JP3704473B2 - 化学物質および微生物の検出のためのラマンオプトロードプロセスおよび装置 - Google Patents

化学物質および微生物の検出のためのラマンオプトロードプロセスおよび装置 Download PDF

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Description

【０００１】
（発明の背景）
本発明は、種々の物質の分析のためのプロセスおよび装置に関し、より詳細には、検体（例えば、環境汚染物質、薬物、爆薬、毒素、病原体、生物学的サンプル構成要素、ならびに化学戦薬剤および生物戦薬剤）の、定性的および／または定量的な、検出および同定のためのプロセスおよびデバイスに関する。この検体は、単離され、収集され、そしてバイオコンセントレーター（ｂｉｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）によって濃縮され、次いでラマン分光法技術を用いて分析される。
【０００２】
（先行技術の説明）
環境マトリクスおよび生物学的マトリクス中の検体の検出および同定は、湿式（ｗｅｔ）化学分析手順の使用を伝統的に必要としてきた。これらの手順はしばしば、入念な、時間がかかり、そして労力を要し、高度に訓練された技術者および高性能の高価な機器を必要とする、サンプルの収集工程、調製工程、分析工程およびデータ解釈工程を含む。
【０００３】
いくつかの例では、研究室での分析機器をサンプル収集および分析を自動的に行うように設計される専用のモニタリング装置としての使用に適合させて、結果を得るために必要とされる労力の量および時間を削減することが可能であった。例えば、赤外（ＩＲ）分光法を時々用いて、汚染物質について煙道ガス放出をモニタリングし得る。均質な物質を通して光を伝搬させる場合、一部の光は吸収され、一部はその物質を透過する；ＩＲ分光技術は、分子振動に起因する、ＩＲ窓における光吸収／透過を測定する。分子構造が変化するにつれてＩＲスペクトルは変化する。すなわち、ＩＲスペクトルは、その化学組成に独特のその物質の「指紋」である；化学組成が変化する場合、指紋ＩＲスペクトルは変化する。それゆえ、煙道ガスの組成が変化する場合、その変化は、ＩＲスペクトルのある部分をモニタリングすることによって検出され得る。しかし、物質の内容物がより複雑になるかまたは変動するにつれて、多くの異なる化学物質のスペクトルが互いに重複することに起因して、指紋における変化の原因を正確に決定することはさらに難しくなる。それゆえ、指紋機器（例えば、ＩＲ分光計）でさえ、多くの検出適用（特に、複雑なサンプル中の微量のレベルの検体の検出を必要とする検出適用）には用いられ得ない。さらに、ＩＲ分光法は通常、水性媒質中に溶解または懸濁した検体の直接検出には不適合である。
【０００４】
均質な物質を通って伝搬する光の一部は、その物質によって吸収され、そして透過し、一部はまた種々のプロセスによって散乱される。ＩＲのように、散乱プロセスの一つ、すなわち、ラマン散乱もまた、分子振動に起因する。しかし、振動周波数を吸収強度に関する情報と共に記載するＩＲとは異なり、ラマンは、散乱断面積についての情報を生じる。ＩＲおよびラマンは、基本的に異なる物理的プロセスに依存する。ＩＲは、振動サイクルの間の吸収種の双極子モーメントの変化に依存する。非対称種は、より対称な種よりも大きな双極子モーメントを有するので、強いＩＲスペクトル特徴は、分極基および対称基の逆対称性振動から生じる。
【０００５】
ラマン散乱強度は、振動サイクルの間の散乱種の分極率の変調の程度、すなわち、核振動変位に関連した電子分極率の変化から生じるラマン周波数に依存する。従って、対称種および分極性原子（例えば、硫黄）を含む基の対称振動モードは、強く散乱する傾向がある。分子の三次元構造および分子内−分子間相互作用は、基準振動の周波数および形態を決定する。それゆえ、ラマン効果において観察される周波数、強度および分極状態を分析することにより、分子構造が決定され得る。このような分析に基づくラマン分光法は、固有の指紋情報を作成する際に、ＩＲと同等に強力である、それほど周知ではない分析技術であるが、この２つの有意差に起因して、有意に異なる情報を生じるだけでなく、水性サンプルならびに非水性サンプルと適合し、そして固体または表面を何のサンプル調製をも伴わずに分析し得るという利点をも有する。例えば、ラマン効果において観察される周波数、強度および分極状態を分析することによって、たとえ、生物学的高分子のように複雑であっても、化学物質の分子構造が決定され得ることが公知である。タンパク質のコンホメーション変化、電荷効果、結合ひずみおよび化学的転位は、２００〜２０００ｃｍ−１の領域で研究され得、そしていくつかは１００〜４０００ｃｍ−１の範囲で研究され得る。同様に、ラマンは、ＤＮＡおよびＲＮＡのホスホジエステル骨格のジオメトリーを研究するために用いられている；そして現在もさらに、膜、個々の生細胞および組織におけるインサイチュでの生物学的高分子および複合体の化学およびコンホメーションを解明するために用いられている。水溶液との適合性によって、ラマン分光法は、ネイティブな（すなわち、可溶化された）形態での生体物質の化学を研究するために用いられ得るいくつかの技術のうちの一つである。
【０００６】
ラマンスペクトルは、サンプルに特定の単波長の光を照射することによって作製される。ラマン散乱は、単色放射の狭く強いビームによって生じ、そしてそのビームに対して直角で観察される場合、最良に試験され、その結果、励起ビームの強度は、ずっと低い強度のラマン散乱放射にかぶさらない。それゆえ、レーザーは、ラマン散乱を励起するためにほぼ排他的に用いられる。ラマンスペクトル、すなわち、散乱波長およびそれらの相対強度は、サンプルの分子構造に特有で、物質特異的である。ラマンスペクトルの指紋は所定の化合物に対して固有であるので、ラマンを用いて、サンプルからの、波長がシフトした散乱光と、「既知の」物質からのラマンスペクトルの特徴との比較によって、「未知の」サンプルを同定し得る。近年、ラマン散乱分光法は、水モニタリング系における使用のために調査されている。
【０００７】
わずかな百分率の伝搬光しかラマン散乱されないので、通常のラマン散乱（ＮＲＳ）分光法は、比較的弱いシグナルを生じ、それゆえ、ＮＲＳに基づく任意の分析手順またはモニターは比較的不十分な感度を有する。しかし、２つの異なる現象（すなわち、共鳴ラマン散乱（ＲＲＳ）および表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ））を利用して、ラマン分析の間にさらなる感度を獲得し得る。
【０００８】
ＮＲＳは、励起光の周波数が、検体分子の電子吸収帯よりも大きく離れている場合に生じる。しかし、ＲＲＳでは、励起周波数は、その分子の電子吸収周波数に近づくかまたは一致する。（共鳴する分子部分はしばしば、「発色団」と呼ばれる。なぜなら、大部分のレーザー光は、スペクトルの可視部分における共鳴を励起するからである。）このような共鳴条件下で、発色団または隣接基の原子の振動モードに起因する線は、通常、増強された線がラマンスペクトルにおいて観察される唯一の線である点まで、選択的かつ有意に増強される；ＲＲＳ技術はラマンシグナルを、１０3〜１０6倍増強することが公知である。ＲＲＳは、ＮＲＳを超える１つのさらなる利点を有する。すなわち、発色団からの唯一の線が見られるので、ＲＲＳスペクトルはＮＲＳスペクトルよりもずっと単純であり、かつずっと少ない線を有する。例えば、生物学的物質は例外的化学的複雑さを示し、そしてそれらのラマンスペクトルは相応じて複雑である。ＲＲＳは、これらの複雑なスペクトルを単純化し、それにより、生物学的物質の活性部位および化学的反応を突き止め、そしてラマン線を生物学的高分子または複合体内の官能基および結合に帰属させるために有用であると証明された。
【０００９】
１９７０年代後期には、研究者は、粗い薄い層の金属上に吸着された化合物の単層が、ＮＲＳシグナルの１０9倍程度に高く増強されたラマンシグナルを示すことを発見した。この現象は、「表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）」と呼ばれている。１９８０年代にＳＥＲＳについて行われた大部分の研究は、表面増強現象についての化学的および物理的根拠を調べることを標的としていた。例えば、表面増強効果が、粗雑化した金属表面と直接接触しているかまたは極めて近接している分子または部分に制限されることが現在公知である。これは、周囲の大量の媒質からのシグナルは検出されるには弱すぎ、吸着された分子を分析することをより容易にするという点で有利であり得る。しかし、極めて大きな分子部分（例えば、多くのタンパク質）は、それらのラマンシグナルの任意の有意な増強を生じるためには金属表面からは遠すぎる。例えば、吸着された高分子のＳＥＲＲＳにおいて表面および共鳴の増強が及ぶ、電極からの距離は、約１６ｎｍであることが示されている；電極の表面に直接結合しているかまたは表面から５もしくは６残基以内のアミノ酸からのシグナルは、タンパク質分子内の他の残基からのシグナルよりも強力に増強される。それゆえ、粗雑化された金属電極を用い、そして電極の電位を変更することにより、高分子の配向を、高分子内の選択された部分に属するシグナルの増強を最大にするように変更することが可能である。それゆえ、生体物質のような大きく、複雑な高分子内の基または残基を選択的に研究するために、電極電位ならびに共鳴技術を使用することが可能である。
【００１０】
さらに、ＲＲＳは、表面増強と関連して用いられる場合［表面増強共鳴ラマン共鳴（ＳＥＲＲＳ）］、感度を、ＮＲＳシグナルの１０11〜１０13倍程度も高く増強し得る、すなわち、完全なスペクトルが、１０7未満の分子を用いて作製され得ることがいまや公知である。それゆえ、ＳＥＲＲＳは、検出プロセスおよびデバイスにおける可能な使用について利用可能な最も感度の高い技術のうちの１つであり得る；それゆえ、研究者は、ＳＥＲＳおよびＳＥＲＲＳの実用的適用を、すなわち、微量成分の分析のために、より強いラマンスペクトルのシグナルを生成するために、分析されるサンプルの物質を、粗雑化された金属表面上に直接蒸着することにより、調査し始めた。例えば、特許第４，６７４，８７８号「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｃ ａｎｄ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｂｙ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」，Ｔ．Ｖｏ−Ｄｉｎｈは、有機化合物の微量分析のためにＳＥＲＳを利用する装置および方法論を記載する。
【００１１】
しかし、ラマン分光法は、このような強力に増強されたＳＥＲＳシグナルまたはＳＥＲＲＳシグナルを用いてさえ、ＩＲ分光法と同じ制限を受ける。すなわち、これは、比較的純粋であるか；検体の存在／非存在が主に変動して比較的一定の組成であるか；比較的高い濃度の検体を有するか；または例えば、クロマトグラフィー技術の使用によって、他のサンプル構成要素から単離するため、処理されているサンプルまたは物質について用いられなければならない。あるいは、検体からの指紋シグナルは、サンプル中のより多数かまたは濃縮された種の全ての指紋によって混乱させられ、それにより、不十分な感度および特異性、ならびに多数の誤った応答となる。このようなプロセスまたは機器を新たな環境における使用または新たな媒質もしくはサンプル組成について適合させるためには、かなりの努力および再設計が必要とされる。例えば、ＳＥＲＳを微量分析のために用いる場合、金属表面に適用された任意のサンプル中の全ての化合物からのシグナルが増強される；それゆえ、より少量のサンプル容量が用いられ得るが、このアプローチによって生成される複雑な、重複するシグナルは、微量のレベルの検体を検出または同定することを不可能にする。ＲＲＳは発色団分子由来のシグナルのみを選択的に増強するので、レーザー励起波長の賢明な選択を通して特異性を得るための試みが行われた。しかし、事前共鳴（ｐｒｅ−ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）効果は、サンプル中の、より濃縮された種のシグナルを、ずっと低い濃度で存在する、微量検体からの強力に増強されたＲＲＳシグナルでさえ、より多数の種からの、より弱いシグナルの組み合わせによって依然として覆われるという点まで増強し得る。大部分のサンプルマトリクスは、ＲＲＳ単独が、微量の検体のモニタリングのために十分な特異性を達成するとしても稀にしか達成し得ない、充分な複雑さのマトリクスである。それゆえ、ごく近年では、検体を特異的に捕獲し、検体を溶液から取り出し、そしてこれを（これのみを）ＳＥＲＳ活性コーティングと接触させて、他のサンプル構成要素を大量の媒質中に残す（その媒質中では、これらは、ＳＥＲＳ効果によってシグナルが増強されるには表面から遠すぎる）ために用いられ得るコーティング（例えば、ポリマーまたはクラウンエーテル）を同定するための研究が開始された。しかし、今日までに同定されたコーティングは、大部分の分析、検出またはモニタリング適用に必要な特異性を提供していない。
【００１２】
微生物の検出および同定のために最も広範に使用および／または研究される手順は、２つの広範なカテゴリーのうちの一方に入る。（１）生存微生物の分析は、種々の栄養培地および／または色素培地中での細胞の培養、予備富化工程、および（しばしば、視覚的検鏡と組み合わせた）他の湿式化学技術を含む。あるいは、（２）サンプルは処理されて、任意の細胞物質が破壊され、遊離された核酸内容物が酵素の混合物によって消化され、核酸フラグメントがクロマトグラフィー技術（例えば、ウェスタンブロットまたはサザンブロットなど）によって処理され、次いで、例えば、放射性同位体標識、蛍光標識または酵素標識を用いてタグ化したプローブと反応させ、次いでこの標識を検出し得る。このような分析は、完了するには数日間までを必要とする。
【００１３】
何人かの研究者は、振動分光法（例えば、赤外線またはラマン）を用いて微生物を同定し得ることを提唱した。例えば、細菌の振動スペクトルは、非常に再現性が高く、そして異なる細菌について典型的な、指紋様のパターンである。インタクトな細胞が含まれるので、スペクトルは、細胞の総化学組成（タンパク質、膜、細胞壁、核酸など）の集積された「画像」である。細胞構成要素の数の多さによって、重なったスペクトルバンドは、スペクトル範囲全体を通して観察される。すなわち、このスペクトルは、別個のピークではなく、幅広でかつ複雑な外形を示す。個々の細胞構成要素についての情報の多くは、スペクトルの形の下に「隠される」；いくつかのバンドが、別個の官能基または化学下部構造に帰属され得るが、大多数は帰属され得ない。それゆえ、従来のスペクトル同定アルゴリズムを用いては、細菌のスペクトルを分類できない。しかし、他の型のアルゴリズム（例えば、パターン認識技術）が用いられている。例えば、ドイツの会社は、パターン認識アルゴリズムを利用する、フーリエ変換ＩＲ（ＦＴＩＲ）の原型を導入して、種へと、そして通常は株および／もしくは血清群（ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ）および／または血清型、レベルに分化する、３００を超える多様なグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌をそれらの振動スペクトルのみに基づいて同定した。それにもかかわらず、ＩＲは、いくつかの理由により、複雑なサンプル中の微生物の検出および同定のため（例えば、環境サンプルまたは臨床標本中の病原体の同定のため）の単独の機構としては用いられ得ない。第１に、各々数十万の異なる細菌種ならびに数百万の種の藻類、酵母およびカビ、芽胞、ウイルスおよび花粉（無数の他の粒状夾雑物をいうのではない）からの単一参照スペクトルから構成される参照ライブラリーを通して分別して、所定の未知の特異的同定を確実にするために必要とされるアルゴリズムは極めてわずらわしい；このようなデータベースを開発するために必要とされる努力および費用は非常に高価である。さらに、この問題は、それよりもさらにより複雑である。多くの種は、複数の株（いくつかは病原性であり、そしていくつかは病原性でない）から構成されるが、全て異なるスペクトルを示す。それゆえ、多くの参照スペクトルは、大部分の微生物種について必要とされる。さらに、同一の細菌懸濁物の異なるアリコートから得られるスペクトルは本質的に同一であるが、所定の株が異なる条件下で増殖する場合にスペクトルにおける変動性は増加する；それゆえ、各細菌株について、複数の参照スペクトルが必要である。従って、ドイツのＦＴＩＲを開発するために何年もかかっている；そしてその使用は、単離された細菌を非常に特異的なセットの条件下で培養して、細胞構成要素が、参照スペクトルを開発するために用いられた微生物の細胞構成要素と一致すること確実にすることに基づく。第２に、病原検出器は、純粋な培養物を分析するという贅沢さを有さない；これは、任意の可能な組み合わせの全ての任意の可能な濃度で可能なサンプル構成要素の全てのシグナルの混合物において病原体の特徴を検出し得なければならない。この要件は、アルゴリズムをなおさらに実質的に複雑にする。実際、パターン認識アルゴリズムは、混合物を分析するためにはほとんど適切ではない。なぜなら、これらは、定量的でないからである。ドイツのシステムは、個々の細胞から培養された純粋なコロニーのみを分析するように設計されている。第３に、妥当に迅速な応答時間を達成するために、検出器は、培養が必要でない十分な感度を提供しなければならない。微生物技術を用いてさえ、ドイツＦＴＩＲは、直径４０〜８０μｍのマイクロコロニーを必要とする（４０μｍのスポットは、約１０4の細菌細胞に対応する）。このバイオマスの要件は最少であるが、これらは依然として、好気性生物については６〜８時間の、そしてゆっくりと増殖する嫌気性生物についてはさらに長い、インキュベーション時間を引き起こす。ウイルスは容易には培養されないので、これらは、ＦＴＩＲアプローチによっては全く検出され得ない。そして、第４に、ＩＲ分析は、水と適合しない；細菌細胞内の最少量の水でさえ、特異的同定に必要とされる重要なＩＲ窓をマスクするに充分である。それゆえ、このドイツプロトコルは、乾燥工程を含む。
【００１４】
ラマンは、ＩＲと同じ程度に高く豊富なスペクトル情報を提供するので、ラマンは、細菌同定の単独の根拠としておよび／またはＩＲ分析と組み合わされた補助的な方法として役立ち得ることが示唆されている。ラマンの使用は、水からの妨害の問題を克服する。それにもかかわらず、ラマンは、ＩＲと同様に、ＩＲが使用され得ないのと全く同じ理由で、複雑なサンプル中の微生物の検出および同定に用いられ得ない。ＩＲのように、微生物のラマン同定について今日まで行われた研究は、厳密に制御されたセットの研究条件下で増殖させ、精製された微生物培養物を利用した。微生物内の異なる分類マーカーを選択的にプローブして、生物の正体についてのさらなる詳細を提供し、そしてさらなる特異性を獲得するために共鳴ラマン技術が用いられ得ることもまた示唆された。例えば、２４２ｎｍ、２５１ｎｍおよび２５７ｎｍの励起では、ヌクレオシド、核酸、キノンおよびジピコリネートからのシグナルが選択的に増強される。２３１ｎｍおよび２２２ｎｍの励起では、スペクトルは、ほとんど排他的にタンパク質芳香族アミノ酸ピークおよびプロリンピークを反映する。しかし、これらの研究は、微生物の同定のためのラマンの使用に固有の別の問題を強調した。いくつかの細菌細胞構成要素は、増殖周期における異なる時点の間で、または異なる環境条件に起因して、相対含量が広範に変化する。例えば、ＲＮＡ含量は、増殖速度の関数であるので、培養物の増殖周期の初期に励起されるスペクトルは、より後期の培養物から励起されるスペクトルよりもずっと強い核酸ピークを示す。同様に、特定の培養条件によってもたらされる芽胞形成は、選択された波長での細菌細胞のＲＲＳスペクトルに著しく影響を与え得る；内生胞子コアにおけるジピコリネートからのシグナルは、例えば、２４２ｎｍ、２５１ｎｍおよび２５７ｎｍの励起での、芽胞形成しているＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのスペクトルを特色付ける。所定の種のスペクトルにおいて見出されるバリエーションが多くなるほど、参照ライブラリー中に含まれなければならないモデルスペクトルが多くなり、そしてパターン認識アルゴリズムがより複雑になる。さらに、有用な分類マーカーをプローブするために目的のものであり得る多くのレーザー波長は、このアプローチについては用いられ得ない。なぜなら、この波長は、強い蛍光を誘導し、この蛍光は、ずっと弱いラマンシグナルを覆うからである。これらの問題に対する解決策は、提案されていない。ラマンまたはＩＲのいずれかによる微生物の同定は、純粋なコロニーの培養、続いて非常にわずらわしいデータベースの労力を要する分析を依然として必要とし、このプロセス全体は達成するために数日を必要とする。
【００１５】
多くの研究者は、バイオセンサーが、複雑なマトリクス中の微量成分の直接検出に必要とされる特異性を達成し得ると考える。バイオセンサーは、全ての他のデバイスおよびプロセスとは、これらが生物学的成分（例えば、酵素、抗体またはレセプター）を利用するという点で異なる。バイオセンサーでは、生物学的成分は、検体と結合し、そしてこうすることによって、「生物学的シグナル」を生じる。生物学的成分は、この「生物学的シグナル」を検出し得、そして電気シグナルへと変換し得る変換器と連結される。次いで、この電気シグナルを用いて、警告などの出力を生じ得る。理論的には、生物学的成分が検体を結合する際に示す例外的特異性は、同じ程度の特異性を有するバイオセンサーデバイスを生成し得る。
【００１６】
しかし、あいにく、先行技術のバイオセンサーは、「間接信号」をモニタリングする「非特異的」変換器を利用する。言い換えると、この変換器は、検体と直接関連しているかまたは検体自体によって引き起こされるシグナルを検出せず、むしろ、生物学的活性（例えば、基質の酵素触媒作用、イオンの通過を可能にするかもしくは妨害するレセプターチャネルの開口もしくは閉口、検体とタグ化された分子もしくは標識された分子との間の、抗体活性部位での結合についての競合）によって引き起こされるシグナルを検出する。各々の場合、非特異的変換器は、添加された試薬または二次的な化合物もしくは物質のいくつかの特徴をモニタリングする；これは、検体自体に特有であるかまたは固有の何らかの局面を測定も検出もしない。実際、変換器は、極めて非特異的なシグナルを検出するか、多くのサンプル構成要素はいくつかのシグナルを生じ得るか、または生物学的活性によって生じるシグナルのレベルを変更し得る。非特異的変換器は、違いを見分けることができず、そしてこれらの非特異的妨害に起因した誤った応答を与える。
【００１７】
例えば、酵素活性を阻害する検体を検出するように設計された、酵素に基づくバイオセンサーを例に挙げる。これらのデバイスでは、変換器は、消費された酵素基質、形成された酵素反応生成物または基質の消費もしくは反応生成物の形成によって引き起こされるいくつかのさらなる試薬における変化（例えば、基質消費または反応生成物形成に起因するｐＨの変化に起因する、色素の色の変化）にさえ起因するシグナルの変化を測定する。インヒビター、すなわち、検体が存在する場合、これは、酵素の活性部位を占め、その酵素がその基質を触媒するのを防止し、これは次いで、ｐＨの変化を防止し、それゆえ、色の変化を防止する。非特異的変換器は、色が変化しないことを「見」て、そしてこのことが、検体が存在することを意味すると「仮定する」。しかし、この検体自体は、色の変化を引き起こさず、さらに酵素に結合した検体は色を変化させない。同時に、検体に全体として関連しない他のサンプル構成要素はｐＨを変化させ得、それにより色を変化させるか；溶液を緩衝化し得、それによりｐＨにおける変化および続く色における変化を防止するか；基質もしくは反応生成物を加水分解し得、色における変化を引き起こすかもしくは予防するか；またはそれ自体がさらに着色され得る。変換器は、変換器は色を測定するだけであるので、差を区別できない。
【００１８】
レセプターベースのバイオセンサーは、非特異的な干渉物に対して、同様に感受性である。これらのデバイスにおいて、例えば、検体は、チャネルレセプターに結合し得、そのチャネルを開けるかまたは閉じ、それによりチャネルを通るイオンの流れに影響を及ぼす。バイオセンサーは、検体ではなく、イオン流中の変化を検出するレセプターに基づく。例えば、トランスデューサーは、電気容量を検出する。レセプターの周囲の膜のピンホールは、開かれたレセプターチャネルの場合、正確に同じシグナルを生成し、検体がレセプターに結合したかのように、非特異的なトランスデューサーの応答を引き起こす。
【００１９】
同様に、抗体ベースのバイオセンサー（免疫センサー）はまた、非特異的な干渉物に対して感受性である。免疫センサーは、通常、検体ではなく標識を検出するトランスデューサーを用いて、抗体上の結合部位に対して、標識アナログと検体との間で競合を確立する。例えば、標識は、蛍光団およびトランスデューサー（蛍光検出器）であり得る。検体が存在する場合、より少量の標識アナログが抗体に結合し得、そしてそのトランスデューサーは、より低いレベルの蛍光を「調べる」。次いで、トランスデューサーは、高い検体濃度と低い蛍光濃度を等しくする。しかし、多くの化合物は、自然に蛍光性であり；これらが抗体の近くの任意の表面上に吸収する場合、実際に検体が存在する場合、このトランスデューサーは蛍光を検出し、そしてこのことを検体の不存在として解釈する。あるいは、多くの化合物が蛍光を消光し；これらが抗体の近くに結合または吸着する場合、これらは、トランスデューサーが蛍光タグを検出することを妨げ、トランスデューサーを「だまし」、検体が存在しない場合に、検体が存在するかのように応答させる。
【００２０】
同様の非特異的な干渉物は、非特異的なトランスデューサーに基づく全てのバイオセンサーを困らせ、バイオセンサーデバイスの感度、特異性、および誤り検出比に影響を及ぼす。
【００２１】
非特異的な干渉物に加えて、特異的な干渉物（すなわち、検体に化学的に類似するサンプル成分）はまた、非特異的な伝達バイオセンサーに対して問題を引き起こし得る。ほとんどの生物学的成分は、ただ１種類の検体ではなく、多くの構造的に類似の化合物と結合または相互作用する。例えば、酵素コリンエステラーゼ（これは広範に研究され、そして神経ガスの検出のために使用される）は、目的のたった３種類の神経ガスではなく、およそ３００種類の異なる有機リンおよびカルバメート化合物により阻害され得る。任意のインヒビターは、酵素活性に影響し、これにより、トランスデューサーにより検出されるシグナルに影響する。たとえインヒビターが存在しても、トランスデューサーが検出するシグナルは同じであり、シグナルの強度またはシグナルの強度が変化する割合のみ、異なり得る。従って、非特異的なトランスデューサーは、１種類以上のインヒビターが存在することを決定し得るが、サンプルに存在し得るインヒビターの種類、または異なるインヒビターの数をでさえ、決定し得ない。同様に、いくつかの異なる毒素は、レセプターチャネルの開閉に影響し得、キャパシタンストランスデューサーは、影響された流れを決定し得るが、応答し得る毒素または毒素の混合物の種類を決定し得ない。同様に、抗体は、１を超える抗原またはハプテンと「交差反応」し得、免疫蛍光バイオセンサーは、存在する抗原またはハプテンの種類、またはサンプル中に複数の交差反応性種が存在するか否かをさえ、識別し得ない。
【００２２】
従来のバイオセンサー技術は、化合物を具体的に同定し得ないので、各々の検体について異なるトランスデューサーならびに異なる生物学的成分を使用することなく、１種類を超える検体を検出および同定し得るバイオセンサーを設計することは、不可能であり、各々についての異なるトランスデューサーおよび生体物質を使用することなく、１種類以上の検体を定量し得るバイオセンサーを設計することは、不可能である。それゆえ、所定のサンプルまたは材料内で同定および/または定量されなければならない検体数が増加するにつれて、バイオセンサーのサイズおよび複雑性が増加する。
【００２３】
ほとんどのバイオセンサーのプロセスおよびデバイスは、生物学的成分が検体に曝される場合に、検体が水溶液に存在することが必要とされ、そして生物学的成分は、溶液または溶媒中で連続的に存在する。それゆえ、バイオセンサーが風媒性の蒸気またはエアロゾルを検出するために使用される場合、サンプル気体は、始めに、水性の収集流体中に洗い込まれ、そして次いで、この流体は、生物学的成分に取り入れられる。液体洗浄は、任意の自動化システムの複雑性および費用を増加し、そしてシステムは、十分な水の供給の近くで使用されることが必要とされる。さらに、バイオセンサー装置の有効期限または作動期限は、限定され得る。なぜならば、生物学的成分は、しばしば乾燥した場合よりも溶媒和された場合のほうが安定性が劣るからである。
【００２４】
従来のバイオセンサー技術の別の主な欠点は、生物学的成分の相対的な脆弱性に起因する。多くの生物学的成分（特にタンパク質（例えば、酵素および抗体）および複合体（例えば、レセプター））は、種々の機構により容易に変性（すなわち分解または不活性化）される。この機構としては、熱、ｐＨの変化、機械的摂動、または非水性溶媒、界面活性剤もしくはプロテアーゼの存在が挙げられる。多くのバイオセンサーは、生物学的成分を固定するための手法としての単純な吸着に依存し、表面が任意の時間水に浸された場合に、吸着された生物学的成分は、表面から浸出し得る。今日までに、認識されるか、研究されるか、または特許にされた任意のバイオセンサー技術を用いて、バイオセンサーの応答がこれらの機構のいずれかにより影響されてきたのか否かを決定することは不可能であり、すなわち、生物学的成分が浸出したか否か、熱的もしくは化学的もしくは生物学的に変性されたか否か、あるいはｐＨの局在的な変化または補助因子の存在もしくは不在などにより改変されるその結合速度論を有したか否かを決定することは不可能である。検出されない生物学的活性の損失は、誤った応答の原因となる。
【００２５】
さらに、従来のバイオセンサーが大量に生産される場合、生物学的成分の固定化が破壊試験を実施することなく、首尾よく完了したか否か（すなわち、正確な量の生体物質が固定されたか否か、固定された調製物が全て反応性であるかまたは部分的に反応性であるか、そして/または、生体物質が正確な配向で存在するか否か）を決定することは、不可能ではないが通常困難である。同様に、任意の時間保存された生物学的成分の反応性は、破壊試験を実施することなく評価または決定され得ない。従って、製造または保存されたバイオセンサー生成物のロットを評価するための唯一の方法は、生成または保存される固定された生体物質の各々のバッチに対して無作為抽出を行い、そして制限された数の固定した生物学的な品目について破壊試験を実施することである。
