CN115684438A - 一种基于q-tof-ms的姜半夏中掺伪姜虎掌的鉴定方法 - Google Patents
一种基于q-tof-ms的姜半夏中掺伪姜虎掌的鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于Q‑TOF‑MS的姜半夏中掺伪姜虎掌的鉴定方法，包括(1)标准样品溶液制备；(2)提取标准样品的化合物分子特征，以MFE算法寻找化合物；(3)标准样品特征化合物分析及建模；(4)待测样品溶液制备；(5)待测样品特征化合物提取；(6)结果调取与预测。本发明基于Q‑TOF采集质谱数据，通过MPP软件对炮制后的半夏和虎掌的差异成分进行研究，为半夏炮制品的掺伪检测提供可靠的依据，为中药质量评价提供有力保障。
Description
技术领域
本发明涉及半夏鉴别技术领域，特别是涉及一种基于Q-TOF-MS的姜半夏中掺伪姜虎掌的鉴定方法。
背景技术
半夏为天南星科半夏属植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥块茎，具有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结的功效；用于湿痰寒痰，呕吐反胃，梅核气等。虎掌作为最常见的半夏伪品，又名掌叶半夏，为天南星科半夏属植物掌叶半夏PinelliapedatisectaSchott的干燥块茎，个小者常冒充半夏使用，两者外观极为相似，经加工炮制后更加难以鉴别。
半夏和虎掌为同科同属植物，因此所含化学成分的种类极其相近，已有文献报道通过显微鉴别、光谱色谱分析、PCR技术并结合统计学分析，建立半夏及其伪品的指纹谱图谱，寻找DNA特征片段等方法加以区别研究，但均专属性不强，且不能就掺伪进行定量检测。有研究报道水麦冬酸是虎掌具有而半夏不含的特征性成分，可以采用液相色谱法加以鉴别，可是聂黎行等(聂黎行，康帅，张南平，等.高分离度快速液相色谱-三重串联四极杆质谱快速检查半夏和虎掌中水麦冬酸[J].药物评价研究，2018，41(9)：1640-1643.)采用液相-三重四极杆质谱联用仪对11批半夏和7批虎掌研究证实，半夏中也含有少量水麦冬酸，水麦冬酸并非虎掌的特征性成分，且炮制后虎掌的水麦冬酸也会消失。因此只研究药材的成分差异而不研究其炮制品，存在一定的局限性。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种基于Q-TOF-MS的姜半夏中掺伪姜虎掌的鉴定方法，基于Q-TOF采集质谱数据，通过MPP软件对炮制后的半夏和虎掌的差异成分进行研究，为半夏炮制品的掺伪检测提供可靠的依据，为中药质量评价提供有力保障。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于Q-TOF-MS的姜半夏中掺伪姜虎掌的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)标准样品溶液制备：分别等量称取来源确切的姜半夏、姜虎掌样品，分别加入甲醇后浸渍、超声处理，冷却至室温，离心、微孔滤膜过滤，各取续滤液，得到各标准样品溶液；
(2)提取标准样品的化合物分子特征，以MFE算法寻找化合物：采用液相色谱-飞行时间质谱联用仪对步骤(2)制备的标准样品溶液进样，采集总离子流数据；通过Profinder软件对总离子流数据进行处理，通过离子精确质量数、同位素簇峰、同位素簇峰间隔与理论值比较的方法，寻找样品中化合物，并将结果生成含有化合物信息的CEF格式文件；
(3)标准样品特征化合物分析及建模：将生成的CEF格式文件导入MPP软件中，进行姜半夏和姜虎掌差异化合物统计分析；创建最小二乘判别分析模型，并检查PLS-DA模型图和分组的拟合度R2预测能力Q2，建立MPP模型；
(4)待测样品溶液制备：待测样品中加入甲醇后浸渍、超声处理，冷却至室温，离心、微孔滤膜过滤，续滤液即为待测样品溶液；
(5)待测样品特征化合物提取：采用液相色谱-飞行时间质谱联用仪对待测样品溶液进样，采集总离子流数据，进行特征化合物提取；
