CN115201392A - 一种乳品中磷脂的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于分子网络的乳品中磷脂的检测方法，包括如下步骤：A)对乳品采用溶剂提取，分离得到磷脂提取物；B)将磷脂提取物采用UHPLC‑MS进行检测分析，得到色谱数据和质谱数据；C)采用MS‑DIAL对色谱和质谱数据进行峰提取、解卷积、化合物识别和峰对齐处理，得到二级质谱图和特征量化表；D)利用GNPS平台整合二级质谱图和特征量化表绘制分子网络，联合MS‑DIAL和分子网络方法进行定性分析；E)根据所述定性分析结果，提取化合物对应的MS峰面积进行相对含量的计算。本发明提供的分析方法操作简单，分析的磷脂种类多，鉴定结果准确可靠，方便快捷。

Description

一种乳品中磷脂的检测方法

技术领域

本发明涉及乳品检测技术领域，尤其是涉及一种乳品中磷脂的检测方法。

背景技术

脂质是乳及乳制品中重要的营养成分，例如母乳中的脂质，可为婴儿的生长和发育提供40％-55％的能量。与甘油三酯相比，磷脂尽管只占总脂质的0.5％至1.0％，但由于其具有多种生理活性，近年来受到了各界广泛的关注。乳中的磷脂通常是指甘油磷脂和鞘磷脂(SM)，其中甘油磷脂可分为磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)等等。这些磷脂除了可以维持乳脂肪球的稳定存在，还具有抗炎、降低胆固醇、促进脑神经系统的发育、改善记忆等多种功能。

截止目前为止，检测磷脂的方法有TLC，HPLC-ELSD，31P-NMR，LC-MS等等。其中，LC-MS因其高灵敏度、高选择性和高准确性而广泛应用于乳及乳制品中磷脂成分的分析。然而，质谱的使用会引入上千甚至上万的图谱信息，使得数据处理仍然非常困难。

近年来出现的分子网络技术，可根据二级质谱中离子碎片的相似性，将所有分子离子数据整合成直观的网络光谱，作为一种可视化策略，被应用于分析化学。在分子网络分析中，即使在不知道样品化学成分的情况下，依然可以探索成千上万(甚至数十亿)的MS/MS质谱，因此非常适用于大数据分析。分子网络最早由Watrous应用于微生物中天然产物的研究，随后被不断应用于植物、动物和人类样本的研究。因此，分子网络在脂质组学，特别是磷脂组学的数据处理方面有巨大的潜力。

此外，分子网络是在全球天然产物社会分子网络(Global Natural ProductsSocial Molecular Networking,GNPS)数据库平台建立的，GNPS平台庞大的数据库和运算能力可以帮助匹配预测许多原本意料之外的化合物，弥补了手动建立本地数据库和鉴定化合物的不足。但是GNPS数据库并未收录很多磷脂的信息，而磷脂标准品价格昂贵，可获得的标准品数量有限，并且也仅能用于总结出结构类似的化合物，对于没有对照品的化合物类型来说鉴定仍然困难。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种乳品中磷脂的检测方法，本发明提供的方法对于磷脂的检测准确性好、精确性好和灵敏度高。

