CN107884486A - 一种测定黄芪多糖的单糖组成的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定黄芪多糖的单糖组成的方法，其包括如下步骤：1)制备黄芪多糖水解样品；2)制备混合单糖标准品；3)柱前衍生化处理：分别将步骤1)所得黄芪多糖水解样品和步骤2)所得混合单糖水解标准品与0.5mol/L的PMP甲醇溶液及0.3mol/L的NaOH溶液混合，充分振摇，75℃水浴条件下反应35min，后冷却至室温，加入0.3mol/L的盐酸进行中和，再加入氯仿进行萃取，离心，弃去有机层，重复萃取2～3次，得上层水液，经0.22μm微孔滤膜过滤，分别得黄芪多糖衍生化处理溶液和混合单糖衍生化处理溶液，备用；4)高效液相色谱法分析：确定黄芪多糖的单糖组成及其含量。本发明灵敏度高、样品用量少、稳定性好，实现了操作简单且较低成本地检测黄芪多糖中的单糖组成。
Description
技术领域
本发明涉及测定方法领域，特别涉及测定多糖的单糖组成。
背景技术
中药多糖具有增强免疫力、抗应激、抗病毒等广泛的生物学活性，已在畜牧兽医领域得到广泛的应用，也是新兽药研究的热点。但目前的现状是兽用中药多糖的质量控制标准的不完善(仅检测总糖含量)，致使一些假、劣的多糖产品屡屡出现，危害养殖业的发展。因此开展兽用中药多糖质量控制的研究，是创制新型多糖药物或饲料添加剂的重要前提。一般来说，多糖所具有的药理活性往往与其单糖组成是密切相关的，因此在检测总糖含量时还需对其单糖组成进行定性分析。由于多糖和单糖都不具有紫外吸收，无法直接对其进行测定。在用高效液相色谱法分析多糖组成及其含量时，一般采用凝胶色谱柱与示差折光检测器或蒸发光散射检测器等仪器，这些方法不仅灵敏度低、基线噪音大、柱温对结果影响较大、测定过程中易发生单糖转化并且这些仪器与色谱柱价格高昂。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种测定黄芪多糖的单糖组成的方法，其实现了方法简单且低成本地对黄芪多糖的单糖组成进行检测。
本发明所采取的技术方案是：一种测定黄芪多糖的单糖组成的方法，其包括如下步骤：
1)制备黄芪多糖水解样品：取黄芪精制多糖与2mol/L的三氟乙酸溶液混合后于90℃下水浴处理10h，用4mol/L的氢氧化钠溶液中和至中性，离心去上清液得黄芪多糖水解样品，备用；
2)制备混合单糖标准品：取D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖、D-核糖、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖和阿拉伯糖共溶于水得混合单糖标准品，备用；
3)柱前衍生化处理：分别将步骤1)所得黄芪多糖水解样品和步骤2)所得混合单糖水解标准品与0.5mol/L的PMP甲醇溶液及0.3mol/L的NaOH溶液混合，充分振摇，75℃水浴条件下反应35min，后冷却至室温，加入0.3mol/L的盐酸进行中和，再加入氯仿进行萃取，离心，弃去有机层，重复萃取2～3次，得上层水液，经0.22μm微孔滤膜过滤，分别得黄芪多糖衍生化处理溶液和混合单糖衍生化处理溶液，备用；
4)高效液相色谱法分析：通过高效液相色谱法分别对步骤3)所得的黄芪多糖衍生化处理溶液和混合单糖衍生化处理溶液的色谱图进行对比及分析，确定黄芪多糖的单糖组成及其含量。
具体地，步骤1)水解过程中的温度及水浴处理时间尤为重要，本发明经意外发现黄芪多糖在90℃下水浴处理10h后可充分水解，以提高后期检测数据的准确性。同理，步骤3)柱前衍生化处理过程中，将限定在75℃，水浴处理时间限定在35min，使得黄芪多糖衍生化处理更为充分。
作为上述方案的进一步改进，步骤1)中所述的黄芪精制多糖为黄芪粗多糖经大孔树脂纯化浓缩后经真空冷冻干燥所得。
作为上述方案的进一步改进，步骤1)中所述黄芪粗多糖为取药用黄芪按料液重量比为1：16、浸提时间3h、浸提温度90℃、提取次数2次，后经抽滤、浓缩提取液，无水乙醇沉淀浓缩10h，取沉淀物经真空干燥所得。具体地，本发明对药用黄芪浸提防风粗多糖过程得料液比、浸提时间、浸提温度及浸提次数的限定大大提高了浸提效率，避免了不必要的原材料浪费。
步骤4)中高效液相色谱法是将所述黄芪多糖衍生化处理溶液和混合单糖衍生化处理溶液分别经色谱柱分离，用磷酸盐缓冲溶液与乙腈溶液按重量份比为85：15的混合液进行洗脱，控制柱温40℃，流速1mL/min，进样量20μL检测波长254nm。
本发明的有益效果是：本发明通过建立PMP柱前衍生化-高效液相色谱法对黄芪多糖的单糖组分及含量进行分析，其灵敏度高、样品用量少、稳定性好，本发明的方法准确可靠，能够很好地分离各单糖组分，实现了操作简单且较低成本地检测黄芪多糖中的单糖组成。
附图说明
本发明中图1为实施例1中混合单糖衍生化处理溶液的高效液相分析色谱图；
本发明中图2为实施例1中黄芪多糖衍生化处理溶液的高效液相分析色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。实施例
一种测定黄芪多糖的单糖组成的方法，其包括如下步骤：
1)制备黄芪粗多糖：取药用黄芪按料液重量比为1：16、浸提时间3h、浸提温度90℃、提取次数2次，后经抽滤、浓缩提取液，无水乙醇沉淀浓缩10h，取沉淀物经真空干燥，得黄芪粗多糖；
2)制备黄芪精制多糖：取步骤1)所得黄芪粗多糖经大孔树脂纯化浓缩后经真空冷冻干燥，得黄芪精制多糖；
