CN104297406B - 一种广谱鉴定β-受体激动剂类药物的方法 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明提供一种广谱鉴定β-受体激动剂类药物的方法，涉及药物检测领域。通过应用超高效液相色谱-四级杆-轨道阱高分辨质谱设备，得到与β-受体激动剂类药物特征性化学结构相关联的质谱信号，根据β-受体激动剂质谱信号特征和解离规律，构建β-受体激动剂类药物特征图谱信息库。通过质谱采集的高通量数据与特征图谱库数据比对，鉴定样品中存在的已知药物，并且通过对质谱信号的模式识别，预测样品可能存在的新型未知药物。最终形成β-受体激动剂类药物广谱性鉴定方法，实现对未知样品中β-受体激动剂类药物的快速鉴定。本发明提供的方法具有良好的社会效益和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及药物检测领域，具体的，涉及一种广谱性鉴定β-受体激动剂类药物的方法。
背景技术
兽药、添加剂及有害化合物残留是影响我国动物性产品安全的重要因素，国内外在养殖环节非法使用β-受体激动剂类药物(俗称“瘦肉精”)已经造成多起食品安全事件，成了困扰世界范围内食品安全的难题。它不仅威胁着人类的健康，具有致畸、致突变和致癌等作用；同时严重影响畜禽产品的出口贸易，造成巨大的经济损失。我国政府从1997年起就已明令禁止在动物养殖过程中使用“瘦肉精”，经过多年治理，成效显著。但受利益驱使，少部分不法经营者仍在违法使用，“瘦肉精”问题始终难以根除，对我国的食品安全构成极大威胁。
监管技术落后是“瘦肉精”屡禁不止的一个重要因素。如目前检测β-受体激动剂类药物的技术通常只能同时监测十几种，但已有报道或研究的β-受体激动剂类药物却有几十种甚至上百种，而且不断有新合成的类似物出现，而现有的方法根本检测不到，这样会使很多有类似效果的β-受体激动剂类药物被掺杂在饲料中进入动物体内，严重制约了“瘦肉精”监管工作的开展。
另外，现有技术(如ELISA、HPLC-MS/MS或GC-MS)在检测饲料、组织、血液或尿液中是否存在β-受体激动剂类药物药物时，遇到两方面的限制，一方面如ELISA、试纸条等快速检测技术一次只能实现对已知一种或两种药物的筛选，阳性样品还需用质谱进一步确证和定量；另一方面如用HPLC-MS/MS或GC-MS检测未知样品中是否含有β-受体激动剂类药物时，现有技术的做法是需要将所有已知的β-受体激动剂类药物的标准品全部穷尽检测，再与检测结果一一对比筛选其中是否含有β-受体激动剂或含有哪种β-受体激动剂，而这类药物标准品种类多、价格昂贵，且不易获得，这无疑增加了检测的工作量和难度。所以，亟待开发出一种不需要检测标准品，即能够实现在动物饲料及动物产品中广谱性筛查和确证β-受体激动剂类药物是否存在的一步完成法。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明提供一种广谱鉴定β受体激动剂类药物的方法以弥补现有技术的上述不足。
本发明首先提供了β-受体激动剂类药物质谱库的构建方法，包括以下步骤：
1)对β-受体激动剂类药物进行一级二级质谱扫描；所述β-受体激动剂类药物包括标准品药物和非标准品药物；
2)将扫描得到的所有β-受体激动剂类药物的一级、二级质谱信息导入软件中，建立基于β-受体激动剂类药物一级二级质谱库。
上述质谱库的构建方法还包括将现有技术中已知的其他β-受体激动剂类药物的质谱信息添加入质谱库中。
其中步骤1)采用超高效液相色谱-四级杆-轨道阱高分辨质谱仪UPLC-Q-Extractivesystem(UPLC,WatersACQUITYUPLCH-ClassBioSystem；MS,ThermoFisherQ–Exactive)进行扫描。
