CN109212103A - 一种高效提取测定贝母中多糖单糖组分的柱前衍生hplc方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效提取测定贝母中多糖单糖组分的柱前衍生HPLC方法。采用90℃条件下在恒温水浴锅中提取多糖，盐酸水解多糖的方式获得多糖水解液，PMP衍生化后，用高效液相色谱进行定性定量检测分析。本发明通过该方法定量分析十种贝母中多糖的组成及含量，具有良好的线性，灵敏度，回收率，重复性和稳定性。不同贝母中均含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖，它们具有相同的单糖组成但不同的比例。充分提高贝母的利用价值。

Description

一种高效提取测定贝母中多糖单糖组分的柱前衍生HPLC方法

技术领域

本发明属于贝母多糖组分提取及分析领域，具体涉及一种贝母多糖的最佳提取方法及柱前衍生化HPLC检测贝母中多糖单糖组分的方法。

背景技术

中药贝母是一种球茎植物，属于百合科(Liliaeeae)，贝母属(Fritillaria L.)，由140种已知物种组成，不仅是中国医学中使用草药的重要成分，而且在亚洲国家具有很大的经济价值。作为一种中药，贝母被列入最早的中药专着“神农本草经”作为止咳药，低痰干咳，阴虚咳嗽，痰中带血，可以促进肺部的分散功能，化痰，缓解咳嗽，解毒和溶解肿块。

近年来，植物来源的多糖由于其独特的化学和物理性质以及免疫调节，抗肿瘤，抗氧化，抗高血糖，抗糖化，抗疲劳生物活性特征而受到持续关注。多糖是贝母重要的活性之一，但关于贝母中多糖的报道甚少。为了更好的开发贝母，探讨贝母中多糖成分的结构和生物活性，为进一步的开发利用贝母提供参考。多糖的活性随结构和现有形式而变化，因此，在提取过程中，结构需要保持完整性，常用的提取方法包括水提，醇沉，酸碱提取，超声提取，冻融和酶解。由于贝母多糖组分的含量和多糖组成对于评价贝母及其相关产品的质量和营养及药用价值尤为关键，迫切需要在各种贝母样品中同时检测和定量单糖的分析方法。

目前多糖分析方法主要有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)和HPLC等。其中HPLC柱前衍生方法已被广泛应用于测定植物各器官多糖组分的含量测定分析，并且得到了较为显著的科研成果。但是目前还缺乏针对贝母多糖提取的高效、环保的工艺流程。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种高效提取测定贝母中多糖单糖组分的柱前衍生HPLC方法；采用90℃条件下在恒温水浴锅中提取多糖，盐酸水解多糖的方式获得多糖水解液，PMP衍生化后，用高效液相色谱进行定性定量检测分析。本发明通过该方法定量分析十种贝母中多糖的组成及含量，具有良好的线性，灵敏度，回收率，重复性和稳定性。不同贝母中均含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖，它们具有相同的单糖组成但不同的比例。充分提高贝母的利用价值。

本发明通过以下步骤实现：

(1)样品处理

a、多糖的提取

将贝母粉碎，过60筛，准确称取10g与盛有100ml无水乙醇的圆底烧瓶进行混合，80℃条件下在恒温水浴锅内冷凝回流一小时以除去脂质，过滤后取滤渣将此操作重复一次，过滤后在常温下干燥30min；取干燥后的滤渣放置在加有300ml蒸馏水的圆底烧瓶中；

热水提取：90℃条件下在恒温水浴锅中提取1.5h，重复两次；抽滤过后收集滤液，合并两次的滤液，使用旋转蒸发仪在59℃下将过滤的上清液蒸发至原始体积的1/3-1/4，将4倍体积的无水乙醇加入多糖浓缩液中，在4℃放置12h，在4℃下离心(15min，8000r/min)、收集得到贝母粗多糖；将粗多糖加入80ml蒸馏水溶解，再加入10ml的Sevag试剂(氯仿：正丁醇(V/V)＝4:1)，剧烈振摇，室温下用离心机离心5min(3500r/min)；将4倍体积的无水乙醇加入取得的上清液中，沉淀用乙醇与丙酮洗涤，再经抽滤，干燥后得到贝母多糖；

b、多糖的水解

盐酸水解：将贝母多糖样品10mg放入10ml的螺纹顶空瓶，加2ml的盐酸溶液(2mol/L)，混匀后密封，然后在恒温水浴锅90℃下水解3小时，冷却后，离心5min，取得上清液多糖水解液，待衍生化；

