CN112505222A - 一种测定黄芪药材中单糖组成与含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于黄芪药材中单糖组成与含量测量技术领域，具体为一种测定黄芪药材中单糖组成与含量的方法，该测定黄芪药材中单糖组成与含量的方法的具体步骤如下：S1：黄芪多糖的提取；S2：黄芪多糖的水解；S3：单糖对照品的衍生化；S4：样品的衍生化；S5：设定色谱条件；S6：线性关系考察；S7：稳定性试验；S8：重复性试验；S9回收率与精密度试验；S10：黄芪多糖中单糖组成及含量测定。该方法的灵敏度高、分离效果好，线性范围宽、检出限低，精密度、重复性、稳定性和回收率良好，操作简便，结果稳定可靠，可用于黄芪药材中多糖的单糖组成分析及定量测定，也可为药材植物多糖组成研究提供参考。

Description

一种测定黄芪药材中单糖组成与含量的方法
技术领域
本发明涉及黄芪药材中单糖组成与含量测量技术领域，具体为一种测定黄芪药材中单糖组成与含量的方法。
背景技术
黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，前者主产东北,后者主产区在山西和内蒙、陕北等地。作为常用传统中药之一，黄芪味甘、性平，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌等功效。目前研究认为黄芪的主要化学成分为黄酮类、皂苷类、多糖类，具有调节免疫、保护心血管与神经系统、抗肿瘤、护肝等药理作用。其中黄芪多糖、皂苷、黄酮等化合物具有较强的生物活性。临床主要用于气虚乏力、食少便溏、中气下陷、久泻脱肛、血虚萎黄、内热消渴等病。
作为大宗药材之一，黄芪药材在临床上使用较广，已有研究表明不同生长年限黄芪药材的成分含量存在较大差异，其中黄酮类及皂苷类成分含量随生长年限增加而呈逐年升高，但多糖类成分含量随生长年限增加变化趋势不一。黄芪药材中的黄芪多糖是一种重要的生物活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、抑制人肝癌细胞增殖、调节免疫等作用。黄芪多糖作为黄芪的主要活性成分因其非专属性和可控性不强等问题，未能作为质控指标评价黄芪种质资源。近年来对黄芪多糖的探索研究也成为了医学界的研究热点，多糖的生物活性离不开其单糖组成，而多糖的单糖组成及其含量测定是进行多糖质量控制的重要依据，目前研究者多利用紫外分光光度法测定总多糖量作为药材品质评价的指标,然而该指标缺乏专属性特征。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定黄芪药材中单糖组成与含量的方法，以解决上述背景技术中提出的目前研究者多利用紫外分光光度法测定总多糖量作为药材品质评价的指标,然而该指标缺乏专属性特征的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种测定黄芪药材中单糖组成与含量的方法，该测定黄芪药材中单糖组成与含量的方法的具体步骤如下：
S1：黄芪多糖的提取：称取黄芪药材约20g，加10倍量水，100℃下提取2h，过滤，滤渣再加5倍量水提取30min，滤液合并浓缩至50mL，再加入1/5体积savage试剂，除去蛋白质，离心，8000r/min，10min，除去不溶物，再加无水乙醇至90％，静置12h，离心，8000r/min，10min，干燥，即得黄芪多糖，精密称取黄芪多糖0.25g，定容于5mL量瓶中备用，得到黄芪多糖供试液；
S2：黄芪多糖的水解：取S1的黄芪多糖供试液1mL，加入2mol/L三氟乙酸溶液2mL，110℃条件下，水解6h，取出，放冷，水浴蒸干，残渣加入甲醇1mL搅拌，蒸干以去除三氟乙酸，重复3次，残渣加水溶解，转移至5mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得多糖水解溶液；
S3：单糖对照品的衍生化：分别精密称取甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖对照品2.5mg，置于10mL量瓶中加水溶解，并加至刻度，即得混合对照品溶液，取混合对照品溶液100μL与0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液50μL及0.3mol/LNaOH溶液50μL混合，充分振摇，70℃水浴条件下反应30min，冷却至室温，加入0.3mol/LHCl50μL进行中和，加入1mL氯仿萃取，离心，弃去有机层，重复萃取3次，得上层水液，经0.22μm微孔滤膜滤过，备用；