步骤1)质谱扫描的条件为：
a)检测方式：正离子模式
b)离子源：电喷雾离子源
c)喷雾电压：3500-4000V，优选3500V
d)雾化温度：350℃
e)传输毛细管温度：320℃
e)鞘气流速：30L/min
f)辅助气流速：10L/min
g)反吹气流速：5L/min
h)碰撞能：25.0-35.0V，优选30.0V
i)扫描模式：Fullms/ddms2(全扫描/数据依赖二级扫描)
j)扫描范围：50-750M/Z
k)分辨率：70000/17500(Fullms/ddms2)
l)最大扫描时间：100ms
m)动态排除：10.0s
其中步骤2)的软件为TraceFinder。
上述方法制备得到的β-受体激动剂类药物质谱库也属于本发明的保护范围。
进一步地，本发明提供了一种广谱鉴定β-受体激动剂类药物的方法，包括以下步骤：
1)采用上述方法构建β-受体激动剂类药物质谱图库和32种β-受体激动剂类药物信息库，包括化合物分子离子m/z、保留时间、同位素峰、二级碎片离子m/z；
2)待测样品的前处理；
3)利用UPLC-QE对前处理后的样品进行分离和质谱检测，质谱扫描采用Fullms+ddms2模式，得到样品中所有化合物的质谱信息；
4)将所得质谱信息导入TraceFinder软件，建立分析质谱图数据的处理方法，然后将分析得到的所有化合物分别与步骤1)所建质谱图库中质谱图相似度以及32种β-受体激动剂类药物信息库中化合物母离子m/z、保留时间、同位素峰、二级碎片离子m/z进行比对，若五项信息全部匹配，则该物质被认为是β‐受体激动剂类药物。
所述32种β-受体激动剂类药物分别为班布特罗、溴布特罗、西布特罗、西马特罗、克伦普罗、氯丙那林、马布特罗、特布他林、妥布特罗、齐帕特罗、丁酚胺、菲诺特罗、异丙肾上腺素、异舒普林、奥西那林、苯乙醇胺A、利托君、克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、皮布特罗、吗喷特罗、拉贝特罗、异克伦潘特、喷布特罗、福莫特罗、沙美特罗、异他林、肾上腺素、净特罗、丙卡特罗、多巴酚丁胺等。
本发明的广谱性鉴定β-受体激动剂类药物的方法中，步骤2)的前处理方法为：
①提取：a.若待测样品为饲料：称取2-5g待测饲料样品置于干净容器中，精确至0.01g，加入20-50ml盐酸甲醇或20-50ml1.0％甲酸提取液，震荡10-20min后，然后于4℃条件下7000-12000rpm离心5-10min，取上清液备用；或
b.若待测样品为尿液：准确取1份体积尿液样品约2-5ml，置于干净容器中，加入3份体积pH5.2的乙酸铵缓冲液，涡旋混匀后，7000-12000rpm离心10min，取上清液备用；或
c.若待测样品为血浆：准确取1份体积血浆样品约2-5ml置于干净容器中，加入3倍体积pH5.2的乙酸铵缓冲液，混匀，加入同血浆体积的6％高氯酸，7000-12000rpm离心10min，取上清液备用；或
d.若待测样品为组织：准确称取2-5g组织样品置于干净容器中，加入6-10mLpH5.2的乙酸铵缓冲液，再加入用乙酸铵缓冲液稀释5倍的150μl葡萄糖醛甘酸或硫酸酯酶，组织匀浆机匀浆，65℃震荡酶解1.5-2h，加入2-5ml的6％高氯酸，8000-12000rpm离心10min，取上清液备用；对于眼睛和脂肪样品，在加入高氯酸沉淀离心之后取上清液，加入6-15mL正己烷，3000r/min离心10min，去下层液体重复萃取，然后再进行固相萃取净化过程；
②净化：用3mL甲醇，3ml超纯水活化混合型阳离子交换萃取小柱，准确吸取步骤①得到的3-5ml离心后的上清加入固相萃取小柱，令其自然流速流出，然后用3mL超纯水，3ml甲醇淋洗，待其全部流出，吹干柱中残留的液体，再用3mL2％或5％氨水甲醇溶液洗脱，用衍生小瓶收集全部的洗脱液。在40℃条件下氮气吹干，最后用0.4-1ml液相初始流动相复溶，过0.1或0.22μm滤膜(对于个别比较难过滤的样品可以用0.45μm滤膜)，滤液上机待测。