(6)结果调取与预测：将步骤(5)提取的待测样品特征化合物信息调入MPP模型中进行预测。
标准样品溶液的具体制备方法为：分别称取标准样品各0.5g，分别加入75v/v％甲醇20mL，浸渍、超声处理，冷却至室温，离心后经微孔滤膜过滤，分别取续滤液，作为标准样品溶液。
标准样品为10种姜半夏和10种姜虎掌。
步骤(2)中，设置化合物寻找条件，最小绝对响应值≥5000counts，化合物保留时间偏差±0.3min，质量偏差±(15ppm+2.0mDa)，化合物元素组成主要为C、H、O、N、S、Cl。
步骤(3)中，采用MPP软件进行姜半夏和姜虎掌差异化合物统计分析的具体步骤为：(a)根据采集数据信息将文件分成姜半夏和姜虎掌两组，再次对样品中寻找到的化合物进行过滤，设置离子最小绝对响应值≥500000counts，保留时间偏差≤0.15min，质量偏差±(15ppm+2.0mDa)，化合物归一化百分偏移值为75％，选择中位值加权各化合物来表示样品偏离程度；(b)对过滤后的数据进行差异分析，建立统计分析实验数据；(c)通过MPP软件的主成分分析方法，建立基于化合物差异的两组数据的差异性，并寻找到两组之间的差异化合物。
步骤(b)中，软件设置参数为：化合物至少在9个样品有可接受的值，显著性分析中，选择T-检验最大P＜0.01，最小倍数变化值FC＜2.0。
待测样品溶液的具体制备方法为：称取待测样品0.5g，加入75v/v％甲醇20mL，浸渍、超声处理，冷却至室温，离心后经微孔滤膜过滤，取续滤液作为待测样品溶液。
标准样品与待测样品的特征化合物提取时，液相色谱条件均为：4.6mm×150mm、3μm的Agilent InfinityLabPoroshell 120EC-C18色谱柱；流动相为甲醇-5mmol乙酸铵梯度洗脱；流速为0.4mL/min；柱温为40℃；进样体积为3μL；
质谱条件均为：电喷雾离子化；以氮气为载气，载气流速8L/min，载气温度300℃，鞘气流速11L/min，鞘气温度350℃，碎裂电压135V；离子模式为正离子。
本发明的有益效果是：通过高分辨液质联用仪和MPP统计软件对半夏及其伪品虎掌的姜制炮制品的化学成分进行分析，找到姜虎掌特有的成分，选择含量较高的作为姜半夏掺姜虎掌的鉴别成分，并建立具有一定预测性的数据模型，从而作为高鉴别正确率的掺伪鉴别的手段，应用于半夏炮制品掺伪检测，为中药质量评价提供有力保障。
附图说明
图1为标准样品姜半夏的总离子流图(A)及MFE寻找到化合物叠加图(B)；
图2为标准样品姜虎掌的总离子流图(A)及MFE寻找到化合物叠加图(B)；
图3为姜半夏和姜虎掌两组标准样品的PCA分析结果(A代表姜半夏，B代表姜虎掌)；
图4为待测样品为100％姜半夏的模型预测结果；
图5为待测样品为100％姜虎掌的模型预测结果；
图6为待测样品为第一种掺20％姜虎掌的姜半夏的模型预测结果；
图7为待测样品为第二种掺20％姜虎掌的姜半夏的模型预测结果；
图8为待测样品为第三种掺20％姜虎掌的姜半夏的模型预测结果；
图9为待测样品为第一种掺50％姜虎掌的姜半夏的模型预测结果；
图10为待测样品为第二种掺50％姜虎掌的姜半夏的模型预测结果；
图11为待测样品为第三种掺50％姜虎掌的姜半夏的模型预测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步描述：
实施例
仪器：
1260型高效液相色谱(配有在线脱气系统、二元泵、自动进样器、柱温箱)、6530型飞行时间质谱仪(配有ESI电喷雾电离源)、Agilent Masshunter Workstation DataAcquisition B.09.00数据采集软件、Qualitative Workflows B.08.00软件、Profinder10.0软件、MassProfilerProfessional15.1软件(美国安捷伦公司)；XS206十万分之一电子天平(瑞士METTLERTOLEDO公司)；超声清洗仪(上海汉克科学仪器有限公司，SK3310HP)。
试剂
