CN113419010B - 贝母类药材的特征图谱构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种贝母类药材的特征图谱构建方法及其应用。该方法先将贝母类药材粉碎，称取药材粉末，加入氨溶液碱化，再加入二氯甲烷‑甲醇混合溶液，称定重量后进行超声处理，再次称定重量，加二氯甲烷‑甲醇混合溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，滤液用氮气吹干溶剂，残渣加入甲醇复溶，经滤膜过滤，续滤液作为供试品溶液采用UHPLC‑QQQ‑MS动态MRM模式进行分析，即可得到贝母类药材的特征图谱。本发明采用非靶向和拟靶向代谢组学结合的策略筛选得到一组贝母类药材鉴别标志物，通过筛选得到的鉴别标志物，建立五种贝母类药材MRM特征图谱，可用于实现五种贝母类药材的区分以及掺伪贝母药材中所用非正品贝母的鉴别。

Description

贝母类药材的特征图谱构建方法及其应用
技术领域
本发明属于中药药材鉴别技术领域，具体涉及贝母类药材的特征图谱构建方法及其应用。
背景技术
贝母为常用止咳化痰中药，是百合科贝母属多种植物鳞茎的总称。2020版《中国药典》中收载有五种贝母类药材，包括川贝母(FCB)、平贝母(FUB)、浙贝母(FTB)、伊贝母(FPB)和湖北贝母(FHB)。其中川贝母和伊贝母为多基原药材，川贝母来源于卷叶贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)、暗紫贝母(F.unibracteata Hsiao et K.C.Hsia)、甘肃贝母(F.przewalskii Maxim.)、梭砂贝母(F.delavayi Franch)、太白贝母(F.taipaiensisP.Y.Li)和瓦布贝母(F.unibracteata Hsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang etS.C.Yue)Z.D.Liu,S.Wang et S.C.Chen)，共六种基原。伊贝母来源于新疆贝母(F.walujewii Regel)和伊犁贝母(F.pallidiflora Shrenk)。五种药材中以川贝母最为名贵，有“止咳圣药”之称。由于其价格显著高于其他贝母类药材，市场上以其他贝母类药材掺伪造假的现象频现，复方制剂中代用品投料的情况也是屡见不鲜。但贝母类药材基原复杂，且多为近缘植物，性状相近，且同一种贝母在不同生长条件下形态学变化较大，种内变异复杂，给鉴别带来了极大的困难。由于不同贝母药理作用、功效及适应症不尽相同，临床用药的混乱将直接影响其临床使用的安全性和有效性。因此，阐明不同贝母类药材的化学成分差异，建立专属性强的鉴别方法，对于有效揭示掺伪造假、规范川贝母临床使用具有重要意义。
目前，贝母药材的鉴别方法主要是基于其性状显微特征、化学成分和DNA遗传信息。贝母类药材由于来源于近缘物种，其性状显微特征多为共有特征，难以辨识，而DNA分子鉴定技术实验过程繁琐且其结果高度依赖于实验过程中提取DNA的质量，贝母类药材常因硫熏蒸处理导致其DNA完整性大大降低，提取质量低，严重影响方法的稳定性。此外，通过川贝母特异性条带的存在与否只能判定川贝母的存在而无法检出掺入川贝母中的非川贝母药材。基于质谱技术的植物代谢组学方法则可以避免上述方法的这些局限性，并且由于其优越的灵敏度和分辨率已被广泛应用于解决中药材的真伪鉴别问题。迄今为止，基于代谢组学方法的贝母类药材鉴别研究已有一些报道，但是上述五种贝母类药材的鉴别特征仍不十分明确，尚未建立一种专属有效的鉴别方法以实现五种贝母类药材的鉴别以及正品贝母与掺伪贝母的同时检出。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供贝母类药材的特征图谱构建方法及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
贝母类药材的特征图谱构建方法，包括以下步骤：
步骤1，制备供试品溶液：将贝母类药材粉碎，称取药材粉末，加入氨溶液碱化，再加入二氯甲烷-甲醇混合溶液，称定重量后进行超声处理，再次称定重量，加二氯甲烷-甲醇混合溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，滤液用氮气吹干溶剂，残渣加入甲醇复溶，经0.22μm滤膜过滤，续滤液即为供试品溶液；