本发明提供了一种基于分子网络的乳品中磷脂的检测方法，包括如下步骤：

A)对乳品采用溶剂提取，分离得到磷脂提取物；

B)对磷脂提取物采用UHPLC-MS进行检测，得到色谱数据和质谱数据；

C)采用MS-DIAL对色谱数据和质谱数据进行峰提取、解卷积、化合物识别和峰对齐处理，得到二级质谱图和特征量化表；

D)利用GNPS平台将二级质谱图和特征量化表进行整合，联合MS-DIAL和分子网络方法进行定性分析；

E)根据所述定性分析结果，提取化合物对应的MS峰面积进行相对含量的计算。

本发明提供的基于分子网络的乳品中磷脂的检测方法首先将乳品采用溶剂萃取，分离得到磷脂提取物。

按照本发明，所述步骤A)具体为：

a)对乳品采用氯仿-甲醇进行溶剂萃取，经涡旋，超声，离心，分离有机相得到脂质粗提物；所述氯仿-甲醇溶液中氯仿和甲醇的体积比为2:1；

b)将脂质粗提物与丙酮混合，经涡旋，超声，离心，去除上清液，沉淀浓缩即得；

所述丙酮为-20℃下预冷的丙酮。

乳品和水混合，采用氯仿-甲醇溶剂溶解，涡旋，超声，所述氯仿-甲醇溶剂中氯仿和甲醇的体积比为2:1；所述超声优选具体为超声10～15min；25℃～30℃。

超声后为离心，分离有机相得到脂质粗提物；所述离心优选为3～4℃，7000～8000rpm离心10～12分钟，而后将下层有机相提取。再次加入氯仿-甲醇溶液，重复上述提取步骤1～3次，优选重复2次，合并有机相干燥，得到脂质粗提物。

将脂质粗提物与丙酮混合，所述丙酮为-20℃下预冷的丙酮；所述混合优选为涡旋混合。

而后超声，离心，去除上清液，沉淀浓缩即得。

所述超声优选在冰水中超声处理10～15min；所述离心为2℃～3℃，以9000～10000rpm离心10～12分钟。

离心后去除上清液，重复1～2次，沉淀物30℃下真空浓缩吹干，得到粗的磷脂提取物。

将磷脂提取物采用UHPLC-MS进行检测，得到色谱数据和质谱数据。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述的UHPLC-MS数据采集中，液相色谱分离条件为：色谱柱采用The Phenomenex Kinetex C18 column(2.1×100mm，2.6μm)；柱温60℃；流速0.3mL/min；流动相A:10mM CH₃COONH₄、40％H₂O和60％乙腈；流动相B：10mMCH₃COONH₄、10％乙腈和60％异丙醇；正离子模式下进样量1μL，负离子模式下进样量5μL；色谱梯度洗脱程序，

本发明其中优选实施方式中，所述梯度洗脱具体为：

0～12min 40％B～100％B；

12～13.5min 100％B；

13.5～13.7min 100％B～40％B；

13.7～18min 40％B。

在本发明的一种实施方式中，采用高通量质谱技术对纯化后的磷脂成分进行信息采集，具体检测参数为：

一级质谱采集模式为全扫描，质量范围为50～1300m/z，二级质谱采集模式为DDA和Windows Scanning，其中，DDA参数中：Top-n＝10，质量范围为50～1300m/z；离子源温度450℃；气帘气40psi；雾化气50psi；辅助气50psi；去簇电压90V；喷雾电压5500V(POS)，-4500V(NEG)；一级碰撞能量5eV，二级碰撞能量40±20eV；一级质谱累积时间0.2s，二级质谱累积时间0.05s；Cycle time 0.75s。

即为本发明先采用一级质谱采集模式为全扫描，质量范围为50～1300m/z，二级质谱采集模式为DDA；而后再次：一级质谱采集模式为全扫描，质量范围为50～1300m/z，二级质谱采集模式为Windows Scanning。

具体Windows Scanning参数设置如下：

根据DDA采集模式得到的总离子特征数目及其对应的质荷比、响应强度，设置Windows scanning的开窗参数，使每个窗口范围内的累积离子响应强度相近，即累积离子响应强度在每个窗口均匀分布。

在本发明其中一部分实施方式中，Windows Scanning部分是采用电喷雾电离(ESI)源，正离子模式喷雾电压为5500V，负离子模式喷雾电压为-4500V，源温度500℃，碰撞能40±20eV，MS1采集范围m/z为50～1300，MS1accumulation time设置为150ms；根据DDA采集模式得到的总离子特征数目及其对应的质荷比、响应强度，设置windows scanning窗口将MS1的采集范围进行划分。

采用上述DDA采集模式结合Windows Scanning可以提高离子化效率，得到更多、更全面的化合物离子特征，同时在Windows scanning的基础上提高二级质谱的质量便于整合成分子网络进行定性分析。

采用MS-DIAL对质谱数据进行峰提取、解卷积、化合物识别和峰对齐处理，得到二级质谱图和特征量化表。

在本发明的一种实施方式中，软件为MS-DIAL，版本4.60以上(prime.psc.riken.jp/compms/msdial/main.html)，其中色谱峰的强度阈值为1000amplitude，Mass slice width为0.1Da，Sigma window value为0.5，二级质谱背景噪音阈值为10amplitude，同位素离子范围为0.5Da。