甲醇(质谱级，Merck公司)；甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙酸铵(质谱级，CNW)；水由Milli-Q系统纯化制得。
提取溶剂及方式选择
考察了超声处理和回流处理方式，发现超声和回流效果相当，为了方便选择超声处理方式，同时考察了超声处理时间，分别考察了30、60、120min，结果30min处理基本可以提取完全。考察了提取溶剂的选择，采用甲醇、乙醇与水不同比例进行考察，结果选择75％甲醇作为提取溶剂。
流动相选择
考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1％甲酸溶液、甲醇-5mmoL乙酸铵等系统，按照不同比例梯度洗脱，结果甲醇-5mmoL乙酸铵流动相系最优。
质谱条件的优化
通过正负离子监测模式比较，正离子得到的化合物较多，故采用正离子模式。考虑到半夏中小分子化合物会比较多，通过考察碎裂电压(Fragmentor)175、150、135V，结果135V条件得到化合物信号较高，因此选择135V。
基于Q-TOF-MS的姜半夏中掺伪姜虎掌的鉴定方法，具体包括以下步骤：
(1)标准样品溶液制备：
分别称取取来源确切的姜半夏、姜虎掌样品各0.5g，分别加入75v/v％甲醇20mL，浸渍30min，超声处理30min，冷却至室温，经5000r/min离心10min，0.45μm微孔滤膜过滤，分别取续滤液，作为标准样品溶液。
标准样品包括10种姜半夏和10种姜虎掌，具体信息见表1。生半夏[Pinelliaternata(Thunb.)Breit.]委托浙江震元中药饮片有限公司从甘肃、山西、浙江、河北、贵州等地购买，并由该公司加工成姜半夏；虎掌(PinelliapedatisectaSchott)主要从河北购买，并委托浙江震元中药饮片有限公司按照姜半夏方法加工制成姜虎掌。
表1
(2)提取标准样品的化合物分子特征，以MFE算法寻找化合物：
采用液相色谱-飞行时间质谱联用仪对上述制备的标准样品溶液进样，采集总离子流数据；
液相色谱条件为：4.6mm×150mm、3μm的Agilent InfinityLabPoroshell 120EC-C18色谱柱；流动相为甲醇-5mmol乙酸铵梯度洗脱；流速为0.4mL/min；柱温为40℃；进样体积为3μL。流动相梯度洗脱程序见表2。
表2
质谱条件为：电喷雾离子化；以氮气为载气，载气流速8L/min，载气温度300℃，鞘气流速11L/min，鞘气温度350℃，碎裂电压135V；离子模式为正离子。
通过Profinder软件对总离子流数据进行处理，设置化合物寻找条件，最小绝对响应值≥5000counts，化合物保留时间偏差±0.3min，质量偏差±(15ppm+2.0mDa)，化合物元素组成为C、H、O、N、S、Cl等。通过离子精确质量数、同位素簇峰、同位素簇峰间隔与理论值比较的方法，寻找样品中化合物，并将结果生成含有化合物信息(包括质荷比、保留时间、精确分子量、同位素簇峰、价态数等)的CEF格式文件。
(3)标准样品特征化合物分析及建模：
将生成的CEF格式文件导入MPP软件，对标准样品进行姜半夏和姜虎掌差异化合物统计分析。首先根据采集数据信息将文件分成姜半夏和姜虎掌两组(每组10个样本)，再次对样品中寻找到的化合物进行过滤，设置离子最小绝对响应值≥500000counts，保留时间偏差≤0.15min，质量偏差±(15ppm+2.0mDa)，化合物归一化百分偏移值为75％，选择中位值加权各化合物来表示样品偏离程度。然后对过滤后的数据根据化合物出现的频率、响应值、可变性、特征性等进行差异分析，软件设置参数为：化合物至少在9个样品有可接受的值，显著性分析中，选择T-检验最大P＜0.01，最小倍数变化值FC＜2.0，从而建立统计分析实验数据。通过MPP软件的主成分分析方法，建立基于化合物差异的两组数据的差异性，并寻找到两组之间的差异化合物。
基于上述对姜半夏和姜虎掌差异化合物统计分析结果，创建最小二乘判别分析(PLS-DA)模型，并检查PLS-DA模型图和分组的拟合度R2预测能力Q2，从而建立MPP模型。
