CN113671070A - 化妆品安全风险物质高通量筛查质谱数据库的建立及应用 - Google Patents

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CN113671070A CN202110878067.5A CN202110878067A CN113671070A CN 113671070 A CN113671070 A CN 113671070A CN 202110878067 A CN202110878067 A CN 202110878067A CN 113671070 A CN113671070 A CN 113671070A
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方继辉
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Abstract

本发明属于化妆品安全和化学品质谱检测领域，具体涉及化妆品安全风险物质高通量筛查质谱数据库的建立及应用，本发明依据超高效液相色谱‑四极杆飞行时间高分辨质谱联用仪(UPLC‑Q‑TOF)、SCIEX OS及Library View软件构建化妆品中安全风险物质高通量筛查质谱数据库，通过数据库中化合物的保留时间、母离子及碎片离子精确质量信息、同位素丰度比等对样品中的安全风险物质进行快速筛查和定性，为风险监测和隐患排查提供有效技术支撑；本发明构建数据库的最大优点在于能够用于对样品中未知物筛查时定性速度快、准确，可实现在没有标准品的情况下对样品中的多种类禁限用物质进行同时快速定性及定量检测，降低了检测成本，大大提高了检测速度和效率。

Description

化妆品安全风险物质高通量筛查质谱数据库的建立及应用
技术领域
本发明属于化妆品安全和化学品质谱检测领域，具体涉及化妆品安全风险 物质高通量筛查质谱数据库的建立及应用。
背景技术
从技术层面上看，《化妆品安全技术规范》列出了1388中禁用组分和47 种限用组分，但现有的检测标准和方法严重缺失，对其覆盖率尚不足15％，很 多禁限用组分无法检测，存在很大的监管漏洞。此外，同一个检测标准检测的 组分较少，同一个化妆品需要多个标准进行组合检测，实验室检测效率低下。 现行标准中禁限用物质定性定量最常用的液相色谱-串联三重四极杆质谱在分析 多种类目标物时抗干扰和准确度方面不具备优势。超高效液相色谱串联高分辨 质谱法(UPLC-HR-MS)常被用于样品中多组分的快速筛查和识别。高分辨质 谱的依赖性数据采集模式将对所有化合物母离子进行全扫描，然后基于设定对其进行选择性的碎裂，再进行碎片离子质量扫描，从而实现对目标物的快速筛 查和定性分析。从监管层面看，面对市场上海量化妆品，基层监管人员只能采 取随机偶遇抽检方式，针对性不强，多年抽检结果显示靶向命中率低于5％，抽 检效能低下。
基于此，开展化妆品中安全风险物质高通量筛查识别和检测关键共性技术 的研究和风险监测应用是十分有必要的。随着高分辨质谱技术的发展，飞行时 间质谱法凭借高通量、高分辨率、谱库检索、免标准品分析等优点，在痕量分 析领域得到应用。配合高通量、全质量数据采集以及谱库检索等功能可以快速、 准确地对大量化合物进行筛查测定。液相串联质谱系统是一种能够确证样品提 取物中的某一目标分析物的强有力分析手段，它不仅能够提供被测试物的色谱 保留时间，还可以得到母离子和碎片的质荷比以及离子比率信息。由于不同品 牌高分辨质谱相互之间无法实现谱图数据库的信息共享，因此需各自单独建立 适用的质谱筛查数据库，用于定性筛查及确证，检测效率低下，且难以实现对 未知风险物质的定性以及定量检测。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明旨在建立一种化妆品安全风险物质高 通量筛查质谱数据库及应用，能够对日常化妆品中安全风险物质进行快速的筛 查确证及定量。
基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种化妆品安全风险物质高通量筛查质谱数据库的 构建方法，所述数据库的建立基于超高效液相色谱、Q-TOF高分辨质谱联用仪 以及SCIEX OS和LibraryView系统；所述数据库的构建包括如下步骤：
S1：化妆品安全风险物质的选取及分类
化妆品安全风险物质包括化妆品中禁限用组分相关检测标准中规定的禁限 用化合物以及禁限用化合物的类似物、同系物、衍生物、修饰物；
将化妆品安全风险物质均按照功能、化学结构进行逐级分类；
S2：收集并整理化妆品安全风险物质的基本信息
收集化妆品安全风险物质的化合物中文名称、英文名称、分子式、CAS号、 化合物类别、mol文件、紫外最大吸收波长、三重四极杆质谱定性定量离子、检 测标准、临床推荐使用剂量，将上述信息录入数据库，同时利用LibraryView系 统依据化合物分子式以及分子中各元素的天然丰度比，计算出化合物的精确分 子量，并录入数据库；
S3：确定化合物的正负离子扫描模式和加合方式
选择化合物最佳响应值下的正负离子扫描模式和加合方式，确定母离子的 质荷比；其中，正离子扫描模式包括如下三种加合方式：[M+H]+，[M+NH4]+， [M+Na]+，负离子扫描模式为[M-H]-；
S4：利用Q-TOF高分辨质谱联用仪获取化合物的一级和二级碎片离子
将化合物的混合标准对照溶液经Q-TOF高分辨质谱联用仪，于±20～± 50eV的连续碰撞能量下产生一级和二级叠加谱图，利用SCIEX OS系统将母离 子以及子离子经连续碰撞能量下获得的碎片离子导入LibraryView系统；
S5：利用超高效液相色谱确定化合物的的色谱保留时间
将化合物的标准储备溶液经超高效液相色谱进行洗脱检测，获取化合物的 保留时间，并录入数据库；
经上述步骤S1～S5构建得到化妆品安全风险物质高通量筛查质谱数据库。
