CN220854740U

CN220854740U - 一种在线萃取顺次电离质谱分析装置

Info

Publication number: CN220854740U
Application number: CN202322532134.5U
Authority: CN
Inventors: 邱子栋; 黄璐琦; 钟达财
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2023-09-18
Filing date: 2023-09-18
Publication date: 2024-04-26
Anticipated expiration: 2033-09-18

Abstract

本发明提供了一种新颖的在线萃取顺次电离质谱分析装置(S‑oEESI‑MS)，所述装置包括多溶剂泵并联结构、样品萃取仓、电喷雾离子源。所述装置可用于复杂样品中不同极性物质的依次在线萃取及顺次电离表征，获得更为全面的质谱指纹轮廓。所述装置相比于传统的LC‑MS及oEESI‑MS，具有更为精准的区分鉴定能力，可完成传统技术难以区分的高相似中药的精准鉴定。

Description

一种在线萃取顺次电离质谱分析装置

技术领域

本发明属于中药分析技术领域，具体涉及一种在线萃取顺次电离质谱分析装置。

背景技术

不同样品的精准区分和鉴定是中药学的关键研究课题之一，对生产者、消费者或监管机构都具有重要意义。中药材多来源于动植物组织器官，其质量和价格受到品种和产地差异的影响较大。高度相似的样品，例如相邻产地生产的中药材，通常外观形貌接近，所含有的主要的次生代谢物也基本一致，是市场上混淆和掺假的主要来源，难以通过传统的鉴定方法准确区分。

随着现代分析化学和仪器制造技术的不断发展，中药的快速检测技术也取得了不断的进步。光谱技术、色谱技术和分子生物学技术是当前中药鉴定的主要手段，这些技术各有其特点和局限性。具体来说，近红外光谱技术和高光谱成像等光谱技术具有通用性强、快速、不破坏样品等优点，但是其准确度相对较低，且光谱信号易受到非目标成分的干扰，从而易导致假阳性误判。色谱技术，特别是色谱-质谱联用技术，能够对中药中的次生代谢物进行准确分析，用于质量评价和鉴别，其准确度相对较高，但需要复杂冗长的样品前处理过程，可能导致样品中关键物质的损耗或丢失。此外，高含量的主要成分对关键痕量成分的干扰和离子抑制也难以避免。分子生物学方法(如PCR等)是鉴定动植物原料来源的有效工具，但是中药的质量不仅由基因决定，还受到环境因素等导致的同一物种的质量差异的影响。这种环境因素导致的质量差异，分子生物学工具也无法识别。因此，目前仍然缺乏可靠的中药鉴定技术，特别是面对高度相似的样品时，无法满足快速、准确、前处理简单、成本低的鉴定要求。

近年来，直接质谱以其无需样品前处理，可直接对复杂基质样品进行快速、高通量质谱分析的优势得到了越来越多的关注。由于质谱具有极强的分子定性和定量能力，可以在一定程度上实现对不同中药样品的原位快速检测和定性鉴定。然而，由于缺乏提取、预分离等前处理操作，直接质谱同时表征复杂多组分的能力相对不足。在质谱图中，痕量组分被高含量组分抑制的现象比较普遍，而高度相似样品的主要组分往往是一致的，差异却体现在痕量甚至超痕量物质上。因此，提高直接质谱对复杂多组分的同时分析能力对中药的准确鉴定具有重要意义。

发明内容

为了改善上述技术问题，本发明提供一种在线萃取顺次电离质谱分析装置及其应用。

第一方面

本发明提供一种在线萃取顺次电离质谱分析装置(S-oEESI-MS)，所述装置包括多溶剂泵并联结构、样品萃取仓(6)、电喷雾离子源(7)。

根据本发明的实施方案，多溶剂泵并联结构包括至少2个溶剂泵结构，例如2个、3个、4个等。

根据本发明的实施方案，溶剂泵结构包括溶剂存储瓶(1)、精密蠕动泵(5)；溶剂存储瓶中包含萃取溶剂；溶剂存储瓶(1)通过溶剂输送管线(4)与精密蠕动泵(5)连接；精密蠕动泵(5)将萃取溶剂泵至样品萃取仓(6)。