【００２６】
実際、生体物質が、任意の方法（例えば、合成、抽出、生成、凍結乾燥、結晶化および／または固定化）で処理される場合、生物学的活性の一部または全ては、失われるかまたは破壊され得る。それゆえ、多段階プロセス中の各々の工程で時折、得られた調製物の生物学的活性を測定することが必要である。従来の生物学的活性のアッセイのいくつかとしては、分光学的技術（例えば、蛍光タグの結合がモニターされる免疫アッセイ、または色のある反応生成物の形成がＵＶ−可視吸光度により測定される酵素アッセイ）が挙げられる。他の生物学的活性のアッセイとしては、例えば、放射性タグが挙げられる。生物学的活性を測定するためのほとんど全ての従来のアプローチが破壊的であり、すなわち調製物の各々のロットのアリコートがアリコート中の生体物質を消費または汚染する試験に供される。例えば、固定された酵素調製物の生物学的活性を決定するために、基質が固定された酵素のアリコートに加えられ、そして基質が反応性生物の転換される速度が決定され、抗体調製物の結合能を決定するために、タグをつけられた抗体または標識抗原が抗体のアリコートに加えられ、そして抗体に結合する標識の量が測定される。多くの他の、よりさらに骨の折れる技術がまた、アミノ酸配列決定、クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動などを含む、生物学的産物の製造の間の種々の段階で、生体物質の状態を評価するために使用され得る。全てのこれらの手順は、時間がかかり、そして非常に熟練した技術者を必要とする。
【００２７】
抗体は、それらの高度な特異性および親和性、目的のほとんどの検体に対する抗体を惹起する能力、およびバルクにおいて比較的容易かつ廉価に、均一な物理的特徴および化学的特徴を有するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）を生成する能力に起因して、バイオセンサーにおける使用のためにますます普及しつつある。しかし、検体に対する抗体の高い親和性は、主要な不利点ならびに利点である。ほとんどの免疫センサーは、競合結合スキームを使用し、ここで検体（例えば、コカイン）は、抗体結合部位についてタグ化したアナログ（例えば、蛍光標識したコカイン）と競合する。一旦、いずれかのリガンドが抗体の活性部位に結合すると、この抗体は、再使用され得ない。各々、全てのサンプルについて、抗体およびタグ化したアナログの両方が消耗され、そして放棄および置換されなければならない。
【００２８】
抗体および試薬の頻繁な置換は、高価なだけでなく、バイオセンサーの操作ならびに供給計画を複雑にする。これにより、抗体が再使用され得るように、結合検体および／または標識アナログを除去するための効率的かつ実際的な方法を見出すことに、顕著な労力が費やされている。現在研究中であるこのアプローチは、２つの広範なカテゴリーに分割され得、１つは抗体の再生に基づき、他方は、抗体結合の可逆性に基づく。
【００２９】
抗体が、免疫複合体を解離することおよびカオトロピック剤でリガンドをリンスして除くことにより、再生され得ることは、長い間から既知であった。カオトロピック剤は、抗体の局所的な環境において劇的な変化を引き起こすことにより、抗体、リガンド、またはその両方において顕著なコンフォメーション変化を誘導する。最適な抗体活性は、一般的にｐＨ６〜８の範囲で生じるため、媒体のｐＨまたはイオン強度を変化するカオトロピック剤は、抗体の可変Ｆａｂ領域を「開ける（ｕｎｚｉｐ）」。効果的なカオトロピック剤としては、グアニジン塩酸塩、チオシアン酸カリウム、ＨＣｌ、エチレングリコール、ドデシル硫酸ナトリウム／尿素、およびプロピオン酸が挙げられる。リガンドが放出され、そして洗い流された後、この抗体は、中性ｐＨで再生することにより本来のコンホメーションに回復する。より最近の研究は、抗体を再生するための温度摂動のできる限りの使用、またはバルク溶媒の極性を減少することにより、リガンド結合に対する疎水性効果の寄与を減少することに焦点を当ててきた。両方のこれらの後者のアプローチはまた、抗体における顕著なコンフォメーション変化を引き起こし、そしてそれらが使用された後、この抗体は、処理を逆行させること（すなわち、冷却することか、または溶媒の極性を増加すること）により再生されなければならない。不運にも、たとえどのアプローチが使用されても、顕著な量の抗体の結合能が各々の解離／再生サイクルで失われ得る。通常、十分な能力が失われるので、この抗体調製物は、６〜１０サイクルごとに廃棄および置換されなければならない。さらに、能力の損失は、サイクルごとに、予測不可能に変化する傾向にある。先行技術のバイオセンサーは、各々のサイクルがどの位の効果を抗体能力に対して有するかを決定し得ないので、再生プロセスは、検体の定量化において、確度または精度を必要とする任意の適用に使用され得ない。
【００３０】
再生に対する代替物は、抗体結合の可逆性に基づく。固定された抗体の結合部位が始めに標識リガンドで事前に飽和されている場合、検体を含むサンプルは引き続いて導入され、標識アナログは、検体により「置換」されることは、既知である。１つの置換のアプローチ（「バイオアフィニティー」と呼ばれる）では、事前に飽和された抗体は、半透膜（すなわち、高分子量の標識アナログに対してではなく、低分子量の検体分子に対して透過性である膜）内に囲まれる。非標識検体を含むサンプルが導入される場合、この検体は、この膜を通って拡散し、そして抗体結合部位から標識アナログを置換する。置換された標識は、膜により抗体の近位に保持され、そして検体の濃度が連続して低下する場合、標識アナログが抗体の結合部位に対してより有効に競合し、そして結合検体が次第に置換されるにつれて、それはこの膜を通って拡散し、この結果、全ての検体が通過し、そして全てのアナログが結合されるまで、よりさらに濃度を低下する。トランスデューサーは、結合し続ける標識か、または置換される標識のいずれかからのシグナルをモニターし得る。バイオアフィニティーのアプローチは、いくつかの魅力的な特色を提供する。例えば、抗体も標識リガンドも分析の間は消耗されず、これにより、消耗物を大きく減少し、較正条件を単純化し、そして所望ならば、「リアルタイム」のモニターを設計することを可能にする。しかし、検体が膜を通って拡散するために必要な時間は、応答時間および回復時間の両方を増加する。さらに、半透膜に対する必要性のために、バイオアフィニティーデバイスは、比較的低分子量の検体の検出のみに対して適切である。最後に、バイオアフィニティーセンサーは、任意の他の免疫センサーのアプローチとして、同じ宿主の非特異的な干渉物および特異的な干渉物に対して感受性である。
【００３１】
より最近、標識アナログがフレキシブルな化学的な連結を介して抗体に付着される新たな可逆的抗体技術が、発明された。検体の不在下では、アナログ部分は、抗体の活性部位を占有する。検体を含むサンプルが導入される場合、この検体はアナログを置換し、それはバイオアフィニティーセンサー中でも同様に起こり、そしてバイオアフィニティーセンサー中のように、このアナログは決して系から漏れない。しかし、バイオアフィニティーセンサーと異なり、このアナログは、膜によるのではなく、フレキシブルな連結により抗体の近位に保持される。周囲の媒体中の検体の濃度が減少する場合、「捕獲性」のアナログは、抗体の結合部位に対して再度、効率的に競合し得、いかなる部分的または一時的な抗体変性を伴わずに、検体結合を逆進させ、これによりいかなる抗体能力の負の影響も伴わずにベースラインに対してセンサーを修復する。この新たなアプローチは、「Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ（ＲＣＲＵ）」（特許第５，１５６，９７２号、１９９２年１０月２０日、「Ａｎａｌｙｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｅｎｓｏｒ ｗｉｔｈ ａ Ｌｉｇａｎｄ ａｎｄ ａｎ Ａｎａｌｏｇｕｅ Ｂｏｕｎｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｅｎｓｉｎｇ Ｓｕｒｆａｃｅ」、Ｄ．Ｉｓｓａｃｈａｒ）と呼ばれ、種々の非特異的な形質導入免疫センサー（例えば、免疫蛍光技術）の使用について提案されてきた。これはまた、ＲＣＲＵ構想が他のタイプの生物学的成分（例えば、他のタイプのタンパク質（レクチン、抗体フラグメント、ポリペプチド、合成ペプチド、およびレセプター））を使用することを明示する。従って、抗体の使用では検出され得ない非常に低分子量のハプテンを含む、広範な検体の特異的な検出のためにＲＣＲＵベースのバイオセンサーを設計することは可能である。そして半透膜が存在しないため、高分子量の検体の検出についても同様に可能である。しかし、ＲＣＲＵのアプローチは、バイオアフィニティーに関連するいくつかの制限（例えば、応答時間および回復時間ならびに分子量制限）を排除し、そしてまた検出され得る異なる検体の数を拡張するが、ＲＣＲＵのアプローチは、先行技術の非特異的な形質導入に対する非特異的な干渉物および特異的な干渉物の影響に関連する問題を被る。
【００３２】
非常に希薄な検体濃度の検出を意図する、ほとんどの任意のデバイスまたはプロセスは、−従来の器具使用（例えば、ＩＲ分光法またはラマン分光法）、またはより新規なバイオセンサー技術のどちらに基づこうと−サンプル体積に関して検体を濃縮し得るサンプリングシステムまたはサンプリングプロセスと組み合わされ得る。例えば、固体吸着剤システム（例えば、活性炭、テナックス（ｔｅｎａｘ）、もしくは石英ファイバー束）または液体洗浄システムは、気体サンプルを濃縮するために使用され得る。固体吸着剤が使用される場合、始めに、大きい体積の気体が、固体吸着剤を通して吸引され、検体が吸着剤の表面上に吸着することを可能にする。次いで、サンプリング気体を遮断し、そして小さな体積の加熱された気体が固体吸着剤を通して流され、検体を脱着し、そして検出器へのサンプル伝達ラインを通して、濃縮された検体分子を流す。しかし、このようなサンプリングシステムまたはサンプリングプロセスは、これら自身の多くの欠点を有する。吸着の間に検体分子を収集するときに固体吸着剤を効果的にするこれらの同じ特質はまた、吸着の間、表面に検体を保持させ、そして首尾よく追い出された「粘着性」分子は、サンプル伝達ラインの壁上に再吸着する傾向にあり、決してトランスデューサーに到達しない。このことは、減少された全体的な感度の原因となる。さらに、表面吸着は、比較的非特異的な機構であるので、多くの他のサンプル成分が濃縮され、そして検体に加えてトランスデューサーに輸送され、バックグラウンドの「ノイズ」を増加し、そして誤った警告および感度のさらなる減少に寄与する。干渉物が持続的に付着し得、表面を次第に汚染し、そして検体に吸着させず、そして標準検体を用いる頻繁な較正のみがこの特異的な問題を検出し得る。液洗浄装置は、煩雑であり、消耗物−例えば水−を必要とし、そして暑く湿気の多い気候では、オーバーフローする傾向がある。固体吸着剤と同様に、液体洗浄装置は非特異的である。すなわち、これらは、検体に加え、数百の他の成分を収集しそして濃縮し、これによりバックグラウンドのシグナルまたはノイズを増加し、そしてさもなければ清澄なサンプルを用いて達成される感度を減少する。固体吸着剤をよび液体洗浄装置の両方は、バッチサンプラーであり、これは、検出器が低い検体濃度よりも高い検体濃度にもはや素早く応答し得ないことを意味する。両方とも「ゴースト」（すなわち、１回のサンプリングサイクルで収集された高濃度の検体のによりサンプラーまたは伝達ライン中に残った、残渣の検体）を生成する。次いで、これは、続くサンプリングサイクルで流し出され、誤った警告を生成する。いずれの設計の高体積のサンプラーも大きく、そして操作のために有意な量の電力を必要とする傾向にある。
【００３３】
従って、広範なサンプル調製を伴わない複数の検体の直接的な分析および特異的な同定を提供する方法論および装置に対して必要性が存在することは、明らかである。
【００３４】
検体が微量の検体の信頼の置ける分析のために他のサンプルの成分から収集され、濃縮されそして単離される、ラマン分光法に基づく改良されたプロセスおよび装置に対して必要性が存在することはまた、明らかである。
【００３５】
信頼の置ける分析および／または特異的な同定および／または微量の検体の定量のために、モニターされている「生物学的シグナル」または二次シグナルよりもむしろ、検体自体が検出され、そして特異的に同定されるバイオセンサー技術に基づく改良されたプロセスおよび装置に対して必要性が存在することはまた、明らかである。
【００３６】
変性、不活性化、汚染または浸出された生体物質に起因する誤った応答を妨げるために、生物学的成分自体が直接的にモニターされるバイオセンサーに基づく改善されたプロセスおよび装置に対して必要性が存在することはまた、明らかである。
【００３７】
製造を最適化するため、そして貯蔵の間の産物の分解を検出するために、生物学的調製物（例えば、固定化生物学的産物）の直接的な非破壊分析を提供する方法論および装置に対する必要性もまた、存在することはまた、明らかである。
【００３８】
検体、および検体のみが収集され、そして濃縮されて、そしてそれにより分析の前に他のサンプル成分から分離される特定のサンプル濃縮アプローチに対して必要性がまた、存在することもまた、明らかである。
【００３９】
（発明の簡単な説明）
リガンドと生体高分子との間の結合の、３次元構造ならびに生物学的物質およびリガンド自体の分子内−分子間相互作用に対する影響と一緒に、生体物質およびリガンドのラマンスペクトルにおいて観測可能であるような両方の物質の通常のモードの振動の周波数および形態に対して生じる影響において反映されるように、ラマンスペクトル情報と生物学的物質の構造および化学との間の固有の相関が、検体の存在を検出するためのかなり特異的なプロセスおよびデバイスのための基準として使用され得る。ここで、所定の検体を検出するために、その検体がリガンドである生体物質（すなわち、その活性部位でその検体を結合し、従って、生体物質−検体（生体物質−リガンド）複合体を形成し得る生体物質）を使用することが可能であることが見出された。その生体物質の適切な選択によって、ラマン分光法技術および計装の思慮深い選択と共に、この検体の存在によって誘導されるこの生物学的物質のラマンスペクトルにおける変化は、検体が存在することを決定するために使用され得る。実際に、ラマン効果において観測される周波数、強度、および分極状態を分析することによって、単一の所定の生物学的物質と相互作用し得る複数の検体（リガンド）のそれぞれが、個々に、かつ特異的に同定される。例外的なサイズおよび多くの生体物質の複雑性、ならびにそれらのスペクトルの生じた複雑性にも関わらず、所定の検体は、所定の生体物質のラマンスペクトルに対する著しい影響を有し得る。この影響は高度に再現性があり、そして生体物質の活性部位に結合される検体に完全に固有である。生体物質に結合し得る複数の検体（および交差反応性電位干渉物（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｔｓ））は、そのサイズが非常に小さい場合においてさえ、各検体の結合は、固有の化学物質の生体物質−検体複合体を生じ、従って、固有のラマンスペクトルを生じる。この寄与は、検体の検出および同定において種々の方法で使用され得ることがここで見出された。例えば、生体物質のベースラインスペクトルが得られ得る。次いで、生体物質が、分析される物質（すなわち、検体を含む）と接触されると、ラマンスペクトルがモニタされ、ベースラインスペクトルに対して比較される。ベースラインスペクトルにおける変化は、生体物質に結合し得る１つ以上の物質が存在することを意味する。この物質が、単一検体の存在または量によってのみ異なり得ることが知られているならば、生体物質のスペクトルの変化は、検体が存在するに違いないことを示す。特定の同定（および、特に、組成が広範囲に変化し得る物質での使用において）に対して、参照スペクトルが得られ得、その後分析が開始される。これらの参照スペクトルは、例えば、複数の生体物質−検体複合体のスペクトルを含み得る。次いで、生体物質は、分析される物質に曝露され、そしてそのスペクトルが、上のようにモニタされる。スペクトルの変化が観測される場合、この新しいスペクトルは、参照スペクトルのライブラリーに対して比較される。この新しいスペクトルが、参照スペクトルの１つと適合する場合、特定の生体物質−検体複合体が、規定によって、形成されたに違いなく、従って、特定の検体が、物質中に存在しなければならない。
【００４０】
活性部位における検体の存在は、新しい化学部分（すなわち、検体自体（または、例えば、酵素−インヒビター複合体に場合には、検体残基））の存在に単に起因して、ラマンスペクトルに存在する新しい線を生じる。このような線に関連する波長がモニタされ得、線が出現する場合、検体の存在および／または同一性が推論され得る。加えて、生体物質と検体（または、例えば、酵素−インヒビター複合体の場合においては、検体残基）との間に形成された結合は、その検体の検出および分析において使用され得るラマンスペクトル中の新しい線の形成によって反映されることが見出された。さらに、生体物質自体中の結合または部分に関連するラマン線は、所定の検体に結合することによって、固有に影響され得、従って、生体物質中のラマン線が、検体を検出し、そして同定するためにモニタされ得ることがここで見出された。同様に、所定の生体物質は、生体物質に結合した検体または検体残基のラマンスペクトルに対して影響を有し得、そして結合された分析部分内の結合または部分に関連したラマン線が、結合していない検体、生体物質中または生体物質と検体との間の結合または部分に関連した線の代わりに、またはそれに加えて、モニタされ得ることが見出された。
【００４１】
微生物、血球および感染した組織細胞のような個々の細胞が、例外的に大きく、そして複雑な化学物質であると考えられ得、そして、それ自体、完全に固有なラマンスペクトルを保有する。このような細胞に結合し得る生体物質およびラマン技術および計装の思慮深い選択によって、生体物質−細胞複合体のラマンスペクトル分析を使用して、複合体内に結合された細胞の存在を検出し、そしてその細胞を固有に同定し得ることがここで見出された。あまり複雑でない検体における場合のように、生体物質に関連したラマンスペクトル線、生体物質と細胞との間の結合に関連した線、および／または細胞自体に関連した線は、検出および同定プロセスにおいて使用され得る。生体物質−検体複合体のラマンスペクトル分析を使用して、通常、「細胞」を含まないと考えられるウイルス、胞子、および花粉のような他のタイプの微生物を同定し得ることがここで見出された。
【００４２】
ラマン散乱の強度は、照射された分子の数に比例することが知られている。ラマン分光法技術を使用して、生体物質と相互作用した検体、モニタされるラマンスペクトルの部分が、検体内の結合、検体と生体物質との間の結合、または生物学的物質自体内の全体の結合に関連するかどうかの定量的測定を実施し得ることが見出された。
【００４３】
サンプルが、任意の物理的状態において、ラマン分光法技術によって試験され得；スペクトルが、純粋な液体、溶液、結晶、多結晶性粉末、繊維、および表面フィルムから得られ得ることが知られている。生物学的物質が溶媒和され、部分的に水和され、または実質的に乾燥していようといまいと、検体が生物学的物質と相互作用し、そして生物学的物質によって結合され；そして、そうしている間に、完全に溶媒和した生体物質と相互作用する場合のように、生体物質が本質的に乾燥している場合、検体は、生体物質のベースラインラマンスペクトルに対して、同じタイプの変化を生じることがここで発見されている。従って、本質的に乾燥した、または部分的に水和した生体物質が、風媒性の蒸気または微粒子の直接検出および分析において使用され得、ならびに、溶媒和した生体物質が、溶解または懸濁された検体の直接検出および分析において使用され得ることがここで見出された。
【００４４】
所定の分析のために使用され得る生体物質およびラマン技術および計装の選択は、検体（単数または複数）、分析される物質、所望される情報に依存する。広範囲の技術および計装（例えば、ＲＲＳおよびマイクロプローブ技術を含む）を効率的に使用して、所望の特異性および感度を獲得し得ることが示されている。生物学的物質が、適切に固定化される場合、それらの結合活性を保持し、そしてこの固定化状態にいる間、検体と相互作用および結合し、そして生体物質−検体複合体が、生物学的物質が溶液または懸濁液中にある場合のように、固定化された生体物質で形成される場合、ベースラインラマンスペクトルにおいて同じ種類の変化を示すことがここで見出された。さらに、生体物質が、金属表面上に、適切に固定化される場合、生体物質および生体物質−検体複合体は、表面増強現象に起因する、ラマンシグナルの増強を示すことがここで発見された。従って、ＳＥＲＳおよびＳＥＲＲＳ技術を使用して、生物学的物質に結合し、そして捕獲された検体の検出および同定において、感度および特異性を獲得し得る。
【００４５】
ＳＥＲＳ技術は、微生物検体の同定を非常に簡単化するために利用され得ることが見出された。上記のように、ＲＲＳは、微生物内の選択分子の調査し、そしてそれによって、特異性を得るための非常に強力な道具であり得る。また、多くのレーザー波長が、微生物分析のために使用することができない。なぜなら、それらは、蛍光を激しく誘導するために、強いＲＲＳシグナルでさえ圧倒してしまうからである。蛍光を消光するためにＳＥＲＳを使用することによって、同時にＲＲＳシグナルを増強しながら、非常に広い範囲の波長を使用して、非常に広い範囲の細胞構造および成分における共鳴を誘起し得ることがここで見出された。少なくとも、ＳＥＲＳは、可視領域で励起された病原体からの強い、蛍光のないラマンシグナルの生成を可能にし得、ここで、レーザーは、小さく、低出力であり、容易に利用可能であり、丈夫であり、そして高価ではない。第２に、上記のように、いくつかの細菌細胞構築物は、増殖サイクルにおける異なるポイント間に、または異なる環境条件に起因して、相対的な含量が広く変化する。このような可変性は、細胞壁または細胞膜からのスペクトル寄与よりもむしろ細胞質構築物からのスペクトル寄与において、主に観測され；スペクトル情報が、細胞表面マーカーからの寄与に限定される場合、可変性の多くが排除され得るために、スペクトルシグナルが、細胞表面マーカーおよび可変性細胞質構築物の両方からの寄与の組み合わせである場合、スペクトルは、増殖／環境条件の段階に依存し得る。ＳＥＲＳ効果が、粗い金属表面に極端に近接した分子に制限されるので、ＳＥＲＳは、細胞表面構造を選択的にプローブすることが見出された。例えば、２５１ｎｍでの励起を使用して、ジピコリネートにおける共鳴を誘起することなく、キノンからの表面増強共鳴散乱（ＳＥＲＲＳ）スペクトルを生成し得；そして２２２および／または２１８ｎｍでの励起を使用して、ＲＮＡ含有物からの混同を導入することなく、タンパク質からのＳＥＲＲＳスペクトルを生成し得ることがここで見出された。可変性の細胞質構築物からのスペクトル寄与を排除することによって、本発明は、潜在的に誤った応答の１つの源を排除し、そして複合体混合物またはサンプル中の微生物の信頼のおける同定において必要とされるデータベースを単純化する。
【００４６】
さらに、粗い電極が、ＳＥＲＳ−活性表面として使用され得、そして電極電位の変化を使用して、生体物質および／または生体物質−検体複合体の配向を調節し得、それによって、表面に最も隣接した部分を調節し、それによって生体物質および／または生体物質−検体複合体内の部分からのシグナルの増強の程度を調節することがここで見出された。従って、電極を使用して、検体検出および分析プロセスの感度および特異性の両方を、検体の存在および／または同一性に固有な選択されたラマンバンドの増強を最大にするように電位を設定することによってか、または電位をサイクルさせ、そして種々の電極電位において生成する参照スペクトルのライブラリーに対する比較のために、多重スペクトル（すなわち、いくつかの電極電位のそれぞれにおいて生成されるスペクトル）を生成するかのいずれかによって、増強し得る。
【００４７】
最終的には、生体物質−検体の複合体に関して、十分に反応性の形態、熱的または化学的に変性された形態、および固定化された形態の所定の生体物質は、異なる三次構造および分子内相互作用を有する、本質的に異なる化学物質であることが、公知である；従って、十分に反応性の形態、熱的または化学的に変性された形態、および固定化された形態の所定の生体物質は、異なりかつ独特のラマンスペクトルを有する。ラマン分光学は、変性、化学的な改変、凍結乾燥、および結晶化の結果として生じるコンホメーション変化を試験するために非常に有用であることが公知である。しかし、生体物質のコンホメーションと、リガンドと結合または複合体化するための生体物質の能力（本明細書中以降「反応性能力」とよばれる）との間の直接的な相関性は、以前に全く注目されなかった；代わりに、リガンドと複合体化する生体物質の能力の評価についての全ての先行技術は、複合体形成の実測（すなわち、上記に議論されるような、破壊的生物学的活性アッセイを介する）に基づいていた。しかし、生体物質のラマンスペクトルとその反応性能力との間には、実際に直接的な相関性が存在し、そしてこの反応性能力分析が、生体物質の潜在的生物学的活性の予測について、および潜在的生物学的活性の変更に対して寄与する原因となる因子の決定についての両方の有用な非破壊的機構であることが、現在示されている。実際、反応性能力分析は、「検体」（すなわち、原因となる因子）の検出のための４工程プロセスであるとみなされ得る。第１に、生体物質を、「検体」との接触させる。この「検体」は、例えば、生体物質と「複合体化」し得る（すなわち、変性した生体物質、変更された酸化状態、変更された凝集状態、変更されたペプチド骨格構造などの特徴である化学変化が誘導されるような様式において、生体物質と相互作用し得る）熱または化学物質であり得る。化学物質または微生物の検体に関して、生体物質におけるこれらの化学変化は、生体物質のラマンスペクトルにおいて反映され、そして「生体物質−検体の複合体」の特徴であり、そしてこれらに独特である（すなわち、熱的もしくは化学的に変性された生体物質または酸化もしくは還元された生体物質の特徴であり、そしてこれらに独特であるなど）。従って、目的の生体物質からのラマンスペクトル情報の作成、およびその後の、既知の生物学的活性の生体物質（すなわち、生物学的活性が従来の活性アッセイを使用してその後に測定された、部分的または完全に変性された生体物質）のモデル参照スペクトルのライブラリーとの情報の比較を通じて、「複合体」を形成した「検体」（すなわち、生体物質を部分的または十分に変性させた因子）を同定して、それによって、サンプル材料の潜在的生物学的活性を予測することが可能である。
【００４８】
さらに、複数のこのような「複合体」（すなわち、混合物中の所定の生体物質の複数の別々の形態）の各々を検出し、そして定量し得ることが、現在見出されている。化学物質および微生物の検体に関して、生体物質の状態を変性させるかまたは変更する因子は、独特なスペクトルを有する生体物質の形態を生じる。同じ生体物質のいくつかの異なる形態が存在する場合であっても、それらは、それらのラマンスペクトルを通して、個別に同定され、そしてさらに定量され得る。従って、材料における条件は、いくつかの生体物質が完全に変性され、そしていくつかが十分な生物学的活性を保持するようである場合でも、ラマン反応性能力分析は、存在する各形態の量、それによって、混合物の全体的な反応性能力（すなわち、全体的な潜在的生物学的活性）を決定するために使用され得る。
【００４９】
従って、ラマン分光学的ツールは、本発明に従って行われる検体の検出および分析の間に、バイオセンサープロセスまたはデバイスにおいて生物学的成分自体を非破壊的にモニターするために使用され、生体物質が十分に反応性であり、そしてそれらの検体を結合し得るか否かを決定し得る。例えば、参照スペクトルは、生体物質−検体の複合体からのみではなく、変更した反応性能力を示す種々の形態の生体物質からもまた、得られ得る。次いで、ベースラインのラマンスペクトルが、材料の分析の間（例えば、空気の連続的モニタリングの間）、モニターされているので、このベースラインスペクトルにおいて観察される任意の変化は、種々の生体物質−検体の複合体の参照スペクトルに対してのみではなく、種々の形態の生体物質の参照スペクトルに対してもまた比較され得る。ベースラインスペクトルが、変性もしくは部分的に変性されたもの、またはそうでなければより反応性が小さい形態の生体物質に対応するスペクトルに変化する場合、この情報は、生物学的活性における変化の影響を和らげるために使用され得る（例えば、サンプリング速度の調整、検体を定量するために使用される数学的操作の改変、またはさらに生体物質の置換）。それ故に、本発明に従って、生体物質自体のラマン反応性能力分析は、先行技術のバイオセンサーで遭遇する最も深刻な問題のうちの１つ（すなわち、生物学的物質の相対的脆弱さ）を修正するために使用され得る。
【００５０】
さらに、微小環境に囲まれている生体物質、特に、固定化された生体物質は、バルク（ｂｕｌｋ）媒質の環境（すなわち、周囲の溶液または空気）とは非常に異なり得ることが公知である。従って、生体物質のラマン散乱スペクトルをモニターし、そして反応性能力分析を実行することによって、生体物質の状態について（すなわち、生体物質における微小環境およびその微小環境の影響について）例えば、バルク媒体のｐＨ、温度、またはイオン濃度をモニターすることによって達成され得るよりも、はるかに多くの情報を得ることが可能であることが、現在、見出されている。従って、ラマン反応性能力分析は、生物学的活性に有害に影響する所望されない環境因子を同定するために（および修正するために）使用され得る。例えば、ラマン反応性能力分析は、高いｐＨに起因する減少した生物学的活性に特徴的な生体物質の形態を検出し得、一方、材料は、検体についてモニターされている；いくつかの酸または緩衝液は、最適な生物学的活性に適切なレベルにｐＨを調整するために添加され得る。
【００５１】
本発明に従うラマン反応性分析技術は、化学物質または微生物検体の検出の間以外の時間およびそれ以外の方法にて使用され得ることが、留意されるべきである。例えば、これは、生体物質がバイオセンサーでの後での使用に意図されるか否かおよびこのバイオセンサーがラマン変換器を利用するか否かにかかわらず、合成調製物、抽出調製物、精製調製物、凍結乾燥調製物、結晶化調製物、および／または固定化調製物を含む生物学的調製物の製造および貯蔵の間に使用され得る。例えば、固定化された酵素調製物は、所定の反応生成物を合成するそれらの能力を予測するために分析され得る（この実施例において、「検体」は、生体物質を固定するために使用されるプロセスである）。モデル参照スペクトルのライブラリーは、生物学的活性が従来の酵素活性アッセイ技術を使用して決定されている、多数の異なる固定化調製物から調製される。分析されるべき固定化された調製物は、適切な波長の照射に曝され、その得られたラマンスペクトルは、収集され、そして処理され、次いで、この調製物の測定されたスペクトルは、この調製物の反応性能力を決定するために、モデル参照スペクトルのライブラリーに対して比較される。この反応性能力分析は、例えば、調製物のバッチをスクリーニングして、不適切に処理されている調製物を同定するか、または貯蔵の間に分解した生物学的調製物を検出するために使用され得る。同様に、反応性能力分析は、抽出、精製、化学的な改変、合成もしくは生合成、凍結乾燥、および結晶化の手順（所望の場合には、インサイチュ）をモニターして、収量を最適化するために、不適切に処理された調製物を同定するためにバッチをスクリーニングするために、貯蔵の間に分解した調製物を検出するためなどに使用され得る。