利用GNPS平台将二级质谱图和特征量化表等信息进行整合，联合MS-DIAL和分子网络方法进行定性分析。

按照本发明，所述定性分析具体为：

i)按照前体离子质量公差和碎片离子质量公差筛选碎片离子，利用余弦值大于0.7和最小匹配的碎片离子设为6建立分子网络；所述前体离子质量公差设置为0.02Da，碎片离子质量公差设置为0.02Da；

ii)将GNPS分析结果导入Cytoscape 3.8.2软件，绘制可视化网络图；

iii)根据可视化网络图中各节点的相似性信息，推断出与已知化合物相似的化合物；

对于MS-DIAL识别出的少数不是磷脂或不确定的特征化合物，再次核对其母离子和二级谱图，借助LIPID MAPS等数据库以确定其具体磷脂类别，剔除假阳性保留假阴性。

本发明所述磷脂包括鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇；

其中磷脂酰胆碱的线性范围为1～75μg/mL；磷脂酰乙醇胺的线性范围为1～75μg/mL；鞘磷脂的线性范围为1～75μg/mL。

本发明所述乳品包括但不限于羊乳和牛乳；所述羊乳优选为绵羊乳。

本发明根据脂质成分的极性分布，采用Foch试剂和预冷丙酮(-20℃)从乳粉样品中提取分离纯化磷脂，相比固相萃取和薄层色谱法，溶剂萃取操作简单，可处理大批量样本。通过高效液相色谱分离，并基于高分辨率质谱技术实现对乳粉中磷脂的非靶向筛选，相比TLC，HPLC-ELSD和³¹P-NMR，能够更准确地对磷脂分子种类和含量进行分析。

本发明利用DDA模式采集结果，指导设置Windows Scanning采集模式的参数。减少离子抑制现象的发生，增加鉴定数量。

本发明技术方案采用联合MS-DIAL的分子网络进行鉴定。弥补了手动建立本地数据库和鉴定化合物的不足，同时对于无对照品的化合物类型该方法同样适用。经验证，该方法是一种快速、可靠的测定乳品中磷脂的方法，不仅能定位到磷脂的种类，还能定位到具体所含的脂肪酸组成，是一种可有效降低假阳性结果的分析方法。

本发明提供了一种基于分子网络的乳品中磷脂的鉴别方法，包括：

将上述技术方案得到的数据信息以构建主成分和正交偏最小二乘判别分析模型，得到用于区别不同品种、不同产地乳品中差异性磷脂。

本发明人发现：21种磷脂(VIP>1，P<0.05)可被用作区分这两个品种绵羊乳样品的潜在标志物。类似，有23种磷脂(VIP>1，P<0.05)可以作为区分两个产地绵羊乳样品的潜在标记物。

本发明提供了一种基于分子网络的乳品中磷脂的检测方法，包括如下步骤：A)对乳品采用溶剂提取，分离得到磷脂提取物；B)将磷脂提取物采用UHPLC-MS进行检测，得到色谱数据和质谱数据；色谱参数为：色谱柱：C18，流动相A:10mM CH₃COONH₄、40％H₂O和60％乙腈；流动相B：10mM CH₃COONH₄、10％乙腈和60％异丙醇；梯度洗脱；C)采用MS-DIAL对色谱数据和质谱数据进行峰提取、解卷积、化合物识别和峰对齐处理，得到二级质谱图和特征量化表；D)利用GNPS平台整合二级质谱图和特征量化表等信息绘制分子网络，联合MS-DIAL采用分子网络方法进行定性分析；E)根据所述定性分析结果，提取化合物对应的MS峰面积进行相对含量的计算。本发明提供的分析方法操作简便，分析的磷脂种类多，鉴定结果准确可靠，方便快捷。

附图说明

图1为联合MS-DIAL和分子网络的分析流程图；

图2为DDA&Windows Scanning和Windows Scanning两种方法的分子网络图，其中黑色节点代表磷脂；

图3为DDA&Windows Scanning和Windows Scanning两种数据采集模式下形成的网络参数比较；

图4为方法的应用，用于分析三种不同来源绵羊乳中的磷脂组成；

图5为实施例3中不同品种(A、B)的PCA分析以及OPLS-DA分析结果以及不同产地(C、D)的PCA分析以及OPLS-DA分析结果；

图6三种数据分析方法(仅用GNPS、仅用MS-DIAL以及使用联合MS-DIAL的分子网络)的比较。

具体实施方式

本发明提供了一种乳品中磷脂的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种乳品中磷脂的检测方法进行详细描述。