步骤2，取步骤1得到的供试品溶液采用UHPLC-QQQ-MS动态MRM模式进行分析，得到贝母类药材的特征图谱，其中：
色谱条件为：色谱柱为Waters CORTECS T3 UPLC柱，150mm×2.1mm，1.6μm；流动相为含10mM甲酸铵的0.1％甲酸溶液A和乙腈B；流速0.2mL/min；柱温30℃；进样体积为2μL；洗脱条件：0～8min，15％～25％B；8～30min，25％～30％B；30～35min，30％～50％B；35～38min，50％～100％B；38～40min，100％B；40～41min，100％～15％B；41～45min，15％B；
质谱条件：毛细管电压为3.5kV；载气压力为35psig；干燥气温度为350℃；干燥气流速为8L/min；鞘气温度为350℃；鞘气流速为11L/min；喷嘴电压为1000V。
进一步地，步骤1中每0.5g药材粉末，加入3mL 25％的氨溶液碱化1h，再加入50mL二氯甲烷-甲醇混合溶液进行超声处理，二氯甲烷-甲醇混合溶液中二氯甲烷和甲醇的体积比为4：1。
进一步地，步骤1中碱化时间为1h，超声处理时间为1h。
进一步地，步骤2中，对于川贝母药材，供试品溶液50μL加入10μL 80μg/mL客西茄碱溶液后再进行分析；对于浙贝母药材，供试品溶液50μL加入10μL 24μg/mL客西茄碱溶液后再进行分析。
进一步地，步骤2中，UHPLC-QQQ-MS动态MRM模式参数如下：
(1)川贝母特征图谱的动态MRM参数
Figure BDA0003166704240000031
(2)平贝母特征图谱的动态MRM参数
Figure BDA0003166704240000032
(3)浙贝母特征图谱的动态MRM参数
Figure BDA0003166704240000033
(4)伊贝母特征图谱的动态MRM参数
Figure BDA0003166704240000041
(5)湖北贝母特征图谱的动态MRM参数
Figure BDA0003166704240000042
进一步地，步骤2中：
对于川贝母类药材，所述特征图谱包括3个特征峰，其中，3号峰客西茄碱为参照峰，获得相对保留时间，所述相对保留时间应在规定值的±5％之内，所述规定值为峰1：0.57、峰2：0.62、峰S：1.00；
对于平贝母类药材，所述特征图谱包括3个特征峰，其中，3号峰贝母素乙为参照峰，获得相对保留时间，所述相对保留时间应在规定值的±5％之内，所述规定值为峰1：0.79、峰2：0.82、峰S：1.00；
对于浙贝母类药材，所述特征图谱包括2个特征峰，其中，1号峰客西茄碱为参照峰，获得相对保留时间，所述相对保留时间应在规定值的±5％之内，所述规定值为峰1：1.00、峰2：1.07；
对于伊贝母类药材，所述特征图谱包括3个特征峰，其中，1号峰伊贝辛为参照峰，获得相对保留时间，所述相对保留时间应在规定值的±5％之内，所述规定值为峰1：1.00、峰2：1.23、峰3：1.35；
对于湖北贝母类药材，所述特征图谱包括3个特征峰，其中，3号峰蒲贝素为参照峰，获得相对保留时间，所述相对保留时间应在规定值的±5％之内，所述规定值为峰1：0.68、峰2：0.73、峰S：1.00。
基于贝母类药材中主要活性成分甾体生物碱类成分，本发明采用非靶向和拟靶向代谢组学结合的策略筛选得到一组贝母类药材鉴别标志物，通过筛选得到的鉴别标志物，利用UHPLC-QQQ-MS动态MRM扫描建立五种贝母类药材MRM特征图谱，可用于实现五种贝母类药材的区分以及掺伪贝母药材中所用非正品贝母的鉴别。该方法相对现有贝母类药材鉴别方法更为专属，且可同时实现正品贝母与掺伪贝母的检出，可在一定程度上完善贝母类药材的质量控制。
附图说明
图1为五种贝母类药材的代表性总离子流图(a)以及20个潜在差异标志物和内标的MRM色谱图(b)。
图2为川贝母特征图谱。其中：a为卷叶贝母；b为暗紫贝母；c为甘肃贝母；d为梭砂贝母；e为太白贝母；f为瓦布贝母。
图3为平贝母特征图谱。
图4为浙贝母特征图谱。
图5为伊贝母特征图谱。
图6为湖北贝母特征图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
一、基于非靶向代谢组学技术的贝母类药材潜在差异标志物筛选
1实验材料