根据本发明的实施方案，萃取溶剂选自不同极性有机或无机溶剂，例如水、甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯等。

根据本发明的实施方案，每个溶剂存储瓶中独立地包含相同或不同的萃取溶剂；优选地包含不同的萃取溶剂，例如不同极性的单一萃取溶剂或混合萃取溶剂。

根据本发明的实施方案，溶剂存储瓶包括溶剂存储瓶I、溶剂存储瓶II；优选地，溶剂存储瓶I、溶剂存储瓶II中包含不同极性的萃取溶剂。

根据本发明的实施方案，通过设置溶剂梯度，经精密蠕动泵(5)将不同梯度和/或极性的萃取溶剂泵至样品萃取仓(6)。

根据本发明的实施方案，溶剂梯度设置为：0-10s 100％水、10-50s 100％-0％水、50-60s 100％甲醇。

多溶剂泵并联结构可进一步显著扩大萃取溶剂的极性覆盖范围，实现高、中、低等不同极性组分的顺序萃取和电离。

根据本发明的实施方案，萃取溶剂中可任选的加入添加剂，例如甲酸、乙酸、氨水、三氟乙酸等。

根据本发明的实施方案，样品萃取仓(6)中包含过滤器，例如滤膜。过滤器或滤膜可防止固体粉末或颗粒进入雾化器。

根据本发明的实施方案，滤膜为微孔滤膜(0.22μm-0.45μm)。

根据本发明的实施方案，样品萃取仓(6)主体为合金、惰性硅胶或PP塑料等惰性材料。底部放置有PES等材质的微孔滤膜(0.22-0.45μm)。

根据本发明的实施方案，样品无需进行任何其他预处理或预分离。

根据本发明的实施方案，溶剂输送管线(4)为石英毛细管或Peek管。

根据本发明的实施方案，所述溶剂输送管线(4)通过一段金属管与样品仓相连，金属管上连接高压电源HV(9)。

根据本发明的实施方案，所述石英毛细管通过peek接头固定于各部件之上。

根据本发明的实施方案，萃取溶剂进入样品萃取仓(6)前，对萃取溶剂施加高压电场HV(9)。

根据本发明的实施方案，样品经萃取溶剂萃取后，经电喷雾离子源(7)，在雾化气(10)的作用下，形成电喷雾并完成样品离子化，进而通过离子传输管进入质谱仪(8)。

根据本发明的实施方案，雾化气选自氮气、氦气等惰性气体，例如氮气。

根据本发明的实施方案，所述装置可与各种质谱仪(如QTOF/TQ/Orbitrap-MS等)耦合联用。

第二方面

本发明提供上述装置在样品的分析和/或检测中的应用。根据本发明的实施方案，所述样品选自药品(例如中药样品)、食品、化妆品、保健品等。

本发明还提供上述装置与化学计量学多元统计分析方法联用在样品的分析和/或检测中的应用。

根据本发明的实施方案，所述样品选自药品(例如中药样品)、食品、化妆品、保健品等。

根据本发明的实施方案，化学计量学多元统计分析方法包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)。

第三方面

本发明提供上述装置在中药白术样品的产地分析和/或检测中的应用。

根据本发明的实施方案，溶剂流速为100μL/min。

根据本发明的实施方案，溶剂存储瓶I中的萃取溶剂为水。

根据本发明的实施方案，溶剂存储瓶II中的萃取溶剂为甲醇。

根据本发明的实施方案，萃取溶剂中加入0.01％-10％的乙酸，例如1％的乙酸。

根据本发明的实施方案，白术样品为粉末状。

根据本发明的实施方案，样品萃取仓(6)中的样品加入量为0.05mg-5.0mg，0.1mg-2.0mg，例如0.5mg。

根据本发明的实施方案，质谱采用正离子模式。

根据本发明的实施方案，质谱扫描的质量范围为m/z 100～1000。

根据本发明的实施方案，雾化气体的流速为3L/min～15L/min，优选为5L/min～11L/min，例如9L/min。

根据本发明的实施方案，碎裂电压为50V-250V，优选为50V-150V，例如100V。

根据本发明的实施方案，毛细管电压为2kV～4.5kV，优选为3kV～4kV，例如3.5kV。

根据本发明的实施方案，雾化气体温度100℃-350℃，优选为100℃-200℃，例如150℃。

根据本发明的实施方案，中药白术样品为不同产地的高相似白术样品；优选为湖南产地的白术样品、浙江产地的白术样品；进一步优选为安徽产地的白术样品、河南产地的白术样品、湖南产地的白术样品、浙江产地的白术样品。

