CN116026958B - 一种血液中药物和个人护理品的高通量识别方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种血液中药物和个人护理品的高通量识别方法，属于分析化学技术领域。该方法基于高分辨率质谱，首先建立典型PPCPs质谱数据库，包括100种典型PPCPs的名称、分子式、CAS号、加合离子模式，一级质谱峰m/z以及二级质谱图中的相对强度最高的一个或两个特征碎片；其次在血液样品前处理后利用超高效液相色谱‑高分辨率质谱，对血液中低浓度PPCPs高效分离，并在单独的一次分析测定中对血液中PPCPs的一级、二级质谱谱图同时进行快速连续的扫描；最后将谱图信息与典型PPCPs质谱数据库进行匹配，实现血液中药物和个人护理品的高通量识别。该方法样本需求量小，识别准确度高、用时短，且不需要购买标准样品，能够实现血液中典型PPCPs的高通量识别。
Description
技术领域
本申请属于分析化学技术领域，具体涉及一种血液中药物和个人护理品的高通量识别方法。
背景技术
随着商业经济的发展，全球药物和个人护理品(Pharmaceuticals and personalcare products,PPCPs)，包括各种人用和兽用的处方药、非处方药、化妆品原料和防晒剂等的生产和使用迅猛增加。已有研究在人体生物样品(如血清、尿液和乳汁)中检测到多种PPCPs，如抗生素、二苯甲酮(benzophenones,BPs)、苯甲酸酯类(parabens)、三氯生(triclosan,TCS)和三氯卡班(triclocarban,TCC)等。研究表明PPCPs多具有生物累积效应以及多种慢性毒性效应，如邻苯二甲酸酯、UV防晒剂4-MBC等具有生殖毒性，二苯甲酮、奥克立林等存在致癌性，麝香酮、对羟基苯甲酸酯等存在致突变性。此外，PPCPs还可能干扰生物的内分泌系统，如三氯生、三氯卡班、合成麝香等，对人体健康存在潜在危害。
血液是了解环境污染物人体内暴露情况的代表性生物样品，鉴定和识别血液中的PPCPs具有重要意义。然而血液样本通常基质比较复杂，采集量小，且PPCPs常以低浓度存在于血液样品中，这对血液样品分析方法提出了巨大的挑战。
目前识别血液中的PPCPs主要使用的是靶向分析这一传统方法，其着重于检测、鉴定或识别特定的化合物或同类化合物，能够同时识别的PPCPs数量少，耗时长。此外，由于血液样本基质比较复杂，因此在识别前需要进行前处理，相关技术中记载的提取和纯化过程繁琐、成本高、耗时长，且难以处理大量的样品。
申请内容
1.要解决的问题
本申请针对现有技术记载的血液中的PPCPs的识别方法局限于标准物质从而无法同时识别多种PPCPs、血液样品前处理方法繁琐等问题之一，提供一种血液中药物和个人护理品的高通量识别方法，该方法基于高分辨率质谱，首先建立典型PPCPs质谱数据库，包括100种生产使用量大、存在健康风险且受到广泛关注的典型PPCPs的名称、分子式、CAS号、加合离子模式，一级质谱峰m/z以及二级质谱图中的一个或两个特征碎片；其次在血液样品前处理后利用超高效液相色谱-高分辨率质谱，对血液中低浓度PPCPs高效分离，并在单独的一次分析测定中对血液中PPCPs的一级、二级质谱谱图同时进行快速连续的扫描；最后将谱图信息与典型PPCPs质谱数据库进行匹配，实现血液中药物和个人护理品的高通量识别。该方法样本需求量小，识别准确度高、用时短，且不需要购买标准样品，能够实现血液中典型PPCPs的高通量识别。
2.技术方案
为了解决上述问题，本申请所采用的技术方案如下：
本申请提供了一种血液中药物和个人护理品的高通量识别方法，该方法基于高分辨率质谱，首先建立目标种类的典型PPCPs质谱数据库，包括多种生产使用量大、存在健康风险且受到广泛关注的典型PPCPs的名称、分子式、CAS号、加合离子模式，一级质谱峰m/z以及二级质谱图中的一个或两个特征碎片；其次在血液样品前处理后利用超高效液相色谱-高分辨率质谱，对血液中低浓度PPCPs高效分离，并在单独的一次分析测定中对血液中PPCPs的一级、二级质谱谱图同时进行快速连续的扫描；最后将谱图与典型PPCPs质谱数据库进行匹配，匹配成功则确认该物质存在，实现血液中药物和个人护理品的高通量识别。
进一步地，上述一种血液中药物和个人护理品的高通量识别方法，包括如下步骤：
