CN113125546B - 一种毛发质谱检测芯片及毛发快速鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种毛发质谱检测芯片，按照下述方法制备而成：首先将毛发样品粉碎，并用清洗液清洗干净后，干燥处理；将干燥的毛发样品使用裂解液悬浮，超声或研磨处理后加入提取液进行蛋白提取；将蛋白提取液离心，取上清液滴加至靶面材料上，干燥后覆盖基质溶液，干燥处理后即得到毛发质谱检测芯片。本发明还公开了采用制备的毛发质谱检测芯片对毛发进行快速鉴定的方法。本发明鉴定方法简单，易操作，耗时短（≤30分钟），对检测人员要求低；所用样本预处理试剂均为普通化学试剂，无安全风险且价格低廉，容易获取，检测成本低；测定结果准确，数据容易解读，无需专业人员分析；检测通量高，便于实现自动化。

Description

一种毛发质谱检测芯片及毛发快速鉴定方法

技术领域

本发明涉及毛发检测技术，尤其是涉及一种毛发质谱检测芯片，本发明还涉及采用该毛发质谱检测芯片快速鉴定毛发来源的方法。

背景技术

发制品是以人发或特种化纤丝为原材料，经过一系列工序加工而成的假发制品，主要用于发型妆饰、美容美发教学及弥补缺发、脱发等生理缺陷，满足特种职业需求等。其中绝大部分产品用于发型妆饰，具有必需品的时尚消费特征。

当前对于一款发制品品质的评判一般参照发制品的材质进行，以材质对发制品划分一般分为人发产品、化纤产品、人发与化纤混合产品等。人发制品主要采用真人发为原料进行制作，该类产品质量较好，无论是手感、色泽等都和原生发差别不大，佩戴在头上，通常难以辨别真假，属于高端消费品，产品价格偏高，主要面对中高端收入消费人群；化纤发制品主要以化纤丝为原料加工而成，产品相对人发制品在手感和色泽方面略逊一筹，然而跟人发比较接近，主要面对中低端消费人群。由于人发来源有限，限制了高端发制品的生产。面对巨大的利益诱惑，部分生产者使用与人发接近的动物毛发为原料进行高端发制品的生产，大量假冒人发的高端发制品流入市场，严重危害了该行业的健康发展。

对发制品的鉴定目前多采用人工目力观察法和理化的灼烧法、腐蚀法等传统方法。目力观察法对检测者经验要求较高，往往不能做到准确鉴定；除去目力观察，对人源发鉴定使用最多的是理化的灼烧法和腐蚀法。灼烧法是直接将发制品进行燃烧，由于灼烧时会产生高温火焰，存在一定的安全风险，且灼烧法只能区分化纤发和人源发，而对于使用动物毛发充当人源发的假冒产品不能进行鉴别，同时对发制品的灼烧可产生刺鼻气味，对人员呼吸系统产生影响。腐蚀法是采用强酸强碱等具有强烈腐蚀能力的化学试剂对发制品进行处理，由于化学试剂具有生物危险，会危害实验人员的人身安全，同时腐蚀性强酸易挥发，产生的蒸汽将严重污染环境；同样腐蚀法只能区分化纤发和人源发，对使用动物毛发充当人源发的假冒产品不能进行鉴别；且由于使用化学试剂，产生的废弃物和液体需要按要求进行定点回收和处理，鉴定成本较高。

由于动物毛发成分与人源发成分基本相同，使用动物毛发充当人源发为原料制作的高端发制品再使用传统方法进行鉴定，已不能与人源发制品进行区分，大量动物毛发制作的以次充好的高端发制品进入市场，给当下的发制品市场秩序带来严重危害。

基因测序技术是当今最先进的物种鉴定技术，其通过检测待测样品中遗传物质序列信息，利用计算机技术对测定序列信息进行深入分析，最终获得物种信息，达到检测目的。基因测序技术已经广泛应用于物种分析、遗传分析、亲自鉴定、法医追踪、新种发现等诸多领域。在毛发鉴定方面，基因测序技术通过测定微量毛发中的DNA遗传物质，可以精确锁定毛发来源个体，但其复杂的操作要求和昂贵的费用，限制其应用范围，目前通过基因测序技术鉴定毛发只应用于刑事案件侦破和亲缘鉴定方面。