上述方法中，步骤3)液相色谱条件为：色谱柱：WatersT3column，2.1×150mm，3μm；进样量：5ul；流动相：A：0.1％甲酸+10mM乙酸铵水；B：0.1％甲酸乙腈；洗脱梯度：
上述方法中，步骤3)质谱条件为：
a)检测方式：正离子模式
b)离子源：电喷雾离子源
c)喷雾电压：3500-4000V，优选3500V；
d)雾化温度：350℃
e)传输毛细管温度：320℃
e)鞘气流速：30L/min
f)辅助气流速：10L/min
g)反吹气流速：5L/min
h)碰撞能：25.0-35.0V，优选30.0V
i)扫描模式：Fullms/ddms2(全扫描/数据依赖二级扫描)
j)扫描范围：50-750M/Z
k)分辨率：70000/17500(Fullms/ddms2)
l)最大扫描时间：100ms
m)动态排除：10.0s
本发明提供的广谱鉴定β受体激动剂类药物的方法可实现对待测样品中β受体激动剂类药物的广谱性快速筛选，以及样品中未知的β受体激动剂类药物的定性和定量，为动物食品安全提供有效的监管手段，有利于保障人民食品安全，具有良好的社会效益和经济效益。本发明方法检测时不需要同时测定β受体激动剂类药物标准品，即可以同步检测饲料、血、尿以及组织样品中的32种β-受体激动剂类药物，此谱库还能根据文献报道或该类药物的质谱解析规律，不断进行扩建和完善，进而能鉴定更多的β-受体激动剂类药物或类似物。据统计本方法在饲料中的检出限为0.04-2.18ng/kg，尿液中的检出限为0.06-0.30ng/ml，血液中的检出限为0.007-0.07ng/ml，而国标以及有文献报道的方法在饲料中的检出限为10ng/kg，血尿中的检出限位0.1ng/ml；另外一个重要的优势是本方法中所用的质谱为最新出现的高分辨率质谱，对药物的质荷比能精确到小数点后5位，而常用的低分辨质谱其质荷比只能精确到小数点后2位，因此对比而言，本发明方法的检测灵敏度和准确性远远大于文献报道的方法。同时本方法的线性范围为0.20-500ng/ml，线性范围与其他方法相比也要广得多。
附图说明
图1为32种β-受体激动剂类药物(1ng/mL)总离子流图。
图2为饲料样品克伦特罗质谱图与谱库中标准品克伦特罗质谱图的相似度比较图。该图由上到下分别为样品实际质谱图、实际样品质谱图与谱库质谱图差异和谱库中与之匹配质谱图。通过这项手动比对可以验证TraceFinder软件处理结果的可靠性，以及去除一些假阳性和假阴性结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例使用到的溶液配制如下：
盐酸-甲醇提取溶液：取0.1M盐酸800mL，加入甲醇200mL，混匀。甲醇：色谱纯。5％氨水甲醇溶液：取5mL氨水与95mL甲醇混合。0.2％甲酸/水溶液：取2mL甲酸，加水定容到1000mL
液相流动相：水相：取1mL色谱纯甲酸，0.7708g乙酸铵，加水定容到1000mL；有机相：取1mL色谱纯甲酸，用色谱纯乙腈定容到1000mL。
液相系统所用甲醇和乙腈(HPLC级)购自美国Sigma公司，纯水(HPLC级)购自美国Fisher公司，甲酸(99.0％HPLC级)和乙酸铵(99.5％HPLC级)购自北京迪科马科技有限公司。实验用水均为超纯水，由Milli-QAdvantageA10超纯水系统以去离子水为进水制的。
标准储备液：准确称取适量的标准物质，置于15ml离心管中，然后加入适量的HPLC级甲醇进行溶解，配置成1.0mg/ml的标准储备液，涡旋1min以保证样品充分溶解，不易溶解的标样可置于超声仪中超声10min以加速溶解，于-20℃条件下避光保存。
