマンスペ
クトルを有する化学物質が、前記支持部材上に配置され、そしてここで前記処理
されたラマン散乱を分析する工程が、前記バイオコンセントレーターおよび該バ
イオコンセントレーターに結合される前記少なくとも1種の被検体のラマンスペ
クトルを、該化学物質のラマンスペクトルに対して比較する工程を包含する、方
法。 - 【請求項22】 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記少なくとも
1種の被検体が前記バイオコンセントレーターヘ結合される場合に、非結合バイ
オコンセントレーターのラマンスペクトルにおける同じ周波帯から変化しないま
まであることが知られている、該バイオコンセントレーターおよび該バイオコン
セントレーターに結合される該少なくとも1種の被検体を含む前記媒質のラマン
スペクトルにおける少なくとも1つの周波帯を、該バイオコンセントレーターお
よび該バイオコンセントレーターに結合される少なくとも1種の被検体を含む該
媒質の該ラマンスペクトルにおける少なくとも1つの他の周波帯と比較する工程
であって、該少なくとも1つの周波帯は、該少なくとも1種の被検体が該バイオ
コンセントレーターに結合される場合に、該非結合バイオコンセントレーターの
スペクトルにおける同じ少なくとも1つの他の周波帯から変化することが知られ
ている、工程により、前記分析する工程が達成される、方法。 - 【請求項23】 請求項1に記載の方法であって、ここで1つの支持部材上
に配置される複数のバイオコンセントレーターが存在し、そして 被検体が、各バイオコンセントレーターに結合され、そしてここで各バイオコ
ンセントレーターからのラマンスペクトルが、分析される、方法。 - 【請求項24】 請求項1に記載の方法であって、ここで前記分析する工程
が、以下: 前記バイオコンセントレーターのスペクトルを決定する工程;および 該バイオコンセントレーターの値を0に設定し、そして該バイオコンセントレ
ーターに結合される被検体からのラマン散乱スペクトルの値を、該0値と比較す
る工程、を包含する、方法。 - 【請求項25】 試験生体物質の少なくとも1つのリガンドと結合する能力
を決定するための非破壊的方法であって、該方法は、以下の工程を包含する: 試験生体物質を、ラマン散乱を生じ得る光供給源を用いて照射し、該照射され
た試験生体物質のラマン散乱スペクトルを生じる工程; 該ラマン散乱スペクトルを収集して処理する工程;および 該処理されたラマン散乱スペクトルを分析し、該試験生体物質のリガンドと反
応する能力を決定する工程、 これにより、該分析する工程は、このようにして該試験生体物質について得ら
れた該試験生体物質のラマン散乱スペクトルを、同じ型の生体物質の少なくとも
1つの標準サンプルから対応して得られるラマン散乱スペクトルと比較する工程
であって、該標準生体物質がリガンドに結合する既知の能力を有する、工程を包
含する。 - 【請求項26】 請求項25に記載の非破壊的方法であって、ここで前記試
験生体物質が、以下からなる群から選択される、方法:酵素、酵素補因子、補酵
素、抗体、へムタンパク質、ペプチド、合成ペプチド、トキシン、トキソイド、
スフィンゴ糖脂質、レクチン、脂質、リン脂質、炭水化物、糖、ガングリオシド
、核酸、病原体接着因子、レセプター、レセプターサブユニット、膜、小器官お
よび細胞、これらの生体物質の同定可能なフラグメント、ならびにこれらの生体
物質を含むこれらの組合せ。 - 【請求項27】 請求項25に記載の非破壊的方法であって、ここで前記試
験生体物質のリガンドと結合する能力が、合成、抽出、分離、精製、凍結乾燥、
結晶化、再構築、混合、消化、破砕、誘導体化、加熱、照射、エージング、複合
体形成、化学修飾および固定化のうちのいずれか1つにより変更され得た、方法
。 - 【請求項28】 ラマン散乱スペクトル全体が分析される、請求項25に記
載の非破壊的方法。 - 【請求項29】 ラマン散乱スペクトルの少なくとも1つの選択バンドが分
析される、請求項25に記載の非破壊的方法。 - 【請求項30】 前記ラマン散乱スペクトルを収集して処理する工程が、ラ
マン分光計により行なわれる、請求項25に記載の非破壊的方法。 - 【請求項31】 前記生じたラマンスペクトル散乱が、前記試験生体物質に
連結されるリポーターにより発せられない、請求項25に記載の非破壊的方法。 - 【請求項32】 請求項25に記載の非破壊的方法であって、ここで前記収
集して処理する工程が、以下からなる群から選択される分光計により実行される
、方法:分散分光計、多重チャネル分光計、フーリエ変換分光計、アダマール変
換分光計、定常変換分光計、音響光学チューナブルフィルター分光計、インテグ
レイテッドオプティック音響光学チューナブルフィルター分光計、ファイバーオ
プティック分光計、ファイバーオプティックアレイ分光計、顕微鏡分光計、画像
化分光計、液晶チューナブルフィルター分光計、および画像化顕微鏡分光計。 - 【請求項33】 請求項25に記載の非破壊的方法であって、ここで前記ラ
マン散乱が、以下からなる群から選択される、方法:通常ラマン散乱、表面増強
ラマン散乱、共鳴ラマン散乱、表面増強共鳴ラマン散乱およびラマン一過性波散
乱。 - 【請求項34】 請求項25に記載の非破壊的方法であって、ここで前記試
験生体物質が、バイオコンセントレーターであり、そしてここで前記分析する工
程が、該バイオコンセントレーターが、少なくとも部分的に失活されているか否
かを決定する、方法。 - 【請求項35】 請求項34に記載の非破壊的方法であって、ここで前記バ
イオコンセントレーターが、支持部材上に配置され、そしてここで該バイオコン
セントレーターが、全て生物学的供給源由来である、分子、高分子、複合体、分
子のフラグメント、ならびに複合体のフラグメントおよびサブユニット;生物学
的供給源由来の、分子、高分子、複合体、分子のフラグメント、複合体のサブユ
ニット、および複合体のフラグメントに結合するリガンド;からなる群から選択
され、 ここで該分子、高分子および複合体が、酵素、酵素補因子、補酵素、抗体、抗体
フラグメント、へムタンパク質、天然ペプチドおよび合成ペプチド、スフィンゴ
糖脂質、レクチン、脂質、リン脂質、炭水化物、糖、ガングリオシド、核酸、核
酸のフラグメント、病原体接着因子、レセプター、レセプターサブユニット、リ
ポソーム、膜、小器官、細胞、組織、該分子または高分子を含む複合体、からな
る群から選択され、 そして該リガンドが、酵素基質、酵素インヒビター、抗原、抗原アナログ、ハプ
テン、レセプターアゴニスト、レセプターアンタゴニストおよび糖質、からなる
群から選択される、 方法。
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