CN108593821B - 一种用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法 - Google Patents
一种用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法，取微量组织样本于预先加入预冻的甲醇‑水溶液中，经低温珠撞匀浆后，离心取上清液用于代谢组学研究，组织残渣加入预冻叔丁基甲醚，再次匀浆离心后用于脂质组学研究。本发明通过微量的组织能实现亲水和亲脂性内源性代谢物的同时提取，分别用于代谢组学和脂质组学研究，与文献报道方法相比，通过两步分别提取，避免了混合溶剂一步提取再通过两相分离实现亲水和亲脂代谢物提取过程中单一提取体系难以实现脂质全谱覆盖，以及部分亲水性的代谢物在相分离过程中部分分配到脂质提取层的技术问题，同时采用MTBE提取具有比二氯甲烷‑甲醇更高的脂质提取效率和更便利的实验操作性。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，具体地说，是一种用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法。
背景技术
组织样本，特别是微量病例样本和小动物的组织样本在进行包括生化指标、免疫、组织切片、基因和蛋白以及组学分析时，常遇到样品的量不足以进行如此多的测试分析，这就需要建立一些高通量适合同一样本能够同时获得多个检测参数的分析方法。代谢组学和脂质组学作为系统生物学研究的方法，这两种组学能获得相互关联的代谢指标，同一样本同时用于两组学的研究，可以避免取两份样品分别用于两组学研究所带来的由于取样位置的差异而影响两组学数据的关联性和一致性；同时两组学合并进行样品前处理，不仅节约了人力、物力和成本，更重要的是节约了时间，提高了样品前处理的通量性。
甲醇(MeOH)-水和甲基叔丁基醚(MTBE)体系已广泛地分别应用到组织样本亲水性和亲脂性代谢物的提取。专利文献CN103776911A采用MeOH-H2O-MTBE同时提取冷冻干燥组织样本中的亲水性和亲脂性的样本，然后通过补加H2O实现水相和MTBE相分离，分别获得亲水性(水相中)和亲脂性(MTBE中)代谢物的提取，由于采用混合溶剂体系，其极性单一，难以覆盖高极性和低极性的代谢物，另外在相分离时，由于MTBE极性稍大，会有一部分极性偏小的亲水性代谢物分配到MTBE层，而这一部分代谢物在反向色谱(RPC)分离时，由于极性较大有可能出现色谱不保留或者色谱峰性差等问题。氯代烷烃—H2O是脂质组学提取的重要溶剂体系，也有研究报道依次分别采用甲醇(MeOH)-H2O和二氯甲烷(DCM)-MeOH体系提取组织样本中亲水性和亲脂性代谢物，但在采用MeOH-H2O进行提取时，该提取体系会影响脂质代谢物的聚集，可能使它们形成亲水性部分朝外而亲脂性部位朝内的胶束，H2O会以氢键的形式与脂质分子作用而在胶束外层形成水膜，当采用DCM-MeOH脂质提取时，由于该体系水溶性很差而不能突破水膜及其脂质胶束外层，则不能有效地溶解脂质分子实现脂质提取。同时DCM作为氯代试剂具有高毒性外，还由于DCM的高密度特性，提取完毕经离心后提取溶液(DCM溶液)在下层而组织残渣在上层，严重影响提取溶液与组织残渣的分离以及提取溶液的转移。
因此针对现有技术的缺点，特别是类似技术方法的不足，有必要提供一种提取效率更高，稳定性好的提取方法，用于组织样本代谢组学和脂质组学研究，使亲水性和亲脂性代谢物在两种提取体系中实现较好地分配，避免部分亲水性的代谢物在相分离过程中部分分配到脂质提取层所带来的色谱分离问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种微量组织样品亲水性和亲脂性代谢物两步连续提取的新方法，相比传统采用两份样品完成亲水性和亲脂性代谢物提取方法具有消耗样品小，高通量，不仅节约人力、物力和财力，更节省了时间，与文献报道类似方法相比，该方法提取效率更高，稳定性好，亲水性和亲脂性代谢物在两种提取体系中实现较好地分配，避免部分亲水性的代谢物在相分离过程中部分分配到脂质提取层所带来的色谱分离问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法，先后采用预冻的甲醇(MeOH)-水和叔丁基甲醚(MTBE)溶剂体系分两步对组织样本进行提取，获得亲水性和亲脂性提取物，亲水性提取物采用亲水性作用色谱高分辨质谱(HILIC-HRMS)分析用于代谢组学研究，亲脂性提取物采用反向色谱高分辨质谱(RPC-HRMS)分析用于脂质组学研究。
作为本发明的一个优选实施方案，分别采用两个提取体系：预冻MeOH-水和预冻MTBE，预冻MeOH-水用于亲水性代谢物提取，预冻MTBE用于亲脂性代谢物提取；先进行亲水性代谢物的提取，待移除提取溶液后，其提取组织残渣用于亲脂性代谢物的提取；所述亲水性代谢物提取中MeOH与水的体积比为0.1-10:1。
作为本发明的一个优选实施方案，整个操作保持低温，所述低温是指≤4℃。
作为本发明的一个优选实施方案，所述亲水性代谢物提取中MeOH与水的体积比为1:1。