本发明通过构建上述化妆品安全风险物质高通量筛查质谱数据库，便于将 待检试样的质谱数据与数据库中记载的标准品的质谱数据行对比分析，能够实 现对安全风险物质的快速筛查和定性。
进一步地，化合物的标准储备溶液以及混合标准对照溶液由如下方法制得：
1)配制标准储备溶液
取单个化合物的标准品以甲醇或含水的甲醇或含酸的甲醇作为溶剂，配制 成ρ＝1.0mg/mL的标准储备溶液；
2)配制混合标准储备溶液
分别取等量的上述单个化合物的标准储备溶液混合，并以甲醇作为稀释溶 剂，配制成ρ＝0.02mg/mL的混合标准储备溶液；每组混合标准储备溶液由50 个化合物的标准储备溶液混合配制而成；
3)配制混合标准对照溶液
将混合标准储备溶液以甲醇作为稀释溶剂，稀释至ρ＝0.2μg/mL，作为混合 标准对照溶液。
本发明通过配制混合标准储备溶液，每组标准储备溶液由50个化合物的标 准储备溶液混合而成，能够同时对样品中多种类禁限用物质进行同时快速定性， 并利用不同浓度梯度的混合标准储备溶液，实现对阳性检出的安全风险物质进 行快速的定量。
进一步地，所述步骤S4利用Q-TOF高分辨质谱联用仪获取化合物的母离 子和子离子碎片离子过程中，设定的质谱条件如下：
离子源：电喷雾离子源(ESI源)；
监测模式：依据不同化合物性质分别选择正离子(ESI+)或负离子(ESI-) 信息依赖扫描IDA(TOF MS-IDA-TOF MS/MS)模式；
采集时间设置：30min；
离子源参数：雾化气(gas1)压力：55psi；干燥气(gas2)压力：55psi； 气帘气(Curtain gas)压力：30psi；碰撞气(CAD gas)压力：7；离子源温度： 550℃；
TOF-MS设置：电离(Polarity)模式：正离子或负离子；正离子喷雾电压： 5500V；负离子喷雾电压：-4500V；扫描质核比范围：35-2000Da；累计时间： 0.2s；正离子去簇(DP)电压：80V；负离子去簇(DP)电压：-80V；正离子 碰撞能(CE)：10V；负离子碰撞能(CE)：-10V；碰撞能扩展(CE spread)： 0V；
IDA设置：实验类型：小分子检测；最大候选离子数：10；触发二级碎裂 扫描的离子强度阈值：100cps；动态背景扣除：选择该模式；
TOF-MS/MS设置：扫描质核比范围：20-2000Da；累计时间：0.07s；正离 子去簇(DP)电压：80V；负离子去簇(DP)电压：-80V；正离子碰撞能(CE)： 35V；负离子碰撞能(CE)：-35V；碰撞能扩展(CE spread)：15V。
进一步地，步骤S5利用超高效液相色谱确定化合物的的色谱保留时间过程 中涉及到的液相条件如下：
流速：0.35mL/min；进样量：5μL；色谱柱的柱温：40℃；
正离子模式：流动相A：5mM乙酸铵含0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％ 甲酸甲醇溶液；
负离子模式：流动相A：0.005％甲酸水溶液；流动相B：0.005％甲酸甲醇 溶液；
梯度洗脱程序如下表所示。
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 98 2
1 98 2
3 80 20
8 60 40
15 40 60
20 20 80
25 5 95
27 5 95
27.5 98 2
30 98 2
进一步地，依据化合物的性质分类进行色谱柱的选择，其原则如下：依据 化合物的极性特点选取相应的色谱柱，常规化合物选用Acquity HSS T3柱(100 mm×2.1mm×1.8μm)；偏极性化合物选用Poroshell SB-Aq柱(150mm×3.0 mm×2.7μm)；强极性化合物选用Poroshell HILIC-Z柱(150mm×3.0mm×2.7 μm)。
第二方面，本发明提供一种由上述方法构建得到的化妆品安全风险物质高 通量筛查质谱数据库。
第三方面，本发明提供上述化妆品安全风险物质高通量筛查质谱数据库在 化妆品安全风险物质检测中的应用，包括利用利用信息依赖扫描IDA(TOF MS-IDA-TOF MS/MS)模式采集待检样品数据，结合已构建的数据库，采用非 目标物筛查模式(Non-targetedscreening)进行定性筛查过程。
第四方面，本发明提供一种化妆品中安全风险物质的定性及定量检测的方 法，包括如下步骤：
(1)待检试样准备
准确称取待检化妆品于饱和氯化钠溶液中分散均匀得分散液；向分散液中 加入含0.5％甲酸的乙腈溶液，混匀并超声提取30min，随后于-4℃～0℃、 8000rpm/min离心5min，取上清液并加水定量稀释、过0.22μm滤膜，制得待检 试样备用；
(2)筛查确证
将待检试样经超高效液相色谱、Q-TOF高分辨质谱联用仪进行上机检测， 超高效液相色谱的液相条件如上所述，Q-TOF高分辨质谱的质谱条件如上所述； 得到待检试样中各化合物的母离子质荷比、子离子质荷比、保留时间、同位素 信息；
将待检试样中各化合物的母离子质荷比、子离子质荷比、保留时间、同位 素信息与前述数据库中标准物质的上述信息进行比对，获取待检试样的确证点 数IPs；依据检出标准，对待检试样是否含有安全风险物质进行定性筛查；
(3)定量分析
将经筛查确证为阳性的试样，配制与该试样配方相同或相近的基质空白样 品，基质空白样品中不含有安全风险物质；取等量的五份基质空白样品，并向 基质空白样品中加入不同浓度梯度的混合标准储备溶液制得不同浓度梯度的混 合标准液；混合标准储备溶液中含有确证为阳性的安全风险物质；
将上述不同浓度梯度的混合标准液以及确证为阳性的试样进行超高效液相 色谱、Q-TOF高分辨质谱联用仪上机检测，构建标准曲线，计算得到阳性试样 中确证为阳性的安全风险物质的含量。
进一步地，所述检出标准为：
首先，确证化合物的确证点数不低于4.5IPs才能满足定性要求，其中，待 检试样的母离子质荷比与数据库中标准化合物的母离子质荷比相匹配，则记为2 IPs；待检试样的子离子的质荷比与数据库中标准化合物的子离子质荷比相匹配， 则即为2.5IPs；