【００５２】
最終的には、本発明は、生体物質の狭いカテゴリーに制限されないことが発見されている。先行技術のバイオセンサー技術は、しばしば、単一の型の生物学的成分に制限される。例えば、ほとんどの蛍光バイオセンサー技術は、抗体を用いて使用され得るのみである；それらは、酵素、レセプター、または核酸を用いて使用され得ない。ほとんどの電極バイオセンサー技術は、特定のカテゴリーの酵素を用いて使用され得るのみである；それらは、他の型の酵素、または抗体もしくは核酸もしくはレセプターを用いて使用され得ない；など。しかし、生体物質と複合体化した検体の検出および同定のためのラマン散乱スペクトル分析は、記載されるように、実質的な任意の生体物質（タンパク質およびタンパク質複合体、核酸材料、アクセプターおよびレセプター、ペプチド、レクチン、サッカリド、糖質、脂質および脂質複合体、他の生物学的高分子および複合体、リガンド（例えば、抗原、ハプテン、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト）ならびに膜、オルガネラ、細胞、および組織でさえも含む）を用いて使用され得ることが現在示されている。同様に、ラマン反応性能力分析（すなわち、ラマンスペクトル情報からの、リガンドとの複合体を形成するそれらの潜在的能力の予測）は、この広範な範囲の生体物質に対して実行され得ることが現在発見されている。
【００５３】
簡潔には、次いで、本発明は、４工程を含む、１以上の検体の直接的な検出および同定、定性および／または定量のためのプロセスおよび装置である。第１工程において、検体と、いくつかの検体がバイオコンセントレーターに結合し得るかまたはそれと複合体化し得るような様式において、適切な「バイオコンセントレーター」（すなわち、本発明に従って使用される生物学的成分）とを接触させる。第２工程において、このバイオコンセントレーター−検体の複合体は、１以上の所定の波長の照射に曝されて、ラマン散乱スペクトルバンドを生成する。第３工程において、ラマン散乱スペクトルバンドの少なくとも一部は、ラマン分光器によって収集され、そして処理され、そして電気シグナルへと変換される。最終的に、第４工程において、この電気シグナルは、ベースラインスペクトルの１以上の電気シグナルに対して比較して、検体を検出および／または同定、定性および／または定量することによって分析される。このベースラインは、例えば、分析されるべき材料と接触させる直前に、生体物質から取得したスペクトルであり得る。このベースラインはまた、モデル参照スペクトルのライブラリー（すなわち、既知のバイオコンセントレーター−検体の複合体を用いて以前に生成され、次いで比較の目的のためにメモリーに適切に保存されたスペクトル情報）であり得る。
【００５４】
本発明の同じ４工程はまた、バイオコンセントレーターの反応性能力分析、または他の型の生体物質において使用され得る。この場合、生体物質が「複合体化」する「検体」は、例えば、この生体物質を変性し得る熱または化学物質、この生体物質の酸化状態またはスピン状態または凝集状態あるいはペプチド骨格構造を変更し得る環境因子などであり得る。前と同様に、このベースラインは、「検体」と接触させる直前の生体物質から取得したスペクトルであり得る。ライブラリーは、十分に活性かつ部分的または完全に変性したかまたはそうでなければ分解したバイオコンセントレーターのモデル参照スペクトルを含み得る。このバイオコンセントレーター自体が分析される場合、反応性能力分析の結果は、本発明に従って、バイオコンセントレーターが関与する検体の検出および分析に対して標的化されたプロセスに影響するかまたは変更させるかまたは最適化するために使用され得る。ラマン反応性能力分析が生体物質の他の型に実行される場合、得られる情報は、生体物質が関与するプロセス（例えば、生体物質自体の抽出または化学的な改変または精製）を調整または最適化するために使用され得る。
【００５５】
生物学的成分（例えば、バイオコンセントレーター）が含まれるため、本発明はバイオセンサー技術として公知の技術に属すると考えられ得る。ラマン散乱分光法は光学技術であり、そして用語「オプトロード」は光学的変換に基づくバイオセンサのために使用されるため、本発明はここで「ラマンオプトロード」技術といわれる。あるいは、しかし、本発明に含まれるベースとなる工程ならびに基本的なプロセスおよび現象でさえ、有意にバイオセンサ先行技術と異なるため、本発明はその代わりに、ラマン分光法に基づく検出または分析またはモニタリングプロセスまたはデバイスによる使用のための高度に特異的なサンプリングプロセスまたはデバイスであることが想定され得る。それ故に、固体吸収剤もしくは液体スクラバーのような、他のサンプル濃縮プロセスまたはデバイスにわたる有意な改良であるというアプローチにおいて、実質的に、特に検体を収集し濃縮するように機能するという認識下で、本発明に使用されるような生物学的成分は、ここで「バイオコンセントレーター」と呼ばれる。
【００５６】
このラマンオプトロード発明のプロセスまたはデバイスがとり得る多くの形態が存在する。例えば、バイオコンセントレーターが検体と結合する工程およびラマン分光法およびエレクトロニクスが分光学的情報を生成し分析する工程が独立して行なわれ得、たとえ異なる時間（数時間または数日間あけて）においてさえ、および／または異なる位置においてさえも、実施され得る。例えば、バイオコンセントレーターは１箇所において検体と結合または収集しそして濃縮するために使用され得、次いでこのバイオコンセントレーター−検体複合体が第２の位置に輸送され、この第２の位置において、ラマン分光分析および検体検出／同定が実施される。しかし、バイオコンセントレーターおよびラマン分光法およびエレクトロニクスは、確実に、同時に、および所望される場合、完全に自動的にでさえも実施される検体収集およびシグナル変換および分析で単一のデバイス内に一体化され得る。本発明に従って設計されたラマンオプトロードデバイスは、このデバイスが無人で作動し得、検体が検出されるとき自動的に警告を発し得、検出される検体の同一性および量に関する情報を示す視覚的表示および／またはハードコピー印刷を生成し得、任意の「使用済み（ｓｐｅｎｔ）」バイオコンセントレーター（すなわち、反応容量が任意の機構（例えば、検体結合、交差反応干渉結合、変性などを含む）によって有意に減少されるバイオコンセントレーター）を自動的に交換し得、および／またはさらなるプロセシング（例えば、プロセスコントロール機能）のための情報をコンピューターに送り得る十分なエレクトロニクスおよびソフトウェアを有し得る。
【００５７】
本発明のためのバイオコンセントレーターは、広範囲の種々の分子、高分子、複合体、およびフラグメントのいずれかであり得、酵素、抗体、抗体フラグメント、他の生物学的に活性なタンパク質（例えば、血液タンパク質）、ペプチド（合成ペプチドを含む）、他の生物学的分子（例えば、グリコスフィンゴ脂質、レクチン、脂質、リン脂質、核酸）、または病原体吸着因子、複合体（例えば、レセプター、またはレセプターサブユニット、または膜、オルガネラ、または細胞）、または組織もしくはこれらの成分を含む複合体が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、特に検体自体が生物学的である場合（例えば、酵素、抗体、レセプター、核酸など）である場合、このバイオコンセントレーターは、このような生物学的検体に正常に結合する広範な種々のリガンドのいずれかであり得、この「リガンドバイオコンセントレーター」は、酵素基質、補因子、またはインヒビター、抗原、抗原アナログ、またはハプテン、アゴニストまたはアンタゴニスト、糖などを含むリストから選択されるが、これらに限定されない列挙から選択される。このバイオコンセントレーターは、多くの実践的基準（特に検出されるべき検体の型および数；所望される特異性および親和性で検体と結合するかまたは補足するためのバイオコンセントレーターの能力、その安定性、その有用性、およびそのラマン散乱分光特性；バイコンセントレーター成分を製造するコスト）に基づいて選択され得る。
【００５８】
バイコンセントレーターの賢明な選択により、本発明は、単一の元素イオンからタンパク質および核酸まで、レセプターおよびオルガネラのような生物学的複合体までのサイズ、分子量および複雑さの範囲にわたる任意の化学的検体（分子を含む）を実質的に検出するために使用され得ることを注意すべきである。さらに、本発明は化学化合物または複合体の検出および同定に限定されず、微生物（例えば、ウイルス、バクテリア、リケッチア目細菌、菌門、花粉、胞子、藻類、珪藻類など）、および他の型の生物または細胞（例えば、疾患細胞または感染細胞）、異なる型の血液細胞などを検出および同定するために使用され得ることに注意すべきである。本発明は細胞下の成分および構造を検出および同定するために使用され得ることにも注意すべきである。本発明は、生育不可能な生物および「生きた」生物と「生きていない」生物との間の差異を検出し；毒性形態の化学物質または生物学的高分子と毒性形態の化学物質または生物学的高分子（例えば、毒素とトキソイドとの間）との間の差異を検出するために使用され得ることにさらに注意すべきである。
【００５９】
本発明は、液体媒体（水性または非水性のいずれかで、それらに分散または溶解または保有される）中にあるか、または風媒性（すなわち、蒸気、エアロゾル、または粒子である）のいずれかである非検体を直接に検出および／または同定および／または定量するために使用され得ることにも注意すべきである。さらに、バイオコンセントレーターは、風媒性検体に対する曝露の間、または次の変換の間に可溶化または溶媒和される必要はない。乾燥または部分的に水和した生物学的成分は、空気サンプルに直接に曝露され得、そして風媒性の検体の蒸気、エアロゾル、または粒子と直接に反応する。しかし、このバイオコンセントレーターは、確実に溶液中にあり得るか、または表面上に固定化され得、この表面は使用中に液体でコートされるか、または浸漬され；そしてラマンオプトロード発明は、バイコンセントレーターと結合する前に、サンプルが溶液中にあるかまたは溶液にスクラブされるプロセスおよびデバイスをカバーする。
【００６０】
バイオコンセントレーターは、結合工程またはラマンスペクトル生成／分析工程のいずれかの間、基材に固定されてもよいし固定されなくてもよいことにさらに注意すべきである。用語「基材」は、例えば、このバイコンセントレーターの運動を制限するタンパク質またはポリマーフィルムまたは多孔性材料のようなマトリクス内への組み込みまたはそのマトリックスによる捕捉を通して、固体または多孔性の支持表面上にこのバイオコンセントレーターが支持されない場合でさえ、このバイオコンセントレーターが固定される（すなわち、媒体を通したその自由な運動が制限される）という意味の広い定義を有する。このバイコンセントレーターは、本発明に従って固定される必要はないが、その代わりに、液体媒体に溶解され得るか、または溶媒和され得；あるいはそれ自体固体の形態にあり得る（例えば、検体に曝露され検体と結合し、および／または続いてラマン散乱スペクトルの生成のための励起光に曝露される場合に、結晶化されるかまたは粉末化される）。このバイコンセントレーターは、収集／検出／モニタリング／分析プロセスにおける任意の点で、固定することなく、溶媒和されたまたは溶解された生物学的材料として、あるいは粉末化された材料または結晶性の材料として残存し得る。しかし、このバイコンセントレーターは、検体結合工程およびラマン分析工程を通じて、確実に、固体または多光性の支持表面上に、あるいはフィルムまたは多光性の媒体内に、固定され得る。あるいは、このバイオコンセントレーターはまず、自由な（すなわち固定されていない）形態にある間、検体に対して曝露され得、続いて、ラマンスペクトル生成工程および分析工程のために固定され得る（例えば、固体の支持体または表面または多孔性材料またはフィルムまたは媒体上に吸着されるかまたは捕捉される）。
【００６１】
固定された場合、このバイコンセントレーターは、当業者に公知であるように広範な種々の機構（例えば、吸着、架橋、架橋と結合した吸着、共有結合、捕捉などを含む）のいずれかによって固定され得、そして表面上に、または膜（生物学的成分自体から全体的にかつ単独に形成される膜を含む）内に固定され得る。基材上に固定される場合、バイオコンセントレーターが固定化される基材（またはフィルムまたはその中の材料）上の表面は、バイコンセントレーター、検体（単数または複数）およびサンプル（単数または複数）が物理的にかつ化学的に適合性である実質的に任意の材料からなり得、そして広範な種々の形態（例えば、バッジ、チケット、ディップスティック、紙上の小さな斑点、プラスチック、ポリマー、布、または他の材料、光ファイバーまたは結晶、小さなビーズ、スライドガラス、チューブ、金属フィルム、紙テープまたはプラスチックテープなど）のいずれかをとり得る。所与の適用に使用されるべき表面またはフィルムまたは材料、およびその形状は、この適用に最適であると考慮されるサンプリング手順によって決定される。
【００６２】
バイオコンセントレーターは単一の生物学的成分であり得、そしてラマンオプトロードプロセスまたはデバイスは、単一の検体の検出に使用され得る。あるいは、このバイオコンセントレーターは、複数の検体と複合体化し得る単一の生物学的成分であり得、そしてラマンオプトロードは、バイオコンセントレーターと複合体化し得る少なくとも幾つかの化合物または微生物を検出かつ同定するために使用され得る。なお別の代替において、このバイオコンセントレーターは、複数の生物学的成分の混合物であり得、各々が１つ以上の異なる検体と複合体化し得、それによって広範に多様な物理的特性および化学的特性を有する大多数の検体および／または複数の検体を検出、分析、そしてモニターすることを可能にする。ラマンオプトロードはまた、例えば、固体支持体の１つ以上の領域上に、または膜内に１つ以上のバイコンセントレーターが固定されるサンプリングシステムまたはサブシステムを有し得；ラマン分光計測器は、同時にまたは連続的にのいずれかでこれらの異なる領域内の種々の位置から個々のスペクトルを収集するように設計され得、それによってまた、異なる位置において異なるバイコンセントレーターと結合し得る複数の検体を検出かつ分析することを可能にする。
【００６３】
所望のラマンスペクトル情報を生成するために適切な任意の光源が使用され得、この光源としては、深ＵＶ、近ＵＶ、可視、および／または近赤外のスペクトル範囲において作動する１つ以上のレーザー、および他の適切な光源が挙げられるが、これらに限定されない。共鳴ラマン技術が使用される場合、バイオコンセントレーター内の結合、検体内の結合、または複合体中のバイオコンセントレーターと検体との間で形成する新しい結合内の共鳴を励起する光源が選択され得る。このバイオコンセントレーターは、継続的にまたは定期的な間隔のいずれかで、サンプルまたはサンプル流に対する曝露の間そして曝露にわたって、励起光からの照射に対して曝露され得、それによって、サンプルまたは媒体または環境の迅速または継続的な検出および分析または「リアルタイム」のモニタリングを可能にする。あるいは、このバイオコンセントレーターはまずサンプルに対して曝露され得、次いで後に、次の分析のために、レーザーが、ラマン分光器デバイスと結合され得るかそのデバイスに挿入され得るかまたはそのデバイスによって走査され得る。
【００６４】
ラマンオプトロードプロセスまたはデバイスは、単一の光源からの単一の励起波長を利用し得る。あるいは、１つ以上の光源によって生成される１つ以上の励起光の波長が、本発明に従うプロセスまたはデバイスに使用され得る。例えば、２つ以上のレーザー波長（各々はバイオコンセントレーター−検体の複合体内の異なる結合の共鳴を誘導し得る）は、ＲＲＳスペクトルを生成するために連続的に使用され得、このスペクトルは「三次元スペクトル」を生成するために連続的に収集され、処理され、そして分析される。別の実施例として、ＮＲＳスペクトルは、バイオコンセントレーター自体の状態をモニターするためにある波長で生成され得、その間、共鳴は、所与の検体の感受性のあるＲＲＳ検出のための別の波長において複合体化された検体部分に導入され得る。しかし、所望される場合、単一の波長が確実に使用され得る。
【００６５】
当業者に公知であるようなラマン分光法またはラマン分光技術の任意の適切な形態または構成が、ラマン分析工程の間、本発明に従って使用され得、これには、通常のラマン散乱（ＮＲＳ）、共鳴ラマン散乱（ＲＲＳ）、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）、表面増強共鳴ラマン散乱（ＳＥＲＲＳ）、電極と結合されたＳＥＲＳまたはＳＥＲＲＳ、干渉性アンチストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）、刺激ラマン利得（ＳＲＧ）、逆ラマン分光法（ＩＲＳ）、分子光学レーザー検査器（ＭＯＬＥ）またはラマンマイクロプローブまたはラマン顕微鏡法または共焦点ラマン顕微分光法、三次元（３−Ｄ）ラマンまたは走査ラマン、ラマン飽和分光法、時間分解共鳴ラマン、ラマンデカップリング分光法、ＵＶ−ラマン顕微鏡法、および／または超ラマン散乱が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、ラマン分析工程の間に利用されるラマン分光ハードウェアおよび成分は、方法またはプロセスまたは装置またはデバイスのための所望されるパラメータ（例えば、所望される感度、特異性、精度、および応答時間、使用されるべきレーザー波長およびモニターされるべき得られる周波帯（ｗａｖｅｂａｎｄ）、使用されるべきバイオコンセントレーターの数および検出されるべき検体の数、所望されるサイズ、重量、およびシステムの耐久性、標的調達コストおよび／または作動コストなど）によって課せられる制約に依存して、バンドパスフィルターシステム、フィルター−グレーティングまたはプリズム−グレーティング分散システム、マルチチャンネルシステム、走査マルチチャンネルシステム、またはマルチプレックス分光器（例えば、Ｈａｄａｍａｒｄ変換システムまたはＦｏｕｒｉｅｒ変換システムまたは定常変換システム）、音響−光学システムもしくは一体型光学音響−光学システム、画像システム、またはマイクロプローブシステムもしくは顕微鏡システム、またはファイバー光学システムを含むが、これらに限定されない列挙から選択され得る。各々の場合において、ラマン分光器システムまたはサブシステムは、バイオコンセントレーターまたはバイオコンセントレーター−検体複合体または生物学的物質から発せられた放射をその入力として受容し、それを処理し、そしてその出力を集束し、光学シグナルを電気シグナルに変換し得る検出器（単数または複数）上に当てる。好ましい形態はマルチプレックス設計またはマルチチャンネル設計であり得、これらのラマン分光器設計は優れた応答時間および感度を提供し得る。別の好ましい形態は画像化設計であり得、これらのラマン分光器設計は多くの異なる検体の同時検出および同時同定のためのバイコンセントレーターのアレイの使用を可能にする。超微量検体検出に対して、好ましい形態はまた、画像化ラマン分光器システムに組み込まれようとなかろうと、マイクロプローブまたは微顕微鏡法技術および装置の使用を含み得る。それにも関わらず、他の適用に対して、はるかに単純でかつ低コストのアプローチが好ましくあり得る。例えば、単一の検体が重要であり分析されるべきサンプルが比較的清浄でありその組成において一貫している場合、たった１つまたは幾つかの周波帯がモニターされるべきであり、バンド−パスフィルターが選択の設計であり得る。例えば、チャコールフィルターを通して分解する窒素マスタードの検出のためのラマンオプトロードにおいて、バンドパスまたは光学フィルター設計が使用され得、バイコンセントレーターとしてＤＮＡを使用し、１４９２ｃｍ-1および１５３０ｃｍ-1のスペクトルラインをモニターする。
【００６６】
一旦、ラマン分光器が光シグナルを電気シグナルに処理すると、この電気シグナルは、生成したベースラインスペクトルと比較され、後に、バイコンセントレーター、または前もって調製されこのような比較のためにラマンオプトロードのメモリに保存された参照ラマンスペクトルのライブラリ、またはその両方と材料を接触させる。本発明に従って、このライブラリは、例えば、完全に反応性のバイコンセントレーター、分解されたまたは変性されたバイオコンセントレーター、種々のバイオコンセントレーター−検体複合体（定量的分析で種々のバイコンセントレーター／検体濃度比であり得る）、および／またはバイオコンセントレーター−干渉物複合体からのスペクトルを含み得る。このスペクトル比較は、バイオコンセントレーターに結合した任意の検体を検出および／または同定および／または定量するため、ならびに／あるいはバイオコンセントレーターまたは生物学的物質自体の状態の任意の部分的または完全な変性、位置決め、または変化を決定するための基礎として使用される。
【００６７】
スペクトル比較／分析は、差スペクトル、または第１もしくは第２もしくは第３または第４の誘導スペクトル、または選択された波長モニタリング、または当業者に公知である手動での適用に適切な他の型の操作および計算を含み得ることに注意すべきである。好ましい形態において、差スペクトルは、一般的に、他の形態の分析よりスペクトルの小さな変化に対してより感受性であるため、差スペクトルが使用される。異なるラマンコンフォメーションマーカーが、それらが互いから器械的に分解され得ない点に重なり合う場合、例えば、デコンボリューション、Ｆｏｕｒｉｅｒデコンボリューション、極大エントロピー、またはＭｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ法のような操作が使用されこのようなバンドの分離を向上するかまたは分解されたスペクトルをシミュレートし得る。本発明に従うスペクトル分析は、当業者に公知である任意の適切なアルゴニズムまたはアルゴニズムの組み合わせを使用して実施され得、これらには、例えば、類似性、相関、および距離測定、確率ベースの整合のようなライブラリ探索法、適切なピーク探索、および主成分分析、非線形人工神経回路網アプローチ、ファジー理論、またはデータ融合、線形、古典的最小二乗法、主成分回帰、部分最小二乗法、多変量分析またはパッチ多変量分析、あるいは標準加算技術などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
正確な定量的情報を提供することが意図されるラマンオプトロードプロセスおよびデバイスに対して、種々の較正手順が使用され得る。例えば、外部「標準」が使用され得、この標準内の１つ以上のスペクトルバンドの強度はバイオコンセントレーター−検体複合体のラマンスペクトルの１つ以上のラインの強度と比較される。特に、この目的のために２つの検出器を利用するラマン分光器設計において、分割参照ビームまたは参照セルもまた、使用される。バイオコンセントレーターの幾つかの部分が保護され得、その結果、それがサンプル／検体に対して暴露され、そして曝露されるバイオコンセントレーターのスペクトルの１つ以上のラインとの比較のために保護されたバイオコンセントレーターのスペクトルの１つ以上のラインが使用される。なお別のアプローチにおいて、サンプリングおよび分析の間、不変のままであることが既知であるバイコンセントレーターのスペクトルの１つ以上の波長が、検体との結合または変性または位置決めの際に変化することが既知である１つ以上の１つ以上のラインと比較され得る。さらに、バイオコンセントレーターおよび／またはバイコンセントレーター−検体複合体のスペクトル内のラインは、本発明に従って、サンプルに加えられた内部標準のスペクトルのラインと比較され得、および／または特定の目的のためにバイコンセントレーターと共に固定され得る。
【００６９】
同様に、正確な定量的情報を提供することが意図されるラマンオプトロード反応容量分析に対して、種々の較正手順が使用され得る。例えば、外部「標準」が使用され得、この標準内の１つ以上のスペクトルバンドの強度が、測定された生物学的物質のラマンスペクトルの１つ以上のラインの強度と比較される。分割参照ビームまたは参照細胞はまた、特に本目的のための２つの検出器を利用するラマン分光器設計において使用され得る。分析の間不変であることが既知である生物学的物質のスペクトルの１つ以上の波長は、変性、酸化またはスピンまたは凝集状態の変化、ペプチド骨格構造などの変化の際に変化することが既知である１つ以上のラインと比較され得る。さらに、測定された生物学的物質のスペクトル内のラインは、本発明に従って、特定の目的のために、サンプルに加えられた内部標準および／または生物学的物質と共固定された（調製物が固定化された調製物である場合）内部標準のスペクトルのラインと比較され得る。
【００７０】
ラマンオプトロードが検体構造内の１つ以上の位置にて異常な（ｕｎｕｓｕａｌ ａｎｄ ｕｎｃｏｍｍｏｎ）同位体を含有する分子を検出するために使用され得、すなわちこのラマンオプトロードが異なる化学種間を区別し得ることに加えて、標識された分子と標識されていない分子との間を区別し得る。これらの同位体は、放射性同位体、重水素または炭素−１３のような「安定な標識」、またはそれらの組み合わせであり得る。異なる化学物質の分析のように、異なる同位体的に標識された種のラマンオプトロード分析は定量的かつ定性的であり得る。したがって、このラマンオプトロード技術は、合成された標識調製物の純度を分析するための迅速かつ単純な手段として使用され得る。ラマンオプトロード技術はまた、分子内の正確な位置に標識が挿入されたことを確実にするために使用され得る。
【００７１】
最終的に、「完全な」ラマンスペクトルが得られる必要はないが、「完全な」ラマンスペクトルが得られ得ることに注意すべきである。ラマンオプトロードプロセスおよびデバイスは、ラマンオプトロードプロセスまたはデバイスのために意図される適用、および所望される情報の量に依存して、「完全な」スペクトル、１つ以上の部分スペクトル、僅かなスペクトルバンド、または単一のスペクトルラインを生成し、モニターし、または分析するために設計され得る。さらに、このプロセスおよびデバイスは、（ａ）検体のスペクトルの追加による新たなラインまたはバンド；（ｂ）検体とバイコンセントレーターの活性部位との間で結合することによって引き起こされるバイオコンセントレーター自体のベースラインスペクトルの変化（例えば、三次元コンフォメーションの変化またはバイオコンセントレーターの分子内相互作用によって引き起こされるスペクトルの変化）；（ｃ）検体がバイコンセントレーターと結合する際に形成される新たな結合または部分からのラマン散乱によって引き起こされる新たなスペクトルバンド；（ｄ）バイオコンセントレーターとの結合によって引き起こされる検体自体のスペクトルの変化；または（ｅ）それらの幾つかの組み合わせ、をモニターし得る。
【００７２】
すでに議論されるように、本発明は、すなわち、検出されるべき「検体」が生物学的物質と相互作用し得る因子であり、それによってその生物学的物質が部分的にまたは完全に変性されるか、またはその酸化もしくは凝集もしくはスピン状態が変更されるか、またはペプチド骨格構造が変化されるか、または生物学的物質が固定されるなどの場合、生物学的材料またはその成分は、ラマン反応容量分析技術を使用して分析される任意のプロセスまたはデバイスを含む。化学検体または微生物検体を伴う場合、乾燥し、粉末化され、結晶性の、粒子上の、部分的または完全に水和されるかまたは可溶化され、懸濁され、または溶解される生物学的物質について実施され得る。さらに、分析は、単一の生物学的物質または複数の生物学的物質、および広範な種々の生物学的物質についてラマン反応性容量分析が実施され得る。さらに、ラマン反応容量分析は、生物学的物質がその状態または潜在的生物学的活性に影響を及ぼし得る１つ以上の因子と相互作用する場合に実施され得；そして相互作用の程度（すなわちどのくらいの量の生物学的物質が得られる形態の各々で存在するか）が定量的に測定され得る。
【００７３】
本発明に従って、ラマンオプトロードデバイスまたはプロセスは、バイコンセントレーターの反応容量の変化に起因するラマンオプトロード応答に対する任意の他の悪影響が自動的に調整されるように、設計され得る。スペクトル分析は、バイオコンセントレーター調整物が不適切に製造されるか、または貯蔵と共に分解するか、または使用中に変性し、もしくは消耗し、もしくは表面から浸出することが示される事象において警告を生じ得る。さらに、ラマンオプトロードは、化学検体または微生物検体の検出の間、スペクトル分析が変更された反応容量を示す場合、そのサンプリング速度を自動的に調節し；結合動態が変更される事象における定量的分析結果を調節するために数学的操作を自動的に実行し（すなわち、部分的変性または部分的阻害または競合的結合またはｐＨの変動によるバイオコンセントレーター反応容量の変化を明らかにする）；反応容量が受容可能な最小値未満である事象において所定の多数または一部のバイコンセントレーターを自動的に交換し；および／または例えば、ｐＨまたはイオン濃度を調節することによってバイオコンセントレーターを取り囲む微小環境を変更するように、設計され得る。本発明のこの局面は、ラマンオプトロードの誤りの警告速度および信頼度の改良におよぼす主な影響を有し；また、生産、製造、および貯蔵手順を単純化および改良する。
【００７４】
同様に、任意の生物学的材料のラマン反応容量分析は、ラマンオプトロードバイオコンセントレーターであろうと、別の適用のために調整された生物学的物質（例えば、他の型のバイオセンサーにおける使用もしくは生物学的成分を含む他の型の検出プロセスにおける使用のために意図された生物学的物質、または製薬および生体物質のような他の型の適用のために意図された他の型の生物学的調製物）であろうと、製造および／または貯蔵および／または使用の間に生物学的物質をモニターし、そして製造もしくは貯蔵を調節もしくは変更するか、任意の悪影響を緩和するための条件を使用するために使用され得る。この生物学的物質は、生合成された材料もしくは抽出物であり得、または乾燥され、精製され、凍結乾燥され、結晶化され、または固定された調製物であり得る。例えば、デバイスが製造ラインを終結し、そして任意の欠陥デバイスが拒絶される際に、最終「検査（ｃｈｅｃｋ−ｏｕｔ）」の一部としての完成されたバイオセンサーデバイス内の生物学的物質について自動的にラマン反応容量分析が実施され得；または製造プロセスが満足に進行するかどうかを決定するために悪状態を検出し、悪状態を変更または緩和するための手段を開始し、製造プロセスにおける所与の工程の終点を検出し、そして全体の収率を改良および／またはコストを減少させるために製造プロセスにおける１つ以上の点で行なわれ得る。所望される場合、本発明に従うラマン反応容量分析プロセスまたはデバイスは、生物学的物質の製造を自動化および／または最適化するためにプロセス制御デバイスに入力を提供するために使用され得る。