(2)单糖PMP的衍生化

a、精密称取单糖样品，分别于10ml容量瓶中，加5ml氨水制成混合单糖溶液，精密取200μl，加入200μl PMP甲醇溶液(0.5mol/L)，充分摇匀，在70℃水浴条件下反应30min，冷却室温，再加入适量10％冰乙酸溶液调节至中性，混匀后加1ml氯仿用于超声萃取过量的PMP，弃掉下层液体，此操作重复3次，离心10min(转速8000r)后收集上清液，最后用0.45um滤膜过滤，稀释到一定浓度后待测；

b、精密量取200μl步骤(1)b多糖水解液，加入200μl的氨水溶液，按照上述方法PMP衍生处理后待测；

c、分别精密称取单糖对照品10.0mg放入到10ml容量瓶中加入5ml氨水，配成2mg/ml的混合标准溶液；然后进行稀释得到一系列标准溶液，浓度依次为2μg/ml，200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，20ng/ml，2ng/ml吸取各个标准系列溶液100μl，依照上述方法PMP衍生处理后待测；

(3)用高效液相色谱质谱联用仪：

岛津HPLC-16二元泵输送系统，紫外检测器SPD-16，检测波长：250nm，柱温：30℃，流速：1.0ml/min，色谱柱：Inertsil ODS-3，C18柱(4.6×250mm，5um)，流动相：77％磷酸盐(0.05mol/L，PH＝6.8，)-23％乙腈，进样量：12、色谱条件：色谱柱型号Shim-pack VP-ODS6022748(150L×2.0)，柱温及检测器温度：30℃；流速：0.2mL/min；流动相：5mmol/L乙酸铵-乙腈，梯度洗脱程序：0-5mim17％乙腈；5-10min18％乙腈；10-15min19％乙腈；15-19min21％乙腈；19-25min18％乙腈25-40min15％乙腈；进样量：2μl；

(4)定性定量检测：

取步骤(2)a经PMP衍生处理后6种单糖对照品的混合溶液，于步骤(3)条件下进样测定；

将步骤(2)b经PMP衍生处理后的贝母样品于步骤(3)条件下进样测定；

取步骤(2)c经PMP衍生处理后的一系列不同质量浓度的6种单糖对照品的混合溶液，于高效液相色谱质谱联用仪设定的条件下分别进样测定，重复6次，测定其对应浓度的色谱峰面积，进行线性回归，得到回归方程，相关系数和线性范围、定量限和检测限见表1；用线性方程对样品进行定量，样品中单糖的响应值应在仪器检测的线性范围内；

表1混合单糖标准品的标准曲线、检测限和定量限

注：LOQ为定量限，LOD为检出限。

所述的6种单糖如下表2所列：

表2

编号	名称	简称
			1	甘露糖	Man
2	核糖	Rib
			3	葡萄糖	Glu
4	半乳糖	Gal
			5	木糖	Xyl
6	岩藻糖	Fuc

本发明的有益效果是：

1、本发明获得了最佳的贝母多糖的提取、水解方法，用PMP标记-HPLC法定量分析十种贝母中多糖的组成及含量，具有良好的线性，灵敏度，回收率，重复性和稳定性。不同贝母中均含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖，它们具有相同的单糖组成但不同的比例。

2应用单因素试验和三因素三水平正交试验对热水提取进行条件的优化，运用SPSS Statistics 17.0软件对数据进行处理分析，得出对多糖提取影响顺序是提取温度>原料液体比>提取时间，优化结果：原料液体比1:30，提取温度90℃，提取时间3h(1.5h重复两次)。在最佳热水提取工艺条件下，得出较高的贝母提取率，表明此方法提取率高且稳定性好，可用于贝母多糖的提取。

3建立了不同品种贝母的二维特征图谱，得到6个比较稳定的共有特征峰，但各成分的峰面积有比较大的差异，能为鉴定不同品种的贝母提供科学依据，此分析方法稳定，重现性好。应用HPLC三维特征图谱，对不同体积乙腈流动相进行考察，更一目了然看出不同体积的乙腈的优劣。同样运用HPLC特征图谱，对不同酸水解和不同贝母样品进行考察，使它们之间的差别更清楚，可以更有效的进行区分。