基质辅助激光解析飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption /Ionization Time of Flight Mass Spectrometry简称MALDI-TOF MS）是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱,其主要由两部分组成：基质辅助激光解析电离离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）。其原理是将生物样品与过量的基质溶液点在样品板上，溶剂挥发后形成样品与基质的共结晶，利用激光作为能量来源辐射结晶体，基质从激光中吸收能量使样本解吸附，基质与样本之间发生电荷转移使得样本分子电离，样本离子在加速电场下获得相同的动能，经高压加速、聚焦后进入飞行时间质谱分析器进行质量分析，检测器检测到不同质荷比（m/z）的离子，并以离子质荷比为横坐标，以离子峰为纵坐标形成特异性的蛋白质组指纹图谱，进而与数据库中图谱进行对比，得到鉴定结果。目前MALDI-TOF MS已应用于核酸鉴定、肉类溯源、食品安全、标记物分析、蛋白分析、病毒检测、基因检测等诸多领域，但是暂未有人将其应用在毛发鉴定方面。

发明内容

本发明的目的在于提供一种毛发质谱检测芯片，以及采用质谱学方法对毛发进行快速鉴定的方法。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的毛发质谱检测芯片，按照下述方法制备而成：

第一步，将毛发样品粉碎，并用清洗液清洗干净后，干燥处理；

第二步，将干燥的毛发样品使用裂解液悬浮，超声或研磨处理后加入提取液进行蛋白提取；

第三步，将蛋白提取液离心，取上清液滴加至靶面材料上，干燥后覆盖基质溶液，干燥处理后得到毛发质谱检测芯片。

其中第一步中粉碎毛发样品需采用物理粉碎方式，如采用剪刀剪碎。

第一步中所用的清洗液为有机溶液，包括乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮等挥发性有机溶剂。

其中所述第二步中所用的裂解液为50%甲酸和80%三氟乙酸配制的混合液；所用的提取液为乙腈等挥发性有机溶剂。

第三步中所用的靶面材料为金属或多孔纳米材料板；所用的基质溶液为有机小分子酸；所述金属板上镀有疏水膜，所示多孔纳米材料板进行光雕靶点处理；所用的基质溶液为有机小分子酸。

本发明的一种毛发快速鉴定方法，采用本发明制备的毛发质谱检测芯片，鉴定时，使用带有毛发数据库的质谱仪对毛发质谱检测芯片进行定性鉴定，并输出鉴定报告。

质谱仪鉴定时，其参数如下：推斥极电压20KV；引出极电压18.1 KV；聚焦极电压7KV；检测电压2.5 KV~4.0 KV；延时150~500ns；激光强度20~45%；激光频率60Hz；质量范围1000~10000Da。

本发明采用质谱学方法，通过分析人发和动物毛发之间蛋白指纹的差异对人源发等高端发制品进行具体原料鉴别，通过简单的蛋白提取步骤和蛋白指纹采集分析，可快速鉴定毛发种类，精准定位人源发制品原料类型，可有效打击高端发制品造假的市场行为，保障发制品行业良性发展。

本发明鉴定方法简单，易操作，耗时短（≤30分钟），对检测人员要求低；所用样本预处理试剂均为普通化学试剂，无安全风险且价格低廉，容易获取，检测成本低；测定结果准确，数据容易解读，无需专业人员分析；检测通量高，便于实现自动化。

附图说明

图1中a、b、c分别是人发、驼毛和黄牛毛的指纹图谱。

图2是实际鉴定的人发匹配棒状图。

图3是单个样品的鉴定结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。

如无特殊说明，本发明所用的试剂为本领域常用试剂，所用的处理方法为本领域常规方法。

本发明所述的毛发快速鉴定方法如下：

第一步，首先制备毛发质谱检测芯片：

S1，将毛发样品用剪刀粉碎至30目左右，以增加样品表面积；然后取适量粉碎后的毛发放于1.5ml离心管中，使用无水乙醇（也可以采用甲醇、异丙醇、丙酮等挥发性有机溶剂）清理毛发表面杂质（由于无水乙醇溶解油脂且易溶于水易挥发，不会出现残留干扰后续的实验），清洗干净后，干燥处理；