【００７５】
このラマンオプトロード発明は、従来の湿潤化学技術、従来のラマン分光器デバイスまたはプロセス、または従来のバイオセンサーであろうと、種々の理由のために、先行技術の全てに対して優れている。
【００７６】
従来の湿潤化学分析と比較して、例えば、ラマンオプトロード発明は、気体または液体中の微量なレベルの検体の検出および同定のために、はるかに少ないリソース（すなわち、より少ないトレーニング、より少ない工程、より少ない試薬および化学物質、より少ない装備、および分析を完了するために必要とされるより少ない時間）を必要とするという点で優れている。本発明は、例外的特異性（バイオコンセントレーター結合特異性、ラマンスペクトルフィンガープリント、および使用される場合、ＲＲＳおよび／またはＳＥＲＳおよび／または３−Ｄ技術のような追加の特異性を付与するラマン技術によって寄与される）を提供し得るため、たとえあったとしても、僅かなサンプル調製が、従来技術による大規模なサンプル精密検査を必要とする適用に必要とされる。ＳＥＲＳ、ＲＲＳ、ＳＥＲＲＳ、ラマンマイクロプローブまたはラマン顕微鏡法、刺激ラマン利得、または逆ラマンが利用される場合、ラマンオプトロード発明は、検出および分析に対する従来のアプローチのいずれかによって達成される得る感度よりしばしばはるかに良好な、同様にはるかに優れた感度を提供し得る。
【００７７】
ラマンオプトロードは、複合マトリクスの分析、組成が広範囲に変更するサンプルの分析、または微量なレベルの検体の検出のための従来のラマン分光器の使用に対して顕著に優れている。従来のラマン分光器は、分析のためのサンプルを収集または濃縮する方法を有しない；それは、サンプルと接触するプローブまたはサンプリング付属品のみを有するが、サンプルに含まれる成分と意図して相互作用し得ない。よくても、ラマン機器は、サンプル中の成分を濃縮するための固体吸収剤のような従来のサンプリングデバイスと結合され得る。しかし、上で議論されるように、このような先行技術の吸収剤は多くのまたは大部分のサンプル成分を濃縮し、それによって高いバックグラウンドノイズ、低下した感度、および増加した誤りの警告速度を引き起こす。しかし、ラマンオプトロード発明は、それが検体と特異的に相互作用し得、検体（バルク媒体から検体を物理的に分離することを通して、または同様のシグナルを生成し得ない成分から検体を「単離」する独特のシグナルの生成を通して）を単離し得、そして所望される場合、はるかにより感受性であり特異的かつ迅速な検出および分析のために検体を特別に収集し濃縮し得るバイオコンセントレーターを有するという点で、優れている。本発明に従うデバイスは、このバイコンセントレーターがラマンオプトロードデバイス内の欠かせない成分であるように設計され得；またはこのバイオコンセントレーターがサンプルコレクターとして使用される別個のアイテムまたはデバイスであり、このサンプルコレクターが、バイオコンセントレーターによって収集されるサンプルの後の分析のためのラマン分光器デバイスに後に取りつけられるか、または挿入されるか、または保持されるように、設計され得る。
【００７８】
先行技術のラマン分光器は粗金属フィルムを使用してシグナル増強を利得し得るが、それは検体が金属フィルム上に吸着するか、金属フィルムと完全に接触して保持されるいかなる様式も有しない。よくても、検体を含むサンプルは、金属フィルムに適用されるが、金属上に吸着するかまたはその表面の数ナノメーター内にある検体の一部からのシグナルのみが増強される。一般に、検体のバルクは、バルク媒体中にとどまり、そこでその非増強シグナルは検出され得ない。さらに、サンプル中の全ての他の成分は、同時に金属表面に適用され、そしてそれらのラマンシグナルは同様に増強され；多くのこのような成分が微量な非検体のはるかに過剰の濃度で存在するようであるため、それらのシグナルは、微量の非検体からのシグナルははるかに過剰に増強され、それによって非検体シグナルに覆い重なる。しかし、このラマンオプトロード発明において、バイオコンセントレーターは、サンプルからの非検体の大部分または全てを収集しかつ濃縮するために使用され得、それは金属表面と接触するかまたは接近し、それによって非特異的で可逆的な吸着に依存する従来のアプローチより、表面増強技術からの非常により高い感度を利得する。ラマンオプトロード発明において、非検体を除くサンプル成分は、バルクサンプル媒体中に残存し、ここでそれらの不変のシグナルは検出され得ない。先行技術のアプローチとして、検体を吸着させるためのポリマーまたはクラウンエーテルコーティングの使用を含み、それを金属表面近傍に保持し、幾つかの改良された感度および特異性を利得する。このラマンオプトロードサンプリングアプローチは、生物学的物質と検体との間の結合、ポリマーまたはクラウンエーテルが示すより検体に対してはるかに特異的でかつはるかに高い親和力を有するプロセスを利用するという点で優れている。さらに、ある程度の非特異的な吸着および／または吸着が合成コーティングと共に経られ；一方、ラマンオプトロードのバイオコンセントレーターコーティングは他のサンプル成分による金属上への吸着を妨害し；そして当業者に公知の技術はバイオコンセントレーター上への吸着を妨害するかまたは最小化するために使用され得る。
【００７９】
先行技術のラマン分光器デバイスはＲＲＳ技術を利用する利用し得る一方で、検体内の共鳴を発生するレーザーのみが感度および／または特異性を改良するために選択され得る。しばしば、サンプルは検体と化学的に同様である他の成分を含み；検体中の共鳴を誘導するレーザーはこれらの関連種内の共鳴または予備共鳴を誘導することが予想され得る。これらの他の種からのより強力なシグナルの発生は、バックグラウンドを増加させ、感度を減少させ、誤りの警告速度を増加させる。他のサンプル成分がしばしば微量の検体より高い濃度で存在するため、これらのより濃縮された成分からの共鳴または予備共鳴シグナルは、検体からの共鳴シグナルに覆い重なることが予想され得る。本発明は、それが検体自体に誘導される共鳴の代わりに、バイオコンセントレーターおよび／またはバイオコンセントレーター−検体複合体に誘導される共鳴を利用するという点で優れている。このバイオコンセントレーターはサンプルに含まれる種と化学的に非常に異なる場合（しばしば、例えば、環境サンプル、工業的プロセスサンプル、現場空気サンプル中にある場合）、バイオコンセントレーターおよび／またはその複合体中の共鳴を誘導する波長は、他のサンプル成分中の共鳴または予備共鳴を誘導する可能性がない。さらに、３−Ｄ技術が本発明に使用される場合、ラマンオプトロードは、検体とバイオコンセントレーターおよび／またはバイオコンセントレーター−検体複合体との両方において共鳴を誘導し得；従来のラマンアプローチと共に使用され得る付随のアプローチは存在しない。さらに、ラマンオプトロードは、バイオコンセントレーターの活性部位で結合することによってのみ引き起こされるバイオコンセントレーターのスペクトルの変化をモニターするように設計され得るという点で優れており；この属性は、ラマンオプトロードが応答する未知のものが実際に目的の検体であり、インターフェラント（ｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｔ）ではないという並外れた信頼性を提供する。
【００８０】
このラマンオプトロードは、多くの異なる理由により、微生物の同定のための振動スペクトル分光法を使用する先行技術に対して優れている。第１に、ドイツのＦＴＩＲプロトタイプ微生物分析器および微生物を同定するための方法を開発するための任意の他の努力は、サンプルを収集、精製および処理するための任意の一体化された機構を考慮していない。全ての先行技術は、単離されたコロニーをプレーティングおよび培養し、次いでこれらの単離された「精製された」コロニーを分析のためにスペクトロメーターに移すというような扱いにくく時間消費型の手順に依存する。このラマンオプトロードは、複雑なサンプルからの標的微生物を本質的に収集および濃縮するためにバイコンセントレーターを使用し、それによって任意のプレーティングおよび培養なしに、複雑なサンプルの迅速な分析を可能にする。
【００８１】
第２に、先行技術アプローチは特異的に標的生物を収集し濃縮するための任意の機構を提供しないため、一旦、標的検体の存在を検出するために所与のサンプルの全ての微生物がプレーティングおよび培養されると、それらは分析されなければならない。他方で、ラマンオプトロードは、バイオコンセントレーターと結合し得る微生物のみを単離し、それ故に、微生物と結合し得る微生物のみが分析される必要がある。第３に、先行技術は、任意の所与の型の微生物を特異的に単離する任意の方法を提供しないため、振動スペクトル分光器（ＩＲまたはラマンのいずれか）に提示される任意の微生物のスペクトルは、所与のサンプル中に存在し得る実質的に全ての微生物の参照スペクトルに対して比較されるべきである。非常に複雑かまたは高度に可変性のサンプル（例えば、環境サンプルまたは臨床標本）の場合、存在し得る異なる微生物の数は、数十万程度である。このようなデータベースを開発するために必要とされる試みは過大である一方で、「未知の」サンプルの比較のための参照データベースを通して分類することが必要とされるアルゴリズムが極度に複雑化される。高い信頼性で「未知」である」と同定する適切なアルゴニズムが開発され得ることが考えることは困難である。このラマンオプトロードは、それが、例えば捕捉抗体の使用を通して、最も複雑化され可変性のサンプルからでさえ少量の微生物のみを特異的に単離するための機構を提供するという点で非常に優れている。従って、ラマンオプトロードのための参照スペクトルデータベースは、バイオコンセントレーターによって捕捉され得るそれらの微生物のスペクトルを含むことのみを必要とし；そしてこのラマンオプトロードははるかにより容易に開発され得、従ってそのアルゴニズムははるかにより単純であり得る。第４に、先行技術は、微生物のプレーティングおよび培養、ならびに数十万の参照スペクトルに対して数千の「未知」の得られるスペクトルの精緻な比較に依存するので、単一の複合サンプルの分析は、作業に多くの日数または週をとり得る。このラマンオプトロードは、バイオコンセントレーターの「組込み（ｂｕｉｌｔ−ｉｎ）」サンプリング／収集／濃縮／精製効果によって、高度に複雑なサンプルの分析でさえも、非常に迅速にかつ容易に達成され得るという点で優れている。第５に、分析を行うために、先行技術の方法は、分光器内の単一の点において、濃縮された標的検体の、シグナルを発生するのに十分なバイオマスを必要とする。それを達成するための唯一の方法は、プレーティングおよび培養である。これは、追加の時間、労力、化学物質、および装置を単に必要とするだけではなく；これは容易に培養されない特定の型の微生物、特に多くのウイルスが検出または同定され得ないことを意味する。精緻な手動の精製／分類工程なしに、花粉のような他の検体は同定され得ない。胞子のようなさらに他の型の検体は、この胞子の発芽、後の培養によってのみ同定され得る。このラマンオプトロードは、それが不可欠なバイオマスを収集し濃縮するためにバイオコンセントレーターを使用し得；ウイルスのような頑強な検体の検出および同定、および手動の分類または強制された発芽なしに花粉および胞子のような他の検体の直接の検出および同定において使用され得る。
【００８２】
このラマンオプトロードは、微生物検出および同定の感度、特異性、および信頼性を増強するための幾つかのさらなるアプローチを提供するといった点でドイツのＦＴＩＲ発明より優れている。幾つかの細菌成分は、分類学的にはるかに重要な情報を提供せず、一方で、他の成分の存在および濃度は非常に広範囲に変化し得る。ＩＲは全てのサンプル成分（微生物または他）からの重なる寄与の合わさったスペクトルフィンガープリントを提供するため、個々の細菌からの寄与は分解され得ず、それ故に、可変性成分は、スペクトルの可変性を引き起こし得、この分析を複雑化し得る。ラマンオプトロードは、それがＲＲＳ、３−Ｄ分光法、および／またはＳＥＲＳ、を個々にまたは集約的に開発し得、重要でない細胞成分由来の「無意味」なスペクトルバックグラウンドを除去し得、異なる分類学的に重要なマーカーからの重なる寄与を分解し得、そして感度を有意に増強し得るという点で優れている。ＲＲＳは、膜、細胞、および組織内の個々の生物学的高分子の選択的プロービングを可能にし、それによってラマンオプトロードの特異性および感度を増強する。ドイツのＦＴＩＲ微生物検出器のようなシステムに使用され得る付随の技術は、存在しない。ラマンオプトロードはまた、各生物からの１つ以上の二次元スペクトルを生成するために１つ以上のレーザー波長を使用するために設計される得る。例えば、１つのレーザー波長は、ＮＲＳスペクトルを発生するために使用され得、検体からの総括的「複合した」フィンガープリントを提供し；第２に、核酸内の共鳴を誘導するために使用され得；そして第３に、続いて、タンパク質残基内の共鳴を誘導するために使用され得る。従って、ラマンオプトロードは、重要な分類学的マーカーを選択的にプローブし、効率的に重なり合うスペクトル情報の幾つかを「分解」し、それによってＩＲをベースとするアプローチにおいて有効でない特異性の追加の層を提供するように設計され得る。さらに、ラマンオプトロードは、ＳＥＲＳ現象を利用して、感度および特異性を増強し得、そして同様にスペクトルの可変性を減少させ得るという点で優れている。上で議論されるように、ＲＮＡおよびジピコリネート（ｄｉｐｉｃｏｌｉｎａｔｅ）のような幾らかの細菌細胞成分は、増殖サイクルにおける異なる点の間、または異なる環境条件に起因して、相対含量が広範囲に変化し得る。このような可変性は、細胞壁または膜からのスペクトル寄与より、細胞質成分からのスペクトル寄与に主に観察される。ラマンオプトロードは、それがＳＥＲＳを利用して、細胞表面構造からのシグナルを選択的に増強し得、それによってスペクトル可変性の主な原因を除去するという点で、優れている。ドイツの発明と共に使用され得る付随の技術は存在しない。さらに、微生物の同定のためのＳＥＲＳの使用をさらに含むラマン分析を利用する先行技術は存在しない。そして最終的に、ラマンオプトロードは、ラマンオプトロード分析が完全に水と適合性であり、従って溶媒和種／懸濁種および乾燥された生物の直接的検出のために使用され得るという点で、ドイツのＦＴＩＲ発明より優れている。
【００８３】
ラマンオプトロードは、ラマンオプトロード発明が特異的である変換器を提供する（すなわち、ラマンオプトロードが検体に対して特徴的かつ独特のシグナルをモニターする）という点でバイセンサの分野における先行技術より優れているが、先行技術は、検体の化学物質または構造と直接相関性を有さない非特異的シグナル（例えば、二次的な化学物質または試薬によって生じるシグナル）をモニターする。さらに、従来のバイオセンサー技術は、警告を誘発するための単一のシグナルの増加または減少をモニターする。本発明のラマン変換器は、検体自体の化学物質から直接に出るまたは直接に影響されるシグナルをモニターし得るのみならず、多くのこのようなシグナルをモニターし得（すなわち、本発明に従うプロセスまたはデバイスは、複数の参照または「既知」のバンドに対して「未知」からの複数のバンドを比較し得る）、そして「未知」のバンドの各々およびそれぞれの全てが警告または正の応答が誘発される前に参照バンドに対する相対強度および波長の両方に対応することを要求し得る。このことは、ラマンオプトロードが先行技術に属するバイオセンサーより実質的に優れた特異性およびはるかに低い誤った警告速度を有することを意味する。
【００８４】
さらに、ラマンオプトロード発明は、従来のバイオセンサーが検体の存在を検出しないような、存在する検体を同定し得；そして検体が生物学的成分の活性部位において結合することをさらに確証し得る（先行技術は確証し得ない）という点で優れている。このことは、ラマンオプトロード発明が、単一のバイオコンセントレーターを使用して、複数の検体を検出および同定および定量し得；他のバイオセンサー技術が、複数の検体を同定および定量するために、全ての検体のための異なる生物学的成分を利用しなければならないことを意味する。さらに、ラマンオプトロードは、１つ以上のバイオコンセントレーターと組み合わせた単一の変換器を使用して、複数の検体の検出および同定および定量をし得；先行技術のバイオセンサーが複数の検体のための定量的情報を生成するために各検体のための別個の変換器を必要とする。さらに、検体を実際に同定するための能力は、変換器応答においてより優れた特異性およびより高い信頼性を生じる。試薬または標識されたアナログが変換のために必要とされないため、ラマンオプトロードバイオセンサー検出プロセスは、はるかにとり単純かつ迅速であり得；このプロセスは温度変化による変動の可能性を減少し得る。さらに、生成されるシグナルのために試薬は必要とされないため、水の必要性がなく；従ってラマンオプトロードプロセスは、空気から直接に蒸気を採取するために使用され得る。
【００８５】
ラマンオプトロードはまた、１つ以上の種々の内部較正手順を使用してラマンオプトロードを較正することが可能であり；先行技術はこのような可能性を提供しないという点で全ての先行技術のバイオセンサよりも優れている。これは、正確かつ精密な定量的情報を提供する間、ラマンオプトロードが真に独立した操作のために設計されることが可能であり；そして検出およびモニタリングデバイス、および複数の個別のサンプルの迅速かつ信頼性のある分析のためのシステムまたはプロセスの、設計および操作を大きく単純化するために使用され得る。
【００８６】
「特定の」変換器を特許請求し得るバイオセンサーの分野での唯一の先行技術は、特許番号４，４１１，９８９号（１９８３年１０月２５日、「Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」，Ａ．Ｇｒｏｗに示されるプロセスである。このプロセスは、変換器としてＩＲ分光器に連結される、１種以上の酵素インヒビター（すなわち、検体）を捕捉するために酵素を利用する。他のバイオセンサー変換器の先行技術と異なり、ＩＲ変換器は、酵素活性を測定しないか、または反応生成物もしくは基質の存在をモニターしない。その代わりに、この変換器は、酵素それ自体のＩＲ吸収スペクトルをモニターし、そしてそのスペクトルまたは個々のスペクトルバンドの変化を「探し出す」。これらの変化は、酵素−インヒビター複合体と直接関連している（すなわち、特異的に検体それ自体との結合に起因する）。この特許は、ＩＲ／酵素の発明が、いかなる理論によっても束縛されないが、ＩＲ光の吸収で観察される変化は、酵素および検体の両方と異なる第３の物質の形成に起因しており、この第３の物質は、特有のＩＲ吸収スペクトルで反射されるそれ自体の同定可能な特性を有すると考えられることに注目する。本発明者は、独特のスペクトルが、各々の酵素−検体複合体に対して生成され得ると考えた。なぜならば、インヒビターは、酵素部分と永続的な１以上の共有結合を形成し得、このことにより、実質的に酵素分子全体の化学特性を変化し得るからである。ＩＲ／酵素プロセスの発明は、以前のバイオセンサーの先行技術を超える多数の利点を提供し、ここでこの変換器は、特有であり、そして酵素のスペクトルを変化させるために酵素と検体との結合を必要とするが、この発明は、その能力および適用において厳格に限定される。最も重要なことには、多くの化合物は、任意の公知の酵素を阻害しない；従って、このＩＲ／酵素プロセスを使用して、大部分の化学検体を検出し得ない。微生物は、酵素を阻害しない；従って、このＩＲ／酵素プロセスを使用して、微生物を検出し得ない。さらに、ＩＲ変換器は、酵素ににおいて、全ての非対称的な結合の情報を発生するので、酵素−検体複合体から産生されるＩＲスペクトルは、多くのバンドが重なり合って極度に複雑である。このバンドからは、間接的にまたは数学的に解析され得ない。この酵素−インヒビター複合体において選択された部分または結合を精査する方法は、存在しない。従って、多くの適用のために必要な特異性を得るために、酵素−検体スペクトルおよび酵素−干渉物スペクトルが十分に異なる酵素を見出すことは、困難であり得る。さらに、ＩＲ吸収変換器の制限された感度に起因して、このＩＲ／酵素プロセスは、多くのトレース検体検出適用に所望される感度のレベルを有さないかもしれない。水は、幅広い波長領域に渡ってＩＲスペクトルと干渉するので、水性サンプルを分析するためのその有用性は、厳しく制限され、そしてこのＩＲ／酵素発明の意図される主要な適用は、空中の蒸気の直接の検出である。最後に、ＩＲ分光法は、光の吸収に基づいているので、ＩＲ光は、このＩＲが放出と検出との間で酵素−インヒビター複合体以外の、いかなる強く吸収する物質も通過しないような方法で、酵素−インヒビター複合体に導入されなければならない。非常にわずかな物質は、ＩＲ照射を透過する。従って、非常にわずかな物質は、ＩＲ光をサンプルと接触するようにするためのシステムを設計するのに使用され得る。一般に、ＩＲ分光計によって分析されるべき任意の物質は、最後に、下地を施され、臭化カリウムと混合され、そして薄いフィルムに圧縮され、これにＩＲ光が照射される。あるいは、少量の異なる塩は、ＩＲスペクトルのいくつかのウインドウで透過され、そしてＭＩＲプレートとして（すなわち、プレート上にコーティングされた物質の分析において）使用され得る。しかし、適切な塩結晶は、非常に脆性であり容易に壊れる。そのためにこの結晶は、例えば、光ファイバーに使用され得ない。さらに、適切な塩の多くは、容易に水に溶解され、このために、分析されるべき物質は、非極性有機溶媒中でＭＩＲプレートに塗布され、次いで乾燥されなければならない。従って、ＩＲ／酵素プロセスに基づいた任意のバイオセンサー用に可能な構成は、極度に限定される。
【００８７】
このラマンオプトロード発明は、ＩＲ／酵素発明よりも非常に優れている。ＩＲおよびラマン分光法が基礎とされる基本現象は、顕著に異なり、同様に２タイプのスペクトル情報を得るために使用される手順および機器も顕著に異なる。従って、ラマンオプトロードは、得られ得る情報のタイプ、実施され得る分析のタイプ、および構成されそして使用され得る方法は、基本的に異なる。例えば、ラマンオプトロード発明は、生体物質と検体との間の共有結合に依存しないが、このような結合は、必ず生じ得る；その代わりに、ラマンオプトロードは、生体物質とそのリガンドとが相互作用する場合に生じ得る、種々の分子内相互作用および分子間相互作用を活用する。この相互作用には、生体物質のペプチド骨格、スルフィド結合、水素結合、アミノ酸残基の微小環境などの主な変化が挙げられる。この変化は、活性部位またはリガンドからかなり離れており、ＩＲ分光法によって検出され得ない。従って、ＩＲ／酵素発明は、酵素インヒビターの検出における酵素の使用に限定されるが、このラマンオプトロードは、実質的に任意の検体の検出において、バイオコンセントレーターのような実質的に任意のタイプの生体物質を利用し得る。これらの製品には、所望であれば、化学物質および微生物の両方、ならびにさらに死んだ微生物、および／または微生物のフラグメントまたは非細胞成分が挙げられる。ラマンオプトロードはまた、水性サンプルをモニタリングまたは分析するのに容易に使用され得る際に優れている。なぜならば、水は、ラマン分光法とは干渉せず、ＩＲとは干渉するからである。より重要なことは、２つのタイプの分光法の間の基本的な違いのために、ラマンオプトロード発明は、得られるスペクトルを単純化および明確化および増強するための多数の異なる技術を活用し得、個々の結合および官能基を精査し、これによって優れた特異性を提供する。例えば、ラマンオプトロードは、表面エンハンスメント、共鳴、表面増強共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）、および３次元分光法を利用し得；ＩＲ／酵素バイオセンサーでの使用に利用可能な比較可能な技術は存在しない。さらに、表面エンハンスメントおよび共鳴の有効度に起因して、ラマンオプトロードは、しばしば数オーダーの規模およびＩＲ／酵素技術よりも著しくより感受性であり得る。ラマンオプトロードは、さらにＩＲ／酵素バイオセンサーよりも、ラマンオプトロードが、構成（例えば、リモートサンプリングまたはサンプリングアレイを含む）のために光ファイバー成分を利用する点で優れている。長距離（すなわち、数キロメータおよびさらに数十キロメータ）を超えるラマンシグナルを送信し得る広範囲の光ファイバーが、利用可能である。同様に、広範囲の強壮で安価な水溶性光導波管物質が、ラマンでの使用に利用可能である。さらに、ラマンオプトロードは、光吸収現象でなく光散乱現象に基づくので、ラマンオプトロードサンプリングは、バイオコンセントレーター表面を直接、およびさらに離れて照会する（ｑｕｅｒｙ）工程を包含し得る；そしてこのようなラマンオプトロードは、ＩＲ／酵素バイオセンサーで使用するには困難かまたは不可能である多くの構成で設計され得る。
【００８８】
ラマンオプトロードは、微細な生物学的成分の状態をモニタリングするための手段（すなわち、バイオコンセントレーター）、ならびに生物学的成分の任意の部分的または完全な変性、阻害、損失または破壊に起因する誤った警告または警告の失敗が存在しないことを確実にするための手段を提供する。ラマンオプトロードは、上記の点で、ＩＲ／酵素発明を含むバイオセンサー分野における全先行技術よりも優れている。先行技術のバイオセンサー発明はどれも、上記の能力を有さない。さらに、ラマンオプトロードは、（例えば、溶媒または補因子またはプロテアーゼの存在下または非存在下でのｐＨまたは温度の変化に起因する）バイオコンセントレーターの反応容量の変化を検出する能力において、特有である。このことにより、正確または明確な定量測定が必要とされる場合はいつでも、ラマンオプトロードが、これらの因子を考慮に入れることを可能にする。他のバイオセンサー技術は、生物学的活性の変化を計算するか、または特に、標的の検体の存在以外の因子に起因して、生物学的成分の生物学的活性の変化が存在することをさらに検出するために、定量分析の間に成される計算を自動的に調節することが不可能である。
【００８９】
ラマンオプトロードのために調製され、そして／またはラマンオプトロードにおいて使用される、各々および全バイオコンセントレーターは、生成の間および使用の間に非破壊的に検査され得、バイオコンセントレーター調製物が完全に活性であることを確実にする。上記の点で、ラマンオプトロード技術はまた、他の全タイプのバイオセンサーまたは関連するアッセイよりも信頼できる。任意の固定化が首尾良く実施され、所望でない夾雑物または副産物は存在せず、そして有意な分解または混入は保存の間発生せず、同様にサンプルの環境が、バイオコンセントレーターの実施においていかなる有害な効果も有さないことを確実にする。バイオセンサー生物学的成分の他のタイプは、製造プロセスの成功および／または保存に起因する任意の分解を評価するためのバッチサンプリングおよび破壊テストに依存することに焦点が当てられており、使用の間、モニタリングされ得ない。
【００９０】
本発明は、バイオセンサー分野のすべての先行分野よりも優れており、ラマンオプロロードは、抗体再生技術および可逆性技術の両方でかなりより効果的に使用され得る。再生技術が使用される場合、このラマンオプトロードは、抗体の状態をモニターするように設計され得、従って、定量検体分析の結果を調整し、これによって、各々の再生サイクルにおいて変性される抗体の量の変化に起因する任意の可変性を排除し；そしたまた、これにより抗体調製物が、置換されなければならない点まで分解されるときを決定する。先行技術に基づくバイオセンサーは、どちらもすることが不可能であり；従って、これらの結果は、各再生サイクルで受ける抗体分解の可変量に起因して、変化し；そしてこの抗体調製物は、その容量が完全に分解されるかなり前の時点で処分されなければならず、このサイクルのいずれもが、分解されすぎる抗体を抗体を利用しないことを確実にする。
【００９１】
ラマン分析は、交差反応部分とは区別され得るので、このラマンオプトロードはまた、可逆性技術と非常に効率的に連結され得る。このラマンオプトロードは、バイオアフィニティー（ｂｉｏａｆｆｉｎｉｔｙ）技術と連結させた場合、先行技術よりも優れている。ここで、他のバイオアフィニティーセンサーは、さらなる費用および標識した高い重量のアナログを生成するのに付随した複雑性を必要とする。このラマンオプトロードは、スペクトルの差を通じて、この検体と高い重量のアナログとを区別することがすでに可能であり、そして付着されるべき特定の標識を必要としない。同様に、ＲＣＲＵベースのラマンオプトロードは、さらなる複雑性および開発の費用ならびに結合したアナログを標識するためのプロトコールを使用することを必要としない。なぜならば、このラマンオプトロードは、すでに、結合したアナログまたは検体それ自体が、バイオコンセントレーターに結合されるかどうかを、ラマンスペクトル情報を通じて決定することが可能であるからである。この検体それ自体が、アナログとして使用される場合でも、このリンクを検体に付着するにより、検体の化学的性質（それ故、そのラマンスペクトル）を変化させる。
【００９２】
ラマンオプトロードは、微生物の検出および同定について他の技術よりも優れている。ここで、このラマンオプトロードは、任意の細胞の増殖または前濃縮（ｐｒｅ−ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）または培養を必要とせず；そして分析は、先行技術の技術によって必要とされる数時間〜数日でなく、数秒内で完了され得る。さらに、ラマンオプトロードは、死んだ細胞または細胞の一部、ならびに生細胞を検出し得、さらに、生きた検体と生きていない検体とを区別し得、このことは、先行技術では、実行不可能である。
【００９３】