需要说明的是，本发明中实施例和对比例是对来自内蒙古两个牧场的东佛利生羊、来自内蒙古的戴瑞羊和来自荷兰的东佛利生羊进行分析的。具体地，在内蒙古乌兰察布市察右前旗玫瑰营镇收集新鲜戴瑞羊绵羊乳，置于已编码的50mL离心管经液氮急冷后于-80℃保存，部分经真空冷冻干燥成粉末保存于50ml样品瓶中；在内蒙古巴彦淖尔市临河区收集新鲜东佛里生羊绵羊乳，置于已编码的50mL离心管经液氮急冷后于-80℃保存，部分经真空冷冻干燥成粉末保存于50ml样品瓶中；在荷兰瓦赫宁根大学附近牧场收集新鲜东佛里生绵羊乳，真空冷冻干燥成粉末装于样品瓶中于-80℃保存。混合样品为三种来源绵羊乳乳粉均匀混合的样品。

实施例1样品前处理方法验证

一种乳品中磷脂提取、分离纯化的方法以及方法验证，包括以下步骤：

(1)采用改良过的Foch方法(氯仿-甲醇2:1v/v)从乳品中分离提取脂质成分；

具体地，以混合样品为分析目标，采用三氯甲烷：甲醇(2:1v/v)混合溶液提取乳粉复溶后的脂质成分：将0.35mL超纯水加入到60mg乳粉中，混匀后再加入1.05mL Folch试剂(氯仿-甲醇2：1v/v)。涡旋60s使其完全溶解，然后超声10min(30℃)。将混合物在4℃下以8000rpm离心10分钟，将下层的0.6mL有机相提取到一个新的干净的Ep管(b)中。接下来，在Ep管(a)中再加入0.45mL Folch试剂，上述提取步骤重复两次。将收集到的三次有机相合并并且干燥，得到脂质粗提取物。向脂质粗提物中加入0.5mL预冷(-20℃)的丙酮。将混合物涡旋60秒以充分混合，并在冰水中超声处理10分钟，然后在2℃下以10000rpm离心10分钟。接下来，去除上清液，并重复上述步骤两次。最后，将沉淀物在30℃下的真空浓缩吹干，得到粗的磷脂提取物。加入80μL异丙醇充分复溶，使用冷冻离心机在4℃下以12000rpm离心10min，吸取上清50μL于带内衬管的进样瓶中用于之后分析，设置3个平行。

(2)在DDA模式下采集样品中磷脂化合物的UHPLC-MS数据；

具体地，UHPLC部分：色谱柱采用The Phenomenex Kinetex C18 column(2.1×100mm，2.6μm)；柱温60℃；流速0.3mL/min；流动相A，10mM CH3COONH4+40％H2O+60％ACN，流动相B，10mM CH3COONH4+10％ACN+60％异丙醇；正离子模式下进样量1μL，负离子模式下进样量5μL；色谱梯度洗脱程序，0min，40％B，12min，100％B，13.5min，100％B，13.7min，40％B，18min，40％B。

质谱MS部分：一级质谱采用全扫描模式采集，质量范围为50～1300m/z，二级质谱采用DDA模式采集，Top-n＝10，质量范围为50～1300m/z。质谱分析采用如下参数，离子源温度450℃；气帘气40psi；雾化气50psi；辅助气50psi；去簇电压90V；喷雾电压5500V(POS)，-4500V(NEG)；一级碰撞能量5eV，二级碰撞能量40±20eV；一级质谱累积时间0.2s，二级质谱累积时间0.05s；Cycle time 0.75s。