药材主要从药材道地产区种植基地、种植户以及药材市场收集了来自不同产地的五种贝母类药材共计60批次，包括18批次川贝母药材(每个基原各3批)，10批浙贝母药材，10批平贝母药材，12批伊贝母药材以及10批湖北贝母药材，均确定其基原。
2实验方法
2.1样品溶液制备
供试品溶液制备：将所有贝母类药材粉碎后过50目筛。精密称取0.5g药材粉末，加入3mL 25％的氨溶液碱化1h，再加入50mL二氯甲烷-甲醇(4：1，v/v)溶液，称定重量，超声处理1h，再次称定重量，加二氯甲烷-甲醇(4：1，v/v)溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，滤液用氮气吹干溶剂，残渣加入1mL甲醇溶液复溶。经0.22μm滤膜过滤，续滤液作为UHPLC-Q-TOF-MS分析的供试品溶液。
QC样品的制备：将所有贝母药材的提取液各取20μL混合即得。
2.2UHPLC-Q-TOF-MS分析条件
色谱条件：采用Agilent 1290InfinityⅡUPLC系统(Agilent，美国)。色谱柱为Waters CORTECS T3 UPLC柱(150mm×2.1mm,1.6μm)。流动相为含10mM甲酸铵的0.1％甲酸溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脱；流速为0.2mL/min；柱温30℃，进样体积2μL。洗脱条件为：0～8min，15％～25％B；8～30min，25％～30％B；30～35min，30％～50％B；35～40min，50％～60％B；40～43min，60％～100％B；43～45min，100％B；45～46min，100％～15％B；46～50min，15％B。
质谱条件：采用配有电喷雾离子源的Agilent 6545Q-TOF高分辨质谱仪(Agilent，USA)。离子源参数设置如下：毛细管电压为3.5kV；载气压力为35psig；干燥气温度为320℃；干燥气流速为8L/min；鞘气温度为350℃；鞘气流速为11L/min；喷嘴电压为1000V；碎裂电压为120V。质谱检测采用正离子模式，MS1扫描范围为m/z 100～1000Da。
对潜在差异标志物的定性分析采用Agilent 1290UPLC-6530Q-TOF MS系统(Agilent,美国)。采用Target模式采集潜在差异标志物的二级质谱数据，碰撞能量设为20、40、50、60、70、80、90及100eV，以获得更全面的碎片信息。
为监测分析系统的稳定性和重复性，在样品分析之前，连续进样6次QC样本(由所有药材提取液等体积混合而得)使分析系统达到平衡。此外，在整个样品分析过程中利用QC样本随行控制，每进样5次供试品溶液后进样1次QC样本。
2.3数据预处理及模式识别分析
首先使用ProteoWizard 3.0.20165软件中的“MSConvert”程序将原始数据(.d文件)转换成mzXML文件，然后导入R studio进行数据预处理。整个工作流程包括四个步骤：①分子特征提取；②同位素峰和加合离子峰注释；③统计学过滤；④基于QC样本的标准化。
第一个步骤分子特征提取是基于XCMS包完成的，具体包括峰检测(peakdetection)、峰分组(peak grouping)、保留时间校正(alignment)和缺失峰填补(missingpeak filling)。首先，利用CentWave算法(ppm＝15，peakwidth＝20-60s，noise＝5000)进行峰检测。将提取得到的分子特征采用obi-warp算法进行保留时间比对，以校正其保留时间漂移。为了获得更好的校正结果，首先将穿插于整个实验过程的所有QC样本进行保留时间校正，随后基于校正过的QC样本对相邻的数据样本进行对齐。将不同样本中识别到的分子特征进行合并分组，即进行峰分组，采用的方法是peakdensity方法。最后利用fillChromPeaks方法进行缺失峰的填补。第二个步骤是利用R包CAMERA对第一个步骤中识别到的分子特征进行同位素峰和加合离子峰注释，这一步有助于后续对感兴趣的代谢物进行鉴定。将注释后的化合物列表(化合物编号、保留时间、m/z、响应值和化合物注释结果)导出到Excel表格。第三个步骤是基于以下三个统计学规则进行进一步地筛选，保留符合以下三个原则的分子特征：①保留时间90-2400s，m/z 350-900(即甾体生物碱的RT和m/z范围)；②至少在一组样本中缺失值小于50％；③QC样品的RSD值小于30％。最后一步是将经过滤的化合物列表再次导入R studio利用MetNormalizer进行基于QC的标准化。