(4)待测样品溶液制备：称取100％姜半夏待测样品0.5g，分别加入75v/v％甲醇20mL，浸渍30min，超声处理30min，冷却至室温，经5000r/min离心10min，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为待测样品溶液。
(5)待测样品特征化合物提取：采用液相色谱-飞行时间质谱联用仪对待测样品溶液进样，采集总离子流数据，进行特征化合物提取；采用与标准样品采集信息、提取化合物完全一致的技术参数。
液相色谱条件为：4.6mm×150mm、3μm的Agilent InfinityLabPoroshell 120EC-C18色谱柱；流动相为甲醇-5mmol乙酸铵梯度洗脱；流速为0.4mL/min；柱温为40℃；进样体积为3μL。流动相梯度洗脱程序见表3。
表3
质谱条件为：电喷雾离子化；以氮气为载气，载气流速8L/min，载气温度300℃，鞘气流速11L/min，鞘气温度350℃，碎裂电压135V；离子模式为正离子。
(6)结果调取与预测：将步骤(5)提取的待测样品特征化合物信息调入MPP模型中进行预测。
按照上述方法分别进行100％姜虎掌待测样品、3种掺20％姜虎掌的姜半夏待测样品、3种掺50％姜虎掌的姜半夏待测样品的鉴别。
结果分析
通过Profinder软件的MFE算法在每个样品中找到2000余个化合物，姜半夏和姜虎掌中找到的化合物如图1、2所示。
通过MPP软件FindUniqueEntities分析，同时满足P＜0.01，FC＜2.0寻找到的特征化合物为121个，其中姜半夏特有的化合物12个，姜虎掌特有的化合物99个。
通过PCA可见姜半夏和姜虎掌两组样本差异明显，见图3，从图中可以看出，PC1权重78.5％，PC2权重4.89％。
通过查找特征化合物分析(FindUniqueEntities)，发现姜半夏特有成分12个，姜虎掌特有成分99个，结合Profinder软件分析结果，通过安捷伦公司提供的TCM-database化合物数据库，并结合文献(翟兴英，张凌，李冰涛，等.采用UPLC-Q-TOF-MS/MS分析半夏药材中的化学成分[J].中国实验方剂学杂志，2019，25(7)：173-183.)及(弓建红，王俊敏，张振凌，等.虎掌(掌叶半夏)的化学成分及药理活性研究进展[J].河南科学，2020，38(3)：386-396.)，初步对化合物进行鉴定，结果详见表4。
表4
注：表3中“/”：数据库或文献未匹配化合物；序号10～14：姜虎掌特有且信号较高的。
通过对已知的姜半夏、姜虎掌，以及姜半夏中掺入一定比例(20％、50％)姜虎掌对模型的预测能力进行预测，结果显示图4为100％姜半夏，样品(箭头所指点)预测显示在姜半夏的模型范围内；图5为100％姜虎掌，样品(箭头所指点)预测显示在姜虎掌的模型范围内；而图6、7、8为掺20％姜虎掌的姜半夏(3种样品)，样品(箭头所指点)预测偏离姜半夏的模型范围，说明掺入一定姜虎掌的样品偏离数据库模型，说明所建立的姜半夏模型有一定的代表性；图9、10、11为掺50％姜虎掌的姜半夏(3种样品)，可以看到样品(箭头所指点)有较大偏离。综上所述所建立的姜半夏和姜虎掌的模型有一定的代表性，也说明通过建立模型预测样品的掺伪有可操作性。
本发明寻找姜虎掌中特有的成分是检测是否掺伪的有效手段，同时还能根据色谱峰的大小确定大致的掺伪比例。本发明中收集了20个样本以Q-TOF采集数据，通过PCA分析，找到了姜半夏和姜虎掌的差异成分，并通过Profinder软件筛查响应高的5个化合物(见表3序号10～14)，可以作为下一步提取制备参考，从而更加有效地对姜半夏中掺姜虎掌情况进行检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于Q-TOF-MS的姜半夏中掺伪姜虎掌的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)标准样品溶液制备：分别等量称取来源确切的姜半夏、姜虎掌样品，分别加入甲醇后浸渍、超声处理，冷却至室温，离心、微孔滤膜过滤，各取续滤液，得到各标准样品溶液；