其次，在满足化合物定性条件即其确证点数不低于4.5IPs的条件下，选择 化合物的母离子质荷比、子离子质荷比、保留时间、同位素信息作为定性参数， 判断上述定性参数相对于数据库中标准化合物的偏差范围，并予以相应的得分 权重，计算待检试样中化合物的Library score值，当Library score≥70则可被确 证为阳性结果，即待检试样中含有某安全风险物质。
进一步地，所述Library score值的计算规则如下：一级质量数误差小于 5ppm，得分权重占比30％；同位素相对丰度偏差小于5％，得分权重占比30％； 二级谱库匹配大于70，得分权重占比40％；如果通过标准品确认保留时间，引 入保留时间偏差小于2.5％，辅以得分权重占比20％，根据实际情况，相应扣减 其他判定标准得分权重，使得总得分为100％；还可以引入子离子质核比偏差小 于5ppm且至少有1个碎片与数据库中匹配，加以辅助定性。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明依据超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱联用仪 (UPLC-Q-TOF)、SCIEX OS及Library View软件构建化妆品中安全风险物质 高通量筛查质谱数据库，通过数据库中化合物的保留时间、母离子及碎片离子 精确质量信息、同位素丰度比等对样品中的安全风险物质进行快速筛查和定性， 为风险监测和隐患排查提供有效技术支撑；本发明构建数据库的最大优点在于 能够用于对样品中未知物筛查时定性速度快、准确，可实现在没有标准品的情 况下对样品中的多种类禁限用物质进行同时快速定性及定量检测，降低了检测 成本，大大提高了检测速度和效率。
附图说明
图1为UPLC-Q-TOF质谱信息采集界面；
图2为LibraryView化合物数据库界面；
图3为数据库筛查定性标准界面；
图4为化妆品中双氰胺筛查确定图；
图5为化妆品中泼尼松醋酸酯筛查确证图；
图6为化妆品中泼尼松筛查确证图；
图7为化妆品中夫西地酸筛查确证图；
图8为化妆品中奈甲唑啉筛查确证图；
图9为化妆品中磺胺甲基异噁唑筛查确证图；
图10为化妆品中吡利霉素筛查确证图；
图11为化妆品中阿法骨化醇筛查确证图；
图12为化妆品中溴莫尼定筛查确证图；
图13为化妆品中甲基泼尼松筛查确证图；
图14为化妆品中对乙酰氨基酚筛查确证图；
图15为化妆品中克罗米通筛查确证图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对 本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅 用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试 剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供一种化妆品安全风险高通量筛查质谱数据库的建立方法，该 数据库的建立基于超高效液相色谱、Q-TOF高分辨质谱联用仪以及SCIEX OS 和LibraryView系统，具体步骤如下：
S1：化妆品安全风险物质的选取及分类
A.化妆品安全风险物质的选取
纳入化妆品安全风险物质高通量筛查质谱数据库的化合物按照以下原则进 行选取：①、化妆品中禁限用组分检测相关标准中所覆盖的化合物，包括《化 妆品安全技术规范》理化检验方法、国标GB/T、进出口行业标准SN/T、轻工 标准QB/T和地方标准DB/T；②、文献检索中真实样品中检出的禁用组分，对 3045篇文献进行了检索，共纳入91个禁用组分；③、针对非法添加钻标避检的 特点，将同一类药物全部纳入数据库，例如实际样品中经常检出氧氟沙星，则 将沙星类共计56个化合物全部纳入；④、标准物质的可及性及购买成本；⑤、 数据库的动态扩展和持续更新，将日常风险监测、监督检验、国内外化妆品安 全事件和公告通告中新发现的禁用组分及已知化合物的同系物、衍生物和修饰 物等持续纳入数据库。目前，已将1132种化合物纳入化妆品安全风险物质清单 并已完成865种化合物的高分辨质谱数据库建库工作。
B.化妆品安全风险物质的分类
按照“按类建库、逐级筛选、分层检测、风险评估”的技术策略，对各种 安全风险物质按功能作用和化学结构进行三级分类。
一级分类按功能作用分为皮肤科药物、代谢及内分泌系统药物、抗变态反 应药物、抗微生物药物、血液系统药物、美白祛斑类、祛痘类、护肤类、染发 类、美乳类、去屑类、防腐剂、着色剂、塑化剂、荧光增白剂等。
二级分类按功能作用细分为皮肤抗病毒药物、抗角质化药物、抗真菌药物、 抗细菌药物、抗寄生虫药物、抗疟药物、皮质激素类药物、抗感染药物、抗过 敏药物、解热镇痛抗炎药物、性激素药物等。
三级分类按化学结构细分为喹诺酮类、磺胺类、糖皮质激素类、苯胺类、 吡唑酮类、有机酸类、环氧化酶-2抑制剂类、非甾体抗炎类、头孢菌素类、青 霉素类、碳青霉烯类、β内酰胺酶抑制剂类、单环β内酰胺类、氨基糖苷类、大 环内酯类、多肽类、林可酰胺类、氯霉素类、四环素类、硝基咪唑类、促肾上 腺皮质激素类、H2-受体拮抗剂类、雌激素类、选择性雌激素受体调节剂、雄激 素类、雄激素拮抗类、同化激素类、H1受体阻断类、过敏介质阻释类、多巴胺 受体阻断类、巴比妥类、磺脲类、促凝血类等。
采用上述方法对化妆品安全风险物质高通量筛查质谱数据库中涵盖的物质 及分类如表1所示。
表1化妆品安全风险物质高通量筛查质谱数据库中涵盖的物质及分类
Figure BDA0003188167350000081
Figure BDA0003188167350000091
S2：收集并整理化妆品安全风险物质的基本信息