将生成的代谢物数据矩阵进行Log2变换，然后导入SIMCA-P 14.1，经par scaling处理后进行PCA分析，利用Hotelling’s T2图进行离群点筛选，剔除离群点后进行正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA)，并采用SPSS 22进行非参数检验计算p-value值。此外，利用MetaboAnalyst 5.0(https://www.metabo-analyst.ca/)进行差异倍数变化分析计算fold change值。其中，PCA分析模型用于对采集到的代谢组学数据进行质量评价，而OPLS-DA模型、倍数变化分析和非参数检验用于潜在差异标志物的筛选，选取变量重要性投影(VIP，Variableimportance in the projection)>1.5、fold change>2及p-value<0.01的变量作为潜在差异标志物。
2.4潜在差异标志物的结构鉴定
对潜在差异标志物的结构鉴定，采用以下方法。首先将Target采集模式采集到的潜在差异代谢物结构信息(前体离子和特征碎片离子)与发明人实验室自建贝母甾体生物碱实物数据库(包含约170个化合物)、已发表文献以及METLIN(http://metlin.scripps.edu/)、MassBank(https://massbank.eu/MassBank/)、HMDB(http://www.hmdb.ca/)等网络公开数据库进行比对，鉴定其结构。对于在数据库及文献中均检索不到的化合物，认为可能是新化合物。利用MassHunter 7.0软件中分子式计算器对分子式进行预测，结合发明人实验室前期研究中总结的贝母甾体生物碱的裂解规律和诊断离子，确定其母核结构类型并尝试对其进行结构鉴定。
3结果
五种贝母类药材中川贝母和伊贝母为多基原中药，其差异标志物应为在川贝母或伊贝母中共有且与其他贝母类药材具有显著差异的成分。因此，选择正交偏最小二乘法对每一种贝母类药材进行该药材与剩余四种其他贝母类药材的两组差异分析从而更具针对性地筛选多基原贝母类药材的潜在差异标志物，即将组别分别设置为川贝母(FCB)与非川贝母(N-FCB)、平贝母(FUB)与非平贝母(N-FUB)、浙贝母(FTB)与非浙贝母(N-FTB)、伊贝母(FPB)与非伊贝母(N-FPB)以及湖北贝母(FHB)与非湖北贝母(N-FHB)建立相应的OPLS-DA模型。通过OPLS-DA模型得分图和置换检验结果可知模型分类能力良好且不存在过拟合现象，较为可靠。
基于OPLS-DA模型的S-plot，结合非参数检验和倍数变化分析，筛选VIP>1.5、foldchange>2且p-value<0.01的变量作为潜在差异标志物。为满足川贝母和伊贝母的差异标志物在不同基原的川贝母或伊贝母中均存在，筛去其中在川贝母或伊贝母各基原样品组中出现频次低于80％的化合物。结果如表1所示。
表1潜在差异标志物的具体信息
Figure BDA0003166704240000081
二、基于拟靶向代谢组学技术的贝母类药材差异标志物验证
1实验材料
药材：从药材道地产区种植基地、种植户以及药材市场收集得到来自不同产地的72批川贝母(每个基原10批次及以上)、10批平贝母、10批浙贝母、14批伊贝母以及10批湖北贝母样品，均确定其基原。
2实验方法
2.1样品溶液制备
内标(internal standard，I.S.)溶液的制备：精密称取澳洲茄胺对照品(solasodine，纯度：99.21％，批号：MUST-20052407，成都曼思特生物科技有限公司，中国)适量，加甲醇溶解，摇匀，经稀释制成浓度8μg/mL的溶液，即得。
供试品溶液的制备：将所有贝母类药材粉碎后过50目筛。精密称取0.5g药材粉末，加入3mL 25％的氨溶液碱化1h，再加入50mL二氯甲烷-甲醇(4：1，v/v)溶液，称定重量，超声处理1h，再次称定重量，加二氯甲烷-甲醇(4：1，v/v)溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，滤液用氮气吹干溶剂，残渣加入1mL甲醇溶液复溶。经0.22μm滤膜过滤，续滤液作为供试品溶液。进入UHPLC-QQQ-MS分析前加入等体积的内标溶液。