(A)建立目的种类的典型PPCPs质谱数据库，根据MS Dial数据库、MoNA数据库及Pubchem网站的标准质谱信息，选取目的种类的典型PPCPs建立典型PPCPs质谱数据库，该典型PPCPs质谱数据库具体信息包括：名称、分子式、CAS号、加合离子模式，一级质谱峰m/z以及二级质谱图中的一个或两个特征碎片，一级质谱是质谱扫描中目标物母离子的信号分布，即目标物在对应加合离子模式下的质荷比，二级质谱是该母离子在高能碎裂后产生的二级离子的信号分布，能够代表目标物的部分特征碎片，从而对目标物的结构进行分析；
(B)血液样品前处理，每500μL血液加入0.25g MgSO4、NaCl混合物(4:1)以去除水分，同时加入三个钢球(直径Ф＝2mm)，在涡旋过程中帮助样品混合均匀；每份样品加入500μL乙腈(ACN)，室温下超声15±5min，以4616×g转速离心10±5min后，分离上清液，再加入500μL的乙腈溶液(乙腈:水，95:5)，室温下超声15±5min，以4616×g转速离心10±5min分离上清液，重复本提取步骤2次；合并三次离心提取的上清液，在平缓氮气流下氮吹浓缩并定容至100μL；
(C)液相色谱-质谱联用仪检测，通过超高效液相色谱(UltiMate 3000,ThermoScientific,美国)和Q Exactive Focus高分辨率质谱(Thermo Scientific,德国)联用，对步骤(B)中得到的浓缩液在质谱正负电离模式下通过“Full MS-ddMS2”的扫描方式进行一级质谱和二级质谱的全扫描；
(D)PPCPs识别，将步骤(C)中血样检测结果与步骤(A)中建立的典型PPCPs质谱数据库进行匹配，匹配成功则确认该物质存在，实现对血样中PPCPs的识别。
进一步地，上述步骤(A)中，目的种类的典型PPCPs选自表1中PPCPs的一种或多种，在美国环境保护署(EPA)推出的计算毒理学网站CompTox中搜集标明用途为药物(Pharmaceuticals)和个人护理品(Personal care products)的物质共8510种，其中包括药物活性成分7522种、个人护理品原料988种；后于MS Dial质谱数据库、MoNA质谱数据库及Pubchem网站查询这些物质的质谱信息，搜索发现其中2117种具有清晰确定的一二级质谱信息；最后于web of science网站搜索其相关研究数量，取相关研究数量前100的物质作为本数据库中的典型PPCPs，该信息库包括PPCPs类物质的名称、分子式、CAS号、加合离子模式，一级质谱峰m/z以及二级质谱图中的一个或两个特征碎片信息。
进一步地，上述步骤(A)中，二级质谱图中的特征碎片为二级谱图中相对强度最高的一个或两个碎片。
进一步地，上述步骤(A)中，目的PPCPs标准二级质谱图中只有一个峰时则选择其为一个特征碎片，当二级质谱图中多于一个峰时则选择其中相对强度最高两个碎片为两个特征碎片。
进一步地，上述步骤(A)中，目的种类的典型PPCPs选自表1中100种PPCPs，其质谱数据库如表1所示。
进一步地，上述步骤(A)中，目的种类的典型PPCPs选自表1中30种PPCPs，其质谱数据库如表2所示。
进一步地，上述步骤(B)中，血液样品包括全血、血浆或血清。
进一步地，上述步骤(B)中，使用高纯氮气缓慢吹扫溶剂对提取液进行浓缩。
进一步地，上述步骤(B)中，定容溶剂为乙腈，定容后当底部若存在少量白色固体MgSO4、NaCl时，需经过再次离心，将上清液转移至色谱瓶。
进一步地，上述步骤(C)中，超高效液相色谱仪为UltiMate 3000(ThermoScientific，美国)；高分辨率质谱仪为Q Exactive Focus(Thermo Scientific，德国)。
进一步地，上述步骤(C)中，超高效液相色谱的条件为：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1mm×150mm,1.7μm,Waters,美国)；
柱温：40℃；
流速：400μL/min；
梯度洗脱流动相：
正相：A：0.1％甲酸/甲醇水溶液，B：甲醇
负相：A：2mM醋酸铵/甲醇水溶液，B：甲醇；
流动相梯度：
进一步地，上述步骤(C)中，高分辨率质谱的条件为：
电离模式：正离子模式+负离子模式；
TOF-MS扫描范围：100-1250m/z；
