CN114354808A - 一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法，属于生物化学和分析化学领域，上述方法包括(1)样品前处理：提取污染物；(2)上机测定：通过UPLC‑Q‑Exactive液质联用对前处理后的样品进行全扫描分析检测；(3)样品峰提取；(4)污染物识别：根据提取的样品峰，通过库匹配污染物靶向识别，和/或无法靶向识别的污染物利用分子网络工具进行识别。本发明的方法仅需要微量体积(30‑100μL)的血液样品，大幅减少了样品的使用量，结合靶向识别和非靶向筛查技术确保了样品中有机化合物的检出，实现了低样本量、高通量、高灵敏识别并鉴定体内有机污染物，为环境暴露与人体健康关系的研究提供科学依据。
Description
技术领域
本发明属于生物化学和分析化学领域，具体涉及一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法。
背景技术
随着工业的发展，环境中的有机污染物，如有机农药、药物个人护理产品(PPCP)和内分泌干扰物(EDCs)等，越来越多，环境也日益复杂。当人体暴露于环境时，环境中的有机污染物可以通过皮肤接触、吸入或饮食等多种途径进入人体，从外暴露向内暴露转化，进而在体内富集或代谢，诱发炎症、慢性病(如糖尿病等)和癌症等疾病，对人类的健康构成严重威胁。血液(包括血清、血浆和全血)是了解人体受污染情况的主要生物检材，因此识别血液中的有机污染物极其重要。
识别血液中的有机污染物包括靶向和非靶向两种分析方法，前者用于高浓度化学物质，后者则用于低浓度化学物质。Rappaport等人研究发现人体系统中存在的多种外部环境污染物的浓度比食品、药品化合物或代谢物的浓度低数千倍，且通常低于实验室条件下非靶向方法的检测限(S.M.Rappaport,et al.“The Blood Exposome and Its Role inDiscovering Causes of Disease”Environ.Health Perspect.122(8),769-774(2014))，因此需要较大体积的生物样本来进行提取分析，例如美国国家健康与营养调查研究(NHANES)有关的方法需要10mL样品用于测定血清中的难降解有机物。安捷伦公司专门开发的人血浆中难降解有机污染物的GC-MS/MS分析方法，将样本的体积控制在200μL。
但是采集血液时，静脉采血属于侵入式采集方式，采样较困难的人群(如婴儿、老人等)的样品非常珍贵，因此通常无法采集足够量的样本用于分析。样本量不足，则无法进行非靶向分析，无法覆盖样本中大量低浓度的有机污染物，识别通量较低。
因此，开发一种小样本体积、高通量识别化合物的有机污染物筛查方法是非常重要的。
发明内容
1.要解决的问题
本发明针对识别血液中痕量有机污染物需要样本体积较大的问题，提供了一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法，只需微量体积(30-100μL)的血液样本可以实现高通量、高灵敏识别体内有机污染物，为环境暴露与人体健康关系的研究提供科学依据。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
本发明提供了一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法，该方法包括如下步骤：
(1)样品前处理：在96孔板中加入30～100μL血液样品，按照血样：萃取剂的体积：质量比为1：(0.54±0.2)的比例加入萃取剂，并加入固定体积的乙腈，涡旋混匀后离心取上清液，氮吹浓缩后使用100μL的乙腈复溶。
优选地，上述萃取剂为硫酸镁-氯化钠混合物。
优选地，上述固定体积的乙腈为300～400μL，用于去除血液样品中的脂质和蛋白质。进一步地，体积为300μL。如公开号为CN109187840A的中国发明专利公开的一种血液中有机污染物的高通量筛查分析方法，其中有机提取溶剂为血液体积的3倍，在实际操作时，由于血液的粘稠等特性，无法精确测量血液的体积，造成一定的误差；此外，由于溶剂体积需要根据样品量添加，因此可能无法大批量同时添加提取溶剂，使得血液样品检测效率低；本发明的乙腈添加量为固定体积，与血液样品体积无关，可以大批量同时添加，提高了检测效率。
优选地，上述涡旋混匀前，溶液中加入钢珠。进一步地，钢珠数量为2。
优选地，上述离心条件为3000～4000r，10～20min。进一步地，离心条件为3500r，15min。优选地，上述样品前处理还包括过程空白，用等体积的Fisher水代替血液样品重复样品前处理流程。
优选地，上述96孔板采用WebSealTM 96方孔微孔板(Thermo Scientific)，孔内容积1000μL，该孔板可以兼容所有96孔配置的自动进样器。
优选地，上述氮吹使用96孔氮吹仪，在室温下温和吹干，用于样品浓缩。