收集化妆品安全风险物质的化合物中文名称、英文名称、分子式、CAS号、 化合物类别、mol文件、紫外最大吸收波长、三重四极杆质谱定性定量离子、检 测标准、临床推荐使用剂量，将上述信息录入数据库，同时利用LibraryView系 统依据化合物分子式以及分子中各元素的天然丰度比，计算出化合物的精确分 子量，并录入数据库。
数据库信息包含化合物的基本化学信息、色谱信息(保留时间)和高分辨 质谱信息(一级和二级精确质量数碎片)，其中色谱信息和质谱信息是化合物 定性的主要依据。数据库中化合物的色谱信息和高分辨质谱信息的准确性和稳 定性在筛查定性分析中至关重要。准确的数据库信息可以降低假阳性和假阴性 的概率。
S3：确定化合物的正负离子扫描模式和加合方式
选择化合物最佳响应值下的正负离子扫描模式和加合方式，确定母离子的 质荷比；其中，正离子扫描模式包括如下三种加合方式：[M+H]+，[M+NH4]+， [M+Na]+，负离子扫描模式为[M-H]-。
S4：利用Q-TOF高分辨质谱联用仪获取化合物的一级和二级碎片离子
将化合物的混合标准对照溶液经Q-TOF高分辨质谱联用仪，于±20～±50eV的连续碰撞能量下产生一级和二级叠加谱图，利用SCIEX OS系统将母离 子以及子离子经连续碰撞能量下获得的碎片离子导入LibraryView系统。
其中，化合物的标准储备溶液以及混合标准对照溶液由如下方法制得：
1)配制标准储备溶液(ρ＝1.0mg/mL)
精确称取10mg(精确至0.01mg)的标准品，置于10mL棕色容量瓶中，加 入甲醇充分溶解后(对于溶解性差的物质可加入少量甲酸或水促进溶解)，室 温超声10min，用甲醇定容至刻度，摇匀。置于-18℃冰箱中贮存备用。
2)配制混合标准储备溶液(ρ＝0.02mg/mL)
分别取等量的上述单个化合物的标准储备溶液0.2mL于10mL容量瓶中混 合，并以甲醇作为稀释溶剂定容至刻度，配制成ρ＝0.02mg/mL的混合标准储备 溶液；每组混合标准储备溶液由50个化合物的标准储备溶液混合配制而成。置 于-18℃冰箱中贮存备用。
3)配制混合标准对照溶液
将混合标准储备溶液以甲醇作为稀释溶剂，稀释至ρ＝0.2μg/mL，作为混合 标准对照溶液，具体采用如下方法：精确移取混合标准储备溶液0.1mL于10mL 容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，作为混合标准对照溶液。置于-18℃冰箱 中贮存备用。
利用Q-TOF高分辨质谱联用仪获取化合物的母离子和子离子碎片离子过程 中，设定的质谱条件如下：
离子源：电喷雾离子源(ESI源)；
监测模式：依据不同化合物性质分别选择正离子(ESI+)或负离子(ESI-) 信息依赖扫描IDA(TOF MS-IDA-TOF MS/MS)模式；
采集时间设置：30min；
离子源参数：雾化气(gas1)压力：55psi；干燥气(gas2)压力：55psi； 气帘气(Curtain gas)压力：30psi；碰撞气(CAD gas)压力：7；离子源温度： 550℃；
TOF-MS设置：电离(Polarity)模式：正离子或负离子；正离子喷雾电压： 5500V；负离子喷雾电压：-4500V；扫描质核比范围：35-2000Da；累计时间： 0.2s；正离子去簇(DP)电压：80V；负离子去簇(DP)电压：-80V；正离子 碰撞能(CE)：10V；负离子碰撞能(CE)：-10V；碰撞能扩展(CE spread)：0V；
IDA设置：实验类型：小分子检测；最大候选离子数：10；触发二级碎裂 扫描的离子强度阈值：100cps；动态背景扣除：选择该模式；
TOF-MS/MS设置：扫描质核比范围：20-2000Da；累计时间：0.07s；正离 子去簇(DP)电压：80V；负离子去簇(DP)电压：-80V；正离子碰撞能(CE)： 35V；负离子碰撞能(CE)：-35V；碰撞能扩展(CE spread)：15V。
每次实验前，利用厂家提供的正负离子调谐液通过CDS系统对仪器分别进 行MS和MS/MS模式的质量精度校正。序列进行中，每运行5针样品，利用厂 商提供的校正液自动进行一次质量精度校正。
S5：利用超高效液相色谱确定化合物的的色谱保留时间
将化合物的标准储备溶液经超高效液相色谱进行洗脱检测，获取化合物的 保留时间，并录入数据库。
在色谱分离分析领域，保留时间作为定性参数之一起着至关重要的作用， 尤其是区分同分异构体和同量异位素化合物。在进行数据库自动筛查时，稳定 的色谱分离系统提供稳定的保留时间可以大大提高筛查效率，也可对样品溶液 中大量的干扰物质进行初步筛查与排除。
利用超高效液相色谱确定化合物的的色谱保留时间过程中涉及到的液相条件如下：
流速：0.35mL/min；进样量：5μL；色谱柱的柱温：40℃；
依据化合物的性质分类进行色谱柱的选择，其原则如下：依据化合物的极 性特点选取相应的色谱柱，常规化合物选用Acquity HSS T3柱(100mm×2.1mm ×1.8μm)；偏极性化合物选用Poroshell SB-Aq柱(150mm×3.0mm×2.7μm)； 强极性化合物选用PoroshellHILIC-Z柱(150mm×3.0mm×2.7μm)。
正离子模式：流动相A：5mM乙酸铵含0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％ 甲酸甲醇溶液；
负离子模式：流动相A：0.005％甲酸水溶液；流动相B：0.005％甲酸甲醇 溶液。
梯度洗脱程序如下表2所示；
表2梯度洗脱程序
Figure BDA0003188167350000111
Figure BDA0003188167350000121
经上述步骤S1～S5构建得到化妆品安全风险物质高通量筛查质谱数据库， 如图1和图2所示，其中图1为UPLC-Q-TOF质谱信息采集界面，图2为 LibraryView化合物数据库界面。
化妆品安全风险物质高通量筛查质谱数据库也可根据筛查目标物的变化而 持续动态扩展，本发明构建的部分信息示例如表3所示。