本発明はまた、バイオテクノロジーの生成物のような生体物質を評価する分野の先行技術よりも優れている。ここで、ラマンオプトロード分析は、生物学的活性を測定するのではなく生体物質の反応能力を決定する。ラマンオプトロードの反応能力の決定は、非破壊的であり、それ故に、生物学的活性を測定するための手順または技術が異なる。ラマンオプトロード反応能力分析は、個々のサンプルまたはアリコートの代わりに、生体物質の全ロットまたはバッチで実施され得る。さらに、ラマンオプトロード反応能力分析は、生体物質の処理の間中、連続的に「実時間」バイアスで実施され得る；これに対して、生物活性を測定するための先行技術は、時間がかかりそして面倒であり、そしてこの結果は、数時間またはさらに数日かけて利用可能ではない。さらに、ラマンオプトロード反応能力分析は、生物学的活性を測定するための先行技術のような、いかなるさらなる試薬も必要としない。最後に、そしておそらく最も重要には、ラマンオプトロード反応能力分析は、（潜在的な）生物学的活性の変化（例えば、変性が生ずる様式、所与の生体物質の酸化状態、ヘムのスピン状態、および／または凝集状態の変化、補助因子の損失、ペプチド骨格のなど変化、あるいはそれらのいくつかの組み合わせ）の根拠の情報を提供し得るという点で優れおり、これにより正しい測定が実施されるのを可能にする；一方で（実際の）生物学的活性を測定するための先行技術は、変化が生じたことを単に決定するが、その原因または根拠のようないかなるの情報も提供し得ない。
【００９４】
ラマンオプトロードはまた、先行技術のバイオセンサー技術を含む、全ての従来の検出技術および／またはモニタリング技術および／または分析技術より優れており、広範なサンプル構成が、本発明で可能でありる。先行技術を基礎とする手順またはデバイスで通常可能であるよりも、かなり広範な適用でラマンオプトロードプロセスまたはデバイス（特に、他のバイオセンサープロセスまたはデバイス）を設計し、そして従来のサンプリングアプローチよりも有意な利点を有するサンプリングアプロ−チを使用することが可能となる。ラマンオプトロードは、例えば、クォーツファイバーバンドルのような従来の固体吸収体サンプリングシステムと外見上類似したサンプリング構成を利用し得る。好ましい実施形態において、例えば、ラマンオプトロードサンプリングシステムは、長い光ファイバー導波管からなり得、ＳＥＲＳ活性金属フィルムおよびバイオコンセントレーターでのみ「覆われ」て、次いで、束ねられるかまたは巻かれる。本発明のこの構成は、広い表面積および低い圧力ドロップ（ｄｒｏｐ）（例えば、クォーツファイバーバンドルによって達成されるもの）を最適の高容量のサンプリングに提供する。しかし、ラマンオプトロードサンプリングシステムは、クォーツファイバーバンドルよりも優れているが、ラマンオプトロード発明は、検体分子を特定の結合メカニズム（すなわち、バイオコンセントレーターとの相互作用）により収集しそして濃縮する。これにより、所望でない潜在的干渉物；クォーツファイバーバンドルの濃度を最小にし、一方、非特異的な吸収メカニズムを利用し、そして多くのまたはほとんどのサンプル成分および検体を濃縮する。ラマンオプトロード光ファイバーにおいて、レーザー光は、多重内部反射（ＭＩＲ）のかすかな波を介してファイバーを通って伝達し得、そして光ファイバー表面上のバイオコンセントレーター−検体複合体と相互作用し得る。光が、ＭＩＲまたはかすかな波を介してバイオコンセントレーター−検体複合体と１２回またはさらに数百回相互作用するので、感度が非常に増強され、さらに各相互作用でシグナルを増強する；クォーツ光ファイバーについては、存在しない。ラマンオプトロードにおいて、濃縮検体をファイバーの外にフラッシュし、またはその検体を検出器に移動させる必要はなく（クォーツファイバーバンドルには必要である）、その代わりに、この検体は、そのバンドル形態で分析される。それ故、クォーツファイバーバンドルに必須の脱着／フラッシュ工程の間に受けるような、ラマンオプトロードでの収集の後の検体の損失は、存在しない。さらに、分析は、ラマンオプトロード光ファイバーコイルにおいて続けられ得、一方で、バッチサンプリング／分析のみが、クォーツバンドルで可能である。そして、ラマンスペクトルを使用して、ラマンオプトロードでのバイオコンセントレーターをモニターし得るので、直接的または連続的にラマンオプトロードサンプリングシステムが、完全に反応性であり、そして検体と結合し得るかどうかを決定することが可能であり；一方で中毒または分解された吸着性能力は、較正のための外部分析物標準を使用しない従来のクォーツファイバーバンドルサンプリングシステムで決定され得ない。
【００９５】
本発明で可能な広範なサンプリング構成の別の例として、ディップスティックが、「スポット」のアレイでコーティングされ、バイオコンセントレーターを含む各スポットは、粗い金属フィルム上で固定化される。このディップスティックは、液体サンプル中に浸けられるか、または表面を塗布するために使用され、これにより、ディップスティック上のバイオコンセントレーターとの複合体に対して、サンプル中または表面上で多数物を分析を可能にする。ディップスティックは、実質的に、画像化ラマン分光計を含む読み出しシステムに挿入される。この画像化ラマン分光計は、ディップスティック上のアレイにおいて、バイオコンセントレーターの各々から個々のスペクトルを同時に収集し得る。これにより、このラマンオプトロードディップスティックは、サンプル中に存在する各個々の構成成分に関連する個々のスペクトル（他のサンプル構成成分からのスペクトル寄与の干渉のない各個々のスペクトル）の同時収集および分析を可能にし、これにより、単一サンプル内の多数の検体の同時の特異性検出および同定および定量を得る。一方、従来のラマン分光計は、分光法の構成を使用したとしても、全てのサンプルスペクトルの重なり合ったスペクトルから構成される非常に複雑な単一のスペクトルの収集のみを可能にする。さらに、本発明の種々のバイオコンセントレーターの下に敷いた金属フィルムの各々を、金属組成および粗野特性の両方で個々に作製し得、金属フィルム上に固定化されるバイオコンセントレーターに対して選択的および特異的および個々にＳＥＲＳ現象に起因してシグナル増強を調節する。これは、本発明が、シグナルサンプリングおよび分析事象の間に種々の検体に対して広範な感度および特異性を示すことを可能とする。一方、ＳＥＲＳ分析に対する従来のアプローチは、単一の金属コーティング表面の使用を含み、その結果１つのサンプル構成成分からのシグナルの増強が、別のサンプル構成成分からのシグナルの増強と正確に同じ特徴を有する、正確に同じ金属表面によって影響される。
【００９６】
本発明を用いて可能な多数の他の構成が存在する。
【００９７】
これは、本発明の以下の詳細な説明からさらに明らかとなり、この詳細な説明は、限定の意味ではなく例示を意図している。先行技術の方法およびデバイスよりも優れた能力および改善された遂行を提供する、より改善されたプロセスおよび装置が提供される。
【００９８】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
一般に、本発明は、４工程を含む直接的な分析プロセスおよびデバイスである。第１の工程は、サンプルをバイオコンセントレーターと接触させる工程、例えば、任意の検体がサンプル中に存在する場合、少なくともいくらかの検体がバイオコンセントレーターと結合し、これにより、バイオコンセントレーター−検体複合体を形成するというような方法を含む。第２の工程において、バイオコンセントレーターおよび／またはバイオコンセントレーター−検体複合体は、ラマン散乱スペクトルを発生させるのに適した１以上のレーザー波長のような照射光に曝露される。次いで、第３のラマン分光学的技術を使用して、スペクトルバンドを収集しそして処理し、光シグナルを電子シグナルに変換するのに適した検出器でこれらのバンドに焦点を合わせる。第４の工程（最終工程）において、電子シグナルを、１以上のベースラインスペクトルと比較して、検体の存在および／または同一性、ならびに所望であれば、量を決定する。さらに、所望であれば、この比較はまた、バイオコンセントレーター自体についての情報（すなわち、バイオコンセントレーターが、十分に反応性であるか、または分析検体が改変されなければならない点もしくはバイオコンセントレーターが取り換えられなければならない点で分解されるかどうか）を提供し得る。次いで、この情報は、検体の検出および分析に使用される手順を調節または改変するために使用される。ベースラインスペクトルは、サンプルをバイオコンセントレーターと接触させる直前にバイオコンセントレーターのラマンスペクトルを単に取るだけで、検体検出と同じ時間で作製され得る。あるいは、より多くの情報が所望される場合、このベースラインは、モデル参照ラマンスペクトルのライブラリであり得、このスペクトルは、反応性および非反応性または部分的に反応性の形態のバイオコンセントレーターから、および「既知」のバイオコンセントレーター−検体複合体から予め生成され得、そして次いでこのような比較のためのラマンオプトロードメモリーに保存され得る。
【００９９】
本発明に従って、装置は、一般に以下を備える：バイオコンセントレーター；サンプルをバイオコンセントレーターと接触させるための方法またはメカニズムまたはデバイス；光源（例えば、バイオコンセントレーターおよび／またはバイオコンセントレーター−検体複合体および／または検体からラマン散乱を発生させるのに適切なレーザー）；光学情報を処理し、その情報を電子シグナルに変換するのに適切なラマン分光計；ならびにモデル参照スペクトルのライブラリを保存し、そしてラマン分光計によって発生される「未知」のサンプルスペクトルを比較しそして分析するのに適したシグナル分析装置または手順またはメカニズム。この方法によって、複合検体を検出および／または同定および／または定量し、そして／あるいはバイオコンセントレーター自体の状態を評価する。この発明はまた、警告、ディスプレイ、プリントアウト、コンピュータまたは制御器へのシグナル、あるいはラマン分析の結果に対する告知または存在または送信または応答のための他の形態を発生するための方法またはメカニズムまたはデバイスを含む。付属成分またはサブシステムとしてはまた、所望されるかまたは必要な場合、例えば、以下が挙げられ得る：温度、ｐＨ、湿度、固有圧（例えば、詰まったフィルターの表示）などをモニタリングおよび／または調節するためのデバイスまたは成分；バッテリーまたは他の電力源；データを入力するためのキーパットまたは他のメカニズム；運搬ケースまたはハウジング；較正手順のための内部標準を追加または測定またはモニタリングするためのメカニズムまたはデバイスなど。
【０１００】
ここで、図面を参照すると、参考が図１に作製され、これは、説明の目的のために、本発明の好ましい形態を例示する。例示の目的のために、この形態としては、水中のフェノールおよび／または置換フェノールの検出が挙げられるが、本発明は、それらの被検体に限定されなく、溶解、懸濁または水和された被検体にも限定されなく、示された配置にも限定されないことが理解される。
【０１０１】
従って、被検体（ここでは、フェノール分子および置換フェノール分子）を含有する水は、機構（例えば、液体ポンプ２５）により、本発明を通して汲み出され、この水は、まず水からの汚物、花粉および破片のような懸濁された微粒子を第１に取り除くフィルター１３を好ましく通過し、次いで、排出される前に、可撓性テープ１７を覆うか通るかまたは通りすぎる。可撓性テープ１７（好ましくは、多孔性であり、そして薄い、粗面な銀のフィルムで覆われる）は、巻き取りリール２１および供給リール２２で支持される。バイオコンセントレーター１５（好ましくは、酵素ＮＡＤＰＨのオキシドリダクターゼの形態である）は、このテープ上の銀フィルム中に固定化される。被検体を含有する液体が、テープに接触する場合、水中に溶解されたフェノール分子は、テープ上の酵素に結合し、それによって、少なくとも幾つかの溶解されたフェノールをテープのバイオコンセントレーター上に収集および濃縮させる。
【０１０２】
レーザー３０のような適切な励起供給源は、１以上の予め決定された波長（ここでは、５６８ｎｍ）の照射３１をバイオコンセントレーター上に投射するように配置される。レーザー照射が、バイオコンセントレーター１５上に当たる場合、ラマン散乱スペクトル３２（酵素−被検体複合体に特有である）が、生成される。この特有の発光スペクトルの照射は、光学分光器サブシステムを通過し、このサブシステムは、例えば、コード信号３４を生じるアダマール変換性液体結晶化空間光モジュレーター（概して３３に示される）；ラマンコード信号を収集および集束するオプティクス（概して３５に示される）；およびディテクター（概して３７に示される）を備え得る。ディテクター３７は、光コード信号を電気信号に変換し、この電気信号は、ソフトウェアプロッセッサ−４０に送信され、このソフトウェアプロセッサーは、発光された照射と参照スペクトルモデルのライブラリー（示されるように）とを比較し、発光された照射が、所与の酵素−フェノール複合体のスペクトルモデルと適合するか否か決定し、生成されるべきこのスペクトルを生じるフェノールを同定し、そして必要に応じてその量を決定する。ディスプレイサブシステム（アラーム５２および／またはディスプレイスクリーン５１（これは、特定のフェノールの同一性およびその相対的量を示す）の形態であリ得る）は、プロセッサー４０のアウトプットに接続される。必要に応じて、結果のハードコピーのプリントアウト５３は、例示されるように、提供され得る。この全体のアセンブリは、当業者に明らかなように、適切なパッケージに収容され得る。
【０１０３】
本発明が作動中である間、バイオコンセントレーターは、連続性ベース、半連続性ベースまたは周期性ベース上のレーザー３０の光に曝される。ソフトウェアプロセッサー４０によって実施された分析は、発光スペクトルの照射が酵素−フェノール複合体のスペクトルと適合するか否かだけでなく、発光スペクトルの照射が完全な活性バイオコンセントレーターのスペクトルと適合するか否かまでも決定する。発光スペクトルの照射の分析が、バイオコンセントレーターが、分解され、変性され、不活性化され、消化され、別の阻害物質に結合されるかさもなければ、フェノールを結合することを不可能にされるかまたは可能でなくされると決定する場合、テープ１７は、バイオコンセントレーター１５の新鮮な供給部が、引き続く分析間隔の間、水の流れに曝されるように進めれられる。
【０１０４】
定量化および検出が所望される場合、内標準６７（テープ上のバイオコンセントレーターと共に固定化されたＳＯ4−２としてここで示される）が使用され得る。ラマン分析の間、内標準６７は、バイオコンセントレーターが照射される場合と同じ時間でそして同じ光源により照射され、そしてバイオコンセントレーター−被検体複合体からのラマン散乱スペクトル帯域が生成、収集および処理される場合と同じ時間でそして同じ計測器により、内標準６７からのラマンの散乱スペクトル帯域は、生成、収集そして処理される（示されるように）。内標準からの９８１ｃｍ−１ラインの強度と被検体のスペクトルからのキーラインの強度の比は、モデル参照スペクトルのこれらのラインの比と比較して、当業者に既知の定量的スペクトル分析方法論の適用により捕集された汚染物質の量を定量化するために使用され得る。
【０１０５】
酵素−インヒビター複合体、酵素−基質複合体または酵素−補酵素複合体の各々のラマンスペクトルが、特有であるので、ラマンオプトロードは、単一の酵素が複数の被検体を捕集するために使用され、そして単一の光学分光器サブシステムが生じたスペクトル情報を収集および処理するために使用される場合でさえ、複数の被検体を同定し得る。例えば、図２は、酵素ＮＡＤＰＨオキシドレダクターゼが、バイオコンセントレーターとして使用され、そしてレーザーが５６８ｎｍで作動する場合、フェノールおよび置換フェノールの検出および同定のために設計されたラマンオプトロードのライブラリーに含まれ得るモデル参照スペクトルを図示する。これらの共鳴ラマン散乱スペクトルから容易に分かり得るように、酵素によって捕集された「未知」のフェノールの同定は、この酵素−「未知」インヒビター複合体が５６８ｎｍで作動するレーザーによって照射される場合に生成される特有のスペクトルと、ライブラリー中の「既知」のＮＡＤＰＨオキシドリダクターゼ−フェノール複合体スペクトルとの比較によって決定され得る。
【０１０６】
テープが、置換フェノールに特異的な酵素で覆われるように記載される一方で、このテープは、その代わりに、他の物質（非汚染物質でさえある）に特異的な酵素で覆われ得る。このテープが複数の被検体を収集および濃縮する酵素で覆われるように記載される一方で、このテープは、特に、単一の被検体を収集および濃縮する酵素で覆われ得る。このテープはまた、置換フェノールのような密接に関係した被検体より、化学反応および配置においてより広範に変化する複数の被検体の検出のために、他の型のバイオコンセントレーター分子（例えば、抗体またはヘムタンパク、あるいはその混合物）または非タンパク質性バイオコンセントレーターでさえも覆われ得る。バイオコンセントレーターおよび、抗体−抗原複合体、抗体−ハプテン複合体、酵素−インヒビター複合体、酵素−基質複合体、酵素−補酵素複合体、または他のタンパク質−リガンド複合体の各々に関するラマンスペクトルの特有の帯域の特異性のために、１つまたは複数の被検体は、１度に検出、同定そして定量され得る。
【０１０７】
図３ａ〜３ｅは、取り外し可能なカセットモジュール５５を例示し、これは、本発明に従って、図１中に例示されるような検出デバイスまたは示されるような他のラマンオプトロードデバイスもしくは配置の中のサンプリングサブシステムとして使用され得る。図３ａは、入口面を例示し、図３ｅは、排出面を例示し、そして図３ｂ〜３ｄは、取り外し可能なカセットの断面を例示する。このカセット５５は、モジュラーハウジング５６中に取りつけられる。このカセット中に、テープ供給スプール６２および巻き取りスプール６４が、示されるように、ある。このカセット５５は、テープ区画６６の液体への曝露を可能にするサンプル窓６８、および排出チャンバ６９（チャンバを通って液体がポンプによって汲み出される）を備える。各カセットの入口面７１（図３ａ中に示されるように）は、微粒子体（例えば、汚物、花粉および懸濁された破片）を除去するためのフィルターエレメント７３を備える。取り外し可能なカセットモジュールは、Ｏリングシール７６によりラマンオプトロードハウジングに封鎖され、そしてラマンオプトロードハウジングの中のカセットの適切な配向のために局所スロット７８を備える。
【０１０８】
図３ｃおよび３ｄに示されるように、巻き取りスプールは、支持ロッド８０上に取りつけられ、スプリングバイアス（ｓｐｒｉｎｇ ｂｉａｓｉｎｇ）手段８１を備える支持ロッド８０は、取り巻きリールを巻きこむ傾向がある。このロッド８０の他の末端は、回転インピーダー（ｉｍｐｅｄｅｒ）８２を備え、これは、このロッドのノッチに適合する。インピーダーが解放される場合、このスプリングは、窓６８の下の各テープの新鮮な区画をもたらすように、ロッドに予め決定された量を回転させる。示されるように、テープ供給スプールはまた、支持ロッド８４に支持される。
【０１０９】
操作の際に、ラマンスペクトル分析が、被検体の存在を示す場合、可視式アラームおよび可聴式アラームが誘発され、そしてテープは、回転インピーダー８２への信号により進められ、その結果、曝されていないバイオコンセントレーターの新鮮な区画が、次のサンプリングサイクルのためにサンプリング窓６８に動かされる。同様に、ラマン分析が、バイオコンセントレーターが、被検体で変性、分解または飽和されることを示す場合、このテープは、進められ得、その結果、完全に活性なバイオコンセントレーターを備えるテープの新鮮な区画がこの窓に曝される。このテープのすべての区画が曝され、そしてすべてのバイオコンセントレーターが使用または消費される場合、オペレーターは、処分カセットを除去し得、そしてそれを新しいカセットと置換し得る。
【０１１０】
固定化バイオコンセントレーターの１つの帯状片で覆われた単一のテープが、示される一方で、固定化バイオコンセントレーターの多重の帯状片またはバイオコンセントレーターのスポットのアレイが、単一のテープ上で使用され得、そして照射を拡散するように曝され得、その結果、全ての帯状片またはスポットが、同じ照射波長へ同時に曝され、そしてすべての生じたラマン帯域が、同時に収集および処理される（例えば、画像化ラマン分光法の使用を通して）ことが、明らかである。バイオコンセントレーターの複数の帯状片またはスポットを備えるテープが、走査型ラマン分光器によって代わりに走査され得ること；そして多重テープが、所望のように使用および走査され得、そして同じ進行機構を用いて同時に進められ得るかまたは異なる進行機構を用いて異なる時に進められ得るかのいずれかであり得ることも、明らかである。参照化学物質（すなわち、内標準）を含有する分離性および識別性の帯状片またはスポットが、定量分析／較正の際の使用のために、テープの中に組み込まれて示される一方で、多重参照化学物質を含有する多重帯状片または多重スポットが、代わりに使用され得；または内標準が、バイオコンセントレーターと伴に混合され得；そして異なる参照化学物質が、異なるバイオコンセントレーターと伴に使用され得、バイオコンセントレーターで混合または相互固定化され得るかまたは１つ以上の分離性帯状片または分離性スポット上に固定化され得るかのいずれかであることが、明らかである。
【０１１１】
カセット内のテープ上に固定化されるバイオコンセントレーターに対応する（従って、それによって検出され得る被検体に対応する）カセット（例えば、バーコード、電気的接触のパターン、突出ピン、など（示されない））をコードするための手段が、カセット中に組み込まれ得、そしてラマンオプトロード電子工学およびソフトウェアは、ラマンオプトロードが、このコードを「解読」し得、そしてこのカセットがラマンオプトロードハウジングの中にある場合、実施されるラマン分析を自動的に調整、改変または変更し得、そしてディスプレイまたはそれに従う印刷物を変化させ得るように、設計され得る。例えば、「コードＡ」がカセット上にある場合、ＮＡＤＰＨオキシドリダクターゼが、テープ上に固定化され、そして測定されたすべてのスペクトルが、酵素およびそのフェノール複合体の参照スペクトルモデルに対して比較されることを示し得る。測定されたスペクトルとモデルスペクトルとの間の任意の「決定的な」一致は、対応するフェノールの同一性をディスプレイ上に提示させる。しかし、「コードＢ」が、カセット上にある場合、例えば、酵素（コリンエステラーゼ）がテープ上に固定化され、そして測定された全てのスペクトルが、その酵素およびその有機リン複合体またはカルバメート複合体の参照スペクトルモデルに対して比較され；そして測定されたスペクトルとモデルスペクトルの間の任意の「決定的な」一致が、対応する殺虫剤または神経薬剤の同定をディスプレイ上に提示させること、を示し得る。ラマンオプトロードは、バイオコンセントレーター、被検体、テープの配置（例えば、テープの上に固定化されたバイオコンセントレーターの帯状片の数）またはさらに、おそらく分析されるべきサンプルの型（例えば、ヒトの血または飲料水が、神経薬剤に対して分析されるべきか否か）に従って、コードを処理するようにさえ設計され得、その結果、レーザーが、テープを照射するための異なる波長に調整され、ポンプが、異なるスピードで操作され、スペクトルが収集および相互添付される場合にわたる間隔が、調整され、分光器が、走査モードまたは３−Ｄ操作モードなどに切り替えられる。
【０１１２】
空気をサンプリングする場合、フィルター７３を気体からの粒子体をろ化するために適合可能なものと置換することにより、同様なカセットが、使用され得る。さらに、所望の場合、加湿器が、非常に乾燥した環境において空気をサンプリングするように意図されるそれらのデバイスのために、カセット中に組み込まれ、最適結合動力学を確実にし得る。加湿器（示されない）が、水リザーバーと同様に単純であり得、そして水リザーバーと接触し、水リザーバーから好ましくはフィルター７３までまたはサンプリング窓中のテープの区画までへと導く芯と同様単純であり得る。
【０１１３】
述べられるように、ラマンオプトロードサンプリングシステムまたはサブシステムは、任意のいくつかの形態をとり得る。本発明に従って、この同じデバイスまたはハウジング（例えば、光源、光学機器、検出器、および／または電子工学製品）の中に物理的に取りつけされないかまたは封入されない表面上のバイオコンセントレーターを固定化することが可能である。サンプリング（すなわち、分析されるべきマトリクスのある部分を、被検体の少なくともある部分がバイオコンセントレーターに結合されるような様式で、バイオコンセントレーターに接触させること）が、サンプリング工程およびラマン読み出し工程のための別々の処理および／またはデバイスを用いて、起こり得るか、あるいはラマン読み出し（すなわち、バイオコンセントレーター−被検体複合体の照射、生じるラマン帯域の分光学的分析、および捕集された被検体の同定への移行）から別々にかつ独立して実行され得る。
【０１１４】
例えば、少なくとも１つのサンプルは、ラマン読み出し装置またはデバイスが備えられる部位から遠くに取り外される位置で、別々のサンプリングプロセスまたはデバイスを用いて収集され得；そして収集されるサンプルは、標識またはコードされ得、そして分析される前にある期間保存される。図４ａ〜４ｅは、分散した空気のサンプル収集するための手持ちサイズのサプリングシステム１５５を例示する。本発明の好ましい形態において、この手持ちサイズのサンプリングデバイスは、図３中に示される取り外し可能なカセット５５および別々のラマン読み出しデバイス（示されない）を組み合わせて使用される。図４ａは、手持ちサイズのサンプリングシステムの断面図を例示し、図４は、手持ちサイズのサンプリングシステムの上面図を、そして図４ｃは、手持ちサイズのサンプリングシステムの側面図を例示する。サンプリングシステム１５５は、サンプリング窓１２７、ファン１３１およびモーター１３３を備えるハウジング１２１を備え、そしてガス通路１２８が、ガスのテープ区画６８への流れおよびファンによって吸引される場合の排出ポート１２９の外への流れを可能にする工程を包含する。サンプリングシステムはまた、空間を有するキャビティ１３５および電力供給バッテリー１４１のためのコネクター１３２；周囲温度を測定するためのサーミスターのような手段１４２；ファンおよびカセットの中のテープを進めるテープ回転インピーダーを制御するための電子工学１４３；サンプリングシステムをオンにするためのスライドスイッチ１２２のような手段および各々のサンプリングサイクルを始めるためのプッシュボタン１２３、を備える。このサンプリングシステムはまた、取り外し可能なカセット５５を維持するキャビティ１３６を備える。取り外し可能なカセットモジュールは、キャビティ中の位置誘導１０８およびカセット中の位置スロット７８によってキャビティ１３６中の位置に誘導され、そしてカセットキャビティ中のＯリングシール１０６およびカセット中の７６によってサンプリングシステムハウジングに封鎖される。ドア１２５および１２６は、バッテリーキャビティ１３５およびカセットキャビティ１３６の内容物をそれぞれ隠し、そして保護する。
【０１１５】
カセットをコードするためのカセット上の手段は、示されないが、この手段は、テープ上に固定化されたバイオコンセントレーターの型（すなわち、バイオコンセントレーターによってサンプリングおよび収集され得る被検体の型、ならびにバイオコンセントレーターに結合され得る被検体の型）を示す。図４ｂに示されるように、サンプリングシステムは、コードによって示されるように、カセットによってサンプリングされ得る被検体を示すディスプレイ１５１を備え；このコードを解読しそしてそれに応じてディスプレイ１５１を改変するためのサンプリングシステム内の手段は、示されない。このサンプリングシステムはまた、サーミスター１４２によって測定される場合の周囲温度を示すディスプレイ１５２を備え、そして／またはバッテリー１４１中に残存する電力が、最低レベルより低いという表示を与える。
【０１１６】
操作の際に、オペレーターは、カセットをカセットキャビティに挿入し、次いでスライドスイッチ１２２を「オン」の位置へ動かすことによりサンプリングシステムをオンにする。このオペレータは次いで、プッシュボタン１６１のような手段を用いて、収集されるべきサンプルの適切な量を設定する。このプッシュボタン１６１は、例えば、サンプルが収集されるべき期間（示されない）、ファンが作動する速さあるいはその両方に影響を及ぼし得る。オペレーターによって選択された期間は、ディスプレイ１５３中に示され得、そして不正確であるかまたは変更されるべき場合は、手段１６２を用いてリセットされ得る。一旦サンプリングの容量が設定されると、オペレーターは、サンプルを収集する用意ができている。サンプルは、サンプリング窓１２７がサンプリングされるべき空気供給源に近位になるようにサンプリングシステムを配置し、そして「サンプル」プッシュボタン１２３を押すことによって、収集され得る。「サンプル」プッシュボタン１２３が押されると、サンプリングシステムは、自動的にファン（それによって、サンプリング窓およびテープを通って空気を引き、そして被検体をテープ上のバイオコンセントレーターと接触させる）を開始し、そしてファンがオペレーターによって設定された期間作動した後、再びファンをオフに切り換え、次いで結合していないバイオコンセントレーターを有するテープ６８の新鮮な区画が、サンプリング窓１２７に入るサンプルに曝されるようにテープを進める。
【０１１７】
所望される場合、デバイスが非常に乾燥した環境で使用される際のそれらの適用のために、加湿器がカセットそれ自身またはサンプリングシステムのいずれかの中に組み込まれ得ることが、明らかである。手持ちサイズのサンプリングシステムが、ファン／モーターを液体ポンプに置換し、そしてサンプリング窓にないテープの区画が水との接触から保護されるように（例えば、水は、テープの隣の区画に「流れ」得ないかまたはテープスプールを収容および保護するカセット中の区分に浸透し得ない）カセットを設計することによって、空気サンプルの代わりに液体サンプルを収集するように容易に設計され得ることも明らかである。さらに、可撓性プローブが、サンプル供給源からの空気または液体をサンプリング窓に方向づけるかまたは汲み出すためにサンプリングシステムに追加され得ることが、明らかである。
【０１１８】
一旦、すべてのサンプルが収集されると、オペレーターは、ラマン「読み出し」システム（示されない）が位置する場所に戻る。ラマン読み出しシステムは、テープの移動の制御、テープの各々の区画からのラマンスペクトル情報の解析および被検体の結果の表示またはプリントアウトの提供のために、光源、光学分光器、ならびに電子工学製品およびソフトウェアを備え；そしてサンプリング窓１２７中のテープ区画が個々にかつ連続して分析されるために、テープカセットを正しい配列に維持するように設計されるテープカセット分析アクセサリもまた備える。本発明の好ましい形態において、このテープカセット分析アクセサリは、粉末、結晶、液体、マイクロリットル未満容量の液体、固体、可撓性材料、繊維および気体の分析のための近代のラマン分析実験器具の使用について利用可能なサンプリング補体と設計において同様であり得る。これらのサンプリングアクセサリは、通常、光学機器を整列するための必要性を最小化または完全に排除するために、動力学的取り付けピンを使用して、サンプル区分中の再現可能なアクセサリの位置決めで迅速なアクセサリ交換を可能にする。次いで、本発明の好ましい形態において、ラマン読み出しデバイスは、市販のラマン実験機器であり、そしてテープカセット分析アクセサリは、市販のラマン分光器サンプリングアクセサリと設計において同様である。さらに、本発明に従って、特定のソフトウェアパッケージが、テープ上のサンプルの分析を制御し、各々の汚染物質の存在および同定を決定し、各々の汚染物質の濃度を計算し、そして各々の分析が完了される場合、サンプルからサンプルへテープを進めるために、使用され得る。このソフトウェアはまた、分析のプリントアウトを生じさせ得、そして／または各々のサンプル中の汚染物質の同定および定量化を分光器のディスプレイスクリーン上に示すディスプレイを提供し得る。