(3)由DDA采集结果，优化Windows Scanning采集参数，并在Windows Scanning模式下采集样品中磷脂化合物的UHPLC-MS数据；

(4)方法学验证；

具体地，将三种磷脂标准品(PE 17:0/17:0、PC 17:0/17:0和SM d18:1/6:0)分别溶于异丙醇中，制备浓度为1mg/mL的标准溶液。然后，将标准溶液混合并稀释10倍，得到一系列的梯度(浓度范围为0.00025至25μg/mL)。当S/N≥3时，将标准浓度作为测试化合物的最低检测浓度。通过测量样品中相应标准品的相对标准偏差(RSD％)来评估方法的准确性和精确性，即日内和日间精密度。日内精密度是通过在一天内对每个样品在相同条件下进行六次重复来确定的，而日间精密度是通过对每个样品连续五天进行三次完整的分析(包括样品制备和仪器分析)而确定的。回收率是通过在脂肪提取前对样品中添加的内部标准进行一式三份的完整分析而确定的。以脱脂牛奶作为样品组C₁和分别加入指定浓度的混合标准品(0.005、0.025、0.050mg/mL的PE 17:0/17:0、PC 17:0/17:0和SM d18:1/6:0)和等量的异丙醇，重复脂质提取步骤作为样品组C₂，用以下公式计算回收率。

其中C₀为所加标准品的理论浓度，C₁和C₂为脂质提取前在不含标准品和含标准品的脱脂乳中测得的实际浓度。

表1.分析方法仪器灵敏度的验证结果

表2.分析方法的日内和日间精度的验证结果

表3.三种磷脂标品的加标回收率

三种磷脂标准品和样品中目标物的提取离子色谱峰面积的RSD％值均小于15％，说明该方法具有良好的精密度。同时，根据重现性的结果，本研究选择的条件表现出良好的稳定性和重现性。同时，在三种浓度(0.005μg/mL、0.025μg/mL和0.05μg/mL)下，PC的回收率为80.6％～107.09％，而SM和PE的回收率相对较低，这可能与进样检测前复溶过程中使用的溶剂有关。其中，鞘磷脂和磷脂酰乙醇胺在异丙醇中的溶解度不是特别理想，有文献在复溶过程中加入三氯甲烷以促进溶解，但考虑到三氯甲烷会损坏色谱柱以及目前实验方案的重现性良好，故未再更改复溶溶剂异丙醇。

实施例2

一种乳品中磷脂的检测方法，包括以下步骤：

(1)采用改良过的Foch方法(氯仿-甲醇2:1v/v)从乳品中分离提取脂质成分；

具体地，以乳粉为分析目标，采用三氯甲烷：甲醇(2:1v/v)混合溶液提取乳粉复溶后的脂质成分：将0.35mL超纯水加入到60mg乳粉中，混匀后再加入1.05mL Folch试剂(氯仿-甲醇2：1v/v)。涡旋60s使其完全溶解，然后超声10min(30℃)。将混合物在4℃下以8000rpm离心10分钟，将下层的0.6mL有机相提取到一个新的干净的Ep管(b)中。接下来，在Ep管(a)中再加入0.45mL Folch试剂，上述提取步骤重复两次。将收集到的三次有机相合并并且干燥，得到脂质粗提取物。向脂质粗提物中加入0.5mL预冷(-20℃)的丙酮。将混合物涡旋60秒以充分混合，并在冰水中超声处理10分钟，然后在2℃下以10000rpm离心10分钟。接下来，去除上清液，并重复上述步骤两次。最后，将沉淀物在30℃下的真空浓缩吹干，得到粗的磷脂提取物。加入80μL异丙醇充分复溶，使用冷冻离心机在4℃下以12000rpm离心10min，吸取上清50μL于带内衬管的进样瓶中用于之后分析，设置3个平行。

(2)在DDA模式下采集样品中磷脂化合物的UHPLC-MS数据；

具体地，UHPLC部分：色谱柱采用The Phenomenex Kinetex C18 column(2.1×100mm，2.6μm)；柱温60℃；流速0.3mL/min；流动相A，10mM CH3COONH4+40％H2O+60％ACN，流动相B，10mM CH3COONH4+10％ACN+60％异丙醇；正离子模式下进样量1μL，负离子模式下进样量5μL；色谱梯度洗脱程序，0min，40％B，12min，100％B，13.5min，100％B，13.7min，40％B，18min，40％B。

DDA部分：一级质谱采用Full Scan模式采集，质量范围为50～1300m/z，二级质谱采用DDA模式采集，Top-n＝10，质量范围为50～1300m/z。质谱分析采用如下参数，离子源温度450℃；气帘气40psi；雾化气50psi；辅助气50psi；去簇电压90V；喷雾电压5500V(POS)，-4500V(NEG)；一级碰撞能量5eV，二级碰撞能量40±20eV；一级质谱累积时间0.2s，二级质谱累积时间0.05s；Cycle time 0.75s。