MS-MS扫描范围：50-1000m/z；
喷雾电压：正离子模式，3500V；负离子模式，-2500V；
标准化碰撞能：20，40，60；
离子源温度：320℃；
毛细管温度：300℃；
鞘气压力：48arb；
辅助气压：10arb；
S-lens RF：55V；
MS全扫描分辨率：35000；
MS/MS扫描分辨率：17500。
进一步地，上述步骤(D)中，匹配包括先进行一级质谱峰m/z的匹配，允许的误差为0.01Da；比对成功后再进行二级质谱图中的特征碎片的匹配，特征碎片允许的误差为0.025Da，若特征碎片均满足匹配条件，则确认物质存在。
进一步地，上述步骤(D)中，匹配使用MS Dial软件进行。
进一步地，上述步骤(D)中，使用MS Dial进行匹配的具体步骤包括：
(1)使用软件：MS Dial 4.70；
(2)导入样品质谱信息：点击“File”、“New project”新建项目，于“Project filepath”选择样品的质谱信息路径，于电离模式“Ionization type”选择软电离模式“softionization”，于分离类型“Separation type”选择色谱法“Chromatography”，于质谱方法类型“MS method types”选择传统液相质谱“Conventional LC/MS”，于数据类型“Datatype(MS1)”“Data type(MS/MS)”选择文件数据“Profile data”，于离子模式“Ion mode”选择对应的正负离子模式，于目标组学“Target omics”选择代谢组学“Metabonomics”；
(3)选择分析文件路径：完成(2)中信息选择后，点击“next”进入“Analyzing filepaths”，选择目标分析样品；
(4)设置分析参数：完成(3)中目标样品选择后，进入“Analysis parametersetting”设置分析参数，于“Adduct”确认加合离子模式，于“Alignment”确认峰对齐参数保留时间误差“Retention time tolerance”和一级质谱质荷比误差“MS1 tolerance”分别为“0.5min”和“0.015Da”，不进行同位素追踪“Isotopes tracking”，于“Data collection”设定数据搜集质量参数“MS1tolerance”为“0.01Da”，“MS2 tolerance”为“0.025Da”，于峰值检测“Peak detection”设置峰值检测参数最小峰高“Minimum peak height”为“1000amplitude”，质量切片宽度“Mass section width”为“0.1Da”；
(5)导入100种典型PPCPs质谱清单：典型PPCPs清单是由物质名称和一级质谱m/z组成的TXT文件，完成(4)中参数设定后，于“Analysis parameter setting”窗口下的“Identification”中的Advanced部分导入自建质谱信息清单，于“Text file”选择自建库路径，设定“Retention time tolerance”为0.5min，“Accurate mass tolerance”为0.01Da，“Identification score cut off”为70％，勾选“Together with alignment”；
(6)一级质谱匹配：完成(5)中目标清单设置后点击“finish”，MS Dial开始进行一级质谱匹配，匹配结束后，点击“Peak point navigator”窗口下的“ref.matched”进行目标物匹配，“Peak spot viewer”将显示匹配到的物质(每一个斑点代表一个物质)，点击“showin table”将显示包括匹配物质的保留时间、一级质谱m/z、峰高、区域、高斯指数等信息的表格“Peak spot table”；
(7)二级质谱匹配：于“Peak spot table”中选择物质，将于右下角的“Exp.vs.Ref”窗口显示该检出物的二级质谱碎片信息，将其与步骤(A)中建立的典型PPCPs质谱信息库中的一个或两个二级特征碎片进行匹配，MS/MS碎片允许误差为0.025Da，若特征碎片均满足匹配条件，则确认物质存在。
3.有益效果