S2，将干燥后的毛发样品使用混合裂解液（50%甲酸和80%三氟乙酸按体积比2:1进行配制，先加入80%三氟乙酸，震荡后再加入50%甲酸）悬浮，放置于超声设备中超声处理5~10min以加速蛋白溶解（该步骤也可以采用研磨处理），最后加入等体积的提取液（乙腈等挥发性有机溶剂）进行蛋白提取；本发明使用50%甲酸和80%三氟乙酸的混合液作为裂解液，相较于单独使用甲酸裂解液，对毛发的裂解效果更好，能释放更多种毛发成分，在后续质谱鉴定时能明显增加质谱图峰个数，大大提高了质谱鉴定的准确性；

S3，将处理好的蛋白提取液13000rpm离心10min，取1μL上清液滴加至靶面材料（质谱样品板，采用镀膜金属板或硅板）上，待干燥后覆盖1μL基质溶液（HCCA溶液），干燥后即得到质谱检测芯片。

第二步，使用飞行时间质谱仪对制得的质谱检测芯片进行鉴定，质谱数据库选择毛发数据库。

鉴定时，其参数选择如下：推斥极电压20KV；引出极电压18.1 KV；聚焦极电压7KV；检测电压2.5 KV~4.0 KV；延时150~500ns；激光强度20~45%；激光频率60Hz；质量范围1000~10000Da。

质谱采集毛发指纹图谱如图1中a、b、c所示，分别为人源发、驼毛和黄牛毛的毛发鉴定用指纹图谱（驼毛和黄牛毛是充当人源发最多的动物毛发原料）。从上述图谱可以看出，不同物种之间的指纹图谱存在明显差异，表明每种物种的蛋白指纹图谱是独特的，可与其他物种进行区分。

第三步，出鉴定结果。

 质谱指纹图谱匹配情况如图2所示，以人发为例：棒状图下部为数据库中存储的人发主要特征峰，上部为处理后采集得到的样本特征峰。通过软件（Autof Analyzer）计算，对结果进行评估，得分在9.0分以上为可信的物种；得分在6.0分以上为可能的物种；得分在6.0分以下为不可信结果。评估结果如图2右侧展示：本次匹配9.0分以上得分，为人发，为物种可信结果。得分小于6.0分的结果为牛毛等其他动物毛发为不可信结果。表明数据库对人发可进行特异甄别。

图3为飞行时间质谱仪出具的单个样品的质谱报告。

Claims (6)

1.一种毛发质谱检测芯片，其特征在于：按照下述方法制备而成：

第一步，将毛发样品粉碎，并用清洗液清洗干净后，干燥处理，清洗液为包括乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮的挥发性有机溶剂；

第二步，将干燥的毛发样品使用裂解液悬浮，超声或研磨处理后加入提取液进行蛋白提取；其中，所用的裂解液是由50%甲酸和80%三氟乙酸按体积比2:1配制而成的混合液，使用时先加入80%三氟乙酸，震荡后再加入50%甲酸；所述提取液为乙腈；

第三步，将蛋白提取液离心，取上清液滴加至靶面材料上，干燥后覆盖基质溶液，干燥处理后得到毛发质谱检测芯片。

2.根据权利要求1所述的毛发质谱检测芯片，其特征在于：所述第一步中粉碎毛发样品采用物理粉碎方式。

3.根据权利要求1所述的毛发质谱检测芯片，其特征在于：所述第三步中的靶面材料为金属板或多孔纳米材料板；所用的基质溶液为有机小分子酸。

4.根据权利要求3所述的毛发质谱检测芯片，其特征在于：所述金属板上镀有疏水膜，所板述多孔纳米材料板进行光雕靶点处理。

5.一种毛发快速鉴定方法，其特征在于：采用权利要求1-4任一项所述的毛发质谱检测芯片，使用带有毛发数据库的质谱仪对毛发质谱检测芯片进行定性鉴定，并输出鉴定报告。

6.根据权利要求5所述的毛发快速鉴定方法，其特征在于：质谱仪鉴定时，其参数如下：推斥极电压20KV；引出极电压18.1KV；聚焦极电压7 KV；检测电压2.5 KV~4.0 KV；延时150~500ns；激光强度20~45%；激光频率60Hz；质量范围1000~10000Da。

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