混合标准储备液：用移液枪分别准确移取等量的单标储备液置于15ml离心管中，再用HPLC级甲醇稀释至1ppm。
混合标准工作液：在绘制标准工作曲线时，用1:1甲醇水进行逐级稀释。
本发明所用仪器为：超高效液相色谱：WatersACQUITYUPLCH-Class，美国Waters公司；四级杆-轨道阱高分辨质谱：Q-Exactive，美国Waters公司ThermoFisher公司；混合型阳离子交换柱：系列MCX(3cc,60mg)，美国Waters公司；固相萃取装置：美国AmeritechScientific有限公司；氮吹仪：美国AmeritechScientific有限公司；离心机：美国Beckman公司。
本发明所用标准品包括包括32种，分别为班布特罗、溴布特罗、西布特罗、西马特罗、克伦普罗、氯丙那林、马布特罗、特布他林、妥布特罗、齐帕特罗、丁酚胺、菲诺特罗、异丙肾上腺素、异舒普林、奥西那林、苯乙醇胺A、利托君、克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、皮布特罗、吗喷特罗、拉贝特罗、异克伦潘特、喷布特罗、福莫特罗和沙美特罗、异他林、肾上腺素、净特罗、丙卡特罗、多巴酚丁胺等，这些标准品均购自美国Sigma公司。
实施例1β受体激动剂类药物质谱库的构建
(1)利用Q-E质谱仪对每种标样进行一级二级质谱扫描。
用已有的32种标准品，包括常用的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等β1，β2，β3-受体激动剂类药物，采用高分辨质谱UPLC-Q-Extractivesystem(UPLC,WatersACQUITYUPLCH-ClassBioSystem；MS,ThermoFisherQ–Exactive)进行。
其前处理方法、液相条件、和质谱条件的优化：前处理方法优化主要包括两个方面，首先是饲料提取液的确定，分别使用1.0％甲酸水和盐酸甲醇提取饲料样品，经检测发现1.0％甲酸水的提取效率为60％-70％，而盐酸甲醇的提取效率大于80％，所以最终确定盐酸甲醇为饲料样品提取液；另一方面在用氨水甲醇进行洗脱时，分别用2％和5％氨水甲醇进行洗脱，用2％氨水甲醇进行洗脱时，克伦特罗的回收率为60％-70％，用5％氨水甲醇洗脱时回收率为80％左右，所以后期实验中使用5％氨水甲醇作为洗脱液。液相条件优化包括流动相组成、洗脱梯度的改变，实验过程中分别采用0.1％甲酸水和甲醇、0.1％甲酸水和乙腈、0.1％甲酸10mM乙酸铵水和乙腈为流动相进行试验，发现最终以0.1％甲酸10mM乙酸铵水和乙腈为流动相，并使用T3色谱柱进行分离时色谱峰的峰形和32种β-受体激动剂类药物的分离度得到明显改善。所以，本发明最终采用WatersT3column(2.1×150mm，3μm)，梯度洗脱。得到32种β-受体激动剂类药物的总离子流图,见图1。并在饲料、血、尿等中做添加回收实验，结果表明所有标样的检出限为0.001ng/mL-0.1ng/mL,在样品中添加的回收率为60％-120％，其中本发明方法对非常常见的两种β-受体激动剂类药物在各种基质中的检测灵敏度、线性范围和回收率见下表1。
表1克伦特罗和沙丁胺醇在饲料、血、尿中的回收率定性限等性能参数
说明方法条件包括前处理和仪器参数
前处理：①提取：
a.称取2g待测饲料样品置于三角瓶中，精确至0.01g，加入20ml盐酸甲醇提取液，震荡20min后，然后于离心机上4℃条件下8000rpm离心10min，取上清液备用；
b.准确取1份体积尿液样品置于10ml离心管中，加入3份体积乙酸铵缓冲液(pH5.2)，涡旋混匀后，8000rpm离心10min，取上清液备用；