(2)提取标准样品的化合物分子特征，以MFE算法寻找化合物：采用液相色谱-飞行时间质谱联用仪对步骤(2)制备的标准样品溶液进样，采集总离子流数据；通过Profinder软件对总离子流数据进行处理，通过离子精确质量数、同位素簇峰、同位素簇峰间隔与理论值比较的方法，寻找样品中化合物，并将结果生成含有化合物信息的CEF格式文件；
(3)标准样品特征化合物分析及建模：将生成的CEF格式文件导入MPP软件中，进行姜半夏和姜虎掌差异化合物统计分析；创建最小二乘判别分析模型，并检查PLS-DA模型图和分组的拟合度R2预测能力Q2，建立MPP模型；
(4)待测样品溶液制备：待测样品中加入甲醇后浸渍、超声处理，冷却至室温，离心、微孔滤膜过滤，续滤液即为待测样品溶液；
(5)待测样品特征化合物提取：采用液相色谱-飞行时间质谱联用仪对待测样品溶液进样，采集总离子流数据，进行特征化合物提取；
(6)结果调取与预测：将步骤(5)提取的待测样品特征化合物信息调入MPP模型中进行预测。
2.如权利要求1所述一种基于Q-TOF-MS的姜半夏中掺伪姜虎掌的鉴定方法，其特征在于，标准样品溶液的具体制备方法为：分别称取标准样品各0.5g，分别加入75v/v％甲醇20mL，浸渍、超声处理，冷却至室温，离心后经微孔滤膜过滤，分别取续滤液，作为标准样品溶液。
3.如权利要求1或2所述一种基于Q-TOF-MS的姜半夏中掺伪姜虎掌的鉴定方法，其特征在于，标准样品为10种姜半夏和10种姜虎掌。
4.如权利要求1所述一种基于Q-TOF-MS的姜半夏中掺伪姜虎掌的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中，设置化合物寻找条件，最小绝对响应值≥5000counts，化合物保留时间偏差±0.3min，质量偏差±(15ppm+2.0mDa)，化合物元素组成主要为C、H、O、N、S、Cl。
5.如权利要求1所述一种基于Q-TOF-MS的姜半夏中掺伪姜虎掌的鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中，采用MPP软件进行姜半夏和姜虎掌差异化合物统计分析的具体步骤为：(a)根据采集数据信息将文件分成姜半夏和姜虎掌两组，再次对样品中寻找到的化合物进行过滤，设置离子最小绝对响应值≥500000counts，保留时间偏差≤0.15min，质量偏差±(15ppm+2.0mDa)，化合物归一化百分偏移值为75％，选择中位值加权各化合物来表示样品偏离程度；(b)对过滤后的数据进行差异分析，建立统计分析实验数据；(c)通过MPP软件的主成分分析方法，建立基于化合物差异的两组数据的差异性，并寻找到两组之间的差异化合物。
6.如权利要求5所述一种基于Q-TOF-MS的姜半夏中掺伪姜虎掌的鉴定方法，其特征在于，步骤(b)中，软件设置参数为：化合物至少在9个样品有可接受的值，显著性分析中，选择T-检验最大P＜0.01，最小倍数变化值FC＜2.0。
7.如权利要求1所述一种基于Q-TOF-MS的姜半夏中掺伪姜虎掌的鉴定方法，其特征在于，待测样品溶液的具体制备方法为：称取待测样品0.5g，加入75v/v％甲醇20mL，浸渍、超声处理，冷却至室温，离心后经微孔滤膜过滤，取续滤液作为待测样品溶液。
8.如权利要求1所述一种基于Q-TOF-MS的姜半夏中掺伪姜虎掌的鉴定方法，其特征在于，标准样品与待测样品的特征化合物提取时，液相色谱条件均为：4.6mm×150mm、3μm的Agilent InfinityLabPoroshell 120EC-C18色谱柱；流动相为甲醇-5mmol乙酸铵梯度洗脱；流速为0.4mL/min；柱温为40℃；进样体积为3μL；
质谱条件均为：电喷雾离子化；以氮气为载气，载气流速8L/min，载气温度300℃，鞘气流速11L/min，鞘气温度350℃，碎裂电压135V；离子模式为正离子。
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