根据本发明的实施方案，利用所述装置获得质谱信息后，筛选样品的特征标志物。

根据本发明的实施方案，特征标志物为如下m/z值对应的化合物：318、158、489、133、533、577、149、445、319、579、349、413、377、302、365、175、317、116、301、429、279、117。

根据本发明的实施方案，获得特征标志物信息后，通过化学计量学多元统计分析方法进一步分析与鉴定。

本发明还提供上述装置与化学计量学多元统计分析方法联用在中药白术样品的产地分析和/或检测中的应用。

有益效果

本发明提供了一种新颖的在线萃取顺次电离质谱分析装置(S-oEESI-MS)，所述装置包括多溶剂泵并联结构、样品萃取仓、电喷雾离子源。所述装置可用于复杂样品中不同极性物质的依次在线萃取及顺次电离表征。所述装置相比于传统的LC-MS及oEESI-MS，具有更为精准的区分鉴定能力。

本发明还提供所述的在线萃取顺次电离质谱分析装置(S-oEESI-MS)在中药白术的的产地分析和/或检测中的应用。所述装置获得的质谱信息通过多变量统计分析，可实现高度相似的不同产地样本的完全区分。对中药质量控制与标准化发展具有广泛的适用性和推广价值。

附图说明

图1为顺次在线萃取电喷雾电离装置结构示意图。

图2为S-oEESI-MS条件优化结果图。

图3为S-oEESI-MS获得的四个不同产地典型质谱指纹图谱；其中A为安徽产地，B为河南产地，C为湖南产地，D为浙江产地。

图4为基于S-oEESI-MS技术的不同产地高相似白术化学计量学区分结果。

图5为基于S-oEESI-MS技术的PCA区分贡献图。

图6为基于S-oEESI-MS技术的PLS-DA模型验证图。

图7为基于S-oEESI-MS技术的PLS-DA VIP值条形图。

图8为基于S-oEESI-MS技术的OPLS-DA VIP值条形图。

图9为基于传统LC-MS与oEESI-MS技术的不同产地高相似白术化学计量学区分结果。

图10为基于LC-MS数据的PLS-DA模型验证图。

图11为基于oEESI-MS数据的PLS-DA模型验证图。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

实施例1

1.实验部分

1.1材料与试剂

分别从河南、湖南、安徽、浙江四省各采集白术样本8批，共32批。所有药材经鉴定后，相关标本保存于中国中医科学院国家中药资源中心。甲醇和乙酸(MS级)购自赛默飞世尔科技公司(中国)。实验用去离子水(18.2MΩ/cm)由Mill-Q水纯化系统(Billerica,MA,USA)制备。

1.2质谱参数优化

所有实验均在安捷伦6470B质谱仪(安捷伦科技(中国)有限公司)上进行。质谱参数是决定目标化合物信号响应的关键因素，因此，首先以白术中的重要成分苍术内酯(m/z203)的信号响应强度为指标，对质谱参数进行了一系列优化，包括碎裂电压、毛细管电压、气体流量和气体温度等。碎裂电压在50～300V范围内进行了优化，气体流量在3～15L/min范围内进行了优化，毛细管电压在2～4.5kV范围内进行了优化，气体温度在100～350℃范围内进行了优化。