优选地，上述样品前处理过程中液体转移使用12通道排枪，排枪的使用可减少人为误差和提高效率。
(2)上机测定：通过UPLC-Q-Exactive液质联用对前处理后的样品进行全扫描分析检测。
优选地，上述UPLC-Q-Exactive液质联用条件为：
色谱仪：Ultimate 3000超高效液相色谱(Thermo fisher，美国)；
色谱柱：C18柱(2.1mm×50mm，2.5μm，Waters)；
柱温：40℃；
流速：0.3mL/min；
正离子模式流动相：0.1％甲酸-水溶液(A相)，甲醇(B相)；
负离子模式流动相：2mM乙酸铵水溶液(A相)，甲醇(B相)；
梯度洗脱表：
质谱仪：Q-Exactive静电场轨道阱高分辨质谱；
全扫描模式：数据依赖扫描模式；
离子源：正负电喷雾电离源；
全扫描质量范围：一级80-1000Da，二级50-800Da；
碰撞能：±35eV；
碰撞能扩散：15eV；
离子源温度：412.5℃。
(3)样品峰提取：使用MSDIAL ver 4.48软件提取步骤(2)中仪器分析得到的有机污染物谱图中的样品峰。
优选地，上述步骤(2)中仪器分析得到的有机污染物谱图结果保存为RAW文件，使用格式转换器转为ABF文件后导入MSDIAL ver 4.48软件中提取样品峰。
优选地，上述样品峰提取的参数设置为：
提峰质量范围：80-1000Da；
提峰质量误差：0.01Da；
提峰信噪比：S:N>3；
提峰保留时间：1-50min。
优选地，上述样品峰提取还包括对齐校正，对齐校正的参数设置为：
对齐保留时间误差：0.1min；
对齐质量误差：0.015Da。
优选地，上述样品峰提取还包括过滤，使用过程空白减少假阳性结果，上述样品峰过滤的参数设置为：
依据3σ原则，保留大于空白样品峰面积average+3std的样品峰面积。
(4)污染物识别：根据步骤(3)中提取的样品峰，通过库匹配污染物靶向识别，和/或无法靶向识别的污染物利用分子网络工具进行识别，分子网络就是将采集的数据和谱库中的数据进行对比，并根据相似性连接到类似谱图的分子，组成一个互联的分子网络，将数据进行可视化和注释，进一步提升鉴定通量。
优选地，上述库匹配污染物靶向识别包括在MSDIAL软件中分别加载正负离子模式的MSP数据库文件，与样品峰列表进行比对与匹配，匹配标签包括精确质量数、保留时间、同位素分布和二级谱图信息。
优选地，上述MSDIAL中设置的匹配参数为：
质量误差：一级0.002Da，二级0.01Da；
保留时间容许误差：2min；
打分值阈值：80分。
优选地，上述利用分子网络工具进行识别包括基于天然产物分子网络(TheGlobal Natural Product Social Molecular Networking,GNPS)，根据相似性对样本的质谱碎片(提峰结果)进行聚类并注释，GNPS是通过色谱峰检测和色谱峰对齐来进行数据处理的基础工具，考虑了一个分子的同位素峰、二级谱图和保留时间，适用于血液样本中化合物的高通量筛查，进一步提高鉴定通量。
优选地，上述基于GNPS平台构建分子网络的参数设置为：
Min Paris Cos:0.7；
Network Topk:10；
Maximum Connected Component Size:100；
Minimum Matched Fragment Ions:2；
Minimum Cluster Size:1；
使用的GNPS数据库有MONA、BERKELEY-LAB、BILELIB19、CASMI、SCIEX、NIH-CLINICALCOLLECTION1、NIH-CLINICALCOLLECTION2、SELLECKCHEM-FDA-PART1、SELLECKCHEM-FDA-PART2、NIH-NATURALPRODUCTSLIBRARY、NIST14-MATCHES、IOBA-NHC、PNNL-LIPIDS、IQAMDB、LDB_POSITIVE、LDB_POSITIVE、MMV_POSITIVE、NIH-SMALLMOLECULEPHARMACOLOGICALLYACTIVE。
库搜索参数设置：
Library Search Min Matched:2；
Score Threshold:0.7；
Maximum Analog Search Mass Difference:100。
3.有益效果
本发明与现有技术相比，其有益效果在于：
(1)本发明的一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法，仅需要30～100μL血液样品，大幅减少了样品的使用量，同时结合非靶向筛查技术确保了样品中有机化合物的检出，即实现了低样本量高通量的有机污染物筛查，达到微量样本即可反映人体内有机污染物暴露组情况的效果。