(3)由DDA采集结果，优化Windows Scanning采集参数，并在Windows Scanning模式下采集样品中磷脂化合物的UHPLC-MS数据；

(4)利用软件对步骤(1)采集到的质谱数据进行峰提取、解卷积、化合物识别和峰对齐等处理。

具体地，通过Reifycs文件转换器，将收集的原始数据转换成ABF(分析基础文件)格式，然后将这些文件导入MS-DIAL进行峰提取、解卷积、化合物识别和峰对齐等处理。其中色谱峰的强度阈值为1000amplitude，Mass slice width为0.1Da，Sigma window value为0.5，二级质谱背景噪音阈值为10amplitude，同位素离子范围为0.5Da。

(5)基于步骤(3)得到的MS/MS光谱和特征量化表，利用GNPS平台(Global NaturalProducts Social Molecular Networking)，采用分子网络方法进行定性分析。

具体地，MS-DIAL可以导出MS/MS光谱和特征量化表。利用GNPS(全球天然产物社会分子网络)平台进行数据整合。其中，前体离子质量公差设置为0.02Da，碎片离子质量公差设置为0.02Da。然后筛选碎片离子，利用余弦值大于0.7和最小匹配的碎片离子设为6建立分子网络。根据网络图中各节点的相似性信息，我们可以推断出与已知化合物相似的化合物。在磷脂网络中，对于MS-DIAL识别出的少数不是磷脂或不确定的特征化合物，结合LIPIDMAPS等数据库再次检查其母离子和二级谱图以确定其具体磷脂类别，剔除假阳性保留假阴性。

(6)结合步骤(5)的鉴定结果，为每个化合物选择了一种加合离子形式，根据鉴定的化合物信息，提取对应的MS峰面积进行相对定量分析。

对比例1直接采用Windows Scanning采集模式

(1)同实施例2步骤(1)；

(2)在Windows Scanning模式下采集样品中磷脂化合物的UHPLC-MS数据；

具体地，UHPLC部分：色谱柱采用The Phenomenex Kinetex C18 column(2.1×100mm，2.6μm)；柱温60℃；流速0.3mL/min；流动相A，10mM CH3COONH4+40％H2O+60％ACN，流动相B，10mM CH3COONH4+10％ACN+60％异丙醇；正离子模式下进样量1μL，负离子模式下进样量5μL；色谱梯度洗脱程序，0min，40％B，12min，100％B，13.5min，100％B，13.7min，40％B，18min，40％B。

Windows Scanning部分：Windows Scanning部分：电喷雾电离(ESI)源，正离子模式喷雾电压为5500V，负离子模式喷雾电压为-4500V，源温度500℃，碰撞能40±20eV，MS1采集范围为100到1000Da；MS1 accumulation time设置为150ms；按照45Da/窗口将MS1的采集范围划分为20个窗口，每个窗口的MS2 accumulation time设置为45ms，采集范围设置为40到100Da。Cycle time为150ms+45ms*20+50ms＝1100ms。。

(3)-(5)同实施例2步骤(4)到(6)；

通过图2和图3可以发现，由于Windows Scanning的采集特点，只采用WindowsScanning采集模式时，同一时间有较多离子与目标离子共流出，未预先进行筛选，所有的离子都被破碎，由于有其他母离子碎片的干扰，造成对解卷积的要求很高，经MS-DIAL解卷积后得到的串联质谱图中干扰峰仍然比较多，由于分子网络主要是根据质谱图相似度结成网络的。先经DDA模式得到特征峰的个数以及对应的响应强度，控制每个窗口的累积响应强度，减少了离子抑制现象的发生，同时，解卷积的困难程度降低，即DDA指导WindowsScanning的采集模式下得到的数据相对更适合用分子网络进行分析。