表3部分化合物信息平台示例
Figure BDA0003188167350000122
Figure BDA0003188167350000131
实施例2
本实施例提供一种由实施例构建的化妆品安全风险物质高通量筛查质谱数 据库在化妆品安全风险物质检测中的应用，具体提供了一种化妆品中安全风险 物质的定性及定量检测的方法，利用信息依赖扫描IDA(TOF MS-IDA-TOF MS/MS)模式采集样品数据，结合建好的数据库采用非目标物筛查模式 (Non-targeted screening)进行定性筛查，筛查数据库可按类选取亦可选择总数 据库进行筛查匹配。
对化妆品中安全风险物质的定性及定量检测的方法，具体包括如下步骤：
(1)待检试样准备
准确称取化妆品样品0.2g(精确到0.0001g)，置于15mL离心管中，准确 加入3mL饱和氯化钠溶液，涡旋30s，分散均匀，加入含0.5％甲酸的乙腈溶液 5mL，涡旋30s，超声提取30min，涡旋混合摇匀，以8000r/min转速0℃冷冻离 心5min，吸取上清液于10mL容量瓶中，加水定容至10mL，混匀，经0.22μm 滤膜过滤后，滤液作为待检试样备用。
(2)筛查确证
将待检试样经超高效液相色谱、Q-TOF高分辨质谱联用仪进行上机检测， 超高效液相色谱的液相条件如上所述，Q-TOF高分辨质谱的质谱条件如上所述； 得到待检试样中各化合物的母离子质荷比、子离子质荷比、保留时间、同位素 信息；
将待检试样中各化合物的母离子质荷比、子离子质荷比、保留时间、同位 素信息与前述数据库中标准物质的上述信息进行比对，获取待检试样的确证点 数IPs；依据检出标准，对待检试样是否含有安全风险物质进行定性筛查。
筛查确证的原则是：根据欧盟指导文件SANTE/11813/2017和欧盟非强制执 行法案2002/657/EC，应用高分辨质谱技术分析被测试物时，分析物的确证通过 色谱信息和质谱信息获取确证点数(Identification points，IPs)，当质谱信息的 数据是由高分辨质谱采集所得，则母离子的精确质荷比与化合物离子化的质荷 比匹配将获得2个确证点，而每个碎片离子的质荷比与标准物质碎片理论质荷 比匹配将获得2.5个IPs。每个化合物的确证必须至少达到4.5IPs，才能满足定 性要求。化合物的元素组成和结构决定了其在特定色谱条件下唯一的保留性能 和天然同位素比例，并且化合物唯一的保留性能有助于分离同分异构体。因此 在满足化合物定性的4.5IPs的基础上，可选择化合物的母离子质荷比，保留时 间，碎片质荷比和同位素匹配四个参数作为定性参数。判定样品中是否含有某 化合物的方法是将采集到的母离子的质荷比、保留时间、子离子质荷比和同位 素信息与数据库中相应的标准物质的母离子质荷比、保留时间、子离子质荷比 和同位素信息进行比对，若满足所设定的偏差范围，则可确定样品中含有该物 质；若不满足设定的偏差范围，则样品中就不含该物质；所以筛查标准中各参 数偏差大小的设置直接影响定性分析的结果。若偏差范围设置过大，会导致假 阳性率高，同时数据量急剧增大；若偏差范围设置过小，会导致假阴性率增加， 造成漏检；经反复优化、总结及用加标样品和实际样品评价，最终筛查定性标 准设置如下：
确认检出的标准为：一级质量数误差小于5ppm，得分权重占比30％；同位 素相对丰度偏差小于5％，得分权重占比30％；二级谱库匹配大于70，得分权重 占比40％。如果通过标准品确认保留时间，可以引入保留时间偏差小于2.5％， 辅以得分权重占比20％，相应扣减其他判定标准得分权重，使得总得分为100％。 还可以引入碎片离子质核比偏差小于5ppm且至少有1个碎片与数据库中匹配， 加以辅助定性。通常情况下，当某个化合物碎片离子的Library score≥70时， Library confidence为绿色√时，即可被确证为阳性结果，如图3所示。如某个化 合物碎片数量少，可采用Quantitation and targetedidentification模式，将目标物 分子式和加合方式添加至components列表，进行目标物筛查以降低假阳性。应 用该数据库和筛查定性标准对692批风险监测样品进行筛查确证，共检出41批 阳性样品，因2批样品中地塞米松和倍他米松含量小于1μg/g而未筛查出，最 终假阳性率为0，假阴性率为4.6％。部分安全风险物质的筛查确证图如图4～ 图15所示。
日常筛查时采用质控标准溶液来验证系统稳定性。精确质量数验证：四级 杆飞行时间质谱(QTOF)的优势是可以准确测定准分子离子和碎片离子的精确 质荷比，并以此判断准分子离子和碎片离子的元素组成，实现对有机物结构分 析与鉴定。筛查方法的可靠性，在很大程度上取决于QTOF仪器在给定质量误 差范围内对精确质量数测定的稳定程度，对于小分子化合物，通常精确质量数 偏差的绝对值不超过5×10-6Da，即5ppm。因此，建立以精确质量数为主要参 考依据的筛查具有可行性。
欧盟(SANCO/12495/2011)对于残留分析结果进行确证的要求是至少两个 确证离子的质量准确度偏差小于5ppm，而对于QTOF-MS测定的母离子和碎片 离子均满足该要求。色谱保留时间验证：在色谱分离分析领域，作为定性参数 之一的保留时间至关重要。在进行数据库自动筛查时，各目标化合物在相同色 谱分离条件下具有稳定的保留时间至关重要，在实际样品分析中，样品溶液中 的大量干扰物质可以通过数据库中化合物的保留时间进行初步筛查与排除，从 而提高筛查分析的效率。为验证仪器、色谱条件、质谱测定参数等分析条件固 定时化合物精确质量数和保留时间重现性是否良好，可随行典型质控标准品溶 液代替混合标准品溶液对化合物质量数和保留时间的稳定性、结果的重复性进 行控制和验证。可选取不同类别、不同性质、不同质谱响应、低中高分子量、 不同保留时间的系列化合物组成质控品，并制备成浓度在定量限附近的质控标 准工作溶液。当使用质控标准工作溶液进行方法验证时，应满足以下质控条件： ①各化合物均检出相应的特征母粒子和碎片离子，且精确质量数偏差不超过 5ppm；②特征离子对信噪比SN≥7，③保留时间相对偏差在±2.5％内。质控化 合物组成见表4。质控标准储备溶液：称取双氰胺、磺胺嘧啶、加替沙星、克林 霉素、酮康唑、泊沙康唑、炔雌醇、4-硝基咪唑、磺胺噻唑、美洛昔康、柳氮磺 吡啶、阿西美辛、夫西地酸、多拉菌素标准品各约10mg(精确到0.00001g) 置于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，作为质控标准储备液。置-20℃ 保存。质控标准工作溶液：分别精密量取质控标准储备溶液适量置于同一10ml 容量瓶中，用50％乙腈溶液配制成浓度在定量下限附近的溶液。