3)制备黄芪多糖水解样品：取黄芪精制多糖50mg与2mol/L的三氟乙酸溶液2mL混合后于90℃下水浴处理10h，用4mol/L的氢氧化钠溶液中和至中性，离心去上清液得黄芪多糖水解样品，备用；
4)制备混合单糖标准品：取D-甘露糖12mg、鼠李糖13.3mg、D-葡萄糖12mg、D-核糖12mg、D-半乳糖醛酸10.9mg、D-半乳糖11.5mg和阿拉伯糖11.2mg定容于25mL容量瓶中，得混合单糖标准品，备用；
5)柱前衍生化处理：分别将100μL步骤1)所得黄芪多糖水解样品和100μL步骤2)所得混合单糖水解标准品与50μL 0.5mol/L的PMP甲醇溶液及50μL 0.3mol/L的NaOH溶液混合，充分振摇，75℃水浴条件下反应35min，后冷却至室温，加入50μL 0.3mol/L的盐酸进行中和，再加入1mL氯仿进行萃取，离心，弃去有机层，重复萃取2次，得上层水液，经0.22μm微孔滤膜过滤，分别得黄芪多糖衍生化处理溶液和混合单糖衍生化处理溶液，备用；
6)高效液相色谱法分析：将所述黄芪多糖衍生化处理溶液和混合单糖衍生化处理溶液分别经Wondasil C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱分离，用磷酸盐缓冲溶液与乙腈溶液按重量份比为85：15的混合液进行洗脱，控制柱温40℃，流速1mL/min，进样量20μL检测波长254nm，进样测定后各色谱峰得到良好的分离，其中混合单糖衍生化处理溶液的高效液相分析色谱图如附图1，黄芪多糖衍生化处理溶液的高效液相分析色谱图如附图2。将混合单糖衍生化处理溶液分别进样1、2、4、6、8、10μL，用峰面积对各单糖的质量浓度回归，线性结果及线性回归方程如下表1所示。取重复性试验中黄芪多糖衍生化处理溶液连续6次进样测定的各单糖峰面积结果，求出平均值，代入各单糖的线性回归方程中求出个单糖摩尔比，结果如下表2所示，计算得出黄芪多糖中D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的摩尔比为92：24110：714：877。
表1单糖标准曲线方程
表2黄芪多糖中各单糖的摩尔比计算结果
上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。
Claims (4)
1.一种测定黄芪多糖的单糖组成的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备黄芪多糖水解样品：取黄芪精制多糖与2mol/L的三氟乙酸溶液混合后于90℃下水浴处理10h，用4mol/L的氢氧化钠溶液中和至中性，离心去上清液得黄芪多糖水解样品，备用；
2)制备混合单糖标准品：取D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖、D-核糖、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖和阿拉伯糖共溶于水得混合单糖标准品，备用；
3)柱前衍生化处理：分别将步骤1)所得黄芪多糖水解样品和步骤2)所得混合单糖水解标准品与0.5mol/L的PMP甲醇溶液及0.3mol/L的NaOH溶液混合，充分振摇，75℃水浴条件下反应35min，后冷却至室温，加入0.3mol/L的盐酸进行中和，再加入氯仿进行萃取，离心，弃去有机层，重复萃取2～3次，得上层水液，经0.22μm微孔滤膜过滤，分别得黄芪多糖衍生化处理溶液和混合单糖衍生化处理溶液，备用；
4)高效液相色谱法分析：通过高效液相色谱法分别对步骤3)所得的黄芪多糖衍生化处理溶液和混合单糖衍生化处理溶液的色谱图进行对比及分析，确定黄芪多糖的单糖组成及其含量。
2.根据权利要求1所述的一种测定黄芪多糖的单糖组成的方法，其特征在于：步骤1)中所述的黄芪精制多糖为黄芪粗多糖经大孔树脂纯化浓缩后经真空冷冻干燥所得。
3.根据权利要求2所述的一种测定黄芪多糖的单糖组成的方法，其特征在于：步骤1)中所述黄芪粗多糖为取药用黄芪按料液重量比为1：16、浸提时间3h、浸提温度90℃、提取次数2次，后经抽滤、浓缩提取液，无水乙醇沉淀浓缩10h，取沉淀物经真空干燥所得。
4.根据权利要求1所述的一种测定黄芪多糖的单糖组成的方法，其特征在于：步骤4)中高效液相色谱法是将所述黄芪多糖衍生化处理溶液和混合单糖衍生化处理溶液分别经色谱柱分离，用磷酸盐缓冲溶液与乙腈溶液按重量份比为85：15的混合液进行洗脱，控制柱温40℃，流速1mL/min，进样量20μL检测波长254nm。
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| CN109682903A (zh) * | 2019-02-19 | 2019-04-26 | 天津赛诺制药有限公司 | 一种注射用黄芪多糖分子量的检测方法 |
| CN110658264A (zh) * | 2018-06-28 | 2020-01-07 | 成都中医药大学 | 一种九制黄精的质量检测方法 |
| CN112505222A (zh) * | 2020-11-25 | 2021-03-16 | 南京中医药大学 | 一种测定黄芪药材中单糖组成与含量的方法 |
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