实施例3磷脂分析方法的应用

利用建立的分析方法分析不同品种、产地的绵羊乳中的磷脂。

(1)采用改良过的Foch方法(氯仿-甲醇2:1v/v)从乳品中分离提取脂质成分；

具体地，以内蒙东佛里生羊(20个样本)、荷兰东佛里生羊(15个样本)以及内蒙戴瑞羊(11个样本)为分析目标，采用三氯甲烷：甲醇(2:1v/v)混合溶液提取乳粉复溶后的脂质成分：将0.35mL超纯水加入到60mg乳粉中，混匀后再加入1.05mL Folch试剂(氯仿-甲醇2：1v/v)。涡旋60s使其完全溶解，然后超声10min(30℃)。将混合物在4℃下以8000rpm离心10分钟，将下层的0.6mL有机相提取到一个新的干净的Ep管(b)中。接下来，在Ep管(a)中再加入0.45mL Folch试剂，上述提取步骤重复两次。将收集到的三次有机相合并并且干燥，得到脂质粗提取物。向脂质粗提物中加入0.5mL预冷(-20℃)的丙酮。将混合物涡旋60秒以充分混合，并在冰水中超声处理10分钟，然后在2℃下以10000rpm离心10分钟。接下来，去除上清液，并重复上述步骤两次。最后，将沉淀物在30℃下的真空浓缩吹干，得到粗的磷脂提取物。加入80μL异丙醇充分复溶，使用冷冻离心机在4℃下以12000rpm离心10min，吸取上清50μL于带内衬管的进样瓶中用于之后分析。脂质提取物随机注射，每9个真实样品注射一个质量控制(QC)样品，以进行LC-MS稳定性控制。LC-MS批次从空白和随后3个QC样品开始，以平衡色谱柱。在批量运行过程中，脂质提取物保存在自动进样样品盘中，温度为8℃。

(2)-(6)同实施例2步骤(2)-(6)。

(7)使用化学计量学分析步骤(6)所得脂质成分的峰表中包含的数据信息，以构建主成分和正交偏最小二乘判别分析模型，得到用于区别不同品种(东佛里生羊和戴瑞羊)、不同产地(中国内蒙和荷兰)绵羊乳中差异性磷脂。

由图4可以发现在三种来源的绵羊乳中磷脂的研究中，正离子模式和负离子模式下分别鉴定了91和114种磷脂，可见，该方法是一种快速、可靠的测定乳品中磷脂的方法，并且可有效降低假阳性结果的发生。图5中的PCA分析，对于东佛里生羊和戴瑞羊绵羊乳而言，发现前五个主成分的累积贡献率为90.5％，用前两个主成分生成PCA得分图，发现两个不同品种的样本可以基本分离(图5A)。基于PCA的结果，采用了正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)用于不同品种绵羊奶的分析，而OPLS-DA得分图同样也显示出良好的分离效果。根据OPLS-DA模型得到VIP值(投影中的变量重要性)。其中VIP得分大于1且P值小于0.05的磷脂被认为有潜在意义，可用于区分这两个不同的品种。总之，21种磷脂(VIP>1，P<0.05)可被用作区分这两个品种羊奶样品的潜在标志物。类似，有23种磷脂(VIP>1，P<0.05)可以作为区分两个产地绵羊乳样品的潜在标记物。

表4三种来源的绵羊乳磷脂的半定量分析

表5不同品种(东佛里生羊和戴瑞羊)绵羊乳中的差异性磷脂

表6不同产地(内蒙和荷兰)绵羊乳中的差异性磷脂

对比例2(GNPS鉴定结果)

(1)-(3)同实施例2步骤(1)到(3)

(4)将原始数据文件通过格式转换，利用GNPS平台绘制分子网络，其中，前体离子质量公差设置为0.02Da，碎片离子质量公差设置为0.02Da。然后筛选碎片离子，利用余弦值大于0.7和最小匹配的碎片离子设为6建立分子网络进行鉴定。并对GNPS的鉴定结果进行评估。

对比例3(MS-DIAL鉴定结果)

(1)-(3)同实施例2步骤(1)到(3)

(4)利用软件对步骤(3)采集到的质谱数据进行峰提取、解卷积、化合物识别和峰对齐等处理。

具体地，通过Reifycs文件转换器，将收集的原始数据转换成ABF(分析基础文件)格式，然后将这些文件导入MS-DIAL进行峰提取、解卷积、化合物识别和峰对齐等处理。其中色谱峰的强度阈值为1000amplitude，Mass slice width为0.1Da，Sigma window value为0.5，二级质谱背景噪音阈值为10amplitude，同位素离子范围为0.5Da。通过与谱库中磷脂的二级质谱对比，直接对MS-DIAL的鉴定结果进行评估。