c.准确取1份体积血浆样品置于10ml离心管中，加入3倍体积(6ml乙酸铵缓冲液(pH5.2)，混匀，加入同血浆体积的6％高氯酸(沉淀蛋白)，8000rpm离心10min，取上清液备用；
d.准确称取2g组织样品置于50ml离心管中，加入2-6mL乙酸铵缓冲液(pH5.2)，加入150ul葡萄糖醛甘酸/硫酸酯酶(先用乙酸铵缓冲液稀释5倍)，组织匀浆机匀浆，65℃震荡酶解1.5-2h，加入同体积的6％高氯酸(沉淀蛋白)，8000-12000rpm离心10min，取上清液备用(对于眼睛和脂肪样品，在加入高氯酸沉淀离心之后取上清液，加入6-15mL正己烷，3000r/min离心10min，去下层液体重复萃取，然后再进行固相萃取净化过程)；
②净化：用3mL甲醇，3ml超纯水活化混合型阳离子交换柱，萃取小柱，准确吸取步骤①得到的3ml离心后的上清加入固相萃取小柱，令其自然流速流出，然后用3mL超纯水，3ml甲醇淋洗，待其全部流出，吹干柱中残留的液体，再用3mL5％氨水甲醇溶液洗脱，用衍生小瓶收集全部的洗脱液。在40℃条件下氮气吹干，最后用0.4-1ml液相初始流动相复溶，过0.1或0.22μm滤膜(对于个别比较难过滤的样品可以用0.45μm滤膜)，1ml液相初始流动相复溶，过0.1mm滤膜，滤液上机待测。
液相色谱条件为：色谱柱：WatersAtlantisT3column，2.1×150mm，3μm；进样量：5μl；流动相：A：0.1％甲酸+10mM乙酸铵水溶液；B：0.1％甲酸乙腈；
洗脱梯度：
质谱条件为：
a)检测方式：正离子模式
b)离子源：电喷雾离子源
c)喷雾电压：3500V
d)雾化温度：350℃
e)传输毛细管温度：320℃
e)鞘气流速：30L/min
f)辅助气流速：10L/min
g)反吹气流速：5L/min
h)碰撞能：30.0
i)扫描模式：Fullms/ddms2(全扫描/数据依赖二级扫描)
j)扫描范围：50—750m/z
k)分辨率：70000/17500(Fullms/ddms2)
l)最大扫描时间：100ms
m)动态排除：10.0s
这些参数完全能满足β-受体激动剂类药物的广谱性筛选鉴定。
(2)查阅文献资料得到其他无标准品的β-受体激动剂类药物的一级二级质谱信息。
利用现有的第三方网上免费小分子质谱数据库或文献报道得到没有标准品的β-受体激动剂类药物，如HMDB(http://www.hmdb.ca/),METLIN(http://metlin.scripps.edu/),Massbank(http://www.massbank.jp),PubChem(http://ncbi.nlm.nih.gov/)等，尽可能得到所有的β-受体激动剂类药物的一级二级质谱图。
(3)TraceFinder软件建立母离子和特征碎片离子质谱库。
将(1)种扫描得到的所有β-受体激动剂类药物的一级、二级质谱信息导入TraceFinder软件中，建立基于β-受体激动剂类药物一级二级质谱图比对搜索数据库(简称质谱库)，对于没有标准品而无法获得其实际一二级质谱图的化合物，通过将(1)中得到的一二级质谱信息整合得到一个包含化合物母离子m/z、保留时间、化学式、二级碎片离子m/z等信息的β-受体激动剂类药物信息库。TraceFinder软件是由Thermo公司推出的可用于小分子化合物筛查鉴定并定量的软件。首先通过分析扫描实际样品所得到的一二级质谱图，将分析得到的所有组分分别与所建质谱图库中二级质谱图以及32种β-受体激动剂类药物信息库中化合物母离子m/z、保留时间、同位素峰、二级碎片离子m/z进行比对，若五项信息全部匹配，则该物质被认为是β-受体激动剂类药物。
(4)质谱库的验证