(2)本发明的一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法，样品前处理中提取时加入的有机溶剂体积为固定值，与血液样品的体积无关，即无须根据血液样品的体积添加固定倍数体积的有机溶剂，有利于血液样品的大批量检测，提高了工作效率。
(3)本发明的一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法，样品前处理中可以有效提取血液中的极性有机化合物，排除蛋白质干扰影响，后续结合液质分析可以高覆盖筛查有机污染物。
附图说明
图1为本发明的基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法的流程图；
图2为实施例1中的色谱流出图(A、B、C)及提取、鉴定所得样品峰数量图表(D)，其中A1：30μL全血样品进样35μl色谱流出图，A2：30μL全血血样进样35μL色谱流出图(重复实验)，A3：30μL全血血样进样85μL色谱流出图；B1：50μL全血血样进样35μL色谱流出图，B2：50μL全血血样进样35μL色谱流出图(重复实验)，B3：50μL全血血样进样85μL色谱流出图；C1：100μL全血血样进样85μL色谱流出图，C2：100μL全血血样进样85μL色谱流出图(重复实验)，C3：100μL全血血样进样85μL色谱流出图(重复实验)；
图3为基于GNPS分子网络工具识别的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
需要说明的是，除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。
任何方法或过程权利要求中所述的任何步骤可以以任何顺序执行，并且不限于权利要求中提出的顺序。
实施例1
本实施例提供一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法的验证，具体为在血样中加入四种标准物质并进行识别，其步骤为：
(1)样品制备：
取1mL血样，加入不定量的Nicotinamide、Isoleucine、Phenylalanine和L-Tryptophan四种标准物质，其浓度不高于20ppb。
(2)标准物质鉴定：
在96孔板中加入30、50和100μL的血样，按照血样：硫酸镁-氯化钠混合物为1：(0.54±0.2)的比例加入混合物，迅速加入300μL乙腈溶剂和2颗钢珠后立即涡旋混匀；混匀的样品离心(3500r，15min)并转移上清液；上清液氮吹至近干后用使用100μL乙腈复溶；每个样品制备三个重复样，过程空白则用等体积的Fisher水代替血液样品重复上述流程。
(2)通过UPLC-Q-Exactive液质联用系统(Thermo fisher，美国)对前处理后的样品进行全扫描分析检测。其仪器设置参数为：
色谱仪：Ultimate 3000超高效液相色谱；
色谱柱：C18柱(2.1mm×50mm，2.5μm)；
柱温：40℃；
流速：0.3mL/min；
流动相：0.1％甲酸-水溶液(正离子模式A相)及甲醇(B相)；
梯度洗脱：
质谱仪：Q-Exactive静电场轨道阱高分辨质谱；
全扫描模式：数据依赖扫描模式；
离子源：正电喷雾电离源；
全扫描质量范围：一级80-1000Da，二级50-800Da；
碰撞能：±35eV；
碰撞能扩散：15eV；
离子源温度：412.5℃。
(3)打开仪器分析得到的RAW文件可以得到样品的色谱流出图，使用格式转换器将RAW文件转为ABF文件，导入MSDIAL ver 4.48软件中提取样品峰。
所有样品经过峰对齐校正，并使用过程空白减少假阳性结果。提峰、对齐和过滤的参数设置为：
提峰质量范围：80-1000Da；
提峰质量误差：0.01Da；
提峰信噪比：S:N>3；
提峰保留时间：1-50min；
对齐保留时间误差：0.1min；
对齐质量误差：0.015Da；
保留大于空白样品峰面积average+3std的样品峰面积。
(4)在MSDIAL软件中加载正离子模式的MSP数据库文件(包含MassBank等数据库)与样品峰列表进行比对与匹配。匹配标签包括精确质量数、保留时间、同位素分布和二级谱图信息，MSDIAL中设置的匹配参数为：
质量误差：一级0.002Da，二级0.01Da；
保留时间容许误差：2min；
打分值阈值：80分。
结果如表1所示，标准物质在每个样品中的保留时间，二级谱图均匹配成功，其中四种标准品在所有样品中均有检出。
表1本实施例中标准物质的检测结果
实施例2
本实施例提供一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法，具体为儿童全血介质中有机污染物的库匹配可疑物识别方法，其步骤为：
(1)在96孔板中加入30、50和100μL的儿童全血样本，按照血样：硫酸镁-氯化钠混合物为1：(0.54±0.2)的比例加入混合物，迅速加入300μL乙腈溶剂和2颗钢珠后立即涡旋混匀；混匀的样品离心(3500r，15min)并转移上清液；上清液氮吹至近干后用使用100μL乙腈复溶；每个样品制备三个重复样，过程空白则用等体积的Fisher水代替血液样品重复上述流程。