【０１１９】
操作の際に、一旦すべてのサンプルが、収集され、そして手持ちサイズのサンプリングデバイスが、ラマン分光光度計を収容する実験室に戻されると、オペレーターは、サンプリングシステム１５５からテープカセット５５を取り出し、カセットを本明細書中に記載されるラマン読み出しアクセサリの中に挿入し、そしてラマン分光光度計をプログラミングして自動的にテープの各々の区画を分析し、そしてオペレーターが選び出す各々の分析からの、分光光度計が示す情報の型を提供する。カセットが、テープ上にあるバイオコンセントレーター（そしてそのために、このテープを用いることにより、検出および同定され得る被検体）を示すためにコードされる場合、ラマン分光光度計読み出しシステムはまた、コードを解読するための手段（本発明の好ましい形態において、これは、ラマン分光光度計サンプリングアクセサリに設計される）を備え；そして電子工学製品おおよびソフトウェアは、ラマン分析が、自動的にそれに応じて適合され（例えば、比較が、ライブラリー中の異なるセットの参照スペクトルモデルに対して行われ、そして定量的測定が、異なる較正標準に対して行われる）そしてディスプレイまたはプリントアウトが、異なる被検体を反映するように変更されるように、設計される。
【０１２０】
光学導波管材料または光学導波管成分は、所望の場合、ラマンオプトロードにおいて使用され得る；例えば、バイオコンセントレーターは、適切な導波管材料（例えば、ファイバー光学導波管、または光学導波管結晶もしくは光学導波管プレートなど）の表面上に固定化され得る。図５ａ〜５ｄは、この配置のいくつかを概略的に例示し、ここにおいて、光学導波管材料は、本発明に従って使用され得る。図５ａに示されるように、バイオコンセントレーター２２３は、例えば、ファイバー光学導波管のチップにまたはこのチップ上に固定化され得；そして励起光が、光源２２１から光ファイバー２２２を通ってバイオコンセントレーター２２３まで伝播し得、そして生じたラマンスペクトルの情報が、同じ光ファイバー２２２を通ってバイオコンセントレーターから分光計２２４まで伝わる。あるいは、このバイオコンセントレーターは、図５ｂに示されるように、光ファイバーまたは光学導波管プレートもしくは光学導波管結晶の一部、大部分またはすべてに沿って固定化され得；そして励起光が、光源２２１からエバネセント波（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ ｗａｖｅ）２３１のような導波管材料２２２を通って伝播し得、そしてスペクトル情報が分光計２２４によって収集および分析される前に、導波管表面上のバイオコンセントレーター２２３と１回以上相互作用し得る。いずれのアプローチにおいても、金属フィルム２２８は、バイオコンセントレーターが金属上に固定化される前に、導波管表面上で覆われ得、その結果、励起光は、バイオコンセントレーターと接触する前に、金属フィルムを透過する。バイオコンセントレーターが、単一の生物学的成分であり得るか、または複数のバイオテクノロジー製品の混合物であり得ることは、明らかである。光学導波管がプレートまたは平らな結晶の形態である場合、複数のバイオコンセントレーターが、このプレートまたは結晶の表面に沿って帯状片中に（または、この光学導波管プレートまたは結晶の表面上の金属フィルムの帯状片上に）固定化され得、そしてバイオコンセントレーターの各々の帯状片からのラマンスペクトルが、別々にかつ独立して収集および処理され得る。
【０１２１】
あるいは、このバイオコンセントレーターが、図５ｃに示されるように、別々の表面（例えば、剛直な支持表面）上に固定化され得、そして光ファイバープローブによって応答指令信号を送られ得る。本発明に従って、アクセスし難い場所に到達するように、長い可撓性の光ファイバープローブ（直径が小さい）を使用することが可能である。例えば、このプローブは、光ファイバー導波管２２２を備え、その先端部に小さなテープカセット２４５を備え得る（図５ｃ中に概略的に例示される）。このプローブは、蒸気のサンプルまたは液体サンプルが、このテープと接触するように設計される。なお別の形態において、図５ｄに示されるように、バイオコンセントレーターは、テープ（例えば、小さなビーズ２６６（これは、例えば、金網状ケージ２６８によってプローブのチップに維持される））の他のある表面上に固定化され得る。光ファイバー導波管が使用される場合、光源２２１からバイオコンセントレーターまで伝播する励起光２１１およびバイオコンセントレーターから光学分光計２２４まで伝播するラマン散乱光２１４の両方は、同じ光ファイバープローブを通って反対の方向で伝播し得るが、異なるファイバーは、所望の場合、使用され得る。
【０１２２】
図５ａ〜５ｄに示されるサンプリングアプローチは、一体型ラマンオプトロード検出システムまたはモニタリングシステムの内および一部のサンプリングサブシステムにおいて使用され得る。あるいは、その固体支持体上のバイオコンセントレーターは、別々のサンプリングデバイスまたはシステムであり得るか、あるいは別々のサンプリングデバイスまたはシステムにおいて使用され得、そして時間および空間の両方において別々にされる場合、ラマン読み出しデバイスまたはシステムからのサンプル／被検体と接触させられ得る。
【０１２３】
図６ａおよび６ｂは、例えば、線量計バッジまたはディップスティックあるいはスワッブなどとして使用され得る、サンプリングデバイスの、それぞれ頂面図および側面図を示す。一旦、サンプルが収集されると（すなわち、デバイス上のバイオコンセントレーターが分析されるべき物質に適切に接触されると）、このサンプリングデバイスは、次いで、捕捉した検体の分析（すなわち、バイオコンセントレーターまたはバイオコンセントレーター−検体複合体の照射、ならびにラマンスペクトルの収集、処理、および分析）のために、図６ｄに一般的に示すように、ラマン読み出しシステムに挿入され得る。図６ａおよび６ｂは、比較的平坦な支持部材４２６の形態でのサンプリングシステム４２５を図示し、これは、少なくとも１つの表面４２８を有し、ここに、バイオコンセントレーター４４１が固定される。このバイオコンセントレーターは、上述した任意の物質またはその任意の組合せであり得；そしてこの支持部材の表面に吸着されるか、架橋されるか、共有結合するか、またはトラップされ得る。この支持部材は、剛性でも可撓性でもよく、そして多孔性（例えば、金属化濾紙）であってさえよい；この支持部材は、これが曝露される放射線に対して透明であり得（例えば、光学導波管プレートまたは結晶）、これによってこの放射線が、このバイオコンセントレーターの下側４２９から投影され得る。被覆４３０（例えば、種々の金属および合金（Ａｇ、Ａｕ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ａｌ、Ｉｎ、Ｗ、ＡｇＢｒ、ＡｇＣｌおよびＴｉＯ2）の１つ以上）が、使用され得る。粗い表面を提供するための好ましい様式は、図６ｃに示され、ここで、サンプリングシステム４２５は、すでに記載した支持部材４２６を備える。ここで、支持部材の表面の少なくとも一部は、複数のマイクロスフィア４６８を備える。これらのマイクロスフィアは、例えば、１００Å〜数万Åの範囲の直径を有する、ポリスチレン、ポリビニルトルエン、ポリブタジエン、テフロン（登録商標）、アルミニウム、白金、またはジルコニウムであり得る；しかし、一般に、５〜５００ｎｍの粗さ突出が好ましくあり得る。次いで、ビーズをつけた（ｂｅａｄｅｄ）表面は、スパッタ堆積金属箔４６９（好ましくは、銀、銅、または金）で被覆される。次いで、バイオコンセントレーターが、すでに記載されたように、この粗い金属表面に固定され得る。この形態のラマンオプトロードサンプリングシステムは、図６ａに概略で示すように、上述のような定量的分析の目的で、光学的に透明な非透過性カバー４５１を使用して、バイオコンセントレーターの一部と検体との接触を防止し得る。この構成のサンプリングシステムを、例えば、線量計バッジ、使い捨てディップスティック、サンプリングスワッブ、サンプリングフィルターなどとして、使用し得る。固定されたバイオコンセントレーターは、少なくとも１つのサンプルに曝露され得る。例えば、バッジはある期間着用され得；ディップスティックは液体または懸濁液に挿入されるかまたはそれを撹拌するために使用され得、スワッブ（液体ありまたはなしで）は表面を拭くかぬぐうか擦るかするために使用され得；液体サンプルがサンプリングフィルターを通して排液され得る、などである。分析されるべき物質に曝露した後に、このサンプリングデバイスは、所望であれば、標識またはコードされて、後の分析のために保存され得る。次いで、この構成のサンプリングデバイスは、当業者に明らかであるように、図６ｄに略図で示す、ラマン読み出しシステム内のサンプリング用付属物に分析のために挿入され得るか、または光ファイバープローブスキャナ（図示せず）を備えるラマン読み出しシステムを使用して分析され得るなどである。このようなサンプリングデバイスは、受動的または能動的な線量測定、実地サンプル分析、血液または尿の分析、微生物汚染に関する表面モニタリングなどに、有用である。
【０１２４】
単一のラマン分光計を、本発明による複数のサンプリングサブシステムと共に使用し得る。このような設計の１つにおいて、複数のサンプリングサブシステムは、光ファイバーケーブルアレイを介してラマン読み出しサブシステムに接続され得る。図７は、例えば、不法な薬物または爆発デバイスのような隠された密売品を検出するための、乗客スクリーニングポータルとして使用され得る構成の模式図である。このポータルは、例えば、ブース６４５およびオペレーターステーション６３５から構成され得る。複数のサンプリングサブシステム６０１（各々が、例えば、取外し可能なテープカセットモジュールを備える）は、示すように、ポータルの内部の周囲の個々のサンプリング部位において一列で配置され得る。個々のファンが各サンプリングサブシステムと連携し得、その結果ブースの内部からの空気が引かれて、テープカセットの各々のバイオコンセントレーターと接触する。あるいは、単一のファンが、単一のファンが適切な量のブース空気をカセットの各々を通して引き、そこに含まれるバイオコンセントレーターと接触させるように、設計された空気排気アレイと接続され得る。各サンプリングサブシステム６０１は、光ファイバーケーブルアレイ６２１を介して、オペレーターステーション６３５内に収容されるラマン分光計に接続され、この光ファイバーケーブルアレイが、ブース内の各サンプリングサブシステム内のバイオコンセントレーターからのラマンスペクトルシグナルを、オペレーターステーション内のラマン分光計へと運ぶ。所望であれば、１つ以上のレーザーのような中心光源が、オペレーターステーション６３５内のラマン分光計と共動し得、そして励起光が分散され得、そして光ファイバーケーブルアレイ６２１を通って個々のサンプリングサブシステム６０１へと運ばれ得る。あるいは、複数の光源（例えば、１つ以上のレーザーの各々）が、サンプリングサブシステムと共動し得る。好ましくは、種々のサンプリングサブシステムからオペレーターステーションへと移動するラマンスペクトルシグナルが、ラマン分析が実施される前に、ラマン分光計サブシステム内の適切な光学機器の使用を通して、単一の光シグナルに組み合わせられる。あるいは、複数のサンプリングサブシステムからの複数のラマンスペクトルが、個々におよび順番に分析され得る。
【０１２５】
ラマン分光計および、可能であれば、光源に加えて、オペレーターステーション６３５はまた、コントロールパネル６３４、視覚的警報６３１および／または可聴警報６３２、ならびに／あるいはあらゆる検出された密売品の存在／確認を示すディスプレイ６３３を備え得る；そしてサンプリングブースは、「ＳＴＯＰ」ライト６０３および「ＧＯ」ライト６０４を備え得る。ディスプレイ６３３はまた、必要に応じて、内部診断情報を示し得る。
【０１２６】
作動において、スクリーニングされるべき乗客は、「ＧＯ」ライト６０４が点灯するまで待つ。次いで、その乗客は、ブース６４５に入り、そしてその内部６０２に立つ。次いで、オペレーターは、コントロールパネル６３４に見られる「ＯＮ」ボタンを押す。これにより、「ＧＯ」ライト６０４を消灯させ、そして「ＳＴＯＰ」ライト６０３を点灯させる（これによって、待ち列にいる次の乗客に信号を送る）；これによって透明なドアを、このブースの入口および出口を覆う位置にスライドさせ；これによって複数のサンプリングサブシステム６０１に位置するファンをオンにし、これらがブース内の空気をバイオコンセントレーターを通してサンプリングサブシステムへと引き；これによってまた、次いで、種々のサンプリングサブシステムからのラマンスペクトルシグナルを分析させる。この分析が密売品の存在を示す場合には、検出された密売品の確認がディスプレイスクリーンに示され得、視覚的警報および／または可聴警報が鳴り得、そして／またはシグナルがセキュリティー本部の警告システムに送られ得る、などである。このラマン分析が、この乗客が密売品を何も運んでいないことを示す場合には、透明なドアが自動的に開き、その乗客にそのブースを去らせ、そして「ＳＴＯＰ」ライトをオフにして「ＧＯ」ライトを再度オンにし、列にいる次の乗客がブースに入るようシグナルを送る。
【０１２７】
最後に、図８は、酵素が熱に曝露されたかもしれないリボヌクレアーゼに関する反応性能力分析のために設計された、ラマンオプトロードのライブラリーに含まれ得る、モデル参照スペクトルを示す。これらのＮＲＳスペクトルから容易に見られ得るように、変性熱の存在は容易に検出され得る。すなわち、２つのＮＲＳスペクトルを比較する場合に、熱的に変性されたリボヌクレアーゼは、未変性のリボヌクレアーゼから容易に区別される。比Ｉ832／Ｉ852およびＩ1000／Ｉ972の相対強度はまた、酵素反応性能力の決定において、使用され得る。
【０１２８】
本発明をより詳細に記載したが、以下の実施例は、本発明の特定の応用の広い範囲を例示するために与えられ、本発明を実施するために使用され得る特定の技術および特定の構成を含む。これらの特定の実施例は、本願に記載される本発明の範囲を限定することを意図されない。
【０１２９】
例えば、マスタード糜爛剤のような化学戦薬剤が、バイオコンセントレーターとしてＤＮＡを使用し、そして２つのベースライン周波数帯をモニタリングするためにＮＲＳ技術を使用して、本発明によって検出され得る。マスタード糜爛剤は、核酸およびポリヌクレオチドをアルキル化し得ることが公知である；そしてまた、グアニン塩基およびそのメチル化誘導体が、異なる区別可能なラマンスペクトルを有することが公知であり、メチル化誘導体は、ネイティブなグアニン塩基に見られる１４８８ｃｍ−１の強いバンドを欠く。Ｃ（８）−ＨをＣ（８）−Ｄに置換することによって、１４８８ｃｍ−１のバンドが１６４５ｃｍ−１にシフトする；このことから、１４８８ｃｍ−１のバンドはＮ（７）＝Ｃ（８）二重結合伸縮であることが結論付けられる。従って、ここで、ラマンＮ（７）＝Ｃ（８）二重結合伸縮バンドのシフトが、ポリヌクレオチドおよび核酸のグアニン部分をアルキル化し得る検体を検出するために、使用され得ることがわかる。例えば、ＤＮＡがメチル窒素マスタードに曝露される場合は、１４９２ｃｍ−１のバンドの強度が減少し、そして１５３０ｃｍ−１にシフトする；この変化は、マスタードによるグアニン部分のメチル化に起因すると考えられ得る。この薬剤に曝露されたＤＮＡにおいて、他の塩基のラマンバンドの変化は、何も観察されない。従って、本発明に従って、２つのＮＲＳ周波数帯（すなわち、１４９２ｃｍ−１および１５３０ｃｍ−１）がモニタリングされて、サンプルにおけるこの薬剤の存在が検出され得る。
【０１３０】
別の実施例において、脂質膜に固定されたレセプターのＮＲＳ分析を使用して、アゴニストおよびアンタゴニストを検出および同定し得る。アルカリ処理した、Ｔｏｒｐｅｄｏ ｍａｒｍｏｒａｔａ電気器官由来のサブシナプス膜フラグメントには、ネイティブな機能性アセチルコリンレセプター（ＡｃＣｈＲ）が豊富にあり、これは、カルバミルコリンのようなアゴニストおよび（＋）−ツボクラリンのようなアンタゴニストを検出および同定するために、使用され得る。５１４．５ｎｍに調節されたアルゴンレーザーを使用して、レセプター膜調製物を照射し得、そしてラマン分光計を使用して、４００〜１８００ｃｍ−１の領域を走査し得る。レセプター調製物が曝露されたサンプル中の、カルバミルコリンの存在は、二重線Ｉ879／Ｉ1443の相対強度が減少し；二重線Ｉ702／Ｉ710の相対強度が増加してピークが７０２／７１０から７００／７１８へとシフトし；９３９／９６１の二重線が９４２／９６７へとシフトし；１０８４ｃｍ−１のピークの強度が増加して１０８６ｃｍ−１へとシフトし；そして５１０／５２５／５４０の三重線に変化がない場合に、検出され得る。サンプル中の（＋）−ツボクラリンの存在は、二重線Ｉ879／Ｉ1443の相対強度が増加し；二重線Ｉ702／Ｉ710の相対強度が増加してピークが７００／７１９へとシフトし；９３９／９６１の二重線が９３５／９５７へとシフトし；１０８４ｃｍ−１のピークの強度が１０８８ｃｍ−１へとシフトしてより強くなり；そして５１０／５２５／５４０の三重線がブロードになって５２０／５５１／５６５にシフトする場合に、検出され得る。
【０１３１】
別の実施例において、マイクロプローブラマン（この場合には、共焦点ラマン顕微分光分析）を使用して、異なる型の白血球（例えば、異なる型の顆粒球）を同定し得る。多くの顆粒（高度に特異的な酵素を含む）が、顆粒球細胞質の内部に存在すること、および異なる型の顆粒球の酵素的成分が、各型に類手独特であることが、周知である。従って、顆粒を含む顆粒球細胞の部分のラマンスペクトルが、ここで、顆粒球の型について独特であることがわかる。ラマンオプトロードのこの特定の実施例において、白血球が、シリカ表面に固定された合成ペプチドバイオコンセントレーターによって、捕捉される。しかし、白血球に対して特異的な抗体が代わりに使用され得、そしてこれらは、この応用に対して好ましいバイオコンセントレーターである。異なる型の白血球（例えば、好中球性および好酸性顆粒球）を検出および同定するために、ヒト末梢血液のサンプルが、固定された合成ペプチドバイオコンセントレーターに塗布され、次いでリンスされる。種々の型の顆粒球の核からのスペクトルは、本質的に同一であり得る；スペクトルが核よりむしろ細胞質から取られたことを確実にするために、１０９４ｃｍ−１の線を、ＤＮＡの指標として使用し得る。すなわち、このスペクトルが１０９４ｃｍ−１において強い性を示す場合には、マイクロプローブの焦点を移動させる。しかし、細胞質からのスペクトルは、６００〜１７００ｃｍ−１のスペクトルウィンドウにわたって顕著に異なる。捕捉された好中球性顆粒球は、６４５ｃｍ−１のピークがより強い６４５／６７３の小さな二重線；７５７ｃｍ−１における中程度に強いピークおよび８２８／８５４における中程度に強い二重線；１００４ｃｍ−１のピークが９８２ｃｍ−１のピークよりずっと強い９８２／１００４における二重線；１１０８ｃｍ−１における中程度に強いピーク；１１２９／１２０８における二重線、１３０７／１３３２／１３６１における三重線、１５０２ｃｍ−１における一重線；１５９０ｃｍ−１がブロードであり、１６１４ｃｍ−１が小さなショルダーであり、そして１６６７ｃｍ−１に中程度のピークである、１５４２／１５９０／１６１４における三重線により、同定され得る。捕捉された好酸性顆粒球は、６２２ｃｍ−１における小さなピーク；６４５ｃｍ−１のピークがより弱い６４５／６７５の小さな二重線；７５８ｃｍ−１における非常に強いピーク；８３７／８５４／８８０における非常に弱い三重線；９８２ｃｍ−１におけるピークが１００４ｃｍ−１におけるピークよりわずかに弱い９８２／１００４における比較的強い二重線；１０７８ｃｍ−１における小さなピーク；１１１９ｃｍ−１における中程度のピーク；１２１２ｃｍ−１における強いピーク；１３０７／１３４０における二重線；１５２０ｃｍ−１における中程度のピーク；１５４７／１６１４における非常に強い二重線；および１６６２ｃｍ−１における小さなピークによって、好中球性顆粒球から区別され得、そして同定され得る。
【０１３２】
分子または複合体の全ての結合および官能基に起因して、ＮＲＳは、タンパク質の非常に複雑なスペクトルを提供することが公知である。しかし、ＲＲＳは、発色団バンドからのシグナルを、これらがそのスペクトルの唯一の特徴である点にまで増強し得る；従って、ＲＲＳスペクトルは、バンド数がより少なく、ずっと簡単である。発色団に直接関連する振動モードは、１０６にまで高い因子によって、その強度が有意に増強されている。従って、ＲＲＳにより生じるスペクトルはより簡単であり、そしてより高い選択性ならびに大いに改善された感度が得られ得る。従って、多くの応用において、ＲＲＳは、ラマンオプトロードプロセスまたはデバイスにおいて使用するための、好ましい技術であり得る。
【０１３３】
例えば、ＲＲＳは、酵素バイオコンセントレーターと共に使用して、ハロゲン化フェノールのような環境の汚染物を検出し、同定し、そして定量し得る。先に議論したように、図２に示すように、酵素ＮＡＤＰＨオキシドレダクターゼを、フェノールおよびパラ置換フェノール（例えば、ｐ−メチルフェノール、ｐ−クロロフェノール、ｐ−フルオロフェノール、およびｐ−ニトロフェノール）を検出するためのバイオコンセントレーターとして、使用し得る。酵素−検体複合体は、５６８ｎｍで作動するレーザーで照射され得、そしてＲＲＳスペクトルが収集され得、そしてウィンドウ３５０〜１０５０ｃｍ−１で分析され得る。ＲＲＳスペクトルへの寄与は、ほぼ全体的に、酵素に結合する汚染物の存在に起因する。フェノールの存在は、例えば、５４７、６０４、６２３、７６１、７８５、および８３４ｃｍ−１でのＲＲＳピークの生成によって、；ｐ−メチルフェノールは、４０５、４７７、５２０、７２３、７４１１、および７５２ｃｍ−１のピークによって；ｐ−クロロフェノールは、３９０、６０８、および６５０ｃｍ−１のピークによって；ｐ−フルオロフェノールは、４７５、５２０、７３１、７６０、および８３５ｃｍ−１のピークによって；そしてｐ−ニトロフェノールは、３８６、５２３、６０５、６２５、６４５、８３５、および８５５ｃｍ−１のピークによって、決定され得る。検出に加えて定量が所望される場合には、共に固定されるＳＯ4 -2の内部標準を使用し得、そしてこの内部標準の線の強度対検体のスペクトルの主要な線の比を使用して、捕捉された汚染物の量を定量し得る。汚染物を定量するために使用され得る主要なピークは、内部標準からの９８１ｃｍ−１の線；フェノールからの５４７ｃｍ−１の線；ｐ−メチルフェノールからの４７７ｃｍ−１の線；ｐ−クロロフェノールからの３９０ｃｍ−１の線；ｐ−フルオロフェノールからの４７５ｃｍ−１の線；およびｐ−ニトロフェノールからの６４５ｃｍ−１の線である。
【０１３４】
別の実施例において、酵素が、バイオコンセントレーターとしてリガンドを使用して、ＲＲＳ分析により検出され得る。この実施例においては、４４１．６ｎｍにおいて作動するレーザーが使用される。この波長での照射は、大部分のタンパク質の共鳴を励起しない；なぜなら、通常のラマン散乱のみが、これらの条件下ではタンパク質自体から観察され、酵素カルボニックアンヒドラーゼのような検体の比較的高い濃度が、通常、ラマンスペクトルを生じさせるために必要とされるからである。しかし、発色団リガンドバイオコンセントレーター（すなわち、この波長で作動するレーザーにより共鳴が生じ得るインヒビター）をバイオコンセントレーターとして使用する場合には、非常に低い量の酵素カルボニックアンヒドラーゼの存在が、本発明に従って検出され得る。カルボニックアンヒドラーゼは、多数のスルホンアミド誘導体によって阻害されることが公知である；そして４４１．６ｎｍで作動するレーザーは、スルホンアミドの共鳴を誘導する。従って、カルボニックアンヒドラーゼの存在は、スルホンアミドバイオコンセントレーターのＲＲＳスペクトルの特定の変化をモニタリングすることによって、決定され得る。例えば、バイオコンセントレーター４−スルホンアミド−４’−ヒドロキシアゾベンゼンに対する酵素の結合は、４−スルホンアミド−４’−ヒドロキシアゾベンゼンの９２５ｃｍ−１の線の９２２ｃｍ−１へのシフト；１１２３ｃｍ−１のバンドの出現；およびＩ1413／Ｉ1388およびＩ1134／Ｉ1138の相対強度の増加によって、検出され得る。これらの変化は、結合しているスルホンアミドの構造の変化に起因すると考えられる。あるいは、バイオコンセントレーター４−スルホンアミド−４’−アミノアゾベンゼンに対する酵素の結合は、９２８ｃｍ−１から９２６ｃｍ−１への４−スルホンアミド−４’−アミノアゾベンゼンの線のシフト；１１２５ｃｍ−１のバンドの出現；ならびにＩ1426／Ｉ1395およびＩ1152／Ｉ1145の相対強度の増加によって、検出され得る。両方のスルホンアミド誘導体が、活性基（すなわち、ヒドロキシおよびアミノ）を、酵素結合部位から遠位の末端に有し、これは、インヒビターを固体基材上に共有結合的に固定するために、容易に使用され得る；そして本発明の好ましい形態においては、スルホンアミドバイオコンセントレーターは、共有結合的に固定される。
【０１３５】
同様に、抗ジニトロフェノール抗体（抗Ｄｎｐ）が、バイオコンセントレーターとして発色団ハプテンを使用し、そしてハプテンの共鳴を励起するために４５７．９ｎｍで作動するレーザーを使用して、検出および特異的に同定され得る。（ＳＥＲＳ技術を使用しない限り、検体が蛍光をクエンチする前に、ヨウ化カリウムが、サンプルと混合されなければならない。）さらに、抗Ｄｎｐ抗体は、（１）形成する新たなピークの増加する強度またはシフトするハプテンのピークの減少する強度の、（２）抗体が結合するときに強度が変化しないハプテンのスペクトルの周波数帯の強度に対する比を測定することによって、定量され得る。例えば、２，４−ジニトロアニリンを、バイオコンセントレーターとして使用する場合には、マウス腫瘍抗体ＭＯＰＣ ３１５ ＩｇＡおよびＭＯＰＣ ４６０ ＩｇＡの存在および同一性が、１３３７ｃｍ−１のハプテンの線（これは、ＭＯＰＣ ３１５が結合すると１３３１ｃｍ−１にシフトするか、またはＭＯＰＣ ４６０が結合すると１３２５ｃｍ−１にシフトする）；および１２７９ｃｍ−１でのハプテンの線（これは、ＭＯＰＣ ３１５が結合すると１２６８ｃｍ−１にシフトするか、またはＭＯＰＣ ４６０が結合するとブロードになるかのいずれかである）をモニタリングすることによって、決定され得る。１３９４および１３５５ｃｍ−１のハプテンのＲＲＳ線は、いずれかの抗体が結合する場合に変化せず、従って、内部較正および両方の定量のために、使用され得る。１つのみの抗体検体が存在すると予測される場合には、１３３７および１２７９ｃｍ−１の線の強度の損失が、それぞれの定量のために使用され得る；いずれかまたは両方が存在する場合には、１３３１および１２６８ｃｍ−１の強度の増加を使用して、ＭＯＰＣ ３１５を検出および定量し得、そして１３２５ｃｍ−１の強度の増加を使用して、ＭＯＰＣ ４６０を検出および定量し得る。
【０１３６】
さらに、抗ジニトロフェノール抗体フラグメントが、同一の発色団ハプテンバイオコンセントレーターのＲＲＳ分析を使用して、同様に検出され得る。例えば、ＭＯＰＣ ４６０由来のＦａｂ’フラグメントが、ｐＨ４．５でのＩｇＡモノマーのペプシン消化によって、調製され得る。調製物中の活性フラグメントの量を決定するために、１３３７、１３２７、１２７９、および１２７３ｃｍ−１の周波数帯がモニタリングされる。活性抗体フラグメントは、２，４−ジニトロアニリンバイオコンセントレーターに結合する場合に、１３３７ｃｍ−１の線を１３２７ｃｍ−１にシフトさせ、そして１２７９ｃｍ−１の線を１２７３ｃｍ−１にシフトさせる。
【０１３７】
本発明の好ましい形態において、バイオコンセントレーターが固定され、そしてさらなる分析のために、固定された調製物を２，４−ジニトロフェノールのようなアナログでリンスすることによって、再生され得る。ジニトロフェノールは、抗体の活性部位での結合についてジニトロアニリンと競合し、これによってこの抗体をバイオコンセントレーターから解放し、そして抗体−アナログ複合体がリンス除去されることを可能にする。溶解した複合体のいくらかの少量でさえ、固定したバイオコンセントレーターの近位に吸着する場合には、この複合体のスペクトルは、バイオコンセントレーター−光源複合体の独特のスペクトルから容易に区別され得る。
【０１３８】
「逆の」実施例において、抗体は、ジニトロフェノールの検出のためのバイオコンセントレーターとして働き得る。好ましい形態においては、溶液中のジニトロフェノールの「リアルタイム」のモニタリングに適切であり、バイオコンセントレーターは、アナログのリジン部分に付着した可撓性ポリペプチド結合を介してＤｎｐ−Ｌ−リジンと結合するマウス腫瘍抗体ＭＯＰＣ ３１５ ＩｇＡからなる。前述のように、４５７．９ｎｍで作動するレーザーが、ハプテンの共鳴を励起するために使用され、そして必要であれば、蛍光をクエンチするために、ヨウ化カリウムが添加される。サンプル流がジニトロフェニルを全く含まない場合には、１３８２、１３３８、および１３１５ｃｍ−１のＲＲＳピークを観察することにより決定され得るように、結合したアナログが抗体の結合部位を占める。１つ以上の検体の濃度が上昇するにつれて、アナログが置換され、そしてそのＲＲＳピークが消滅する。Ｄｎｐ−ＮＨ2の存在は、消滅するアナログのＲＲＳスペクトル、ならびに代わりに出現する１３９３、１３５４、１３３１、および１２６８ｃｍ−１のピークによって決定され得る。検体Ｄｎｐ−ＮＨＣＨ3は、１３７１、１３４０、および１３０８ｃｍ−１のピークの出現を引き起こす；一方で、Ｄｎｐ−Ｎ（ＣＨ3）2は、１３６７、１３２３、および１３０６ｃｍ−１のピークの出現を引き起こす。
【０１３９】
初期の例においては、膜に固定されたレセプターが、バイオコンセントレーターとして働いた。あるいは、膜自体が、バイオコンセントレーターであり得る（例えば、異なる型のビリルビンを検出および同定するため）。例えば、リポソーム−ビリルビン複合体が５１４．５ｎｍで照射され、そして得られるＲＲＳスペクトルが８００〜１６００ｃｍ−１のウィンドウで分析される場合に、スフィンゴミエリンリポソームが、バイオコンセントレーターとして使用され得、そしてＲＲＳ技術が、ＩＸａ、ＩＩＩａ、およびＸＩＩＩａのようなビリルビンを検出および同定するために、使用され得る。