QC样品的制备：将所有贝母药材的提取液各取20μL混合即得。
2.2UHPLC-QQQ-MS分析条件
色谱条件：色谱柱为Waters CORTECS T3 UPLC柱(150mm×2.1mm，1.6μm)；流动相为含10mM甲酸铵的0.1％甲酸溶液(A)和乙腈(B)；流速0.2mL/min；柱温30℃；进样体积为2μL。洗脱条件：0～8min，15％～25％B；8～30min，25％～30％B；30～35min，30％～50％B；35～38min，50％～100％B；38～40min，100％B；40～41min，100％～15％B；41～45min，15％B。
质谱条件：毛细管电压为3.5kV；载气压力为35psig；干燥气温度为350℃；干燥气流速为8L/min；鞘气温度为350℃；鞘气流速为11L/min；喷嘴电压为1000V。最佳MRM参数利用QC样本优化得到，并列于表2。
表2差异标志物的离子对信息及最优MRM参数
Figure BDA0003166704240000091
Figure BDA0003166704240000101
五种贝母类药材样品的总离子流图以及每个潜在差异标志物对应的MRM色谱图如图1所示，可观察到M5和M19的MRM色谱峰肩峰明显，对应不止一个化合物，因而无法准确定量，不适合作为鉴定标志物，应在后续分析中剔除。对其余18个化合物进行线性、精密度和稳定性考察，结果表明除化合物M6稳定性差，无法作为鉴定标志物外，其他差异标志物线性，精密度，稳定性均良好。
对拟靶向代谢组学分析采集到的峰面积在五组药用贝母之间的差异进行显著性分析。结果表明M12在浙贝母和湖北贝母之间峰强度无显著差异，其余16个差异标志物在其对应的贝母药材中峰强度显著高于其他药材，可作为其鉴定标志物，具体信息见表3。
表3 16个鉴定标志物的具体信息
Figure BDA0003166704240000102
三、UHPLC-QQQ-MS动态MRM模式建立五种贝母类药材的特征图谱
1实验材料
1.1药材
从药材道地产区种植基地、种植户以及药材市场收集得到来自不同产地的72批川贝母(每个基原10批次及以上)、10批平贝母、10批浙贝母、14批伊贝母以及10批湖北贝母样品，均确定其基原。此外，从药材市场分别收集了2批安徽贝母，2批土贝母和1批轮叶贝母，均确定基原。
1.2试剂
客西茄碱(Khasianine，KHA，纯度：99.78％，批号：17091202，成都普菲德生物技术有限公司，中国)；贝母素乙(Verticinone，VER，纯度：99.88％，批号：MUST-20050503，成都曼思特生物科技有限公司，中国)；伊贝辛(Yibeissine，YIB，纯度：98.34％，批号：20082106，成都普菲德生物技术有限公司，中国)；蒲贝素(Puqiedine，PUQ，由发明人实验室分离纯化所得，其结构经高分辨质谱(high-resolution mass spectrometry，HRMS)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance，NMR)确认，用面积归一化法测定，纯度大于98％)。
2实验方法
2.1样品溶液制备
供试品溶液制备：将所有贝母类药材粉碎后过50目筛。精密称取0.5g药材粉末，加入3mL 25％的氨溶液碱化1h，再加入50mL二氯甲烷-甲醇(4：1，v/v)溶液，称定重量，超声处理1h，再次称定重量，加二氯甲烷-甲醇(4：1，v/v)溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，滤液用氮气吹干溶剂，残渣加入1mL甲醇溶液复溶。经0.22μm滤膜过滤，续滤液作为LC-Q-TOF-MS分析的供试品溶液。
取川贝母药材提取液50μL加入10μL 80μg/mL客西茄碱制成川贝母药材供试品溶液；取浙贝母药材提取液50μL加入10μL 24μg/mL客西茄碱制成浙贝母药材供试品溶液；其余贝母类药材直接以提取液作为供试品溶液进行UHPLC-QQQ-MS动态MRM扫描。
2.2色谱质谱条件