(2)通过UPLC-Q-Exactive液质联用系统(Thermo fisher，美国)对前处理后的样品进行全扫描分析检测。其仪器设置参数为：
色谱仪：Ultimate 3000超高效液相色谱；
色谱柱：C18柱(2.1mm×50mm，2.5μm)；
柱温：40℃；
流速：0.3mL/min；
流动相：0.1％甲酸-水溶液(正离子模式A相)及甲醇(B相)；
梯度洗脱：
质谱仪：Q-Exactive静电场轨道阱高分辨质谱；
全扫描模式：数据依赖扫描模式；
离子源：正电喷雾电离源；
全扫描质量范围：一级80-1000Da，二级50-800Da；
碰撞能：±35eV；
碰撞能扩散：15eV；
离子源温度：412.5℃。
(3)打开仪器分析得到的RAW文件可以得到样品的色谱流出图，使用格式转换器将RAW文件转为ABF文件，导入MSDIAL ver 4.48软件中提取样品峰。
所有样品经过峰对齐校正，并使用过程空白减少假阳性结果。提峰、对齐和过滤的参数设置为：
提峰质量范围：80-1000Da；
提峰质量误差：0.01Da；
提峰信噪比：S:N>3；
提峰保留时间：1-50min；
对齐保留时间误差：0.1min；
对齐质量误差：0.015Da；
保留大于空白样品峰面积average+3std的样品峰面积。
从图2中可以看出，色谱流出图轮廓近似，出峰稳定，三组实验中识别污染物数量差异小，重复性好：100μL血样实验中大体积进样(C1、C2、C3)识别污染物与30μL和50μL血样实验的大体积进样(A3、B3)识别污染物的数量差异小，证明本发明的方法可以实现微量样本的同等筛查效果，30μL和50μL血样实验的小体积进样(A1、A2、B1、B2)与大体积进样(A3、B3)识别污染物的数量差异小，证明使用我们的方法可以实现小体积进样的同等筛查结果，减少了样本的使用量，可重复测定。
(4)在MSDIAL软件中加载正离子模式的MSP数据库文件(包含MassBank等数据库)与样品峰列表进行比对与匹配。匹配标签包括精确质量数、保留时间、同位素分布和二级谱图信息，MSDIAL中设置的匹配参数为：
质量误差：一级0.002Da，二级0.01Da；
保留时间容许误差：2min；
打分值阈值：80分。
本实例识别出的有机污染物质如表2所示，共计68种。
表2本实施例识别的有机污染物质
(5)对A3、B3、C3三组质谱数据进行基于分子网络的非靶向鉴定分析，其参数设置为：
基于GNPS平台构建分子网络的参数设置：
Min Paris Cos:0.7；
Network Topk:10；
Maximum Connected Component Size:100；
Minimum Matched Fragment Ions:2；
Minimum Cluster Size:1；
使用的GNPS数据库有MONA、BERKELEY-LAB、BILELIB19、CASMI、SCIEX、NIH-CLINICALCOLLECTION1、NIH-CLINICALCOLLECTION2、SELLECKCHEM-FDA-PART1、SELLECKCHEM-FDA-PART2、NIH-NATURALPRODUCTSLIBRARY、NIST14-MATCHES、IOBA-NHC、PNNL-LIPIDS、IQAMDB、LDB_POSITIVE、LDB_POSITIVE、MMV_POSITIVE、NIH-SMALLMOLECULEPHARMACOLOGICALLYACTIVE。
库搜索参数设置：
Library Search Min Matched:2；
Score Threshold:0.7；
Maximum Analog Search Mass Difference:100。
优选地，上述利用分子网络工具进行识别包括
基于GNPS分子网络工具识别的结果如图3所示，图中点表示识别的化合物，边表示化合物之间两两的关联性，即“母体”与碎片化模式相似性形成的“产物”，每一个簇代表一个相似性成网，其鉴定的物质如表3所示，共增加了123个新识别的化学品，这些化学品之间的相似关系在图3中体现出来。
表3基于GNPS分子网络工具识别的有机污染物质
Claims (10)
1.一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)样品前处理：在96孔板中加入30～100μL血液样品，按照血液样品：萃取剂的体积：质量比为1：(0.54±0.2)的比例加入萃取剂，并加入固定体积的乙腈，涡旋混匀后离心取上清液，氮吹浓缩后使用100μL的乙腈复溶；
(2)上机测定：通过UPLC-Q-Exactive液质联用对前处理后的样品进行全扫描分析检测；
(3)样品峰提取：将步骤(2)中仪器分析得到的有机污染物谱图结果保存为RAW文件，使用格式转换器转为ABF文件后导入MSDIAL ver 4.48软件中提取样品峰；