经比较，发现GNPS数据库只鉴定出了75个磷脂特征，而MS-DIAL更多，但是假阳性的比例也很高，达到7.74％，通过两者结合，能够保留尽可能多的磷脂的特征的基础上大大降低假阳性的比例，在鉴定磷脂方面具有极大的应用潜力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于分子网络的乳品中磷脂的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

A)对乳品采用溶剂提取，分离得到磷脂提取物；

B)对磷脂提取物采用UHPLC-MS进行检测，得到色谱数据和质谱数据；

C)采用MS-DIAL对色谱数据和质谱数据进行峰提取、解卷积、化合物识别和峰对齐处理，得到二级质谱图和特征量化表；

D)利用GNPS平台对所得二级质谱图和特征量化表进行整合绘制分子网络，联合MS-DIAL和分子网络方法进行定性分析；

E)根据所述定性分析结果，提取化合物对应的MS峰面积进行相对含量的计算。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤A)具体为：

a)乳品采用氯仿-甲醇进行溶剂萃取，经涡旋、超声、离心，分离有机相，浓缩得到脂质粗提物；所述氯仿-甲醇溶剂中氯仿和甲醇的体积比为2:1；

b)将脂质粗提物与丙酮混合，经涡旋、超声、离心，去除上清液，沉淀浓缩即得磷脂提取物；所述丙酮为-20℃下预冷的丙酮。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤B)所述色谱参数为：

色谱柱：The Phenomenex Kinetex C18 column(2.1×100mm，2.6μm)；柱温为60℃；流动相A:10mM CH₃COONH₄、40％H₂O和60％乙腈；流动相B：10mM CH₃COONH₄、10％乙腈和60％异丙醇；流动相流速为0.3mL/min；正离子模式下进样量1μL，负离子模式下进样量5μL。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体为：

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤B)质谱参数为：

一级质谱采集模式为全扫描，质量范围为50～1300m/z，二级质谱采集模式为DDA和Windows Scanning，其中，DDA参数中：Top-n＝10，质量范围为50～1300m/z；离子源温度450℃；气帘气40psi；雾化气50psi；辅助气50psi；去簇电压90V；喷雾电压5500V(POS)，-4500V(NEG)；一级碰撞能量5eV，二级碰撞能量40±20eV；一级质谱累积时间0.2s，二级质谱累积时间0.05s；Cycle time 0.75s；Windows Scanning参数中：正离子模式喷雾电压为5500V，负离子模式喷雾电压为-4500V，源温度500℃，碰撞能40±20eV，MS1采集范围为50～1300m/z，MS1 accumulation time设置为150ms；根据DDA采集模式得到的总离子特征数目及其对应的质荷比、响应强度，设置windows scanning窗口将MS1的采集范围进行划分。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤C)所述MS-DIAL的参数为：

色谱峰的强度阈值为1000amplitude，Mass slice width为0.1Da，Sigma windowvalue为0.5，二级质谱背景噪音阈值为10amplitude，同位素离子范围为0.5Da。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤D)所述定性分析具体为：

i)按照前体离子质量公差和碎片离子质量公差筛选碎片离子，利用余弦值大于0.7和最小匹配的碎片离子设为6建立分子网络；所述前体离子质量公差设置为0.02Da，碎片离子质量公差设置为0.02Da；

ii)将GNPS分析结果导入Cytoscape 3.8.2软件，绘制可视化网络图；

iii)根据可视化网络图中各节点的相似性信息，推断出与已知化合物相似的化合物；

对于MS-DIAL识别出的少数不是磷脂或不确定的特征化合物，再次核对其母离子和二级谱图，借助LIPID MAPS等数据库以确定其具体磷脂类别。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述磷脂包括鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇；

其中磷脂酰胆碱的线性范围为1～75μg/mL；磷脂酰乙醇胺的线性范围为1～75μg/mL；鞘磷脂的线性范围为1～75μg/mL。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述乳品包括羊乳或牛乳。

10.一种基于分子网络的乳品中磷脂的鉴别方法，其特征在于，包括：

将权利要求1～9任一项得到的数据信息以构建主成分和正交偏最小二乘判别分析模型，得到用于区别不同品种、不同产地乳品中差异性磷脂。

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