S4：样品的衍生化：精密吸取S2中多糖水解液400μL与0.5mol/LPMP甲醇溶液200μL及0.3mol/LNaOH溶液200μL混合，充分振摇，70℃水浴条件下反应30min，冷却至室温，加入0.3mol/LHCl200μL进行中和，加入400μL氯仿萃取，离心，弃去有机层，重复萃取3次，得上层水液，经0.22μm微孔滤膜滤过，备用；
S5：设定色谱条件：采用SymmetryC18色谱柱，流动相采用磷酸盐缓冲溶液–乙腈；柱温35℃；体积流量1.0mL/min；检测波长245nm；
S6：线性关系考察：将梯度浓度的单糖标准溶液按S3的步骤衍生，以各单糖组分的色谱峰峰面积为纵坐标y与相应浓度为横坐标x绘制标准曲线；
S7：稳定性试验：取S4中黄芪多糖水解衍生化后的溶液，分别放置0、4、8、12、16、24h，按照S5放入色谱条件进样6次，记录峰面积；
S8：重复性试验：精密取黄芪多糖6份，每份100mg，经衍生化处理后按S5色谱条件进样，记录峰面积；
S9回收率与精密度试验：在超纯水中分别加入高中低3个水平的混标，按照S3的步骤进行处理，各加标水平平行测定6次，计算其回收率和相对标准偏差；
S10：黄芪多糖中单糖组成及含量测定：将单糖的混合对照品图谱与不同生长年限黄芪多糖色谱图进行对照，并根据单糖峰面积计算多糖中单糖的含量，可以确定黄芪多糖由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
通过本方案的研究，有助于完善黄芪的质量控制与开发利用，该方法的灵敏度高、分离效果好，线性范围宽、检出限低，精密度、重复性、稳定性和回收率良好，操作简便，结果稳定可靠，可用于黄芪药材中多糖的单糖组成分析及定量测定，也可为药材植物多糖组成研究提供参考。
附图说明
图1为本发明不同生长年限黄芪多糖和单糖对照品衍生物的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
实施例：
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种测定黄芪药材中单糖组成与含量的方法，该测定黄芪药材中单糖组成与含量的方法的具体步骤如下：
选材：收集来源于山西省、甘肃省及内蒙古的黄芪药材9批，详细信息见表1。黄芪药材按2020版《中国药典》一部黄芪鉴别要求鉴定为黄芪药材的干燥根。
无水葡萄糖(YG8510，翼飞雪生物科技有限公司)、鼠李糖(YR8080，翼飞雪生物科技有限公司)，半乳糖(YG8010，翼飞雪生物科技有限公司)，甘露糖(YG8420，翼飞雪生物科技有限公司)，半乳糖醛酸(B21894，上海源叶生物科技有限公司)，阿拉伯糖(YA8500，翼飞雪生物科技有限公司)，均为色谱纯。三氟乙酸(TFA)(上海麦克林生化科技有限公司)，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)(上海源叶生物科技有限公司)，均为分析纯；乙腈(德国Merck公司)为色谱纯，水为纯净水(娃哈哈)，其余试剂均为分析纯。
Waterse2695高效液相色谱仪，包括四元泵、柱温箱、自动进样器和Empower工作站(美国Waters公司)；RE-52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；HWS-24型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；BSA-124S型分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；X-30R高速冷冻离心机(美国贝克曼库尔特公司)。
表1 黄芪药材表
Figure BDA0002798594380000051
S1：黄芪多糖的提取：称取黄芪药材约20g，加10倍量水，100℃下提取2h，过滤，滤渣再加5倍量水提取30min，滤液合并浓缩至50mL，再加入1/5体积savage试剂(氯仿：正丁醇＝4:1)除去蛋白质(下层)，离心，8000r/min，10min，除去不溶物，再加无水乙醇至90％，静置12h，离心，8000r/min，10min，干燥，即得黄芪多糖，称取黄芪多糖0.25g，精密称定，定容于5mL量瓶中备用，得到黄芪多糖供试液；