本申请与现有技术相比，其有益效果在于：
(1)本申请提供了一种血液中药物和个人护理品的高通量识别方法，针对生产使用量大、存在健康风险且受到广泛关注的100种典型PPCPs，通过于MS Dial数据库、MoNA数据库、Pubchem网站上收集这些典型PPCPs的一级质谱峰m/z以及二级质谱图中的一个或两个特征碎片信息，建立典型PPCPs质谱数据库，涵盖的100种生产使用量大、存在健康风险且受到广泛关注的典型PPCPs，分析其内暴露情况具有重要意义。
(2)本申请提供了一种血液中药物和个人护理品的高通量识别方法，利用超高效液相色谱-高分辨率质谱联用仪，在单独的一次分析测定中对血液中PPCPs类物质的一级、二级质谱谱图同时进行快速连续的扫描、筛查和鉴定，依托MS Dial建立典型PPCPs的质谱快速匹配方法，克服了依赖于标准品的局限，一次可分析多种典型PPCPs，能够对血液中可能存在的PPCPs类物质进行高通量筛查识别，且相较于传统的非靶向筛查技术更迅速、更准确。此外，具有精确质量数的全扫描数据可以进行存档和回顾性分析，减少分析成本和时间，实现传统方法不能达到的快速识别效果。
(3)本申请提供了一种血液中药物和个人护理品的高通量识别方法，采用MgSO4、NaCl混合物(4:1)作为分散式固相萃取剂对血液进行前处理，可以有效降低基质干扰，提高血液中低浓度PPCPs的提取能力，简化了现有技术中提取和纯化步骤，采用添加分散式固相萃取剂(MgSO4、NaCl混合物)的处理，无需过柱，仅采用一种有机试剂通过多次提取富集污染物，实现对少量血液样品的准确迅速提取与净化，方法简单快捷，操作易行，样本需求少，具有良好的应用价值；此外，该前处理方法在降低基质干扰的条件下能有效提取包括极性和非极性在内的不同类别化合物，提取PPCPs种类全面，信息损失少。
(4)本申请提供了一种血液中药物和个人护理品的高通量识别方法，针对PPCPs类物质，优化探索了超高效液相色谱-高分辨率质谱的条件，依据该仪器条件下的检测识别速度快，准确度高。
附图说明
图1为本发明中血液样品前处理及筛查分析步骤流程图，其中上图为血液前处理流程图，下图为高通量可疑性识别步骤流程图。
图2为实施例1样品中典型PPCPs的色谱流出图，其中上图为正离子，下图为负离子。
图3为实施例1中水杨酸的色谱流出图。
图4为水杨酸标准二级质谱图(上)与实施例1中水杨酸的二级质谱图(下)。
图5为实施例1中烟酰胺的色谱流出图。
图6为烟酰胺标准二级质谱图(上)与实施例1中烟酰胺的二级质谱图(下)。
图7为实施例2中8-羟基喹啉的色谱流出图。
图8为8-羟基喹啉标准二级质谱图(上)与实施例2中8-羟基喹啉的二级质谱图(下)。
图9为实施例2中花生四烯酸的色谱流出图。
图10为花生四烯酸标准二级质谱图(上)与实施例2中花生四烯酸的二级质谱图(下)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请进一步进行描述。
需要说明的是，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”等用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本申请可实施的范畴。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。
如本文所使用，术语“......中的至少一个”旨在与“......中的一个或多个”同义。例如，“A、B和C中的至少一个”明确包括仅A、仅B、仅C以及它们各自的组合。
浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。
实施例1
本实施例提供一种包含100种典型PPCPs的质谱数据库，该100种典型PPCPs是目前生产使用量大、存在健康风险且受到广泛关注的典型PPCPs，根据MS Dial数据库、MoNA数据库及Pubchem网站的标准质谱信息，选取的信息并建立包含100种典型PPCPs的质谱数据库，具体信息包括：名称、分子式、CAS号、加合离子模式，一级质谱峰m/z以及二级质谱图中相对强度最高的一个或两个特征碎片，建立的质谱数据库如表1所示。
表1 100种典型PPCPs质谱数据库
实施例2