【０１４０】
なお別の例において、本発明は、特定の位置が放射性標識または安定な標識で標識された分子の検出および定量において（すなわち、合成プロセスの成功を決定するために）、使用され得る。酵素チミジル酸シンターゼ（ＴＳａｓｅ）は、補因子５，１０−メチレンテトラヒドロフォレート（ＣＨ2−Ｈ4フォレート）をメチル化剤として使用して、２’−デオキシウリジレート（ｄＵＭＰ）のチミジレート（ｄＴＭＰ）への還元的メチル化を触媒する。ヌクレオチドアナログは、ＴＳａｓｅ活性を効果的に阻害することが見出されている；特に、５−フルオロ−２’−デオキシウリジレート（ＦｄＵＭＰ）は、ＴＳａｓｅおよびＣＨ2−Ｈ4フォレートとともに共有結合性三重インヒビター複合体を形成することが示されている。ＲＲＳ技術は、標識されていない補因子の存在下でさえも、同位体標識されたＣＨ2−Ｈ4フォレートのラマンオプトロード検出および定量において、バイオコンセントレーターとしてのＴＳａｓｅおよび３３７ｎｍで作動するレーザーと組み合わせられ得る。例えば、補因子のｐ−アミノベンゾイルグルタメート（ｐａｂａ−ｇｌｕ）部分のｐａｂａ−ベンゾイルの位置の１３Ｃおよびｐａｂａ環上の３，５−位のＤの両方が、酵素と複合体形成した標識されていない補因子のＲＲＳスペクトルに、６００〜１６００ｃｍ−１のウィンドウ内で大きな変化を生じさせる。
【０１４１】
本発明の別の実施例において、マイクロプローブＲＲＳは、バイオコンセントレーターとして使用される合成ポリペプチドを用いて、細菌（例えば、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃａｐｓｕｌａｔａ、Ｒ．ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ、およびＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｔｅｎｕｅ）のラマンオプトロード検出および同定において、使用され得る。この実施例において、ポリリジン臭化水素酸塩が、吸着によってガラス基材に固定される。細菌の水性懸濁液が、バイオコンセントレーターに導入される；そしてＲＲＳスペクトルが、このバイオコンセントレーターによって捕捉された細菌の４８８ｎｍにおける励起により得られる。マイクロプローブラマンシステムは、本発明を使用して、単一の微生物細胞ほどに小さなサンプルからのスペクトルを、生成および処理し得る。Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔａは、９５３、１００２、１０５９、１１５１、１１８９、１４５９、１５１４、１５８６、および１６２８ｃｍ−１におけるバンド形成によって同定され得る。．Ｒ．ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓは、９５６、１００１、１１５３、１１８９、１２５７、１３８９、１４２５、１５１５、および１５８５ｃｍ−１におけるバンド形成によって同定され得る。；そしてＲ．ｔｅｎｕｅは、９５７、１００２、１０４６、１０８７、１１４９、１１８７、１１９９、１２８２、１３５５、１４４０、および１５０９ｃｍ−１におけるバンドにより同定され得る。比較的特異的でないバイオコンセントレーター（例えば、合成ポリペプチド）は、特定の状況下（例えば、サンプルが適度に良好に特徴付けられ、そして存在するかもしれない微生物のほんの少数の異なる種のみが存在する場合；または多くの異なる微生物が存在し得、そしてラマンオプトロード分析がこれらのいずれかまたは全ての検出および同定を意図される場合（すなわち、目的の細菌すべてに対して異なるバイオコンセントレーターを使用することが非実際的である））においてのみ好ましいことに、注意のこと。しかし、大部分の応用について、本発明の好ましい形態は、細菌検体に対するバイオコンセントレーターとして、目的の特定の微生物に対して惹起される抗体を使用することである。
【０１４２】
同様に、ウイルスは、独特のＮＲＳを示し得、そしてタンパク質および／または核酸成分と共鳴する波長で照射される場合に、独特のＲＲＳスペクトルを示し得る。例えば、捕捉されて５１４．５ｎｍで照射される場合に、糸状バクテリオファージｆｄ、Ｉｆｌ、ＩＫｅ、Ｐｆｌ、Ｘｆ、およびＰｆ３は、６００〜９００ｃｍ−１のスペクトル領域の別個のラマンバンド（これらは、タンパク質の芳香族側鎖の分子振動およびカプシド化した一本鎖ＤＮＡゲノムの分子振動に帰属される）から、検出および同定され得る。ウイルス検体は、本ラマンオプトロードの発明に従って、例えば、抗体、レクチン、または病原体接着因子バイオコンセントレーターにより捕捉され得る。広範にわたるヒト、動物、および植物の病原体（リッケチアならびに細菌性およびウイルス性のもの）に対して特異的である、多くの異なる抗体が、Ｌｉｎｓｃｏｔｔ’ｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（「Ｌｉｎｓｃｏｔｔ’ｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ」、４０ Ｇｌｅｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｍｉｌｌ Ｖａｌｌｅｙ、ＣＡ９４９４１）に列挙されるもののような供給源から産生され得る。本発明の好ましい形態においては、抗体が、固体支持表面に固定され、そして検体微生物を含む材料が、この表面と接触される。代替の形態においては、抗体は、液体サンプルに添加されて混合され、ここでこれらの抗体が、任意の標的検体微生物と結合する。次いで、この液体サンプルが、固体支持体表面に固定されたプロテインＡまたはプロテインＧに通される；複合体化した抗体のＦｃ部分が、固定されたプロテインＡまたはプロテインＧに結合し、これによってまた、抗体に対して複合体化された微生物が捕獲される。あるいは、病原体接着因子は、細菌性、ウイルス性、およびリッケチアの疾患の検出および分析において、バイオコンセントレーターとして使用され得る。
【０１４３】
本発明は、ＮＲＳまたはＲＲＳを使用して実施され得るが、表面増強技術が、ＮＲＳと結合してＳＥＲＳを生成しても、またはＲＲＳと結合してＳＥＲＲＳを生成しても、特定の応用に利点を与え得る。代表的に、ＳＥＲＳは、ＮＲＳと同じ情報を提供するが、より良好なレベルの感度で提供する；文献の報告は、ＳＥＲＳが、１０９もの因子でラマンシグナルを増強し得ることを示す。この増強効果は、粗い金属表面に比較的接近するか、または直接接触する分子に関連し、これによって、バルク材料からのシグナルによる干渉を排除する。さらに、ＳＥＲＳは、クエンチしなければ特定の分子または混合物のラマン分析と干渉し得る蛍光をクエンチし、さらなる検体を用いて、またはさらなるレーザー励起波長を用いて、あるいはより広いスペクトルウィンドウにわたって、作動することを可能にする。文献は、一般に、ＳＥＲＳ活性な金属としては、Ａｇ、Ａｕ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ａｌ、Ｉｎ、Ｗ、ＡｇＢｒ、ＡｇＣｌおよびＴｉＯ2（これらに限定されなくてもよい）が挙げられることを報告する；銀は、可視スペクトルの青色／緑色領域にその最適な増強を有し、一方で金および銅は、赤色に最適な増強を有する。理論的な計算は、大きな増強が紫外、可視、および近赤外スペクトル領域にわたって達成可能であることを予測する。１００Å〜数万Åの範囲の表面突出が、ＳＥＲＳ現象を起こす際に有効であり得る；しかし、一般に、５〜５００ｎｍの粗さ突出が、強力に増強されたシグナルを生成するために最良であり得る。これらの表面の全てが、本発明に従って使用され得る。しかし、本発明の好ましい形態においては、銀が使用され、突出の粗さは約２００ｎｍである。粗い表面を調製する好ましい形態は、支持表面（例えば、紙テープまたはＡＴＲ結晶）に堆積されるマイクロスフィアの使用により、次いでスパッタ堆積した薄い金属箔で被覆される。このマイクロスフィアは、例えば、ポリスチレン、ポリビニルトルエン、ポリブタジエン、テフロン（登録商標）、アルミニウム、白金、またはジルコニウムから作製され得る。例えば、銀の最終的な厚みは、最適な結果のためには、約２，０００Åであり得る。しかし、他の程度の粗さおよび／または他の金属（特に、金、銅、タングステン、または白金）が、いくつかの応用において優れた結果を提供し得る；そして粗い金属表面を作製するためのほかの方法、他の種類の支持材料（例えば、プラスチック、金属、またはガラスが挙げられるがこれらに限定されない）、ならびに他の構成（例えば、小ビーズ、光ファイバー、または平行プレートが挙げられるがこれらに限定されない）が、本発明に従って使用され得る。さらに、金属表面は、酸化物層の電気化学的形成を引き起こすよう処理され得、これは、いくつかの状況下においてなおさらにシグナルを増強し得る。ＳＥＲＳおよびＳＥＲＲＳ、ならびにＮＲＳおよびＲＲＳを、本ラマンオプトロードの発明に従って、液体洗浄工程を何も必要とせずに、空気中の物質を直接モニタリング／検出するために、使用し得る。
【０１４４】
本発明の好ましい形態において、バイオコンセントレーターは、ＳＥＲＳ活性表面に、共有結合（好ましくは、チオール−ジスルフィド交換）によって固定されるが、当業者に公知の他の任意の適切な固定化手順が、代わりに使用され得、この手順としては、例えば、他の共有結合、吸着、架橋と組み合わせた吸着、トラップなどが挙げられる。分子またはこの分子内の部分は、ＳＥＲＳ効果を示すために、粗い金属表面と直接的に接触する必要はない。しかし、表面からの距離が増加するにつれて、増強因子は鋭く減少する。すなわち、この表面の約５ｎｍ以内で、増強因子は１桁減少することが公知である。例として、代表的なＩｇＧ抗体は、約６ｎｍ×１０ｎｍである；従って、この抗体が、ＳＥＲＳ活性表面とこの抗体のＦｃ部分との間の共有結合によって固定され、そしてこの抗体が固定後に「立ち上がる（ｓｔａｎｄ ｕｐｒｉｇｈｔ）」場合には、抗体活性部位は、最大のＳＥＲＳ効果の範囲から５ｎｍ外側にある。しかし、十分に間隔を空けて固定される抗体は、「傾く（ｌｅａｎ ｏｖｅｒ）」傾向があり、従って、その活性部位が表面近くに存在する得ことが、公知である；文献は、銀に吸収された免疫グロブリンについて計算された厚みが５０Åであることを報告する。たとえそうでも、いくつかの場合においては、抗体分子全体よりむしろ、抗体フラグメントを付着させることが好ましい。このことは、ＳＥＲＳ効果を最適化するのみでなく、これはまた、バイオコンセントレーター調製物の安定性を改善し得る。Ｆ（ａｂ）2’フラグメントは、ヒンジのすぐ下で抗体を切断するペプシン消化によって調製され得、一方でＦａｂ’フラグメントは、パパイン消化によって調製され得る。
【０１４５】
本ラマンオプトロードの発明のなお別の実施例においては、微生物または生存細胞が、ＳＥＲＳ分析および核酸プローブバイオコンセントレーターの使用によって、検出および同定され得る。粗い銀表面に吸着された一本鎖ポリ（Ａ）は、５１４．５ｎｍで照射されると、ＳＥＲＳスペクトルに７３５および１３３４ｃｍ−１の２つの強いバンドを生じることが、示されている。ポリ（Ｕ）の添加は、二重螺旋の形成を導き、本質的に両方のバンドを排除する；しかし、ポリ（Ｃ）［これは、ポリ（Ａ）と二重螺旋を形成しない］の添加は、一本鎖ポリ（Ａ）のＳＥＲＳスペクトルに最小の効果を有する。従って、一本鎖核酸が核酸プローブと共に二重螺旋を形成する程度は、アデノシン塩基に関連するバンドを分析することによって、決定され得る。一本鎖核酸に熱的に変性したＳｉｇｍａからのウシ胸腺ＤＮＡは、７３４および１１３４ｃｍ−１での強いＳＥＲＳシグナルを生じる；二重螺旋のネイティブＤＮＡは、より強度が低いバンドを生じる。次に、ラマンオプトロードを、微生物または生存細胞の検出および同定のために使用するために、一本鎖核酸プローブバイオコンセントレーターが、当該分野において公知の方法によって、「既知の」微生物または細胞ＤＮＡから調製される；次いでバイオコンセントレーターが、粗い銀表面に共有結合的に固定され、そしてこれらのスペクトルが、ライブラリーに入る。「未知の」サンプル内の微生物または細胞物質を同定するために、このサンプルのアリコートが、任意の細胞内容物を破壊するために適切な様式で処理され（例えば、全ての微生物または細胞を溶解する）、次いで適切な制限エンドヌクレアーゼ酵素を使用して、当業者に公知であるような手順を使用して、任意のサンプル核酸内容物を消化する。消化されたサンプル調製物のアリコートが、粗い銀表面上に固定されたバイオコンセントレーター上に堆積されて、ハイブリダイズを可能にする。これは、目的の微生物、開発されたプローブ、および分析されるべきサンプルの型に依存して、酵素的消化により生成する核酸フラグメントを（例えば、クロマトグラフィー技術またはブロット技術を用いて）分離してまたは分離せずになされ得る。サンプル由来の一本鎖ＤＮＡが固定したバイオコンセントレーターと結合して二重螺旋を形成する程度は、プローブ中のアデノシン塩基からのラマン線の強度の変化を測定することによって、決定され得る。本発明の好ましい形態においては、分析が完了した後に、微生物由来の一本鎖核酸が、固定された核酸プローブバイオコンセントレーターから除去され、そして「再生された（ｒｅｎｅｗｅｄ）」プローブが再度使用される。
【０１４６】
初期には、核酸バイオコンセントレーターのＮＲＳ分析は、化学戦薬剤マスタードの検出のためのラマンオプトロードアプローチの一例として、引用された。ＮＲＳが使用される場合に、バイオコンセントレーターベースラインスペクトルのうちの２つのバンドのみが影響を受け、そして例えば、メチル窒素マスタードの存在を検出するためにモニタリングされ得る。荷電した銀電極を使用して固定ＤＮＡを配向するＳＥＲＳ技術は、さらなる特異性ならびにさらなる感度を増加させる手段として、好ましいアプローチであり得る。例えば、Ａｇ／ＡｇＣＩに対する−０．２Ｖの吸収ポテンシャル（これは、高度に正に荷電した表面に対応する）において、吸着されたＤＮＡのＳＥＲＳスペクトルは、負に荷電したリン酸基の、正に荷電した銀表面との静電的相互作用に起因し得る、２３６ｃｍ−１の強いバンドにより特徴付けられる。固定されたバイオコンセントレーターが中性の銀表面上でモニタリングされる場合には見られない、このバンドは、ＤＮＡがアルキル化剤と反応した後には、リン酸基と銀表面との相互作用の減少に起因して、強度が減少する。メチル化ＤＮＡはまた、新たなＳＥＲＳハンドを、６５６、７００および１３６０ｃｍ−１に示し（これらは、メチル化グアニン残基の特徴的な振動に対応する）；そして１２００ｃｍ−１および１３００ｃｍ−１のバンドの減少した強度（これは、改変されたグアニン−シトシン核酸塩基対の位置でのＤＮＡのコンホメーション変化に関連する）を示す。従って、正に荷電した粗い銀表面を使用することによって、糜爛剤を検出するために、影響を受け、従ってＮＲＳ技術を使用してモニタリングされ得る２つのバンドの代わりに、本発明に従って、６つのバンドがモニタリングされ得る。
【０１４７】
（既に考察された）表面増強が、ＲＲＳと組み合わされてＳＥＲＲＳを生じる場合、ＲＲＳまたはＳＥＲＳ単独により達成される増強に加えて増強要因を生じる。ＳＥＲＲＳにより達成され得る異常な感度および特異性は、本発明のラマンオプトロードのいくつかの適用に有意な利点を有し得る。
【０１４８】
例えば、上記で考察したように、アルゴンイオンレーザーの５１４．５ｎｍ線が、ＤＮＡを照射するために使用される場合、ＮＲＳ散乱のみが生じる。従って、ＳＥＲＳ技術が利用される場合でも、この波長が励起のために使用される場合の分析のために十分強いシグナルを生じるために、比較的大量の核酸が、使用されなければならない。しかし、ＤＮＡバイオコンセントレーターに結合した被検体において共鳴を誘導することにより、そして変換器としてラマン顕微鏡を使用することにより、非常に少量のＤＮＡが、バイオコンセントレーターとして使用され得、そして例外的に低濃度の種々の抗腫瘍薬物が検出され得る。本発明のこの特定の実施例において、仔ウシ胸腺ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｉ型）のストック溶液を、リン酸緩衝化生理食塩水で調製する。仔ウシ胸腺ＤＮＡ懸濁液を、分析されるべきサンプルと混合し、次いで、新鮮な銀ヒドロゾル凝集体懸濁液と混合する。１マイクロリットルの生じた吸着ＤＮＡ／ＤＮＡ−被検体複合体懸濁液を、マイクロプローブ中のキャピラリー管に入れ；そしてＳＥＲＲＳスペクトルが、３５０〜２０００ｃｍ−１の範囲で得られた。ＤＮＡ自身は、これらの条件下で感知可能なスペクトルを与えない。しかし、抗腫瘍薬物アドリアマイシンが、１０００塩基対当たり１分子未満の濃度でも、「未知」サンプル中に存在する場合、アドリアマイシンの存在および正体は、３５３、４４８、１２２６、１２５５、１３１８、１４６４、および１６４２ｃｍ−１の波長の強度における強い増加により決定される。「未知」が、ベレニル（ｂｅｒｅｎｉｌ）（抗トリパノソーマ剤）を含む場合、この薬剤の存在および正体は、１５９８、１４７３、１４３１、１３９８、１３４９、１３０９、１１８８、１１６４、および７７０ｃｍ−１の強いピークの形成を検出することから決定され得；一方、ＤＮＡに結合した抗腫瘍性エリプチシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）は、１６１７、１４０６、１２７３、１０２７、８７８、５８７、４８１、および３８０ｃｍ−１に強いピークを与える。抗腫瘍剤メタ−アムサクリン、ならびに薬物ジスタマイシン（ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ）およびミトキサントロンは、同様に検出および同定され得る。
【０１４９】
本発明においてＳＥＲＲＳを使用する別の実施例では、タンパク質シトクロムＰ−４５０は、その基質の１つである薬物ベンゾフェタミンの検出および同定の際にバイオコンセントレーターとして使用される。ウサギ肝臓ミクロソームから単離され、そして再構築され、そして粗い銀表面上のリン脂質膜において固定されたタンパク質は、４０６ｎｍで作動するレーザーを用いて照射される。「未知」サンプルが、固定化タンパク質調製物に導入される場合、規制物質が、以下を観察することにより検出され得る：２５４ｃｍ−１バンドの強度の増加；３４９および３８４ｃｍ−１の２重線と比較して６７６ｃｍ−１のバンドの強度のわずかな減少；７２０ｃｍ−１バンドの周波数における７２４ｃｍ−１へのシフト；１４９１ｃｍ−１線に対する１５００ｃｍ−１線の強度の相対的な減少；ならびに１５７８ｃｍ−１のピークの１５７５ｃｍ−１への３ｃｍ−１の低周波数シフト。さらに、酵素バイオコンセントレーターの酸化状態の変化もまた検出され得る。４０６ｎｍで照射される場合、酸化型Ｐ−４５０（Ｆｅ３＋）は、１４９１および１３７０ｃｍ−１の強いバンドにより同定され得るが、還元型Ｐ−４５０（Ｆｅ２＋）は、１３４３ｃｍ−１および１３５９ｃｍ−１のバンドにより同定され得る。
【０１５０】
強い塩基性の環境において、シトクロムＰ−４５０は、生物学的に不活性な形態Ｐ−４２０に変換され、これは、酵素の任意の変性における第１段階と考えられる。５１４．５ｎｍで照射される場合、粗い銀表面上に固定された活性形態および不活性形態は、シトクロムＰ−４２０のスペクトルが１６２７ｃｍ−１の新しいバンドを生じ、そしてシトクロムＰ−４５０の系特性である１４００ｃｍ−１のバンドの強度が大きく相対的に減少することで、明確に区別され得る。それ故、シトクロムＰ−４５０バイオコンセントレーターの状態は、ＳＥＲＲＳを基本とするラマンオプトロードのベンズフェタミン検出の間、第２の波長（すなわち、５１４．５ｎｍ）でバイオコンセントレーターを定期的に照射することによりモニターされ得る。
【０１５１】
ラマンオプトロードプロセスのこれまでの実施例は、単一のレーザー波長を使用してラマン散乱を励起するアプローチを記載する。しかし、いくつかの適用には、本発明の好ましい形態は、２つ以上のレーザー波長による照射により生成される２つ以上のスペクトルを収集して分析し、すなわち「３次元（３−Ｄ）スペクトル」を生成する。２つ以上のレーザーが使用され得；あるいは、単一レーザーが使用され得、そしてスペクトル分析の間、２つ以上の異なる線に交互に調整される。３−Ｄ分析は、特定の適用（例えば、例外的な特異性が所望される場合、またはラマンオプトロードが、共通する多くの発色団を有していない低濃度の複数の被検体を検出するように意図される場合）に多数の利点を提供する。
【０１５２】
例えば、酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼは、メトトレキサート（小児期白血病の処置に使用される薬物）の３−Ｄ ＲＲＳ分析および検出のためのバイオコンセントレーターとして使用され得る。ジヒドロ葉酸レダクターゼは、テトラヒドロ葉酸へのジヒドロ葉酸のＮＡＤＰＨ関連還元を触媒する。メトトレキサート（構造的に葉酸に類似し、そしてｐ−アミノベンゾイル基およびプテリジン基を有し、これらの両方が、共鳴活性発色団である）は、この酵素を阻害する。共鳴は、ｐ−アミノベンゾイル基およびプテリジン基において３２４および３５０ｎｍでそれぞれ照射することにより励起され得る。このバイオコンセントレーターが、３２４ｎｍで照射される場合、メトトレキサートの存在は、１６８５ｃｍ−１のラマンバンド損失により決定され得、このバンドは、ＮＡＤＰＨ−酵素二成分複合体では観察され得るが、ＮＡＤＰＨ−メトトレキサート−酵素三成分複合体には無い。照射光が３５０ｎｍに変更される場合、この薬物の存在は、６５９ｃｍ−１の強いバンドの存在により確認され得、このバンドは、薬物−酵素複合体にのみ存在する。
【０１５３】
別の実施例では、３−Ｄ ＲＲＳは、薬物アクチノマイシンＤ（多くのグラム陽性生物およびグラム陰性生物に対して有効な抗生物質）の高度に特異的な検出のために核酸バイオコンセントレーターと組み合わされ得る。この薬物は、ヒトに対して高度に毒性であり、そして転写プロセスを阻害することが公知である。本発明のこの実施例では、薬物およびバイオコンセントレーターの両方のＲＲＳスペクトルにおける特定の変化がモニターされ、それにより捕捉された被検体の正体における例外的な確信を提供する。第１に、３００ｎｍおよび２８０ｎｍの波長でのＵＶ励起により、ＤＮＡバイオコンセントレーター中のアデニンの１５８２ｃｍ−１線およびグアニンの１４９２ｃｍ−１線が、示され得る。アクチノマイシン−ＤＮＡ相互作用が起こる場合、１４９２ｃｍ−１線の強度は、有意に減少し、グアニン塩基がアクチノマイシンにより妨害されることを示し、一方１５８２ｃｍ−１線は変化しないままである（従って、定量分析に使用され得る）。次に、４５８ｎｍでのレーザー励起が使用され、アクチノマイシン発色団における共鳴を励起する。この後者の波長において、非結合抗生物質は、共鳴−増強ラマンバンドを、１５０５、１４８９、１４０５、１３８５、および１２６５ｃｍ−１に与える。これらのうち１３８５、１４８９、および１５０５ｃｍ−１のバンドは、ＤＮＡとの相互作用に敏感である。特に、アクチノマイシンＤが、バイオコンセントレーターに結合する場合、大きな強度変化が、１４８９および１５０５ｃｍ−１線に観測される。
【０１５４】
本発明のさらに別の実施例では、３−Ｄ ＲＲＳは、細菌の高度に特異的な検出および同定のために抗体コンセントレーターと組み合わされ得る。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）に対して惹起されたモノクローナルＩｇＧ抗体は、バイオコンセントレーターとして使用され得、ガラススライド上に固定化され、そして２、３滴の分析されるべき液体サンプルが、この表面に適用され、インキュベートされ、そしてラマン分析の前にリンスされる。２５１ｎｍおよび２４２ｎｍでの照射が使用されて芳香族アミノ酸からの寄与により主として細菌ＤＮＡにおいて共鳴を励起し得；２３１ｎｍでの照射は、主として細菌タンパク質のトリプトファンおよびチロシンのピークにおいて共鳴を励起し得；そして２２３ｎｍでの照射は、主として細菌タンパク質のアミノ酸ピークにおいて共鳴を励起し得る。３つのＲＲＳスペクトルが集められ得、そして捕捉された細菌の例外的に特異的な同定のための、モデル参照スペクトルのライブラリーに対する比較により、９００〜１８００ｃｍ−１の範囲より分析され得る。好ましい実施形態において、抗体は、光学導波管上の粗い金属表面上に固定され；そして励起光が導入され、そして生じたスペクトルは、光学導波管を通って集められる。すなわち、ＳＥＲＲＳは、標的微生物の３−Ｄ分析におけるより高い特異性および感受性のために使用される。それにより生物の分析は、単純化され得、そしてその信頼性は、ＳＥＲＳの使用により改善され、表面分類マーカーの選択的な問合せを可能にし、一方でまた広範囲のレーザー波長の使用を可能にし、蛍光に妨げられることなしに広範囲の分類マーカーのシグナルを選択的に増強する。さらに、所望される場合、熱死滅（ｈｅａｔ−ｋｉｌｌｅｄ）Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、生存細菌と同様に検出されそして同定され得、そして例えば、複合細胞の測定されたＲＲＳスペクトルを、２３１ｎｍの励起で得られたモデル参照スペクトルと比較することにより、生存微生物と区別され得る。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ細菌由来の細胞フラグメントは、２３１ｎｍおよび２２３ｎｍで取られたスペクトルにおいて適切なアミノ酸の線が全く存在しないこと、ならびに２５１ｎｍおよび２４２ｎｍで取られたスペクトルにおいて細菌ＤＮＡに伴う線の不在により検出され得る。
【０１５５】
本発明のさらに別の実施例では、種々の化学戦用薬剤および生物戦用薬剤に特異的な一連の異なる種類のバイオコンセントレーターは、計量棒の表面上に固定され得る。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ（ＵＳＡＭＲＩＩＤ）由来の胞子に対するモノクローナル抗体は、この計量棒の粗い金属表面上の１つの位置に固定され得、Ｅ．ｅｌｅｃｔｒｉｃｕｓ（Ｓｉｇｍａ）由来の酵素アセチルコリンエステラーゼは、第２の位置に、Ｔｏｒｐｅｄｏ ｍａｒｍｏｒａｔａの電気器官由来の膜フラグメント中のアセチルコリンレセプターの富化調製物は、第３の位置に、そしてガングリオシドＧＴ１ｂ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）は、第４の位置に、固定され得る。次いで、この計量棒は、バイオエーロゾル（ｂｉｏａｅｒｏｓｏｌ）液体インパクターにより収集されたサンプル中に挿入され、リンスされ、そして画像化ラマンマイクロプローブ中に挿入され得る。抗体に捕捉される炭疽菌胞子、アセチルコリンエステラーゼを阻害することにより捕捉される化学戦用神経薬；アセチルコリンレセプターに結合した（＋）−ツボクラリン（クラーレ中の活性成分）、および固定されたガングリオシドに結合したボツリヌス毒素は、画像化ラマンシステムにより検出され得、そして同時に同定され得る。
【０１５６】
本発明の好ましい形態では、スペクトルライブラリーは、十分に反応性のバイオコンセントレーター、および部分的に変性されるか、または不活性化されるか、または毒性化されるか、または廃活性のバイオコンセントレーターのスペクトルを含み；そして測定されたスペクトルは、反応性および部分的に変性されるか、または不活性化されるか、または毒性化されるか、または廃活性のバイオコンセントレーターのモデルスペクトルと比較され、十分に大きなパーセンテージのバイオコンセントレーターが、反応性でそしてその被検体に結合し得るか否かを決定する。バイオコンセントレーターの変性または不活性化は、温度変動、ｐＨにおける変化、または液体サンプル中の溶媒または界面活性剤の存在により起こり得、そして上記のように本発明に従うラマンスペクトル分析により決定され得る。例えば、化学的に変性された（例えば、アルカリ溶液に曝された）ＩｇＧ抗体は、強度の減少を伴う、アミドＩＩＩ線およびアミドＩ’線における、それぞれ１２４０ｃｍ−１から１２４８ｃｍ−１へのシフトおよび１６６７ｃｍ−１から１６５６ｃｍ−１へのシフト；１５７３ｃｍ−１トリプトファンのバンドの強度の増加、および１３５９ｃｍ−１および８７９ｃｍ−１のバンドでの強度における減少；チロシンのバンドの強度比（Ｉ856／Ｉ830）の１０：７から９：１０への減少；ならびに９３９ｃｍ−１の強いピークの出現により検出され得る。
【０１５７】
多様なラマンオプトロード反応性容量分析は、本発明にしたがって、多様なラマン分光法技術を使用して、多様な生物学的成分およびバイオテクノロジー産物にも実施され得る。
【０１５８】
例えば、固相ペプチド合成において、ポリマー担持樹脂は、明確な鎖の長さおよび２次構造を有するポリぺプチドの合成において使用される。しかし、問題に対面し得る；寄与している要因は、樹脂に連結された伸長するペプチド鎖（例えば、βシート形成）、および／または保護基の不完全な除去の間の相互作用であると考えられる。固定された形態の合成生物製剤に起因して、従来のアプローチを使用して合成する間は、この鎖を分析することは不可能である。しかしラマンオプトロード反応性容量分析は、本発明にしたがって使用され、合成反応の進行と同時に２次構造および保護基の存在または非存在を追跡し、そしてそれにより正しい手順が処理の間に実行されることを可能にし、インサイチュで合成プロセスをモニターし得る。例えば、伸長するポリリシン鎖のコンホメーションは、媒質全体のｐＨ、イオン濃度、および温度を測定することにより検出可能でないかもしれない、ｐＨ、イオン濃度、および温度における局所的な微環境の変化により影響を受ける。しかし、本発明にしたがって、ＲＲＳ技術が使用され、ポリぺプチドを２１８ｎｍで照射することにより、インサイチュで伸長するポリぺプチドをモニターし得、そして制御し得る。ランダムコイル形態のポリリシンは、１２５８、１３８６、１５５９、および１６５５ｃｍ−１の強いピークの観測により検出され得、ａ−へリックス形態は、１５４８および１６４４ｃｍ−１の強いピーク、ならびに１２７５および１３４８ｃｍ−１の幅広で弱いピークにより検出され得；そしてｂ−シート形成は、１２４４、１５５９、および１６６１ｃｍ−１の強いピーク、ならびに１３５９および１４００ｃｍ−１の中くらいの強さの二重線で検出され得る。定量分析は、内部標準としてＮａＣｌＯ4を使用し、そしてポリリシンのスペクトル由来の基本となるバンドを、ＣｌＯ4−由来の９３２ｃｍ−１のバンドと比較することにより達成され得る。合成プロセスにおける代替の工程では、１０６４ｎｍで作動するレーザーが、保護基の不完全な除去のＮＲＳ検出のために、１０２５ｃｍ−１のバンドをモニターすることにより使用され得る。
【０１５９】