S2：黄芪多糖的水解：取S1的黄芪多糖供试液1mL，加入2mol/L三氟乙酸(TFA)溶液2mL，110℃条件下，水解6h，取出，放冷，水浴蒸干，残渣加入甲醇1mL搅拌，蒸干以去除TFA，重复3次，残渣加水溶解，转移至5mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得多糖水解溶液；
S3：单糖对照品的衍生化：分别精密称取甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖对照品适量(2.5mg)，置于10mL量瓶中加水溶解，并加至刻度，即得混合对照品溶液。取该溶液100μL与0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液50μL及0.3mol/LNaOH溶液50μL混合，充分振摇，70℃水浴条件下反应30min，冷却至室温，加入0.3mol/LHCl50μL进行中和，加入1mL氯仿萃取，离心，弃去有机层，重复萃取3次，得上层水液，经0.22μm微孔滤膜滤过，备用；
S4：样品的衍生化：精密吸取多糖水解液400μL与0.5mol/LPMP甲醇溶液200μL及0.3mol/LNaOH溶液200μL混合，充分振摇，70℃水浴条件下反应30min，冷却至室温，加入0.3mol/LHCl200μL进行中和，加入400μL氯仿萃取，离心，弃去有机层，重复萃取3次，得上层水液，经0.22μm微孔滤膜滤过，备用；
S5：色谱条件：SymmetryC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)(美国Waters公司)；流动相：磷酸盐缓冲溶液(pH6.8)–乙腈(84:16)；柱温35℃；体积流量1.0mL/min；检测波长245nm；
S6：线性关系考察：将梯度浓度的单糖标准溶液按S3的步骤衍生，在优化的实验条件下进行测定。以各单糖组分的色谱峰峰面积为纵坐标(y)与相应浓度为横坐标(x)绘制标准曲线，如表2所示，6种单糖的相关系数均大于0.999，说明线性关系良好；
表2 回归方程和线性范围
Figure BDA0002798594380000061
Figure BDA0002798594380000071
S7：稳定性试验：取黄芪多糖水解衍生化后的溶液，分别放置0、4、8、12、16、24h，按照2.5项下色谱条件进样6次，记录峰面积。结果，甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面积的RSD分别为1.37％、1.24％、0.95％、1.77％、1.12％、1.62％，表明衍生化后的黄芪多糖水解液在24h内稳定性良好；
S8：重复性试验：精密取黄芪多糖样品6份，每份约100mg，经衍生化处理后按2.5项下色谱条件进样，记录峰面积。结果，甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面积的RSD分别为1.71％、0.97％、1.69％、1.22％、1.51％、1.68％，表明本方法重复性良好；
S9：回收率与精密度试验：在超纯水中分别加入高中低3个水平的混标，按照2.3项下方法进行处理，各加标水平平行测定6次，计算其回收率和相对标准偏差，见表3。结果表明，6种单糖的加标回收率为98.92％～105.85％，相对标准偏差均小于3％，说明该检测方法准确度好、精密度高。
表3 单糖组分的空白加标回收率(n＝6)
Figure BDA0002798594380000072
Figure BDA0002798594380000081
Figure BDA0002798594380000091
S10：黄芪多糖中单糖组成及含量测定：将单糖混合对照品图谱与不同生长年限黄芪多糖色谱图进行对照(见图1，图1中A图为2年生，B图为3年生，C图为4年生，D图为单糖对照品；1.PMP；2.甘露糖；3.鼠李糖；4.半乳糖醛酸；5.葡萄糖；6.半乳糖；7.阿拉伯糖)，并根据单糖峰面积计算多糖中单糖的含量(见表4)，可以确定黄芪多糖由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成。其中葡萄糖在黄芪多糖中各单糖所占比例最高，而3年生药材中黄芪多糖中葡萄糖含量较2年生及4年生黄芪药材高，黄芪多糖中单糖物质的量比见表5。
表4 不同生长年限黄芪药材中黄芪多糖的单糖含量测定结果
Figure BDA0002798594380000092
Figure BDA0002798594380000101
表5 不同生长年限黄芪药材中黄芪多糖中单糖的物质的量比(n＝3)
Figure BDA0002798594380000102