(4)污染物识别：根据步骤(3)中提取的样品峰，通过库匹配污染物靶向识别，和/或无法靶向识别的污染物利用分子网络工具进行识别。
2.根据权利要求1所述的一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法，其特征在于，所述萃取剂为硫酸镁-氯化钠混合物。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法，其特征在于，所述固定体积的乙腈为300～400μL。
4.根据权利要求3所述的一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法，其特征在于，所述样品前处理还包括过程空白，用等体积的Fisher水代替血液样品重复样品前处理流程。
5.根据权利要求3或4所述的一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法，其特征在于，步骤(2)中UPLC-Q-Exactive液质联用条件为：
色谱仪：Ultimate 3000超高效液相色谱(Thermo fisher，美国)；
色谱柱：C18柱(2.1mm×50mm，2.5μm，)；
柱温：40℃；
流速：0.3mL/min；
正离子模式流动相：0.1％甲酸-水溶液(A相)，甲醇(B相)；
负离子模式流动相：2mM乙酸铵水溶液(A相)，甲醇(B相)；
梯度洗脱表：
质谱仪：Q-Exactive静电场轨道阱高分辨质谱；
全扫描模式：数据依赖扫描模式；
离子源：正负电喷雾电离源；
全扫描质量范围：一级80-1000Da，二级50-800Da；
碰撞能：±35eV；
碰撞能扩散：15eV；
离子源温度：412.5℃。
6.根据权利要求5所述的一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法，其特征在于，步骤(3)中所述样品峰提取的参数设置为：
提峰质量范围：80-1000Da；
提峰质量误差：0.01Da；
提峰信噪比：S:N>3；
提峰保留时间：1-50min。
7.根据权利要求6所述的一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法，其特征在于，步骤(3)中所述样品峰提取还包括对齐校正，样品峰对齐校正的参数设置为：
对齐保留时间误差：0.1min；
对齐质量误差：0.015Da。
8.根据权利要求7所述的一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法，其特征在于，步骤(3)中所述样品峰提取还包括过滤，样品峰过滤的参数设置为：
依据3σ原则，保留大于空白样品峰面积average+3std的样品峰面积。
9.根据权利要求8所述的一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法，其特征在于，步骤(4)中所述库匹配污染物靶向识别包括在MSDIAL软件中分别加载正负离子模式的MSP数据库文件，与样品峰列表进行比对与匹配，匹配标签包括精确质量数、保留时间、同位素分布和二级谱图信息；和/或所述利用分子网络工具进行识别包括基于GNPS，根据相似性对样本的质谱碎片进行聚类并注释。
10.根据权利要求9所述的一种基于微量样本的高通量识别血液中痕量有机污染物的方法，其特征在于，
所述上述MSDIAL中设置的匹配参数为：
质量误差：一级0.002Da，二级0.01Da；
保留时间容许误差：2min；
打分值阈值：80分；
所述匹配特征离子的参数设置为：
质量误差：0.005Da；
保留时间容许误差：0.1min；
和/或所述基于GNPS平台构建分子网络的参数设置为：
Min Paris Cos:0.7；
Network Topk:10；
Maximum Connected Component Size:100；
Minimum Matched Fragment Ions:2；
Minimum Cluster Size:1；
使用的GNPS数据库有MONA、BERKELEY-LAB、BILELIB19、CASMI、SCIEX、NIH-CLINICALCOLLECTION1、NIH-CLINICALCOLLECTION2、SELLECKCHEM-FDA-PART1、SELLECKCHEM-FDA-PART2、NIH-NATURALPRODUCTSLIBRARY、NIST14-MATCHES、IOBA-NHC、PNNL-LIPIDS、IQAMDB、LDB_POSITIVE、LDB_POSITIVE、MMV_POSITIVE、NIH-SMALLMOLECULEPHARMACOLOGICALLYACTIVE。
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