表4质控化合物组成
Figure BDA0003188167350000151
Figure BDA0003188167350000161
(3)定量分析
将经筛查确证为阳性的试样，配制与该试样配方相同或相近的基质空白样 品，基质空白样品中不含有安全风险物质；取等量的五份基质空白样品，并向 基质空白样品中加入不同浓度梯度的混合标准储备溶液制得不同浓度梯度(如 20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL、100ng/mL)的混合标准液，混合标准 液的浓度梯度可依据实际样品进行调整；混合标准储备溶液中含有确证为阳性 的安全风险物质。
将上述不同浓度梯度的混合标准液以及确证为阳性的试样进行超高效液相 色谱、Q-TOF高分辨质谱联用仪上机检测，构建标准曲线，计算得到阳性试样 中确证为阳性的安全风险物质的含量。
实施例3
本实施例提供一种对化妆品安全风险物质进行定性检测的方法，具体步骤 如下：
建立现行国标GBT 24800.2-2009化妆品中四十一种糖皮质激素的测定及 国家局发布方法《面膜类化妆品中氟轻松检测方法》所涉及曲安西龙等42种糖 皮质激素的UPLC-Q-TOF高分辨质谱数据库。
1、收集并整理曲安西龙等42种糖皮质激素的基本信息
曲安西龙等42种糖皮质激素的中英文名称，化学分子式，CAS号，精确分 子量等基本信息见表5，mol文件从chemspider网站下载，并将基本信息录入数 据库中。同时利用LibraryView软件根据化合物分子式及各元素的天然丰度比自 动计算出化合物的精确分子量。
表5曲安西龙等42种糖皮质激素的基本信息
Figure BDA0003188167350000171
Figure BDA0003188167350000181
2、确定曲安西龙等42种糖皮质激素的正负离子模式和加合方式
选择曲安西龙等42种糖皮质激素的最佳响应值下的正负离子扫描模式和加 合方式，经实验验证，曲安西龙等42种糖皮质激素的加合方式均为正离子 [M+H]+方式。
3、获取化合物的一级和二级碎片
将曲安西龙等42种糖皮质激素用甲醇配制成混合标准对照溶液 (ρ＝0.2μg/mL)，并经过UPLC-Q-TOF进行分析，获取化合物在连续碰撞能量 (20-50eV)下产生的一级和二级叠加谱图。利用SCIEX OS软件将母离子及连 续碰撞能量下获得的碎片离子导入LibraryView软件。
采用的液相条件为：流速：0.35mL/min；进样量：5μL；柱温：40℃；色谱 柱：AcquityHSS T3柱(100mm×2.1mm×1.8μm)；流动相：A：5mM乙酸 铵含0.1％甲酸水溶液；B：0.1％甲酸甲醇溶液。梯度洗脱程序见表2。
超高效液相色谱-高分辨四级杆串联飞行时间质谱联用仪的质谱条件为：离 子源：电喷雾离子源(ESI源)；监测模式：正离子(ESI+)信息依赖扫描IDA (TOF MS-IDA-TOFMS/MS)模式；采集时间设置：30min；离子源参数：雾 化气(gas1)压力：55psi；干燥气(gas2)压力：55psi；气帘气(Curtain gas) 压力：30psi；碰撞气(CAD gas)压力：7；离子源温度：550℃；TOF-MS设 置：电离(Polarity)模式：正离子；正离子喷雾电压：5500V；扫描质核比范围：35-2000Da；累计时间：0.2s；去簇(DP)电压：80V；碰撞能(CE)： 10V；碰撞能扩展(CEspread)：0V；IDA设置：实验类型：小分子检测；最 大候选离子数：10；触发二级碎裂扫描的离子强度阈值：100cps；动态背景扣 除：选择该模式；TOF-MS/MS设置：扫描质核比范围：20-2000Da；累计时间： 0.07s；去簇(DP)电压：80V；碰撞能(CE)：35V；碰撞能扩展(CE spread)：15V。
4、确定曲安西龙等42种糖皮质激素的色谱保留时间
将曲安西龙等42种糖皮质激素的保留时间(RT)录入到数据库中。各化合 物保留时间见表5。同时将mol文件上传添加至数据库中。经过以上数据库建立 的流程，得到曲安西龙等42种糖皮质激素的高分辨质谱数据库。应用于样品中 糖皮质激素筛查时的确认检出标准为：一级质量数误差小于5ppm，得分权重占 比30％；同位素相对丰度偏差小于5％，得分权重占比30％；二级谱库匹配大于 70，得分权重占比40％。当Library score≥70时，Library confidence为绿色√时， 即可被确证为糖皮质激素阳性结果。应用该数据库和筛查定性标准对692批风 险监测样品进行筛查确证，因2批样品中地塞米松和倍他米松含量小于1μg/g 而未筛查出，最终假阳性率为0，假阴性率为4.6％。
实施例4
本实施例提供一种对化妆品安全风险物质进行定量检测的方法，具体步骤 如下：
准确称取XX祛痘膏样品0.2g(精确到0.0001g)，置于15mL离心管中， 准确加入3mL饱和氯化钠溶液，涡旋30s，分散均匀，加入含0.5％甲酸的乙腈 溶液5mL，涡旋30s，超声提取30min，涡旋混合摇匀，以8000r/min转速0℃ 冷冻离心5min，吸取上清液于10mL容量瓶中，加水定容至10mL，混匀，经 0.22μm滤膜过滤后，滤液作为供试品溶液备用。