別の実施例において、ラマンオプトロード反応性容量分析は、熱的または化学的変性（例えば、リゾチームのような酵素）の非破壊検出に用いられ得る。ＮＲＳおよび／またはＲＲＳ技術はこの酵素の反応容量をモニターするために用いられ得る。リゾチームの熱変性は、ＮＲＳスペクトルのアミドＩバンド（加熱によりより高い周波数にシフトし、そして強度が非常に減少する）およびアミドＩＩＩバンド（より低い周波数にシフトし、そして強度が非常に減少する）をモニターすることにより測定され得る。側鎖の熱変性の影響は、水素結合ならびに親水性および疎水性相互作用に関与する側鎖を主に崩壊させる。共有結合した側鎖ジスルフィド架橋は、熱処理により破壊されない；７６℃に加熱した場合でさえ、５０９ｃｍ−１におけるリゾチームＳ−Ｓ伸縮振動バンドは変化しない。したがって、本発明に従って、この特定のバンドは、酵素の反応性容量の定量的アセスメントにおいて用いられ得る。
【０１６０】
より高い感度が所望される場合、紫外線共鳴ラマン散乱（ＵＶ−ＲＲＳ）技術が用いられ得る。リゾチームが２３１．５ｎｍで照射された場合、熱変性による減少した反応容量は、強度がわずかに減少し、１１７６ｃｍ−１へシフトした１１７８ｃｍ−１ピーク；１２４８ｃｍ−１へシフトした１２４０ｃｍ−１ピーク；１３４０ｃｍ−１のショルダーの消失；１４６１ｃｍ−１へシフトした１４５６ｃｍ−１ピーク；および１６８１ｃｍ−１の小さなピークの消失、によって検出され得る。
【０１６１】
酵素は、異なる変性形態を示し、その形態は、変性を引き起こすプロセスに依存して生じる。したがって、本発明に従って、リゾチーム変性の原因となる因子は、生じたラマンスペクトルの適切な分析により決定され得る。例えば、リゾチームの化学変性（例えば、ジメチルスルホキシド、グアニジン塩酸塩、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム、およびＬｉＢｒのような試薬に曝露して引き起こされるような）は、酵素のＮＲＳスペクトル中の１２４０ｃｍ−１付近のアミドＩＩＩバンドの強度に対する１２６０ｃｍ−１でのアミドＩＩＩラマンバンドの強度（すなわち、比率Ｉ1260／Ｉ1240）を測定することにより検出され得る。他の試薬への曝露は、コンフォーメーションにおける単純な変更よりもむしろ実際の化学修飾（例えば、ジスルフィド結合切断、これは５０７ｃｍ−１Ｓ−Ｓ伸縮振動バンドの消失、ならびに１６７２ｃｍ−１から１６６０ｃｍ−１へのアミドＩバンドにおける大きなシフト、および１２５４ｃｍ−１から１２４３ｃｍ−１へおよび１２７１ｃｍ−１から１２６３ｃｍ−１へのアミドＩＩＩバンドにおける大きなシフトにより決定され得る）を生じ得る。
【０１６２】
ラマンオプトロード反応性容量分析の別の実施例において、結晶性粉体形態で貯蔵されたインスリンの熱変性はＮＲＳ技術によってモニターされ得る。本来のインスリンは、１６８０ｃｍ−１にショルダーを伴った、１６６２ｃｍ−１の主要なバンド；１２７０ｃｍ−１の主要なバンドならびに１２８８ｃｍ−１および１２３９ｃｍ−１の幾分弱いショルダー；ならびに１３０３ｃｍ−１、１２６９ｃｍ−１および１２８４ｃｍ−１のバンドを有する。変性インスリンは、１６７２ｃｍ−１へシフトした本来の１６６２ｃｍ−１バンド；１２３０ｃｍ−１に出現した新しいバンド；９４６ｃｍ−１および９３４ｃｍ−１の領域に出現した強いバンド；５１５ｃｍ−１での本来のＳ−Ｓ伸縮振動の強度の増加；６６８ｃｍ−１および６８０ｃｍ−１へ変化した６７０ｃｍ−１のＣ−Ｓ伸縮振動；および、強度減少を伴う６５７ｃｍ−１へシフトした６６８ｃｍ−１での本来Ｃ−Ｓ伸縮振動により検出され得る。５１６ｃｍ−１でのＳ−Ｓ伸縮振動は変化せず、そして、本発明に従って、定量分析に用いられ得る。従って、生じた貯蔵劣化の程度は本発明に従って非破壊的に決定され得る。
【０１６３】
インスリンは２つの鎖（２つのジスルフィド架橋により連結している、ＡおよびＢ）を有する小さな（５．７キロダルトン）タンパク質である。より低濃度でインスリンは、その濃度、ｐＨ、結合するＺｎ2+およびイオン強度に依存して、異なった集合状態、単量体、２量体、４量体および６量体、で存在することが知られている。集合状態は、本発明に従って、ＲＲＳ技術により、容易に決定され得る。例えば、溶液が２１８ｎｍでの照射下でモニターされる場合、単量体が２量体へシフトするにつれて、１６０５ｃｍ−１バンドと比較した場合、１６１７ｃｍ−１バンドは強度が増加する。
【０１６４】
リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の熱変性は２つの状態の間の遷移よりもむしろ段階的アンフォールディングを介して進行することが知られている。熱変性は、酵素のＮＲＳスペクトルの比率Ｉ832／Ｉ852およびＩ1000／Ｉ972ならびに５１０ｃｍ−１付近のバンドをモニターすることより検出され得る。本来の、完全反応性ＲＮａｓｅのＮＲＳスペクトルは、１．０／０．８の比率Ｉ832／Ｉ852を示すが、酵素が完全に変性されるまでは、比率は逆転する（すなわちＩ852／Ｉ832が１．０／０．８）。同様に、１０００ｃｍ−１付近の２つの強いバンドの相対的強度は、酵素の熱変性が完全になるまで、逆転する。５１０ｃｍ−１付近のバンドの周波数および半値幅の変化（バンドが変性の際に周波数においてシフトダウンしそしてより広くなる）はまた、酵素反応性容量を決定するのに用いられ得る。
【０１６５】
以前に論じられるように、ラマンスペクトル分析は、多くの異なった物理的状態の検体およびサンプルマトリックスの型と適合性がある。従って、本発明に従ったプロセスまたはデバイスは多くの異なった形態および構成をとり得る。本発明を実施するのに用いられ得るプロセスまたはデバイスのいくつかの実施例は以下に与えられる。これらの特定の実施例は、本願に記載される本発明の範囲を限定することを意図されない。
【０１６６】
１つの実施例として、粗い金属の薄フィルムはバッジ上にコートされ得、そして有毒殺虫剤のような危険物質に対して特異的な抗体は、金属フィルムに固定され得る。バッジは工場労働者により受動線量計として着用されるように設計され得る。バッジの一部は光学的に透明な、不浸透性のフィルムで覆われ得る。さらに、各バッジは、バッジに対しておよび彼らに対してバッジが割り当てられた労働者に対して独特である、特定の識別子でコードされ得る。労働シフトの始めと終わりにおいて、そのバッジはラマン分光計読み出しシステム（光源、分光計ならびに分析ハードウェアおよびソフトウェアを含む）の中へ挿入され得、そこで定量的操作の間、曝露された抗体およびシールドされた抗体のスペクトルを比較し得る。読み出しシステムは、また内部較正、バッジ識別コード読み取り手段、特別メモリーおよび内部時計を有し得る。その日の始めに、ラマン読み出しシステムは、バッジのシールドしていないセクションの完全に反応性の抗体の量を測定し、そして、フルシフトで着用されるバッジに対して不十分な活性である場合、警告を与える。それは、識別コードに相関させて、そのバッジのスペクトルをメモリーに保存する。その日の終わりに、ラマン読み出しシステムは新しいスペクトルを生成し、そしてメモリーにおけるスペクトルに対して比較する。モデル参照スペクトルに対するスペクトルの差異を比較することによって、１日の間に抗体に結合された殺虫剤の量が決定され得る。さらに、読み出しシステムは、曝露が起こった時間の間隔を測定し得、そしてその日の殺虫剤への労働者の時間平均曝露を計算し得る。さらに、その日のスペクトルは、また以前の日に得られたスペクトルに対して（または同じ労働者により着用された他のバッジで生じたデータに対して）比較され得、そしてそれによって個人の累積曝露ならびにその人の時間平均の毎日の用量が計算され得る。
【０１６７】
別の形態において、コリンエステラーゼのような、化学戦薬剤によって阻害される酵素が、光ファイバーの先端の粗い金属表面に固定され得る。操作の間、光ファイバーのコートされた先端は、チャコールフィルター床に挿入され得る。励起光はファイバーを通ってコートされた先端へ移動し得、そして散乱光はファイバーを通ってラマン分光計へ戻ってくる。従って、このデバイスは、チャコールフィルター床における潜在的破過点を検出するのに用いられ得る。いくつかの異なる神経薬剤がコリンエステラーゼと結合するが、結合する場合、各自は異なるスペクトルを生じるので、デバイスは通過する薬剤を検出するのみならず、存在する各々の神経薬剤の正体の情報をまた提供する。
【０１６８】
別の形態において、水分析器が提供され得、ここで貫流セルが光学的透明セル中に固定されたレセプターを有する。水中の毒素（トキシン）の濃度が上昇する場合、水がセルを通って流れるにつれて、毒素分子はレセプターに結合する。水中の毒素の濃度が非常に減少する場合、レセプターは毒素分子を放出する。各毒素の存在および正体および量が、デバイスに導入されたラマン分光計により決定され得る；システムのソフトウェアは、各毒素の情報がＬＣＤディスプレー上に示されるために、すべての計算ならびにデータ判読および操作をし得る。デバイスは、例えば工業的プロセスプラントからの毒素流出液を測定するため、または公共上水道の純度を測定するために用いられ得る。
【０１６９】
さらに別の形態において、レクチンが使い捨てディップスティック上に固定化され得る。ディップスティックは、血液または尿サンプルを含むバイアルの中へ挿入され得、そして次いでラマン分光計デバイスの中へ挿入され得る。レクチン−リガンド複合体のスペクトルが、次いで、サンプル中に存在する、グルコースを含む種々の糖の量を検出するために得られ得る。
【０１７０】
不揮発性薬物のためのエアーモニターは蒸気およびエアロゾル微粒子を収集／濃縮する液体スクラバーを有し得、微粒子に吸着されるかまたは微粒子を形成する任意の薬物を溶解する液体が、このスクラバーにより捕捉される。この液体は周期的に徐々に排出され得、いくつかの異なるレセプター（異なるカテゴリーまたは分類の薬物に対してそれぞれ特異的である）を含むゾル−ゲル溶液と混合され得る。混合された溶液は、次いでラマン分光計の貫流セルを通して循環され得る。それは、すべてのレセプターのＳＥＲＳスペクトルまたはＳＥＲＲＳスペクトルにおける変化を測定し、それによって存在するすべての異なる薬物を同定するために必要であるオプティックスおよびソフトウェアを有する。
【０１７１】
核酸プローブの使用により、微生物または細胞を検出および同定するためのラマンオプトロード技術を用いる実施例として、適切なプローブは、束になった光ファイバーの先端に固定化され得る。ラマンオプトロードの使用のために、サンプルは任意の細胞物質を溶解するために、およびＤＮＡおよび／またはＲＮＡ含有物を核酸フラグメントに酵素的に消化するために、処理され得る。ラマンオプトロードバイオコンセントレーター光ファイバー先端は、次いで予備処理されたサンプルの中に浸漬され得、そしてハイブリダイゼーションを起こさせ得る。光ファイバーは光源および分光計に連結されている；励起波長は光ファイバーを通ってその先端でプローブへ移動し、そして得られたスペクトルは光ファイバーを通って分光計へ移動し、それは各ファイバーの末端でサンプルと各異なるプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出するためにスペクトルを収集し、処理しそして分析する。一旦、分析が完了すると、光ファイバー先端は、一本鎖核酸プローブを再生するために、リンスしながら加熱され得る。スペクトルは、プローブが完全に再生されそしてすべてのサンプル鎖が取り除かれることを確かにするために用いられ得るから、光ファイバープローブが安全に無期限に再使用され得る。
【０１７２】
あるいは、病原体吸着因子が粗い金属フィルムでコートされた減衰全反射（ＡＴＲ）結晶表面上に固定化され得、そして血液サンプルがその表面に適用される。血液サンプル中のウィルスは病原体吸着因子と結合する。２つ以上の励起光波長は次いで連続して一列のＡＴＲ結晶に送り出され得、そして得られた３−Ｄ ＳＥＲＲＳスペクトル情報が、エバネセント（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ）波現象を通して取り込まれ得る。ウィルスコーティングおよび各属の核酸が、区別された独特のスペクトルを生成するので、３−Ｄ ＳＥＲＲＳスペクトルは次いで、ウィルスの存在を検出するために、および各型を同定するために用いられ得る。
【０１７３】
さらに別の構成において、サンプリングデバイスは、池または小川の種々の水の集合または種々の位置からサンプルを収集するために用いられ得る。サンプリングデバイスはスプール装着テープカセット、液体ポンプ、サンプリングプローブ、電池およびサーミスタ、ならびにサンプル識別情報の入力および記録するためのハードウェアおよびソフトウェアを含み；そしてテープは、各々小片が異なる金属フィルムならびに抗体フラグメント、酵素およびレセプターサブユニットの異なる混合物でコートされている多くの異なる小片を保有し得る。オペレーターはサンプルに関する情報を入力し、そして次いで分析されるべき水の中にサンプリングプローブを浸漬し、そしてボタンを押し得る。ボタンを押すことにより、サンプリングデバイスは、カセット窓中のテープのセクションを通して、所定量の水をポンプでくみ上げ、そのときにサンプリング窓の中でバイオコンセントレーターの小片の隣にあるテープのサンプル同定化情報を記録し、そして次いで種々の小片を示す新しいセクションがカセットのサンプリング窓の中にあるためにテープを前進させる。すべてのサンプルが収集された後で、オペレーターは研究所に戻り得、そして多重チャンネル走査ラマン分光計の中にサンプリングアクセサリーを配置し得る。テープカセット分析アクセサリーは、テープカセットに適応するように設計される。次いでオペレーターはサンプリングデバイスからカセットを取り出し、そしてラマン分光計の中のアクセサリーの中へそれを挿入し得る。多重チャンネル走査分光計は、１つ以上の連続したスペクトルバンドで小片を走査するために；そして、強いシグナルが所定の小片上の特定の位置において見られる場合、その位置に焦点を当て１つ以上の全ＳＥＲＳスペクトルを生成し分析するために、プログラムされ得る。全ＳＥＲＳスペクトルがスペクトル参照ライブラリー内の優先汚染物質（化学的または微生物的）のスペクトルに対応する場合、ラマン分光計はサンプル同定化コード（実地でオペレーターにより入力されるような）の次に、汚染物質の正体および量をプリントアウトするために設計され得る。一旦、テープの与えられたセクションの分析が完了すると、ラマン分光計テープカセット分析アクセサリーは、自動的にテープを次のセクションに進めるように、および分析サイクルを再び経るように設計され得、テープのすべてのセクションが分析されるか、または同定化を記録されたすべてのサンプルが処理されるまで続く。
【０１７４】
さらに別の構成において、抗体バイオコンセントレーターは、長く、被覆された光ファイバーケーブルに結合した、薄く、可撓性のあるコイルまたは束状の光ファイバーの被覆されていない表面上に固定化され得る。ケーブルに沿って移動する励起光は、多重内部反射のエバネセント波によりコイルを通って移動するために、ある角度においてコイルの中に送り出され、それによりその光をコイルの表面のバイオコンセントレーターと繰り返し相互作用させる。エバネセント波がコイルの末端に到着する場合、それはラマン分光計への移動のためにケーブルの中へ戻される。エバネセント波を用いることによって、例外的な感度が達成され得る。このような構成は極端に希薄な検体濃度の遠隔サンプリング（例えば、地下水モニタリング）に用いられ得る。本発明の好ましい形態において、抗体バイオコンセントレーターは「可逆競争認識ユニット（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｕｎｉｔｓ）」（米国特許第５，１５６，９７２号、１９９２年１０月２０日、「Ａｎａｌｙｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｅｎｓｏｒ ｗｉｔｈ ａ Ｌｉｇａｎｄ ａｎｄ ａｎ Ａｎａｌｏｇｕｅ Ｂｏｕｎｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｅｎｓｉｎｇ Ｓｕｒｆａｃｅ」、Ｄ．Ｉｓｓａｃｈａｒ）であるように改変され、それにより、地下水ボアホールにおいての連続「リアルタイム」のモニタリングを可能にする。あるいは、温度摂動、カオトロピック剤または溶媒極性調整のような、より慣習的な抗体再生プロセスは、適切な遠隔モニタリング適用に使用されると考えられ得る。
【０１７５】
所望される場合、先に記載された旅客スクリーニングポータルに対するいくつかの局面と同様に、地下水モニタリングシステムは光ファイバーアレイを有して設計され得る。サンプリングデバイス（この場合、光ファイバーコイル）は種々の地下水モニタリングボアホールに位置し、そして各ボアホール内で種々の深さに、また位置し得る。光ファイバーケーブルは励起光を各タンパク質で被覆されたコイルへ移送するために、および得られたラマンスペクトルを各タンパク質で被覆されたコイルから単一の集中化したラマン分光計へ移送するために用いられ得る。この実施例において、処理および分析のためのスペクトルシグナルを組み合わせる代わりに各コイルからのスペクトルシグナルは、連続的または同時的のいずれかで、例えば、検出器アレイを備えた多重チャンネル分光計の使用によって、収集され、分散されそして検出器アレイ中の検出器の行に集光された所定の光ファイバーからのスペクトルシグナルを用いて、別々に分析される。バイオコンセントレーター−リガンド複合体のスペクトルがバイオコンセントレーター−汚染物質複合体のスペクトルに合致する場合には、集中化したラマン分光計はボアホールの位置および汚染物質が検出された深さを指摘する、警告シグナルを遠隔オペレーターステーションへ伝達し得る。
【０１７６】
さらに別の実施例において、粉体化された酵素が小さなキャピラリー管に緩く充填されそしてグラスウールプラグによって適所に保持され得る。空気は管を通して引かれ得、このとき任意の酵素インヒビターの蒸気が、バイオコンセントレーターに結合する。キャピラリー管は研究所に戻され得、グラスウールプラグは除去され、そして粉体化酵素は捕獲したインヒビターのラマン分析および検出および同定のために代表的ラマン分光計粉体／固体サンプリングアクセサリーへ装着される。
【０１７７】
血液抗体の自動検出および同定用ラマンオプトロードは、サンプルバイアル用カルーセル；ニードルサンプルインジェクター；粗い金属フィルムおよび抗原の固定相で内部をコートされた小さな透明ボートを含む第２カルーセル；ラマン分光器サブシステム；およびプリンターを含み得る。血液サンプルを含むゴム栓でシールされたバイアルは第１カルーセルに置かれ得る。ニードルサンプルインジェクターは自動的に第１バイアルのゴム栓に穴を開け得、バイアルから一定量のサンプルを取り出し、そして第２カルーセル上の第１ＳＥＲＳ活性プレートへそれを移動し、そして次いで一定量のリンス液体を、次のバイアルの栓に穴が開けられる前に廃棄リザーバーへ引きそして放出する。一方では、第１バイアルから取り出されたサンプルの抗体は、第２カルーセルが回転する間、ボート内の固定化された抗原層とともにインキュベートし、血液サンプルを含む第１のＳＥＲＳ活性ボートをラマン分光計サブシステムへ運搬する。ボートがラマン読み出しステーションに到着する場合、血液抗体の検出および同定のための３−Ｄ ＳＥＲＲＳ分析が起こり得、このとき励起光が抗原−抗体複合体と接触する前に、透明なボートの底および金属フィルムを通って送り出され、そして得られたスペクトルるがエバネセント波現象を通して再び取り込まれる。分析が終わった場合、各サンプルの抗体含有量を指摘する結果はプリントアウトして提供され得る。
【０１７８】
インスリンの反応性容量分析のためのラマンオプトロードは、サンプリングアクセサリーとしてのバイアルの導入のためのカルーセルを備えたラマン分光計サブシステムからなり得る。インスリンは光学的に透明なバイアル中に貯蔵される。インスリンが出荷されるべきである場合、バイアルはカルーセル中に最初に積まれる。動くカルーセルは各バイアルを順に照射に対して曝露させる。貯蔵されたインスリンの得られたラマンスペクトルは公知の活性の結晶性粉末インスリンの参照モデルスペクトルに対して比較され得る。受容可能でない高い割合の変性したインスリンを含むバイアルが検出される場合、ラマンシステムは警報を鳴らし、あるいは望まれるならば、カルーセルからそのバイアルを取り出すようにおよび／またはその含有物の状態を指示するためにバイアルにマークするように設計され得る。そのシステムはまた、そのバイアル中のインスリンが最後に分析された日付を示すような各バイアルにマークをつけるために設計され得る。
【０１７９】
固相合成を起こすポリペプチドの反応性容量分析のためのラマンオプトロードは、取り外し可能な光ファイバーのアレイからなり得る。各光ファイバーの表面は、ポリペプチドが光ファイバーの表面上で成長するために、樹脂フィルムの接着用に機能化された。照射光はポリペプチドに接触され、そして得られたラマンスペクトルはエバネセント波現象により取り込まれる。ラマンオプトロードはスペクトル情報に基づいて処理工程を自動的に調整するように、例えば、脱保護化が完了したことをスペクトル情報が指摘するまで、保護基の脱離のために試薬とともにインキュベートし続けるように、もしｐＨが変化する場合は酸、塩基または緩衝液を注入するように、などで設計される。
【０１８０】
上記の本発明の詳細な説明およびその好ましい形態が記載されているが、本発明を実行する種々の様式は上記詳細な開示に基づいて当業者に明白である。これらのおよび他の変形は本発明の範囲内であるとみなす。したがって、本発明はその詳細な説明に限定されないことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明に従った、デバイスの１形態の概略図である。
【図２】 図２は、共鳴ラマン散乱（ＲＲＳ）スペクトル情報の複写であり、これは、酵素バイオコンセントレーターによって捕捉された置換フェノールの検出および同定に使用され得る。
【図３】 図３ａ−３ｅは、本発明に従って利用可能な取り外し可能なカセットユニットの一部の断面および一部の立面の概略図である。
【図４】 図４ａ−４ｅは、本発明に従って利用可能な携帯型サンプリングシステムの一部の断面および一部の立面の概略図である。
【図５】 図５ａ−５ｄは、光ファイバー成分が、本発明に従って使用可能である配向を概略的に図示する。
【図６】 図６ａ−６ｄは、本発明に従って使用され得るバイオコンセントレーター「バッジ」または「ディップスティック」サンプリングユニットおよびそのラマン読み出しシステムの一部の断面および一部の立面の概略図である。
【図７】 図７は、本発明に従った、光ファイバーアレイラマンオプトロードの概略図である。
【図８】 図８は、標準ラマン散乱（ＮＲＳ）スペクトル情報の複写であり、これは、熱によって変性され始めた酵素を検出するために、リボヌクレアーゼのラマン反応容量分析において使用され得る。

Claims (24)

  1. ラマン分光法により、１以上の被検体の、少なくとも検出、同定および定量のいずれか１つのための方法であって、該方法は、以下：
    少なくとも１種の被検体と結合するバイオコンセントレーターを提供する工程であって、少なくとも１種の被検体を該バイオコンセントレーターと接触させ、該バイオコンセントレーター上への該少なくとも１種の被検体の結合を生じ、本質的に該バイオコンセントレーターおよび該少なくとも１種の被検体からなる分析されるべき媒質を形成し、そしてここで、該少なくとも１種の被検体の少なくとも一部が該バイオコンセントレーターに結合される、工程、
    該バイオコンセントレーターおよび該バイオコンセントレーターに結合した該少なくとも１つの被検体を含む該媒質を、供給源からの光で照射する工程であって、ここで該光が、該照射されたバイオコンセントレーターおよび該バイオコンセントレーターに結合された該少なくとも１つの被検体からのラマン散乱を生じ、ここで該ラマン散乱が、該バイオコンセントレーターまたは該被検体のいずれかに連結するレポーターにより発せられない、工程、
    該バイオコンセントレーターおよび該バイオコンセントレーター上の該少なくとも１種の被検体から放射する該ラマン散乱を収集し、そして処理する工程、ならびに
    該処理されたラマン散乱を分析し、該少なくとも１種の被検体の存在および／または正体を決定する工程、
    を包含する、方法。
  2. 請求項１に記載の方法であって、ここで前記バイオコンセントレーターは、支持部材上に配置され、そしてここで該バイオコンセントレーターが、全て生物学的供給源由来である、分子、高分子、複合体、分子のフラグメント、ならびに複合体のフラグメントおよびサブユニット；全て生物学的供給源由来である、分子、高分子、複合体、分子のフラグメント、複合体のサブユニット、および複合体のフラグメントに結合するリガンド；からなる群から選択され、
    ここで該分子、高分子および複合体が、酵素、酵素補因子、補酵素、抗体、抗体フラグメント、へムタンパク質、天然ペプチドおよび合成ペプチド、スフィンゴ糖脂質、レクチン、脂質、リン脂質、炭水化物、糖、ガングリオシド、核酸、核酸のフラグメント、病原体接着因子、レセプター、レセプターサブユニット、リポソーム、膜、小器官、細胞、組織、該分子または高分子を含む複合体、からなる群から選択され、そしてここで該リガンドが、酵素基質、酵素インヒビター、抗原、抗原アナログ、ハプテン、レセプターアゴニスト、レセプターアンタゴニストおよび糖質、からなる群から選択される、
    方法。
  3. 前記光がレーザーからである請求項１に記載の方法。
  4. 前記収集して処理する工程が、該処理する工程においてラマン分光計の使用を包含する、請求項１に記載の方法。
  5. 前記分光計が、画像化分光計である、請求項４に記載の方法。
  6. 請求項１に記載の方法であって、前記処理されたラマン散乱を分析する工程が、前記バイオコンセントレーターおよび前記結合した被検体を含む前記媒質のラマンスペクトルを、同じバイオコンセントレーターおよび結合した被検体のラマンスペクトルに対応する既知のラマンスペクトルを有する参照標準のラマンスペクトルに対して比較する工程を包含する、方法。
  7. 前記被検体が溶液中にある、請求項１に記載の方法。
  8. 前記被検体が空気中にある、請求項１に記載の方法。
  9. 前記少なくとも１種の被検体が、複数の被検体を含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記複数の被検体が、１種のバイオコンセントレーターに結合される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記複数の被検体が、前記バイオコンセントレーター上の異なる場所に結合される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記工程が、同じ物理的位置で行なわれる、請求項１に記載の方法。
  13. 請求項１に記載の方法であって、ここで前記バイオコンセントレーターと接触させる前記工程が、１つの位置で行なわれ、そして前記照射する工程、収集する工程および分析する工程が、該バイオコンセントレーターと接触させる該工程と異なる位置で行なわれる、方法。
  14. 前記照射する工程が、前記少なくとも１種の被検体の実時間分析のために連続的に行われる、請求項１に記載の方法。
  15. 請求項１に記載の方法であって、ここで前記収集して処理する工程が、以下からなる群から選択されるラマン分光計により実行される、方法：分散分光計、多重チャネル分光計、フーリエ変換分光計、アダマール変換分光計、定常変換分光計、音響光学チューナブルフィルター分光計、インテグレイテッドオプティック音響光学チューナブルフィルター分光計、ファイバーオプティック分光計、ファイバーオプティックアレイ分光計、顕微鏡分光計、画像化分光計、および画像化顕微鏡分光計。
  16. 請求項１に記載の方法であって、ここで前記ラマン散乱が、以下からなる群から選択される、方法：通常ラマン散乱、表面増強ラマン散乱、共鳴ラマン散乱、表面増強共鳴ラマン散乱およびラマン一過性波散乱。
  17. 前記支持部材が、粗い金属表面を含む、請求項２に記載の方法。
  18. 前記バイオコンセントレーターが、静止して維持される、請求項１に記載の方法。
  19. 前記バイオコンセントレーターが移動される、請求項１に記載の方法。
  20. 請求項１に記載の方法であって、ここで前記バイオコンセントレーターの一部が、前記被検体との接触に対して保護され、そして前記分析工程が、該バイオコンセントレーターの保護された部分に関連する１つ以上の周波帯を、該バイオコンセントレーターの非保護部分および前記結合された少なくとも１種の被検体から放射する１つ以上の周波帯のラマンスペクトルシグナルと、比較する工程を包含する、方法。
  21. 請求項２に記載の方法であって、ここで既知のラマンスペクトルを有する化学物質が、前記支持部材上に配置され、そしてここで前記処理されたラマン散乱を分析する工程が、前記バイオコンセントレーターおよび該バイオコンセントレーターに結合される前記少なくとも１種の被検体のラマンスペクトルを、該化学物質のラマンスペクトルに対して比較する工程を包含する、方法。
  22. 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記少なくとも１種の被検体が前記バイオコンセントレーターヘ結合される場合に、非結合バイオコンセントレーターのラマンスペクトルにおける同じ周波帯から変化しないままであることが知られている、該バイオコンセントレーターおよび該バイオコンセントレーターに結合される該少なくとも１種の被検体を含む前記媒質のラマンスペクトルにおける少なくとも１つの周波帯を、該バイオコンセントレーターおよび該バイオコンセントレーターに結合される少なくとも１種の被検体を含む該媒質の該ラマンスペクトルにおける少なくとも１つの他の周波帯と比較する工程であって、該少なくとも１つの周波帯は、該少なくとも１種の被検体が該バイオコンセントレーターに結合される場合に、該非結合バイオコンセントレーターのスペクトルにおける同じ少なくとも１つの他の周波帯から変化することが知られている、工程により、前記分析する工程が達成される、方法。
  23. 請求項１に記載の方法であって、ここで１つの支持部材上に配置される複数のバイオコンセントレーターが存在し、そして
    被検体が、各バイオコンセントレーターに結合され、そしてここで各バイオコンセントレーターからのラマンスペクトルが、分析される、方法。
  24. 請求項１に記載の方法であって、ここで前記分析する工程が、以下：
    前記バイオコンセントレーターのスペクトルを決定する工程；および
    該バイオコンセントレーターの値を０に設定し、そして該バイオコンセントレーターに結合される被検体からのラマン散乱スペクトルの値を、該０値と比較する工程、を包含する、方法。
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