选取β-受体激动剂空白猪配合饲料样品，分为A、B两组，从32种β-受体激动剂类药物中随机选取几种用于此次验证试验，其中A组添加马布特罗、莱克多巴胺、和净特罗三种物质，B组添加克伦特罗和丙卡特罗两种物质，每组做三组平行试验。
样品前处理：①提取：称取2g待测样品置于三角瓶中，精确至0.01g，分别向A、B两组饲料样品中加入一定量的预添加β-受体激动剂类药物，使之终浓度均为50ppb，摇匀后加入20ml盐酸甲醇提取液，震荡20min后，然后于离心机上4℃条件下8000rpm离心10min，取上清液备用；
②净化：用3mL甲醇，3ml超纯水活化混合型阳离子交换柱，萃取小柱，准确吸取步骤①得到的3ml离心后的上清加入固相萃取小柱，令其自然流速流出，然后用3mL超纯水，3ml甲醇淋洗，待其全部流出，吹干柱中残留的液体，再用3mL5％氨水甲醇溶液洗脱，用衍生小瓶收集全部的洗脱液。在40℃条件下氮气吹干，最后用0.4-1ml液相初始流动相复溶，过0.1或0.22μm滤膜(对于个别比较难过滤的样品可以用0.45μm滤膜)，1ml液相初始流动相复溶，过0.1mm滤膜，滤液上机待测。
利用UPLC-QE进行分离和质谱检测，质谱扫描采用Fullms+ddms2模式，在完全未知的情况下，得到样品中所有化合物的质谱信息；将所得图谱导入TraceFinder软件后进行组分分析，将分析得到的所有组分分别与所建质谱图库中二级质谱图以及32种β-受体激动剂类药物信息库中化合物母离子m/z、保留时间、同位素峰、二级碎片离子m/z进行比对，若五项信息全部匹配，则该物质被认为是β-受体激动剂类药物，结果如表2，分别是添加不同种β-受体激动剂类药物的A、B两组饲料样品质谱扫描结果与所建质谱图库和化合物信息库匹配得到的结果。m/z指母离子质荷比、RT代表保留时间、IP代表同位素分布、FI代表二级碎片离子、LS代表二级质谱图谱库搜索、Flag代表样品与所建谱库和化合物信息库匹配综合结果。
表2A组饲料样品质谱扫描结果与所建质谱图库和化合物信息库匹配情况
本次添加实验分为A、B两组，每组三个平行实验，共六个样本。其中A组添加马布特罗、莱克多巴胺、和净特罗三种物质，B组添加克伦特罗和丙卡特罗两种物质。根据图中结果显示，最终A组匹配度较高的马布特罗、莱克多巴胺和净特罗，B组匹配度较高的是克伦特罗和丙卡特罗，与预期的结果相符，这充分说明了本发明所确定的样品前处理方法、高效液相色谱分析方法、QE高分辨质谱扫描方法以及TraceFinder软件处理方法的可信度很高。为进一步确认TraceFinder软件处理结果的可信度，还可以进一步人工手动对比实际样品与谱库中标准品质谱图的相似度(图2)，图片由上到下分别为样品实际质谱图、实际样品质谱图与谱库质谱图差异和谱库中与之匹配质谱图。通过这项手动比对可以验证TraceFinder软件处理结果的可靠性，以及去除一些假阳性和假阴性结果。
实施例2鉴定实际样品中β受体激动剂类药物
1、待测样品的前处理；①提取：a.准确取1份体积尿液样品置于10ml离心管中，加入3份体积乙酸铵缓冲液(pH5.2)，涡旋混匀后，8,000rpm离心10min，取上清液备用；
b.准确取1份体积血浆样品置于10ml离心管中，加入3倍体积(6ml乙酸铵缓冲液(pH5.2)，混匀，加入同血浆体积的6％高氯酸(沉淀蛋白)，8,000rpm离心10min，取上清液备用；
c.准确称取2g组织样品(股二头肌、肝脏、肾脏)置于50ml离心管中，加入3mL乙酸铵缓冲液(pH5.2)，加入150ul葡萄糖醛甘酸/硫酸酯酶(先用乙酸铵缓冲液稀释5倍)，组织匀浆机匀浆，65℃震荡酶解1.5h，加入同体积的6％高氯酸(沉淀蛋白)，12000rpm离心10min，取上清液备用；