色谱条件：色谱柱为Waters CORTECS T3 UPLC柱(150mm×2.1mm，1.6μm)；流动相为含10mM甲酸铵的0.1％甲酸溶液(A)和乙腈(B)；流速0.2mL/min；柱温30℃；进样体积为2μL。洗脱条件：0～8min，15％～25％B；8～30min，25％～30％B；30～35min，30％～50％B；35～38min，50％～100％B；38～40min，100％B；40～41min，100％～15％B；41～45min，15％B。
质谱条件：毛细管电压为3.5kV；载气压力为35psig；干燥气温度为350℃；干燥气流速为8L/min；鞘气温度为350℃；鞘气流速为11L/min；喷嘴电压为1000V。按表4至8所示MRM参数对五种贝母类药材的特征成分进行动态MRM扫描。KHA、VER、YIB和PUQ的最优MRM参数利用其对照品溶液优化得到，各贝母类药材特征离子的MRM参数利用QC样本进行优化。
表4川贝母特征图谱的动态MRM参数
Figure BDA0003166704240000121
表5平贝母特征图谱的动态MRM参数
Figure BDA0003166704240000122
表6浙贝母特征图谱的动态MRM参数
Figure BDA0003166704240000123
表7伊贝母特征图谱的动态MRM参数
Figure BDA0003166704240000131
表8湖北贝母特征图谱的动态MRM参数
Figure BDA0003166704240000132
2.3特征图谱的建立
取72批川贝母、10批平贝母、10批浙贝母、14批伊贝母以及10批湖北贝母药材粉末0.5g，精密称定，制备供试品溶液并按进行UHPLC-QQQ-MS动态MRM扫描，记录各色谱峰的保留时间和峰面积。将采集到的五种贝母类药材的质谱信号和积分结果分别导入国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)中，中位数法生成对照特征图谱并计算相似度。
为建立更具有鉴别意义的贝母类药材特征图谱，选择16个鉴定标志物中差异更为显著，峰强度较高，且在同一药材的不同基原之间具有高度一致性的化合物作为特征峰建立五种贝母类药材的特征图谱。参照峰的选择标准则是与该药材的特征峰结构相似且保留时间较为相近，但不与其他药材的特征峰保留时间有所重叠，以避免对其他药材的特征峰有所掩盖。
川贝母的4个鉴定标志物M1、M2、M3和M4均在川贝母药材中显示出极高的丰度，p-value小于0.0001，但是M4在数十批暗紫贝母和梭砂贝母中峰面积都低于3000，而M3在几乎所有批次的甘肃贝母中峰面积都低于10000甚至低于1000，种间差异明显，因此选择M1、M2作为川贝母的特征峰，另外选择在川贝母药材中不存在且保留时间较为合适的KHA(峰3)作为参照峰(S)。川贝母类药材MRM特征图谱相似度计算结果见表9。72批川贝母的相似度均>0.89，表明不同批次药材之间的化学相似性较高。
表9 72批川贝母药材相似度计算结果
Figure BDA0003166704240000141
选择2个川贝母特征成分M1：m/z 722.4→126.1(RT 13.65min)和M2：m/z 722.4→126.1(RT 14.96min)作为特征峰建立川贝母特征图谱(图2)，六种基原的川贝母药材特征图谱基本一致，梭砂贝母这一基原与其他基原略有不同，多个批次药材的图谱中可见湖北贝母的特征峰，但整体图谱差异不大，相似度较高，可与其他四种贝母类药材明显区分。以峰3(KHA)为参照峰(S)计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表10。峰1和峰2的相对保留时间分别为：0.57(峰1)、0.62(峰2)。六个基原的川贝母药材的相对峰面积差异较大，可能受到基原、产地、生长年限、种植方式等多种因素的影响，但整体化学成分仍表现出与其他四种贝母类药材显著的差异。
表10 72批川贝母药材测定结果(相对保留时间)
Figure BDA0003166704240000151