1.3基于S-oEESI-MS直接分析白术样品

S-oEESI-MS实验采用安装在三重四极杆质谱仪(Agilent 6470B)上的新型改良S-oEESI源。用于样品提取和电离的装置示意图见图1。其中，样品萃取仓参照文献【Qiu,Z.D.Huang,L.Q.et al.(2020).Limitation standard of toxic aconitines inAconitum proprietary Chinese medicines using on-line extraction electrosprayionization mass spectrometry.Acta Pharm Sin B,10(8),1511-1520.】。

图1中，1为溶剂存储瓶，2为萃取溶剂I，3为萃取溶剂II，4为溶剂输送管线，5为精密蠕动泵，6为样品萃取仓，7为电喷雾离子源，8为质谱仪，9为高压电源HV，10为雾化气。溶剂存储瓶(1)通过溶剂输送管线(4)与精密蠕动泵(5)连接；精密蠕动泵(5)将萃取溶剂泵至样品萃取仓(6)。样品经萃取溶剂萃取后，经电喷雾离子源(7)，在雾化气(10)的作用下，形成电喷雾并完成样品离子化，进而通过离子传输管进入质谱仪(8)。

实验使用水和甲醇作为萃取溶剂，两相溶剂中均加入1％的乙酸。将两相溶剂分别置于两个溶剂瓶中，使用精密蠕动泵按既定程序有序抽出。梯度洗脱过程在1min内完成，溶剂比例为0-10s 100％水、10-50s 100％-0％水、50-60s 100％甲醇。流速为100μL/min。样品仓底部装有为空滤膜，防止固体粉末或颗粒进入雾化器。雾化辅助气体为氮气。其他质谱参数在正离子扫描模式下使用上述优化参数或仪器默认值。为了提高样品的重现性和稳定性，实验中使用的白术样品为粉末状(0.5mg)，未进行任何其他预处理或预分离。质谱采用正离子模式，质量范围为m/z 100～1000。

1.4基于S-oEESI-MS指纹图谱及指标成分群的白术产地区分策略

将S-oEESI-MS得到的每个白术样品的全扫描质谱指纹图谱分别导出到MicrosoftExcel中，得到每个质谱峰的m/z和相应的强度数据。以不同产地分组，对每个样品根据各峰强度的高低进行排序，选择各样品信号强度前100且同一产地样品共有的峰构建该产地候选特征标志物群；合并不同产地的候选特征标志物群，并剔除重复峰、同位素峰、杂质峰等，最终得到白术药材的特征标志物。采用PCA、PLS-DA、OPLS-DA技术以特征标志物的m/z信号强度为指标，对不同产地白术进行进一步建模区分。

1.5LC-MS和oEESI-MS分析

1.5.1LC-MS分析

应用传统的LC-MS方法对来自4个产地的32批次样品进行分析，获得其LC-MS指纹图谱，并进一步结合化学计量学模型(PCA/PLS-DA/OPLS-DA)对其进行区分。

LC-MS样品制备：准确称量每种样品粉末10mg，加入1.0mL甲醇进行超声辅助提取15分钟，然后使提取物通过0.22μm微孔膜。

LC-MS条件：化合物在色谱柱(ZORBAX Eclipse Plus C18 2.1x100 mm，3.5μm)上分离，流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为含0.1％甲酸的乙腈。柱温为25℃，流速为0.2mL/min。

流动相B梯度洗脱如下：0–4分钟，28％B至60％B；4–6分钟，60％B至90％B；6–15分钟，90％B至100％B；15-20分钟，100％B；20-22分钟，100-28％B；22-24分钟28-28％B。进样量3.0μL。质谱仪为安捷伦6470B(安捷伦科技(中国)有限公司)，其与ESI离子源耦合。质谱仪的参数与S-oEESI-MS装置的设置相同。

1.5.2oEESI-MS分析

使用oEESI离子源进行oEESI-MS分析。oEESI离子源装置参照文献【Qiu,Z.D.Huang,L.Q.et al.(2020).Limitation standard of toxic aconitines inAconitum proprietary Chinese medicines using on-line extraction electrosprayionization mass spectrometry.Acta Pharm Sin B,10(8),1511-1520.】。萃取溶剂为甲醇-水(1:1,v:v)。流速为100μL/min。为了提高分析效率和实验的稳定性，直接上样量为0.5mg。其他质谱条件与S-oEESI-MS装置的设置相同。