Figure BDA0002798594380000111
由表4、5可以看出，单糖组分的含量在0.5～280.0mg/g之间，各批次黄芪多糖均含有甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖6种单糖，且6种组分的平均物质的量比为：甘露糖∶鼠李糖：半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖＝1.00：1.07：9.04：79.72：8.87：21.44。单糖的含量和组成比例有一定差异，说明药材的产地对黄芪多糖的单糖组成有一定影响。
不同产地黄芪多糖均具有相似的单糖组成，即甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖及阿拉伯糖，其中葡萄糖为主要成分，但各单糖含量及组成比例有明显差异。因此，基于黄芪多糖的特征单糖组分分析研究，有助于完善黄芪的质量控制与开发利用。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明；因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (1)

1.一种测定黄芪药材中单糖组成与含量的方法，其特征在于：该测定黄芪药材中单糖组成与含量的方法的具体步骤如下：
S1：黄芪多糖的提取：称取黄芪药材约20g，加10倍量水，100℃下提取2h，过滤，滤渣再加5倍量水提取30min，滤液合并浓缩至50mL，再加入1/5体积savage试剂，除去蛋白质，离心，8000r/min，10min，除去不溶物，再加无水乙醇至90％，静置12h，离心，8000r/min，10min，干燥，即得黄芪多糖，精密称取黄芪多糖0.25g，定容于5mL量瓶中备用，得到黄芪多糖供试液；
S2：黄芪多糖的水解：取S1的黄芪多糖供试液1mL，加入2mol/L三氟乙酸溶液2mL，110℃条件下，水解6h，取出，放冷，水浴蒸干，残渣加入甲醇1mL搅拌，蒸干以去除三氟乙酸，重复3次，残渣加水溶解，转移至5mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得多糖水解溶液；
S3：单糖对照品的衍生化：分别精密称取甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖对照品2.5mg，置于10mL量瓶中加水溶解，并加至刻度，即得混合对照品溶液，取混合对照品溶液100μL与0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液50μL及0.3mol/LNaOH溶液50μL混合，充分振摇，70℃水浴条件下反应30min，冷却至室温，加入0.3mol/LHCl50μL进行中和，加入1mL氯仿萃取，离心，弃去有机层，重复萃取3次，得上层水液，经0.22μm微孔滤膜滤过，备用；
S4：样品的衍生化：精密吸取S2中多糖水解液400μL与0.5mol/LPMP甲醇溶液200μL及0.3mol/LNaOH溶液200μL混合，充分振摇，70℃水浴条件下反应30min，冷却至室温，加入0.3mol/LHCl200μL进行中和，加入400μL氯仿萃取，离心，弃去有机层，重复萃取3次，得上层水液，经0.22μm微孔滤膜滤过，备用；
S5：设定色谱条件：采用SymmetryC18色谱柱，流动相采用磷酸盐缓冲溶液–乙腈；柱温35℃；体积流量1.0mL/min；检测波长245nm；
S6：线性关系考察：将梯度浓度的单糖标准溶液按S3的步骤衍生，以各单糖组分的色谱峰峰面积为纵坐标y与相应浓度为横坐标x绘制标准曲线；
S7：稳定性试验：取S4中黄芪多糖水解衍生化后的溶液，分别放置0、4、8、12、16、24h，按照S5放入色谱条件进样6次，记录峰面积；
S8：重复性试验：精密取黄芪多糖6份，每份100mg，经衍生化处理后按S5色谱条件进样，记录峰面积；
S9回收率与精密度试验：在超纯水中分别加入高中低3个水平的混标，按照S3的步骤进行处理，各加标水平平行测定6次，计算其回收率和相对标准偏差；
S10：黄芪多糖中单糖组成及含量测定：将单糖的混合对照品图谱与不同生长年限黄芪多糖色谱图进行对照，并根据单糖峰面积计算多糖中单糖的含量，可以确定黄芪多糖由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成。
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