本实施例模拟受到30种典型PPCPs污染的血液，并利用本申请的血液中药物和个人护理品的高通量识别方法进行识别，具体包括如下步骤：
本实施例中模拟污染血液样品的制备：取3份0.5mL胎牛血清样品于15mL离心管，加入30种浓度为1ppm的典型PPCPs类物质各5μL，涡旋混匀后静置12h。30种典型PPCPs类物质如表3所示，包括药物25种，防腐剂2种，常用化妆品添加剂1种，美白剂1种，去角质剂1种，这30种物质均来自本申请建立的PPCPs质谱信息库。
本申请的血液中药物和个人护理品的高通量识别方法进行识别：
(A)建立目标PPCPs质谱数据库：选定的30种物质的质谱信息来自于本发明中建立的典型PPCPs质谱信息库，建立包括30种PPCPs类物质的名称、分子式、CAS号、加合离子模式，在正负电离模式下的一级质谱峰的m/z以及MS/MS二级质谱中的一个或两个特征碎片组成的信息库，如表2所示；
表2 30种典型PPCPs质谱数据库
(B)血液样品前处理，提取血液中污染物：每500μL血清加入0.25g MgSO4、NaCl混合物(4:1)以去除水分，同时加入三个钢球(直径Ф＝2mm)，在涡旋过程中帮助样品混合均匀；每份样品加入500μL乙腈(ACN)，室温下超声15min，以4616×g转速离心10min后分离上清液；然后再加入500μL的乙腈溶液(乙腈:水，95:5)，室温下超声15min，以4616×g转速离心10min分离上清液，重复本提取步骤2次；合并三次离心提取的上清液，在平缓氮气流下氮吹浓缩并分定容至100μL；
(C)液相质谱联用仪检测：通过采用超高效液相色谱(UltiMate 3000,ThermoScientific,美国)结合Q Exactive Focus高分辨率质谱(Thermo Scientific,德国)，对步骤(B)中得到的浓缩液在质谱正负电离模式下通过Full MS-ddMS2的扫描方式进行一级质谱和二级质谱的全扫描，所采用超高效液相色谱-高分辨率质谱的条件为：
高效液相色谱仪：超高效液相色谱(UltiMate 3000,Thermo Scientific,美国)；
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1mm×150mm,1.7μm,Waters,美国)；
柱温：40℃；
流速：400μL/min；
梯度洗脱流动相：
正相：A：0.1％甲酸/甲醇水溶液，B：甲醇
负相：A：2mM醋酸铵/甲醇水溶液，B：甲醇；
质谱仪：Q Exactive Focus质谱(Thermo Scientific,德国)；
电离模式：正离子模式+负离子模式；
TOF-MS扫描范围：100-1250m/z；
MS-MS扫描范围：50-1000m/z；
喷雾电压：正离子模式，3500V；负离子模式，-2500V；
标准化碰撞能：20，40，60；
离子源温度：320℃；
毛细管温度：300℃；
鞘气压力：48arb；
辅助气压：10arb；
S-lens RF：55V；
MS全扫描分辨率：35000；
MS/MS扫描分辨率：17500；
(D)PPCPs识别：基于步骤(A)中建立的30种典型PPCPs质谱数据库，对步骤(C)中血样检测结果的PPCPs识别，具体步骤如下：
(1)使用软件：MS Dial 4.70；
(2)导入样品质谱信息：点击“File”、“New project”新建项目，于“Project filepath”选择样品的质谱信息路径，于电离模式“Ionization type”选择软电离模式“softionization”，于分离类型“Separation type”选择色谱法“Chromatography”，于质谱方法类型“MS method types”选择传统液相质谱“Conventional LC/MS”，于数据类型“Datatype(MS1)”“Data type(MS/MS)”选择文件数据“Profile data”，于离子模式“Ion mode”选择对应的正负离子模式，于目标组学“Target omics”选择代谢组学“Metabonomics”；
(3)选择分析文件路径：完成(2)中信息选择后，点击“next”进入“Analyzing filepaths”，选择目标分析样品；