2.结果和讨论

2.1S-oEESI-MS装置的创制与优化

本发明首先建立了两相溶剂输送装置，选择甲醇和添加0.1％甲酸的水作为两相萃取溶剂。具体操作步骤为在100％甲醇相中萃取10s，然后从100％甲醇相逐渐过渡到100％水相萃取40s，最后以100％水相萃取10s，每个样品的萃取时间为1.0min。显然，由于梯度溶剂萃取过程，S-oEESI-MS技术分析单个样品耗时较oEESI-MS技术(10-30s)更长，但相较于LC-MS技术(至少约20-30min)，仍有明显优势。

根据关键目标组分的信号强度，首先对S-oEESI源的雾化气流量、电离电压、毛细管电压和气体温度等关键参数进行了优化，以实现更有效的电离和测定(图2)。从图2A可以明显看到，在3L/min～15L/min的雾化气体流速范围内，目标物质的质谱信号先显著增加，然后逐渐减小。碎裂电压的优化过程表明(图2B)，在50V-150V的相对较低的碎裂电压范围内，信号响应较好，100V时响应最佳。毛细管电压的优化结果揭示(图2C)，过高的电离电压和过低的电离电压都会导致分析物的电离效果降低，而目标分析物在3kV～4kV范围内电离效果相对较好。最后，在100℃-350℃范围内调节雾化气体温度(图2D)；不难发现，在150℃时可以获得最佳的信号响应，而在200℃之后，信号迅速衰减。

因此，后续实验选择了最佳气体流量9.0L/min、最佳碎片器电压100V、最佳毛细管电压3.5kV和最佳气体温度150℃。

2.2不同产地白术特征标志物的筛选

采用经过优化的最佳质谱分析条件，对4个产地的32批次的白术样品进行了快速质谱表征。图3中展示了基于S-oEESI-MS获取的各个产地样品的典型质谱指纹图谱。整体上来看，虽然四个不同产地的白术的典型指纹图谱中主要的化合物大部分为共有峰(如m/z371，301，279，429等)，但是在信号的相对强度上仍然有较大差异。同时，在信号相对较低的物质上，化合物的种类也明显存在差异。

例如，河南产地(图3B)中m/z 205和m/z 391的峰强度非常高，相对强度约为化合物m/z 317的30-50％，而在安徽产地(图3A)和浙江产地(图3D)中，这两个化合物的峰强度还不足基峰m/z 317强度的10％，在湖南产地(图3C)中，甚至都难以在整体轮廓中看到这两个化合物。从绝对信号强度来看，整体上，四个产地的物质含量差异基本都在一个数量级之内，其中浙江产地(图3D)的白术中主要成分的含量较其他三个产地相对较高(m/z 317的信号强度1.2*10⁶)，暗示了浙江产的白术可能具有更佳的药效活性。这与传统认为的浙江产白术为道地药材的经验是一致的。

基于S-oEESI-MS技术获取的白术四个产地的指纹图谱虽然从整体轮廓上显示出一定差异，但是依然难以直观准确对不同产地进行精准区分。因此，本发明进一步对各个产地的特征标志物进行了筛选，以期通过少量的特征标志物即可对不同白术样品进行简单、快速、精准区分。特征标志物的选择以所有32批次白术样品的质谱指纹图谱为基础，分别导出每个样品所有的质谱一级谱质荷比(m/z 100-1000)与信号强度至Excel中(每个样品的>10,000个化合物)，按照产地分组并按照信号强度对不同质荷比的化合物进行排列，最终选择相同产地各个样品中均有且强度前100强的信号为该产地白术的候选特征标志物。进一步排除同位素峰、加和离子峰、空白基质干扰峰等，即可获得不同产地白术的特征标志物。最终，分别从安徽、河南、湖南、浙江中筛选出12、15、13、14个特征标记，合并四个产地结果，去除重复，获得共22个白术区分鉴定的特征标志物(m/z 318、158、489、133、533、577、149、445、319、579、349、413、377、302、365、175、317、116、301、429、279、117)，部分化合物的可能结构被进一步基于文献检索等方式进行了归属(表1)。