附图说明

图1为HCl水解和TFA水解贝母样品中多糖中单糖的HPLC三维特征图谱

1-HCl水解，2-TFA水解，a-Man，b-Glu，c-Gal，d-Xyl，e-Fuc。

图2为不同水解条件下的单糖峰面积的比较。

图3为(a)原料液体比，(b)提取时间，(c)提取温度对多糖的提取率的影响。

图4为PMP衍生化HPLC法测定单糖标准品的色谱图

1-Man，2-Rib，3-GLU，4-Gal，5-Xyl，6-Fuc。

图5为贝母样品多糖组成的HPLC二维特征图谱S1-浙贝母，S2-平贝母，S3-松贝母，S4-太白贝母，S5-甘肃贝母，S6-湖北贝母，S7藏贝母，S8-川贝母，S9-土贝母，S10-伊贝母，1-PMP，2-Man，3-Glu，4-Gal，5-Xyl，6-Fuc。

图6不同比例的乙腈流动相的单糖标准品HPLC三维特征图谱1-23％乙腈，2-22％乙腈，3-24％乙腈，a-Man，b-Rib，c-Glu，d-Gal，e-Xyl，f-Fuc。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。【实施例1】样品处理

(1)样品处理

a、多糖的提取

将贝母粉碎，过60筛，准确称取10g与盛有100ml无水乙醇的圆底烧瓶进行混合，80℃条件下在恒温水浴锅内冷凝回流一小时以除去脂质，过滤后取滤渣将此操作重复一次，过滤后在常温下干燥30min。取干燥后的滤渣放置在加有300ml蒸馏水的圆底烧瓶中，然后按下述提取方法下进行贝母多糖的提取。

90℃条件下在恒温水浴锅中提取1.5h，重复两次。抽滤过后收集滤液，合并两次的滤液，使用旋转蒸发仪在59℃下将过滤的上清液蒸发至原始体积的1/3-1/4，将4倍体积的无水乙醇加入多糖浓缩液中，在4℃放置12h，在4℃下离心(15min，8000r/min)、收集得到贝母粗多糖。将粗多糖加入80ml蒸馏水溶解，再加入10ml的Sevag试剂(氯仿：正丁醇(V/V)＝4:1)，剧烈振摇，室温下用离心机离心5min(3500r/min)。将4倍体积的无水乙醇加入取得的上清液中，沉淀用乙醇与丙酮洗涤，再经抽滤，干燥后得到贝母多糖。

b、多糖的水解

盐酸水解：将贝母多糖样品10mg放入10ml的螺纹顶空瓶，加2ml的盐酸溶液(2mol/L)，混匀后密封，然后在恒温水浴锅90℃下水解3小时，冷却后，离心5min，取得上清液多糖水解液，待衍生化。

三氟乙酸水解：将多糖样品10mg放入10ml的螺纹顶空瓶，加2ml的三氟乙酸溶液(2mol/L)，混匀后密封，然后在恒温水浴锅100℃下水解3小时，冷却后，离心5min，取得上清液多糖水解液，待衍生化。

c、PMP衍生化

单糖PMP的衍生化，按照先前的方法进行一些修改。精密称取单糖样品10mg，分别于10ml容量瓶中，加5ml氨水制成混合单糖标准溶液，精密取200μl，加入200μl PMP甲醇溶液(0.5mol/L)，充分摇匀，在70℃水浴条件下反应30min，冷却室温，再加入适量10％冰乙酸溶液调节至中性，混匀后加1ml氯仿用于超声萃取过量的PMP，弃掉下层液体，此操作重复3次，离心10min(转速8000r)后收集上清液，最后用0.45μm滤膜过滤，稀释到一定浓度后待测。

精密量取200μl多糖水解液，加入200μl的氨水溶液，按照上述方法PMP衍生处理后待测。

分别精密称取单糖对照品10.0mg放入到10ml容量瓶中加入5ml氨水，配成2mg/ml的混合标准溶液；然后进行稀释得到一系列标准溶液，浓度依次为2μg/ml，200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，20ng/ml，2ng/ml吸取各个标准系列溶液100μl，依照上述方法PMP衍生处理后待测。

【实施例2】多糖优化提取及单糖组分柱前衍生HPLC分析研究

1、仪器与试剂：

样品：如下表3所示

表3样品来源

数据分析软件：SPSS Statistics 17.0,《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012,130723版本)。

单糖标准品：D-葡萄糖，D-木糖，D-半乳糖，L-核糖，D-甘露糖和D-岩藻糖购自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,USA)。

乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、冰乙酸(分析纯)、无水乙醇(分析纯)、丙酮(分析纯)、氯仿(分析纯)(天津欧博凯化工有限公司)，三氟乙酸、正丁醇、氨水、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠(分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司)，盐酸(分析纯，信阳市化学试剂厂)，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)(国药集团化学试剂有限公司)，纯净水(宁波丹斯顿环保科技责任有限公司)。

岛津HPLC-16高效液相色谱仪(岛津仪器有限公司)，DZF-6050型真空干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，EE-60恒温水浴锅(温州艾格器械有限公司)，FA2004B电子分析天平(上海越平科学仪器有限公司)，KQ3200DB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，RE-5299旋转蒸发仪(郑州市亚荣仪器有限公司)，80-2电动离心机(常州翔天实验仪器厂)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵(郑州博科仪器设备有限公司)。

2、不同提取方法的选择

将干燥的贝母粉末进行热水水浴锅提取和超声辅助提取，按照上述方法实验，最终得到不同的贝母多糖，通过不同的提取方法得到多糖的提取率和多糖含量。如下表4，由多糖提取率和含量可知，热水提取的效率高于超声辅助提取，由于贝母中含有较多的淀粉，超声波提取法是采用超声波辅助溶剂进行提取，声波产生高速、强烈的空化效应和搅拌作用，破坏植物药材的细胞，提取后贝母粉末变成胶体的形状，多糖较难抽滤，对多糖的提取率和含量是一种损失，具有较低的多糖提取率，而且超声提取对多糖的结构和生物活性的影响还有待进一步的研究；热水回流提取是多糖提取的一种传统的方法，不需要特殊的设备，被广泛用于多糖的提取，通过对提取工艺的优化，实现高效的提取率、节能、绿色的特点。综合考虑，优先选择热水回流提取。

由表4得出浙贝母和土贝母的多糖提取率和含量较多，藏贝母的的多糖含量最少。

表4不同提取方法多糖提取率和多糖含量

3、不同酸水解方法的选择

考察HCl和TFA对贝母多糖的水解，各贝母多糖峰面积的对比的柱状图图2，可以初步得出TFA水解中甘露糖的峰面积较高，但从图1HCl水解和TFA水解多糖中单糖的HPLC三维特征图谱，TFA水解峰信号较差于盐酸水解，而且在实验操作过程中TFA的水解条件是110℃，4h。综合考虑实验条件，结合成本，原料来源及用量，环保低耗等因素，本发明选择HCl作为水解溶剂。

4、热水提取条件的单因素及正交试验

单因素试验结果分析：

以浙贝母为例，原料液体比，提取温度和提取时间被认为是横坐标，多糖提取率是纵坐标。根据不同的条件绘制趋势线。如图3单因素试验结果所示。

由图3(a)得出，多糖的提取率随原料液体比增加而增加，1:30后趋于稳定，提取溶剂的增加，提取液的多糖浓度降低，同时考虑后续的蒸发浓缩能量的消耗和工作效率的延长，选择1:20，1；30,1；40进行3个水平的优化。

由图3(b)可以看出，3-5h提取率变化不大，6h提取率出现下降的趋势，可能随着时间的推移，环境中的微生物把多糖分解，降低了多糖的含量。故选择2h，3h，4h 3个优化水平。

由图3(c)可以看出，多糖的提取率随温度的升高而增大，考虑到温度高影响多糖的活性，而且考虑到低耗高产的理念，选择70℃，80℃，90℃作为优化水平。

正交试验结果分析:

正交试验因素水平见表5，结果与分析见表6及表7。

表5正交试验因素水平表

表6正交试验结果与分析

表7主体间效应的检验

由正交试验得出最优提取方案是a2，b3，c3，即原料液体比1:30，提取时间3h，提取温度90℃。由表5主体间效应的检验得出，校正模型F值为12.492，P＝为0.076，因此所用模型有统计学意义。原料液体比可见P＝0.078，在显著性水平α＝0.05无统计学意义，在α＝0.10有统计学意义，及因子a在显著性水平α＝0.05不显著，在α＝0.10显著。同理可得，提取时间在α＝0.05，α＝0.10都不显著，提取温度在α＝0.05，α＝0.10都显著。各因素对多糖提取率影响主次顺序c提取温度>a原料液体比>b提取时间

5、HPLC分析条件:

岛津HPLC-16二元泵输送系统，紫外检测器SPD-16，检测波长：250nm，柱温：30℃，流速：1.0ml/min，色谱柱：Inertsil ODS-3，C18柱(4.6×250mm，5um)，流动相：77％磷酸盐(0.05mol/L，PH＝6.8，)-23％乙腈，进样量：12、色谱条件：色谱柱型号Shim-pack VP-ODS6022748(150L×2.0)，柱温及检测器温度：30℃；流速：0.2mL/min；流动相：5mmol/L乙酸铵-乙腈，梯度洗脱程序：0-5mim17％乙腈；5-10min18％乙腈；10-15min19％乙腈；15-19min21％乙腈；19-25min18％乙腈25-40min15％乙腈；进样量：2μl。

6、方法学验证结果分析

通过测定线性，精密度，重复性(以松贝母为例)，稳定性(以松贝母为例)和加标回收率(以松贝母为例)来评估HPLC方法贝母多糖定量分析的意义(表8、表9)。HPLC方法在贝母样品的整个浓度范围(1-200μg/mL)内表现出优异的线性，相关系数(R2)大于0.999。单糖标准品的LOD和LOQ在0.071-0.471μg/ml范围内，表明在目前的HPLC条件下该方法的灵敏度很好。HPLC的选择性和灵敏度允许贝母的定量。

表8单糖标准品的方法学验证结果

表9加标回收率结果

7、贝母特征图谱的建立

将不同品种不同产地的贝母分别按照上诉方法制备供试品溶液，对贝母样品进行测定，不同贝母各成分均在18min内洗脱出来，图4为单糖标准品的色谱峰，将所得的各色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012,130723版本)中进行数据处理，以S1为参照图谱，时间窗宽度为0.1，平均数法，将其他样品的色谱峰与参照图谱进行自动匹配，生成贝母样品对照特征图谱，如图5。

对10种贝母特征图谱分析，发现1-6号峰为所有样品溶液色谱峰中共有色谱峰，且峰面积和分离度较大，因此确定此6个色谱峰为贝母特征图谱的共有峰。以S1为对照谱图，计算共有峰的保留时间和峰面积的RSD，结果见表10。由结果可得共有峰的保留时间的RSD为0.05-0.42，峰面积的RSD为24.91-45.77，由此峰面积的RSD说明不同种类的贝母中多糖组分的含量相差很大，含量不一，尤其岩藻糖的含量最低。

表10 6个共有特征峰的保留时间和峰面积的RSD

8、特征图谱的相似度评价

计算10种贝母样品的色谱图和对照谱图之间的相似度，结果见下表11，十种贝母的相似度均大于0.90，说明本实验收集的贝母样品之间质量稳定，不同贝母品种之间多糖组分相似，均含有Man,Glu,Gal,Xyl,Fuc，在贝母质量方面能够发挥积极的作用。

表11贝母多糖样品的相似度

9、含量结果分析

十种贝母中均含有甘露糖，葡萄糖，半乳糖，木糖，岩藻糖，含量不一，岩藻糖在各贝母中的含量最低，川贝母中甘露糖的含量最大，其它九种贝母都是葡萄糖的含量较多，而且浙贝母和土贝母是含糖量最高的。结果如表12。

表12贝母多糖样品的摩尔比，保留时间

10、流动相的选择

流动相的选择是多糖中单糖进行定量的关键，本实验选择了两种流动相进行了比较，5mmol/L的乙酸铵-乙腈和0.05mol/L的磷酸盐-乙腈，乙酸铵-乙腈做流动相时，有严重后拖尾现象，峰与峰之间间隔时间长，峰面积较小；磷酸盐-乙腈做流动相时，这些现象会很好的改善。对不同体积的乙腈进行考察，进行梯度洗脱时，峰型宽窄不一，出峰时间是12.5min，需要40min，时间过于太长；当15％的乙腈进行洗脱时，16.2min才出峰，分离度和峰型都不好，而且单糖的响应值太小，总的出峰时间是26min；22％乙腈进行洗脱时，甘露糖和PMP分不开，总的出峰时间是23min；当24％乙腈进行洗脱时，甘露糖和核糖的分离效果不好，峰型太窄，总的出峰时间是16min；当乙腈的体积比是23％时，总体都有所改善。如下图6不同流动相的HPLC三维特征图谱所示。

11、贝母的颗粒粒度对多糖提取的影响

贝母的主要成分是淀粉，颗粒粒度的大小对多糖的提取也是重要原因之一，粒度越小得到的多糖的提取率逐渐增大，但超过90目，细胞壁被破坏，多糖更容易提取出来，但考虑到操作过程中的粒度太小，提取过程中淀粉变成胶体状，难转移，不易过滤，会对多糖造成损失；粒度太大，会造成提取不充分，多糖的提取率较低。本研究以大浙贝母为例，通过实验优化，选择60目的原料，使实验更容易进行和获得更高的提取率。如下表13所示。