利用信息依赖扫描IDA(TOF MS-IDA-TOF MS/MS)模式采集样品数据， 结合建好的数据库采用非目标物筛查模式进行定性筛查。采用的液相条件为： 流速：0.35mL/min；进样量：5μL；柱温：40℃；色谱柱：Acquity HSS T3柱(100 mm x 2.1mm x 1.8μm)；流动相：A：5mM乙酸铵含0.1％甲酸水溶液；B：0.1％ 甲酸甲醇溶液。梯度洗脱程序见表2。
超高效液相色谱-高分辨四级杆串联飞行时间质谱联用仪的质谱条件为：离 子源：电喷雾离子源(ESI源)；监测模式：正离子(ESI+)信息依赖扫描IDA (TOF MS-IDA-TOFMS/MS)模式；采集时间设置：30min；离子源参数：雾 化气(gas1)压力：55psi；干燥气(gas2)压力：55psi；气帘气(Curtain gas) 压力：30psi；碰撞气(CAD gas)压力：7；离子源温度：550℃；TOF-MS设 置：电离(Polarity)模式：正离子；正离子喷雾电压：5500V；扫描质核比范围：35-2000Da；累计时间：0.2s；去簇(DP)电压：80V；碰撞能(CE)： 10V；碰撞能扩展(CEspread)：0V；IDA设置：实验类型：小分子检测；最 大候选离子数：10；触发二级碎裂扫描的离子强度阈值：100cps；动态背景扣 除：选择该模式；TOF-MS/MS设置：扫描质核比范围：20-2000Da；累计时间： 0.07s；去簇(DP)电压：80V；碰撞能(CE)：35V；碰撞能扩展(CE spread)：15V。
确认检出的标准为：一级质量数误差小于5ppm，得分权重占比30％；同位 素相对丰度偏差小于5％，得分权重占比30％；二级谱库匹配大于70，得分权重 占比40％。
经化妆品安全风险物质高通量筛查质谱数据库筛查比对，确认XX祛痘膏 同时检出甲氧苄啶、泼尼松醋酸酯、泼尼松、氯倍他索丙酸酯、氯苯那敏、氯 霉素、酮康唑和磺胺甲基异噁唑。
取与待测XX祛痘膏配方相同或相近的基质空白样品5份于15mL离心管中 (0.2g/份)，分别加入甲氧苄啶、泼尼松醋酸酯、泼尼松、氯倍他索丙酸酯、 氯苯那敏、氯霉素、酮康唑和磺胺甲基异噁唑混合标准储备溶液适量，按照样 品处理操作步骤处理，配制成化合物浓度为20、40、60、80、100ng/mL的系列 基质标准工作溶液。取供试品溶液和系列基质标准工作溶液分别测定，构建化 合物浓度与相应的色谱峰面积的线性回归方程，将供试品溶液检测所得前体母 离子色谱峰面积代入线性回归方程，测得祛痘膏中甲氧苄啶含量为65.6μg/g、泼 尼松醋酸酯含量为253.3μg/g、泼尼松含量为17.1μg/g、氯倍他索丙酸酯含量为114.4μg/g、氯苯那敏含量为77.4μg/g、氯霉素含量为531.3μg/g、酮康唑含量为 203.4μg/g和磺胺甲基异噁唑含量为1136.1μg/g。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种化妆品安全风险物质高通量筛查质谱数据库的构建方法，其特征在于，所述数据库的建立基于超高效液相色谱、Q-TOF高分辨质谱联用仪以及SCIEX OS和LibraryView系统；所述数据库的构建包括如下步骤：
S1：化妆品安全风险物质的选取及分类
化妆品安全风险物质包括化妆品中禁限用组分相关检测标准中规定的禁限用化合物以及禁限用化合物的类似物、同系物、衍生物、修饰物；
将化妆品安全风险物质均按照功能、化学结构进行逐级分类；
S2：收集并整理化妆品安全风险物质的基本信息
收集化妆品安全风险物质的化合物中文名称、英文名称、分子式、CAS号、化合物类别、mol文件、紫外最大吸收波长、三重四极杆质谱定性定量离子、检测标准、临床推荐使用剂量，将上述信息录入数据库，同时利用LibraryView系统依据化合物分子式以及分子中各元素的天然丰度比，计算出化合物的精确分子量，并录入数据库；
S3：确定化合物的正负离子扫描模式和加合方式
选择化合物最佳响应值下的正负离子扫描模式和加合方式，确定母离子的质荷比；其中，正离子扫描模式包括如下三种加合方式：[M+H]+，[M+NH4]+，[M+Na]+，负离子扫描模式为[M-H]-；
S4：利用Q-TOF高分辨质谱联用仪获取化合物的一级和二级碎片离子
将化合物的混合标准对照溶液经Q-TOF高分辨质谱联用仪，于±20～±50eV的连续碰撞能量下产生一级和二级叠加谱图，利用SCIEX OS系统将母离子以及子离子经连续碰撞能量下获得的碎片离子导入LibraryView系统；
S5：利用超高效液相色谱确定化合物的的色谱保留时间
将化合物的标准储备溶液经超高效液相色谱进行洗脱检测，获取化合物的保留时间，并录入数据库；
经上述步骤S1～S5构建得到化妆品安全风险物质高通量筛查质谱数据库。
2.根据权利要求1所述数据库的构建方法，其特征在于，所述化合物的标准储备溶液以及混合标准对照溶液由如下方法制得：
1)配制标准储备溶液
取单个化合物的标准品以甲醇或含水的甲醇或含酸的甲醇作为溶剂，配制成ρ＝1.0mg/mL的标准储备溶液；
2)配制混合标准储备溶液
分别取等量的上述单个化合物的标准储备溶液混合，并以甲醇作为稀释溶剂，配制成ρ＝0.02mg/mL的混合标准储备溶液；每组混合标准储备溶液由50个化合物的标准储备溶液混合配制而成；
3)配制混合标准对照溶液
将混合标准储备溶液以甲醇作为稀释溶剂，稀释至ρ＝0.2μg/mL，作为混合标准对照溶液。
3.根据权利要求1所述数据库的构建方法，其特征在于，所述步骤S4利用Q-TOF高分辨质谱联用仪获取化合物的母离子和子离子碎片离子过程中，设定的质谱条件如下：
离子源：电喷雾离子源(ESI源)；
监测模式：依据不同化合物性质分别选择正离子(ESI+)或负离子(ESI-)信息依赖扫描IDA(TOF MS-IDA-TOF MS/MS)模式；