表1 22个筛选出的白术特征标志物及部分可能的结构

注：a河南，b安徽，c湖南，d浙江。

2.3基于S-oEESI-MS的高相似不同白术的多元统计分析

通过S-oEESI-MS对各药材中多组分顺次电离表征及不同产地白术特征标志物的筛选，进一步通过化学计量学多元统计分析手段对高相似的不同产地白术进行更为准确的区分鉴定及化学差异性与相关性的可视化。以不同产地的32个样本中22个特征标志物的信号强度为数据依据，依次采用PCA、PLS-DA、OPLS-DA三种统计分析技术进行分析(图4)。

图4A是4个产地白术样本PCA得分图，模型R²X＝0.984接近于1，Q²＝0.629，示意模型分类效果稳定，且预测效果高，可以进行后续差异成分分析。整体上看，在95％的置信区间内，4个产地样本均获得了相对明显区分。仅安徽产地的一个样本出现了异常偏离，与同组的其他样本比较相对离散。由PCA区分贡献图5可知，m/z 365、318、317、445、429、533、319等离子是4个产地白术样本区分的主要贡献离子。

为了更好挖掘出4个产地白术样本代谢差异成分，使用PLS-DA和OPLS-DA技术对数据进行分析。图4B是4个产地白术样本PLS-DA得分图，其R²X＝0.946，R²Y＝0.899，Q²＝0.69，在95％的置信区间内，4个产地样本均获得明显区分。通过排列试验随机进行200次改变分类变量y的排列顺序验证模型的有效性(图6)，R²和Q²值均小于右端原始值，且Q2的回归线在Y轴上的截距为负值，表明所建立的模型没有出现过度拟合，预测能力良好，可以进行差异性分析。差异性分析通常运用VIP值表征差异变量的贡献程度，当VIP值>1，且经t检验P＜0.05时，即认为该成分为组间分离贡献率较大的差异化学成分。由PLS-DA模型VIP区分贡献图，如图7可知，m/z133、117、489、159、377、175为主要分类贡献离子，这与PCA分类贡献主要离子一致。为了进一步验证模型有效性，使用OPLS-DA对数据进行分析，图4C是4个产地白术样本OPLS-DA得分散点图，其与PLS-DA得分散点图结果很相似。通过OPLS-DA区分贡献VIP图8可知，分类贡献率较大离子主要有m/z 133、117、159、377、175这与PLS-DA主要离子保持一致，但OPLS-DA样本相对于PLS-DA聚集程度更高。

综上，基于S-oEESI-MS获得的全梯度质谱指纹图谱及特征标志物筛选策略，结合化学计量学模型，可以实现常规分析技术难以区分鉴定的高相似样品的区分鉴定，有望助推相关样品质量标准与质控水平的提升。

2.4传统的LC-MS和oEESI-MS无法区分高度相似的白术样品

本发明采用传统的LC-MS技术以及oEESI-MS技术，结合化学计量学模型(如PCA、PLS-DA和OPLS-DA)，对来自四个不同产地的白术样品进行了质谱表征和鉴别(图9)。2.4.1LC-MS无法区分高度相似的白术样品

图9A-9C是基于LC-MS得到的指纹图谱数据通过PCA、PLS-DA和OPLS-DA模型进行区分后得到的结果。

PCA得分图(图9A)结果直观显示，四个产地样本较为无序分布，难以实现区分。R²X的值为0.215，Q²的值为-0.0849。在PCA分析中，R²X越接近1.0，说明模型稳定性越高；而Q²大于0.5则表示模型预测率较高。然而，在此处R²X为0.215，小于0.5，且Q²为负值，这表明模型分类稳定性较低，预测效率不高。此外，在模型95％的置信区间内，有一个湖南产地的样品出现异常。