表13原料粒度对贝母多糖提取率的影响

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (1)

1.一种高效提取测定贝母中多糖单糖组分的柱前衍生HPLC方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)样品处理

a、多糖的提取

将贝母粉碎，过60筛，准确称取10g与盛有100ml无水乙醇的圆底烧瓶进行混合，80℃条件下在恒温水浴锅内冷凝回流一小时以除去脂质，过滤后取滤渣将此操作重复一次，过滤后在常温下干燥30min；取干燥后的滤渣放置在加有300ml蒸馏水的圆底烧瓶中；

热水提取：90℃条件下在恒温水浴锅中提取1.5h，重复两次；抽滤过后收集滤液，合并两次的滤液，使用旋转蒸发仪在59℃下将过滤的上清液蒸发至原始体积的1/3-1/4，将4倍体积的无水乙醇加入多糖浓缩液中，在4℃放置12h，在4℃下离心(15min，8000r/min)、收集得到贝母粗多糖；将粗多糖加入80ml蒸馏水溶解，再加入10ml的Sevag试剂(氯仿：正丁醇(V/V)＝4:1)，剧烈振摇，室温下用离心机离心5min(3500r/min)；将4倍体积的无水乙醇加入取得的上清液中，沉淀用乙醇与丙酮洗涤，再经抽滤，干燥后得到贝母多糖；

b、多糖的水解

盐酸水解：将贝母多糖样品10mg放入10ml的螺纹顶空瓶，加2ml的盐酸溶液(2mol/L)，混匀后密封，然后在恒温水浴锅90℃下水解3小时，冷却后，离心5min，取得上清液多糖水解液，待衍生化；

(2)单糖PMP的衍生化

a、精密称取单糖样品，分别于10ml容量瓶中，加5ml氨水制成混合单糖溶液，精密取200μl，加入200μl PMP甲醇溶液(0.5mol/L)，充分摇匀，在70℃水浴条件下反应30min，冷却室温，再加入适量10％冰乙酸溶液调节至中性，混匀后加1ml氯仿用于超声萃取过量的PMP，弃掉下层液体，此操作重复3次，离心10min(转速8000r)后收集上清液，最后用0.45um滤膜过滤，稀释到一定浓度后待测；

b、精密量取200μl步骤(1)b多糖水解液，加入200μl的氨水溶液，按照上述方法PMP衍生处理后待测；

c、分别精密称取单糖对照品10.0mg放入到10ml容量瓶中加入5ml氨水，配成2mg/ml的混合标准溶液；然后进行稀释得到一系列标准溶液，浓度依次为2μg/ml，200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，20ng/ml，2ng/ml吸取各个标准系列溶液100μl，依照上述方法PMP衍生处理后待测；

(3)用高效液相色谱质谱联用仪：

岛津HPLC-16二元泵输送系统，紫外检测器SPD-16，检测波长：250nm，柱温：30℃，流速：1.0ml/min，色谱柱：Inertsil ODS-3，C18柱(4.6×250mm，5um)，流动相：77％磷酸盐(0.05mol/L，PH＝6.8，)-23％乙腈，进样量：12、色谱条件：色谱柱型号Shim-pack VP-ODS6022748(150L×2.0)，柱温及检测器温度：30℃；流速：0.2mL/min；流动相：5mmol/L乙酸铵-乙腈，梯度洗脱程序：0-5mim17％乙腈；5-10min18％乙腈；10-15min19％乙腈；15-19min21％乙腈；19-25min18％乙腈25-40min15％乙腈；进样量：2μl；

(4)定性定量检测：

取步骤(2)a经PMP衍生处理后6种单糖对照品的混合溶液，于步骤(3)条件下进样测定；

将步骤(2)b经PMP衍生处理后的贝母样品于步骤(3)条件下进样测定；

取步骤(2)c经PMP衍生处理后的一系列不同质量浓度的6种单糖对照品的混合溶液，于高效液相色谱质谱联用仪设定的条件下分别进样测定，重复6次，测定其对应浓度的色谱峰面积，进行线性回归，得到回归方程，相关系数和线性范围、定量限和检测限见表1；用线性方程对样品进行定量，样品中单糖的响应值应在仪器检测的线性范围内；

表1混合单糖标准品的标准曲线、检测限和定量限

注：LOQ为定量限，LOD为检出限。