(4)设置分析参数：完成(3)中目标样品选择后，进入“Analysis parametersetting”设置分析参数，于“Adduct”确认加合离子模式，于“Alignment”确认峰对齐参数保留时间误差“Retention time tolerance”和一级质谱质荷比误差“MS1 tolerance”分别为“0.5min”和“0.015Da”，不进行同位素追踪“Isotopes tracking”，于“Data collection”设定数据搜集质量参数“MS1tolerance”为“0.01Da”，“MS2 tolerance”为“0.025Da”，于峰值检测“Peak detection”设置峰值检测参数最小峰高“Minimum peak height”为“1000amplitude”，质量切片宽度“Mass section width”为“0.1Da”；
(5)导入100种典型PPCPs质谱清单：典型PPCPs清单是由物质名称和一级质谱m/z组成的TXT文件，完成(4)中参数设定后，于“Analysis parameter setting”窗口下的“Identification”中的Advanced部分导入自建质谱信息清单，于“Text file”选择自建库路径，设定“Retention time tolerance”为0.5min，“Accurate mass tolerance”为0.01Da，“Identification score cut off”为70％，勾选“Together with alignment”；
(6)一级质谱匹配：完成(5)中目标清单设置后点击“finish”，MS Dial开始进行一级质谱匹配，匹配结束后，点击“Peak point navigator”窗口下的“ref.matched”进行目标物匹配，“Peak spot viewer”将显示匹配到的物质(每一个斑点代表一个物质)，点击“showin table”将显示包括匹配物质的保留时间、一级质谱m/z、峰高、区域、高斯指数等信息的表格“Peak spot table”；
(7)二级质谱匹配：于“Peak spot table”中选择物质，将于右下角的“Exp.vs.Ref”窗口显示该检出物的二级质谱碎片信息，将其与步骤(A)中建立的典型PPCPs质谱信息库中的二级特征碎片进行匹配，MS/MS碎片允许误差为0.025Da，若碎片均满足匹配条件，则确认物质存在。
筛查的30种PPCPs比对情况如表3所示，采用上述识别方法，添加的30种物质均能通过血液中药物和个人护理品的高通量识别方法被成功筛查识别，实现100％的检出率，说明本发明的血液中药物和个人护理品的高通量识别方法具有良好的测量精度，提供较高的准确筛查识别率。
表3实施例2中筛查的30种典型PPCPs与质谱库的比对情况
为验证本发明方法的准确性，本实施例中将上述方法得出的PPCPs类物质的二级质谱图与30种已有外标的标准品的实验谱图进行比对，通过其吻合匹配度判断本方法的准确性。
以个人护理品中常用的去角质物质水杨酸为例，首先检测到137.0231的一级质谱峰，与负离子模式下水杨酸的一级m/z 137.0244相比相对误差为0.0013Da，检测到的该物质流出图如图3所示。且其两个特征碎片离子93.0335/65.0384与水杨酸标准样品的典型碎片93.0331/65.0384的误差为0.004Da/0Da(见图4)，符合本发明设置的误差范围，因此可确定被筛查出的物质为水杨酸。
以个人护理品中常用的美白成分烟酰胺为例，首先检测到123.0553的一级质谱峰，与烟酰胺的精确质量数123.0553误差为0Da，能够实现精确匹配，检测到的该物质流出图如图5所示。且其两个特征碎片离子80.05/96.0453与烟酰胺标准样品的典型碎片80.0489/96.044的误差为0.0011Da/0.0013Da(见图6)，符合本发明设置的误差范围，因此可确定被筛查出的物质为烟酰胺。
实施例3
本实施例提供血液中药物和个人护理品的高通量识别方法对搜集到的血液样品中的PPCPs进行筛查识别，血液样品为脐带血，具体包括如下步骤：
(A)建立典型PPCPs质谱数据库：本实施例中的PPCPs质谱数据库包括100种典型PPCPs的质谱信息库，包括物质的名称、分子式、CAS号、加合离子模式，一级质谱峰m/z以及二级质谱图中的一个或两个特征碎片在正负电离模式下的一级质谱峰的m/z以及MS/MS谱图的一个或两个特征碎片信息，质谱数据库如表1所示；