由于PCA是一种非监督分析方法，在确定变异成分时容易忽略组内差异和随机误差，因此本发明进一步采用了监督模式识别方法PLS-DA对数据进行区分。图9B展示了4个白术样品LC-MS数据的在PLS-DA模型下的得分散点图，其R²X的值为0.315，R²Y的值为0.999，Q²的值为0.701。结果表明，总体分类效果仍优于PCA模型，安徽产白术和河南产白术有明显的区分，但浙江产白术和湖南产白术的区分度不明显。为了进一步验证PLS-DA模型的有效性，本发明进行了置换实验。通过随机进行200次置换检验，改变分类变量y的置换顺序，得到相应的不同随机置换。PLS-DA模型置换检验左端随机置换产生的R²和Q²值均小于右端的原始值时，说明模型的预测能力大于随机置换y的预测能力，表明模型有效，可以进行后续的方差分析。从图10可以看出，只有右端的R²和Q²的部分值小于原始值，说明模型存在过拟合，分类不稳定，预测效率低，这与浙江产地和湖南产地无法区分的结果是一致的。

OPLS-DA是在PLS-DA的基础上结合正交信号剔除X矩阵中与Y矩阵无关的变化，使X矩阵与Y变量的关系最大化，两者分类差值最大化，从而更准确地表征两组化学成分的差异。图9C是4个产地白术样品LC-MS数据的OPLS-DA得分散点图；R²X＝0.172，R²Y＝0.966，Q²＝0.136，整体上看分类结果与PLS-DA相似，但浙江和湖南样品的总体聚集性略高于PLS-DA。由图9C可知，安徽产白术和河南产白术有明显的区分，但浙江产白术和湖南产白术的区分度不明显。

2.4.2oEESI-MS无法区分高度相似的白术样品

图9D-9F是对安徽、河南、湖南和浙江4个产地的白术样品通过oEESI-MS获得的指纹图谱数据进行PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析的结果。

从整体上看，PCA得分散点图仍然非常混乱(R²X＝0.305,Q²＝-0.0852,R²Y＜0.5＝，4个产地的样品没有明显的差异，其中安徽产地的2个样品点出现了异常。

PLS-DA得分的散点图(R²X＝0.288,R²Y＝0.978,Q²＝0.419)表明分类效果优于PCA，安徽和浙江产地的白术可以明显区分，但湖南和河南产地的2个样品无法区分。利用置换检验进一步评价了模型的有效性(图11)，结果表明，只有部分R²和Q²值在右端小于原始值，说明模型拟合过度，分类不稳定，预测效率不高，因此无法区分湖南和河南产地的样本。

图9F展示了4个白术样品的OPLS-DA得分散点图，其中R²X的值为0.171，R²Y的值为0.835，Q²的值为0.0902。从图中可以看出，R²X和Q²的值均小于0.5。结合图9F可以看出，在95％的置信区间内，4类白术样品中只有安徽和浙江可以区分，这与PLS-DA的分类结果一致。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种在线萃取顺次电离质谱分析装置，所述装置包括多溶剂泵并联结构、样品萃取仓、电喷雾离子源；

多溶剂泵并联结构包括至少2个溶剂泵结构；溶剂泵结构包括溶剂存储瓶、精密蠕动泵；溶剂存储瓶中包含萃取溶剂；溶剂存储瓶通过溶剂输送管线与精密蠕动泵连接；精密蠕动泵将萃取溶剂泵至样品萃取仓；

样品萃取仓中的样品经萃取溶剂萃取后，经电喷雾离子源，在雾化气的作用下，形成电喷雾并完成样品离子化，进而通过离子传输管进入质谱仪。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，

多溶剂泵并联结构包括2个溶剂泵结构；

溶剂存储瓶包括溶剂存储瓶I、溶剂存储瓶II；溶剂存储瓶I、溶剂存储瓶II中包含不同极性的萃取溶剂。

3.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，

通过设置溶剂梯度，经精密蠕动泵将不同梯度和/或极性的萃取溶剂泵至样品萃取仓。

4.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，

样品萃取仓中包含过滤器。

5.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，

所述溶剂输送管线通过一段金属管与样品仓相连，金属管上连接高压电源HV。

6.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，

萃取溶剂进入样品萃取仓(6)前，对萃取溶剂施加高压电场HV(9)。