平贝母的4个特征性差异标志物M7～M10中M8和M9差异更为显著且峰强度较高，因此选择这二者作为特征峰，参照峰(S)选择在平贝母中分布和保留时间均与M8和M9较为相近的VER(峰3)；浙贝母的特征成分M11和M13均在浙贝母药材和其他药材中差异显著，其中M11虽然在浙贝母中峰强度显著高于其他药材，但在其他药材中的峰强度也较高，相对于其他药材的特征峰仍可以被明显观察到，M11会对湖北贝母的特征峰造成干扰和掩盖，因此选择M13作为浙贝母的特征峰，另外选择在浙贝母中不存在且保留时间与M13很相近的KHA(峰2)作为参照峰(S)；伊贝母的鉴定标志物M14、M15和M16中M16在多批卷叶贝母中具有很高的丰度，不适合作为特征峰，M14和M15均基本只在伊贝母中存在，因此选择M14和M15作为特征峰，以丰度和保留时间都较为合适的峰1(YIB)为参照峰(S)；对于湖北贝母的特征成分M17、M18和M20，M20丰度较低不适合作为特征峰，因此选择峰强度较高，差异更为显著的M17和M18作为特征峰，参照峰(S)选择保留时间和丰度都较为合适的峰3(PUQ)。
四种非川贝母类药材的MRM特征图谱见图3至图6。相似度计算结果见表11，10批平贝母药材的相似度均>0.99，14批伊贝母药材的相似度均>0.9，10批湖北贝母药材的相似度均>0.99，表明各批次平贝母、伊贝母和湖北贝母药材之间化学相似度较高，浙贝母中仅FTB-10这一批次相似度稍差一些(0.861)，其余批次药材相似性均较高(>0.9)。
表11 44批非川贝母药材相似度计算结果
Figure BDA0003166704240000161
选择2个平贝母特征成分M8：m/z 522.3→504.2和M9：m/z 506.3→428.3作为特征峰建立平贝母特征图谱，以峰3(VER)为参照峰(S)计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表12。峰1和峰2的相对保留时间分别为：0.79(峰1)、0.82(峰2)。
表12 10批平贝母药材测定结果(相对保留时间)
Figure BDA0003166704240000162
Figure BDA0003166704240000171
选择1个浙贝母特征成分M13：m/z 446.3→428.1作为特征峰建立浙贝母特征图谱，以峰1(KHA)为参照峰(S)计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表13。峰2的相对保留时间为1.07。
表13 10批浙贝母药材测定结果(相对保留时间)
Figure BDA0003166704240000172
选择2个伊贝母特征成分M14：m/z 884.5→884.5和M15：m/z 708.4→708.4作为特征峰建立伊贝母特征图谱，以峰1(YIB)为参照峰(S)计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表14，峰2和峰3的相对保留时间分别为：1.23(峰2)、1.35(峰3)。
表14 14批伊贝母药材测定结果(相对保留时间)
Figure BDA0003166704240000173
选择2个湖北贝母特征成分M17：m/z 784.5→784.5和M18：m/z 754.4→398.2作为特征峰建立湖北贝母特征图谱，以峰3(PUQ)为参照峰(S)计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表15，峰1和峰2的相对保留时间分别为：0.68(峰1)、0.73(峰2)。
表15 10批湖北贝母药材测定结果(相对保留时间)
Figure BDA0003166704240000181
2批安徽贝母、2批土贝母和1批轮叶贝母中均几乎没有检测出五种贝母类药材的特征峰，证明所建立的MRM特征图谱可以将五种贝母类药材与安徽贝母、土贝母及轮叶贝母这几种川贝母的代用品或混淆品区分开，具有一定的专属性。
表16 5批川贝母其他代用品或混淆品的峰面积测定结果
Figure BDA0003166704240000182
ND：未检出
基于贝母类药材中主要活性成分甾体生物碱类成分，本发明采用非靶向和拟靶向代谢组学结合的策略筛选得到一组贝母类药材鉴别标志物，通过筛选得到的鉴别标志物，利用UHPLC-QQQ-MS动态MRM扫描建立五种贝母类药材MRM特征图谱，可用于实现五种贝母类药材的区分以及掺伪贝母药材中所用非正品贝母的鉴别。该方法相对现有贝母类药材鉴别方法更为专属，且可同时实现正品贝母与掺伪贝母的检出，可在一定程度上完善贝母类药材的质量控制。

Claims (7)