采集时间设置：30min；
离子源参数：雾化气(gas1)压力：55psi；干燥气(gas2)压力：55psi；气帘气(Curtaingas)压力：30psi；碰撞气(CAD gas)压力：7；离子源温度：550℃；
TOF-MS设置：电离(Polarity)模式：正离子或负离子；正离子喷雾电压：5500V；负离子喷雾电压：-4500V；扫描质核比范围：35-2000Da；累计时间：0.2s；正离子去簇(DP)电压：80V；负离子去簇(DP)电压：-80V；正离子碰撞能(CE)：10V；负离子碰撞能(CE)：-10V；碰撞能扩展(CE spread)：0V；
IDA设置：实验类型：小分子检测；最大候选离子数：10；触发二级碎裂扫描的离子强度阈值：100cps；动态背景扣除：选择该模式；
TOF-MS/MS设置：扫描质核比范围：20-2000Da；累计时间：0.07s；正离子去簇(DP)电压：80V；负离子去簇(DP)电压：-80V；正离子碰撞能(CE)：35V；负离子碰撞能(CE)：-35V；碰撞能扩展(CE spread)：15V。
4.根据权利要求1所述数据库的构建方法，其特征在于，所述步骤S5利用超高效液相色谱确定化合物的的色谱保留时间过程中涉及到的液相条件如下：
流速：0.35mL/min；进样量：5μL；色谱柱的柱温：40℃；
正离子模式：流动相A：5mM乙酸铵含0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸甲醇溶液；
负离子模式：流动相A：0.005％甲酸水溶液；流动相B：0.005％甲酸甲醇溶液；
梯度洗脱程序如下表所示。
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 98 2 1 98 2 3 80 20 8 60 40 15 40 60 20 20 80 25 5 95 27 5 95 27.5 98 2 30 98 2
5.根据权利要求4所述数据库的构建方法，其特征在于，所述依据化合物的性质分类进行色谱柱的选择，其原则如下：依据化合物的极性特点选取相应的色谱柱，常规化合物选用Acquity HSS T3柱(100mm×2.1mm×1.8μm)；偏极性化合物选用Poroshell SB-Aq柱(150mm×3.0mm×2.7μm)；强极性化合物选用Poroshell HILIC-Z柱(150mm×3.0mm×2.7μm)。
6.权利要求1～5任一项所述方法构建得到的化妆品安全风险物质高通量筛查质谱数据库。
7.权利要求6所述化妆品安全风险物质高通量筛查质谱数据库在化妆品安全风险物质检测中的应用，其特征在于，包括利用利用信息依赖扫描IDA(TOF MS-IDA-TOF MS/MS)模式采集待检样品数据，结合已构建的数据库，采用非目标物筛查模式(Non-targetedscreening)进行定性筛查过程。
8.一种化妆品中安全风险物质的定性及定量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)待检试样准备
准确称取待检化妆品于饱和氯化钠溶液中分散均匀得分散液；向分散液中加入含0.5％甲酸的乙腈溶液，混匀并超声提取30min，随后于-4℃～0℃、8000rpm/min离心5min，取上清液并加水定量稀释、过0.22μm滤膜，制得待检试样备用；
(2)筛查确证
将待检试样经超高效液相色谱、Q-TOF高分辨质谱联用仪进行上机检测，超高效液相色谱的液相条件如权利要求4所示，Q-TOF高分辨质谱的质谱条件如权利要求3所示；得到待检试样中各化合物的母离子质荷比、子离子质荷比、保留时间、同位素信息；
将待检试样中各化合物的母离子质荷比、子离子质荷比、保留时间、同位素信息与权利要求6所述数据库中标准物质的上述信息进行比对，获取待检试样的确证点数IPs；依据检出标准，对待检试样是否含有安全风险物质进行定性筛查；
(3)定量分析
将经筛查确证为阳性的试样，配制与该试样配方相同或相近的基质空白样品，基质空白样品中不含有安全风险物质；取等量的五份基质空白样品，并向基质空白样品中加入不同浓度梯度的混合标准储备溶液制得不同浓度梯度的混合标准液；混合标准储备溶液中含有确证为阳性的安全风险物质；
将上述不同浓度梯度的混合标准液以及确证为阳性的试样进行超高效液相色谱、Q-TOF高分辨质谱联用仪上机检测，构建标准曲线，计算得到阳性试样中确证为阳性的安全风险物质的含量。
9.根据权利要求8所述检测方法，其特征在于，所述检出标准为：
首先，确证化合物的确证点数不低于4.5IPs才能满足定性要求，其中，待检试样的母离子质荷比与数据库中标准化合物的母离子质荷比相匹配，则记为2IPs；待检试样的子离子的质荷比与数据库中标准化合物的子离子质荷比相匹配，则即为2.5IPs；
其次，在满足化合物定性条件即其确证点数不低于4.5IPs的条件下，选择化合物的母离子质荷比、子离子质荷比、保留时间、同位素信息作为定性参数，判断上述定性参数相对于数据库中标准化合物的偏差范围，并予以相应的得分权重，计算待检试样中化合物的Library score值，当Library score≥70则可被确证为阳性结果，即待检试样中含有某安全风险物质。
10.根据权利要求9所述检测方法，其特征在于，所述Library score值的计算规则如下：一级质量数误差小于5ppm，得分权重占比30％；同位素相对丰度偏差小于5％，得分权重占比30％；二级谱库匹配大于70，得分权重占比40％；如果通过标准品确认保留时间，引入保留时间偏差小于2.5％，辅以得分权重占比20％，根据实际情况，相应扣减其他判定标准得分权重，使得总得分为100％；还可以引入子离子质核比偏差小于5ppm且至少有1个碎片与数据库中匹配，加以辅助定性。
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