(B)血液样品前处理：参考实施例2；
(C)液相质谱联用仪检测：参考实施例2；
(D)PPCPs识别：基于步骤(A)中建立的100种典型PPCPs质谱数据库，对步骤(C)中血样检测结果的PPCPs进行识别，具体参考实施例2。
最终识别鉴定出该血液样品中含有5种PPCPs(表4)，包括了8-羟基喹啉、芥酸酰胺、亚麻酸、水杨酸、花生四烯酸，其中8-羟基喹啉、花生四烯酸的色谱流出图如图7、图9所示，二级质谱如图8、图10所示。
表4实施例3中筛查出的5种PPCPs的相关数据
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Claims (4)
1. 一种血液中药物和个人护理品的高通量识别方法，其特征在于，所述方法基于高分辨率质谱，首先建立目的种类的典型PPCPs质谱数据库，根据MS Dial数据库、MoNA数据库及Pubchem网站的标准质谱信息，选取目的种类的典型PPCPs建立典型PPCPs质谱数据库，包括典型PPCPs的名称、分子式、CAS号、加合离子模式，一级质谱峰m/z以及二级质谱图中的一个或两个特征碎片，所述目的种类的典型PPCPs选自表1中PPCPs的一种或多种；所述目的PPCPs标准的二级质谱图中只有一个峰时则选择其为一个特征碎片，当二级质谱图中多于一个峰时则选择其中相对强度最高的两个碎片为两个特征碎片；其次在血液样品前处理后，利用超高效液相色谱-高分辨率质谱对血液中PPCPs进行高效分离，并对血液中PPCPs的一级、二级质谱谱图同时进行快速连续扫描；最后将谱图信息与典型PPCPs质谱数据库进行匹配，匹配成功则确认该物质存在，实现血液中药物和个人护理品的高通量识别；
所述方法具体包括如下步骤：
（A）建立目的种类的典型PPCPs质谱数据库，根据MS Dial数据库、MoNA数据库及Pubchem网站的标准质谱信息，选取目的种类的典型PPCPs建立典型PPCPs质谱数据库，所述典型PPCPs质谱数据库具体信息包括：名称、分子式、CAS号、加合离子模式，一级质谱峰m/z以及二级质谱图中的一个或两个特征碎片，所述目的种类的典型PPCPs选自表1中PPCPs的一种或多种；所述目的PPCPs标准的二级质谱图中只有一个峰时则选择其为一个特征碎片，当二级质谱图中多于一个峰时则选择其中相对强度最高的两个碎片为两个特征碎片，所述质谱数据库如表1所示；
（B）血液样品前处理，每500 μL血液加入0.25 g MgSO4、NaCl混合物以去除水分，同时加入三个钢球，在涡旋过程中帮助样品混合均匀；每份样品加入500 μL乙腈，室温下超声15±5 min，以4616×g转速离心10±5 min后，分离上清液，再加入500 μL的乙腈溶液，室温下超声15±5 min，以4616×g转速离心10±5 min分离上清液，重复本提取步骤2次；合并三次离心提取的上清液，在平缓氮气流下氮吹浓缩并定容至100 μL；
（C）液相色谱-质谱联用仪检测，通过超高效液相色谱和高分辨率质谱联用，对步骤（B）中得到的浓缩液在质谱正负电离模式下通过“Full MS-ddMS2”的扫描方式进行一级质谱和二级质谱的全扫描；超高效液相色谱仪为UltiMate 3000；高分辨率质谱仪为Q ExactiveFocus；
所述超高效液相色谱的条件为：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱，2.1 mm×150 mm, 1.7μm, Waters；
柱温：40℃；
流速：400 μL/min；
梯度洗脱流动相：
正相：A：0.1%甲酸/甲醇水溶液，B：甲醇
负相：A：2mM醋酸铵/甲醇水溶液，B：甲醇；
流动相梯度：
所述高分辨率质谱的条件为：
电离模式：正离子模式+负离子模式；
TOF-MS扫描范围：100-1250m/z；
MS-MS扫描范围： 50-1000 m/z；
喷雾电压：正离子模式，3500V；负离子模式，-2500V；
标准化碰撞能：20，40，60；
离子源温度：320℃；
毛细管温度：300℃；
鞘气压力：48 arb；
辅助气压：10 arb；
S-lens RF：55V；
MS全扫描分辨率：35000；
MS/MS扫描分辨率：17500；