1.贝母类药材的特征图谱构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，制备供试品溶液：将贝母类药材粉碎，称取药材粉末，加入氨溶液碱化，再加入二氯甲烷-甲醇混合溶液，称定重量后进行超声处理，再次称定重量，加二氯甲烷-甲醇混合溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，滤液用氮气吹干溶剂，残渣加入甲醇复溶，经0.22μm滤膜过滤，续滤液即为供试品溶液；
步骤2，取步骤1得到的供试品溶液采用UHPLC-QQQ-MS动态MRM模式进行分析，得到贝母类药材的特征图谱，其中：
色谱条件为：色谱柱为Waters CORTECS T3 UPLC柱，150mm×2.1mm，1.6μm；流动相为含10mM甲酸铵的0.1％甲酸溶液A和乙腈B；流速0.2mL/min；柱温30℃；进样体积为2μL；洗脱条件：0～8min，15％→25％B；8～30min，25％→30％B；30～35min，30％→50％B；35～38min，50％→100％B；38～40min，100％B；40～41min，100％→15％B；41～45min，15％B；
质谱条件：毛细管电压为3.5kV；载气压力为35psig；干燥气温度为350℃；干燥气流速为8L/min；鞘气温度为350℃；鞘气流速为11L/min；喷嘴电压为1000V；
UHPLC-QQQ-MS动态MRM模式参数如下：
(1)川贝母特征图谱的动态MRM参数
Figure FDA0003514637290000011
(2)平贝母特征图谱的动态MRM参数
Figure FDA0003514637290000012
(3)浙贝母特征图谱的动态MRM参数
Figure FDA0003514637290000021
(4)伊贝母特征图谱的动态MRM参数
Figure FDA0003514637290000022
(5)湖北贝母特征图谱的动态MRM参数
Figure FDA0003514637290000023
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤1中每0.5g药材粉末，加入3mL25％的氨溶液碱化1h，再加入50mL二氯甲烷-甲醇混合溶液进行超声处理，二氯甲烷-甲醇混合溶液中二氯甲烷和甲醇的体积比为4：1。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤1中碱化时间为1h，超声处理时间为1h。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤2中，对于川贝母药材，供试品溶液50μL加入10μL 80μg/mL客西茄碱溶液后再进行分析；对于浙贝母药材，供试品溶液50μL加入10μL 24μg/mL客西茄碱溶液后再进行分析。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤2中：
对于川贝母类药材，所述特征图谱包括3个特征峰，其中，3号峰客西茄碱为参照峰，获得相对保留时间，所述相对保留时间应在规定值的±5％之内，所述规定值为峰1：0.57、峰2：0.62、峰S：1.00；
对于平贝母类药材，所述特征图谱包括3个特征峰，其中，3号峰贝母素乙为参照峰，获得相对保留时间，所述相对保留时间应在规定值的±5％之内，所述规定值为峰1：0.79、峰2：0.82、峰S：1.00；
对于浙贝母类药材，所述特征图谱包括2个特征峰，其中，1号峰客西茄碱为参照峰，获得相对保留时间，所述相对保留时间应在规定值的±5％之内，所述规定值为峰1：1.00、峰2：1.07；
对于伊贝母类药材，所述特征图谱包括3个特征峰，其中，1号峰伊贝辛为参照峰，获得相对保留时间，所述相对保留时间应在规定值的±5％之内，所述规定值为峰1：1.00、峰2：1.23、峰3：1.35；
对于湖北贝母类药材，所述特征图谱包括3个特征峰，其中，3号峰蒲贝素为参照峰，获得相对保留时间，所述相对保留时间应在规定值的±5％之内，所述规定值为峰1：0.68、峰2：0.73、峰S：1.00。
6.权利要求1至5任一项所述的方法构建得到的特征图谱。
7.权利要求6所述的特征图谱在鉴定贝母类药材中的应用。
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