②净化：用3mL甲醇，3ml超纯水活化混合型阳离子交换柱，萃取小柱，准确吸取步骤①得到的3ml离心后的上清加入固相萃取小柱，令其自然流速流出，然后用3mL超纯水，3ml甲醇淋洗，待其全部流出，吹干柱中残留的液体，再用3mL5％氨水甲醇溶液洗脱，用衍生小瓶收集全部的洗脱液。在40℃条件下氮气吹干，最后用0.4-1ml液相初始流动相复溶，过0.1或0.22μm滤膜(对于个别比较难过滤的样品可以用0.45μm滤膜)，1ml液相初始流动相复溶，过0.1mm滤膜，滤液上机待测。2、利用UPLC-QE对前处理后的样品进行分离和质谱检测，质谱扫描采用Fullms+ddms2模式，得到样品中所有化合物的质谱信息；液相色谱条件为：色谱柱：WatersT3column，2.1×150mm，3μm；进样量：5μl；流动相：A：0.1％甲酸+10mM乙酸铵水；B：0.1％甲酸乙腈；洗脱梯度：如下
质谱条件为：
a)检测方式：正离子模式
b)离子源：电喷雾离子源
c)喷雾电压：3500V
d)雾化温度：350℃
e)传输毛细管温度：320℃
e)鞘气流速：30L/min
f)辅助气流速：10L/min
g)反吹气流速：5L/min
h)碰撞能：30.0
i)扫描模式：Fullms/ddms2(全扫描/数据依赖二级扫描)
j)扫描范围：50-750M/Z
k)分辨率：70000/17500(Fullms/ddms2)
l)最大扫描时间：100ms
m)动态排除：10.0s
2、将所得质谱信息导入TraceFinder软件后进行组分分析，将分析得到的所有组分分别与实施例1所建质谱图库中二级质谱图以及32种β-受体激动剂类药物信息库中化合物母离子m/z、保留时间、同位素峰、二级碎片离子m/z进行比对，若五项信息全部匹配，则该物质被认为是β-受体激动剂类药物。为进一步确认TraceFinder软件处理结果的可信度，还可以进一步人工手动去对比实际样品与谱库中标准品质谱图的相似度，通过这项手动比对可以验证TraceFinder软件处理结果的可靠性，以及去除一些假阳性和假阴性结果。
3、本次试验中所用样品取自饲喂有莱克多巴胺的实验动物。组织样(股二头肌、肝脏、肾脏)包括四组，每组两个平行，血和尿也包括四组，每组一个样品，共32个样品。检测结果显示有27个阳性样本，五个阴性样本。在用本发明的方法鉴定之后，同时使用目前公认的LC/MS/MS检测β-受体激动剂药物的方法(如农业部1025号公告-18-2008、农业部公告1063-3-2008)进行检测，检测结果为27个阳性样本，五个阴性样本，结果与本发明的方法的鉴定结果完全一致，因此，可以充分说明用来检测β-受体激动剂药物的本发明的方法非常可靠。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.β-受体激动剂类药物质谱图库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对β-受体激动剂类药物进行一级二级质谱扫描；所述β-受体激动剂类药物包括标准品药物和非标准品药物；
其中，步骤1)采用超高效液相色谱-四级杆-轨道阱高分辨质谱仪进行扫描；质谱扫描的条件为：检测方式：正离子模式；离子源：电喷雾离子源；喷雾电压：3500-4000V；雾化温度：350℃；传输毛细管温度：330℃；鞘气流速：30L/min；辅助气流速：10L/min；反吹气流速：5L/min；碰撞能：35.0-35.0V；扫描模式：全扫描/数据依赖二级扫描；扫描范围：50-750m/z；分辨率：70000/17500；最大扫描时间：100ms；动态排除：3.0-10.0s；
3)将扫描得到的所有β-受体激动剂类药物的一级、二级质谱信息导入软件中，建立基于β-受体激动剂类药物一级二级质谱库；
其中，步骤3)的软件为TraceFinder。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括将已知的其他β-受体激动剂类药物的质谱信息添加入质谱库中。