（D）PPCPs识别，将步骤（C）中血液样品检测结果与步骤（A）中建立的典型PPCPs质谱数据库进行匹配，匹配成功则确认该物质存在，实现对血液中PPCPs的识别。
2.根据权利要求1所述的一种血液中药物和个人护理品的高通量识别方法，其特征在于，所述血液样品包括全血、血浆或血清。
3.根据权利要求2所述的一种血液中药物和个人护理品的高通量识别方法，其特征在于，所述步骤（D）中，匹配包括先进行一级质谱峰m/z的匹配，允许的误差为0.01Da；比对成功后再进行二级质谱图中的特征碎片的匹配，特征碎片允许的误差为0.025Da，若特征碎片均满足匹配条件，则确认物质存在。
4. 根据权利要求3所述的一种血液中药物和个人护理品的高通量识别方法，其特征在于，所述步骤（D）中，匹配使用MS Dial软件进行，其步骤包括：
（1）导入样品质谱信息：点击“File”、“New project”新建项目，于“Project filepath”选择样品的质谱信息路径，于电离模式“Ionization type”选择软电离模式“softionization”，于分离类型“Separation type”选择色谱法“Chromatography”，于质谱方法类型 “MS method types”选择传统液相质谱“Conventional LC/MS”，于数据类型“Datatype MS1”“Data type MS/MS”选择文件数据“Profile data”，于离子模式“Ion mode”选择对应的正负离子模式，于目标组学“Target omics”选择代谢组学“Metabonomics”；
（2）选择分析文件路径：完成（1）中信息选择后，点击“next”进入“Analyzing filepaths”，选择目标分析样品；
（3）设置分析参数：完成（2）中目标样品选择后，进入“Analysis parameter setting”设置分析参数，于“Adduct”确认加合离子模式，于“Alignment”确认峰对齐参数保留时间误差“Retention time tolerance”和一级质谱质荷比误差“MS1 tolerance”分别为“0.5min”和“0.015 Da”，不进行同位素追踪“Isotopes tracking”，于“Data collection”设定数据搜集质量参数“MS1 tolerance”为“0.01Da”，“MS2 tolerance”为“0.025Da”，于峰值检测“Peak detection”设置峰值检测参数最小峰高“Minimum peak height”为“1000amplitude”，质量切片宽度“Mass section width”为“0.1 Da”；
（4）导入100种典型PPCPs质谱清单：典型PPCPs清单是由物质名称和一级质谱m/z组成的TXT文件，完成（3）中参数设定后，于“Analysis parameter setting”窗口下的“Identification”中的Advanced部分导入自建质谱信息清单，于“Text file”选择自建库路径，设定“Retention time tolerance”为0.5 min，“Accurate mass tolerance”为0.01Da，“Identification score cut off”为70%，勾选“Together with alignment”；
（5）一级质谱匹配：完成（4）中目标清单设置后点击“finish”，MS Dial开始进行一级质谱匹配，匹配结束后，点击“Peak point navigator”窗口下的“ref.matched”进行目标物匹配，“Peak spot viewer”将显示匹配到的物质，点击“show in table”将显示包括匹配物质的保留时间、一级质谱m/z、峰高、区域、高斯指数信息的表格“Peak spot table”；
（6）二级质谱匹配：于“Peak spot table”中选择物质，将于右下角的“Exp.vs.Ref”窗口显示该检出物的二级质谱碎片信息，将其与步骤（A）中建立的典型PPCPs质谱信息库中的一个或两个二级特征碎片进行匹配，MS/MS碎片允许误差为0.025Da，若碎片均满足匹配条件，则确认物质存在。
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