3.一种广谱鉴定β-受体激动剂类药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采用权利要求1-2任一所述的方法构建β-受体激动剂类药物质谱图库；
3)待测样品的前处理；
3)利用UPLC-QE对前处理后的样品进行分离和质谱检测，质谱扫描采用Fullms+ddms3模式，得到样品中所有化合物的质谱信息；
4)将所得质谱信息导入TraceFinder软件后进行组分分析，将分析得到的所有组分分别与步骤(1)所建质谱图库中二级质谱图以及33种β-受体激动剂类药物信息库中化合物母离子m/z、保留时间、同位素峰、二级碎片离子m/z进行比对，若五项信息全部匹配，则该组分被认为是β-受体激动剂类药物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)的前处理方法为：
①提取：
a.若待测样品为饲料：称取3-5g待测饲料样品置于干净容器中，精确至0.01g，加入30-50ml盐酸甲醇或30-50ml1.0％甲酸提取液，震荡10-30min后，然后于4℃条件下7000-13000rpm离心5-10min，取上清液备用；或
b.若待测样品为尿液：准确取1份体积尿液样品约3-5ml，置于干净容器中，加入3份体积pH5.3的乙酸铵缓冲液，涡旋混匀后，7000-13000rpm离心10min，取上清液备用；或
c.若待测样品为血浆：准确取1份体积血浆样品约3-5ml置于干净容器中，加入3倍体积pH5.3的乙酸铵缓冲液，混匀，加入同血浆体积的6％高氯酸，7000-13000rpm离心10min，取上清液备用；或
d.若待测样品为组织：准确称取3-5g组织样品置于干净容器中，加入6-10mLpH5.3的乙酸铵缓冲液，再加入用乙酸铵缓冲液稀释5倍的150μl葡萄糖醛甘酸或硫酸酯酶，组织匀浆机匀浆，65℃震荡酶解1.5-3h，加入3-5ml的6％高氯酸，8000-13000rpm离心10min，取上清液备用；对于眼睛和脂肪样品，在加入高氯酸沉淀离心之后取上清液，加入6-15mL正己烷，3000r/min离心10min，去下层液体重复萃取，然后再进行固相萃取净化过程；
②净化：用3mL甲醇，3ml超纯水活化混合型阳离子交换萃取小柱，准确吸取步骤①得到的3-5ml离心后的上清加入固相萃取小柱，令其自然流速流出，然后用3mL超纯水，3ml甲醇淋洗，待其全部流出，吹干柱中残留的液体，再用3mL3％-5％氨水甲醇溶液洗脱，用衍生小瓶收集全部的洗脱液，在40℃条件下氮气吹干，最后用0.4-1ml液相初始流动相复溶，过0.1或0.33μm或0.45μm滤膜，滤液上机待测。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)液相色谱条件为：色谱柱：T3column，3.1×150mm，3μm；进样量：5-10μl；流动相：A：0.1％甲酸+10mM乙酸铵水；B：0.1％甲酸乙腈；洗脱梯度：
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)质谱条件为：检测方式：正离子模式；离子源：电喷雾离子源；喷雾电压：3500V；雾化温度：350℃；传输毛细管温度：330℃；鞘气流速：30L/min；辅助气流速：10L/min；反吹气流速：5L/min；碰撞能：30.0V；扫描模式：全扫描/数据依赖二级扫描；扫描范围：50-750m/z；分辨率：70000/17500；最大扫描时间：100ms；动态排除：3.0-10.0s。
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