作为本发明的一个优选实施方案，所述组织样本为离体生物组织，提取的样本类型包括所有动物和人组织样本，同一份实验样品用于亲水性和亲脂性代谢物的提取。
例如，该生物组织可以是肝组织、肾上腺组织、阑尾组织、膀胱组织、肠道组织、脑组织、乳腺组织、支气管、冠状组织、耳组织、食管组织、眼组织、胆囊组织、生殖器组织、心脏组织、下丘脑组织、肾组织、大肠组织、肠组织、喉组织、肺组织、淋巴结、口腔组织、鼻组织、胰腺组织、甲状旁腺组织、垂体组织、前列腺组织、直肠组织、唾液腺组织、骨骼肌组织、皮肤组织等等。
作为本发明的一个优选实施方案，采用新鲜冷冻组织进行提取。
作为本发明的一个优选实施方案，提取方法包括：取微量组织样本于预冻的甲醇(MeOH)-水溶液中，经低温珠撞匀浆后，离心取上清液用于代谢组学研究，提取后的组织残渣加入预冻叔丁基甲醚(MTBE)，再次匀浆离心后用于脂质组学研究。
作为本发明的一个优选实施方案，提取方法具体如下：
A)取新鲜组织或解冻组织样品200-300mg于具塞离心管；
B)按照每28mg组织样本加入100μL的溶剂比例加入适当体积的亲水性代谢物提取溶液冻MeOH-水(1/1，v/v)，然后在离心管中加入事先分别用MeOH和MTBE超声波清洗过的钢珠，密封后置于干冰30s，取出后立即置于全自动样品快速研磨仪中研磨2次，研磨频率为60Hz，研磨时间为20s；
C)研磨完毕，立即取出样品在13,000rpm转速下低温(4℃)离心20min，离心完毕，准确移取50μL上清液于全回收的进样瓶中，置于离心旋转蒸发器中浓缩之干，作为亲水性部分提取物；
D)待取完亲水性样品提取液，立即将离心管中剩余的溶液彻底移除，移除后，在剩余的组织残渣中加入与亲水性代谢物提取溶液体积相同的脂质代谢物提取溶液，研磨完毕按照亲水性代谢物提取的方法进行样品离心、50μL样品转移和浓缩，作为脂质部分提取物。
E)在上述亲水性提取物和脂质类提取物中分别加入250μL预先冷冻(4℃)的95％乙腈(ACN)和水-ACN-异丙醇(ISP)(1/1/2，v/v/v)，剧烈震荡30s，超声波辅助复溶1min，在13,000rpm条件下低温(4℃)离心20min，取上清液过0.22μm的过滤膜，分别作为亲水性和脂质类代谢物进样分析样品，置于-20℃待上机检测分析。
F)亲水性样品采用HILIC-HRMS进行数据采集，亲脂性样品采用RPC-HRMS进行数据采集。仪器分析的进样顺序、相关的质控和评价与第三部分相同，针对每一批样品，上样顺序依次为溶剂空白、过程空白、QC样品、12个样品、QC样品、12个样品……QC样品、QC稀释样品和溶剂空白，样品以随机生成的顺序进行进样。MetID样品穿插于这些样品中，采用全MS扫描+DDMS2采集数据。整批数据的质量评价主要基于对溶剂空白、过程空白、QC和稀释QC等样品的数据分析。
G)样品采集的数据采用组学数据处理和分析软件进行包括特征提取、样品峰对齐、原始数据数据导出、原始数据过滤以及标准化等处理、组学多元统计分析以及代谢物质谱鉴定。
本发明与现有类似同时实现组织样本亲水和亲脂代谢物提取方法比较，具有以下优点：
1、与MeOH-H2O-MTBE同时提取冷冻干燥组织样本中的亲水性和亲脂性的样本的方法相比，一是采用新鲜冷冻样品，而不是冷冻干燥样品，减少由于过多样品处理出现代谢物降解丢失或次级代谢物新增，同时本方法在整个过程维持低温状态，确保代谢物的稳定；二是分别采用两种不同极性体系溶剂提取，避免了MeOH-H2O-MTBE同时提取所出现的问题——由于采用混合溶剂使提取很难覆盖具有不同极性的脂质全谱，由于MTBE极性较大，水相中较低极性的亲水性代谢物会部分分配到MTBE，这些较高极性的代谢物在RPC分离中可能出现峰性差甚至出现不保留等问题。
2、与MeOH-H2O和DCM-MeOH体系分别提取组织样本中亲水性和亲脂性代谢物方法相比，本发明采用MTBE具有较好的水溶性，能突破溶解脂质分子的屏障，提取效率高，本方法数据结论也证实该推论，同时MTBE是绿色试剂，MTBE密度低于DCM，提取液固液分离后在组织残渣上层，有利于实验操作和实验自动化的实施。
附图说明
附图1:大鼠肝脏两种脂质组学提取方法数据轮廓分析比较(A和B：ESI(-)，C和D：ESI(+)，A和C：本发明MTBE提取，B和D：文献DCM-MeOH(3:1,v/v)方法)。图中：Cer：神经酰胺，CerG：简单葡糖苷(脂)酰鞘氨醇系列，CL：心磷脂，DG：甘油二酯，dMePE：二甲基磷脂酰乙醇胺，GM3：神经节糖苷脂，LdMePE：溶血二甲基磷脂酰乙醇胺，LPC：溶血磷脂胆碱，LPE：溶血磷脂酰乙醇胺，LPG：溶血磷脂酰甘油，LPI：溶血磷脂酰肌醇，LPMe：溶血磷脂酰甲醇，LPS：溶血磷脂酰丝氨酸，MG：单甘油酯，MGDG：单半乳糖基甘油二酯，OAHFA：(O-酰基)-1-羟基脂肪酸，PA：磷脂酸，PC：卵磷脂，PE：磷脂酰乙醇胺，Pet：磷脂酰乙醇，PG：磷脂酰甘油，PI：磷脂酰肌醇，PIP：磷脂酰肌醇磷酸盐，PMe：磷脂酰甲醇，PS：磷脂酰丝氨酸，SM：鞘磷脂，TG：甘油三酯。
附图2:大鼠肝脏两种脂质组学提取方法特征信息量(A&C)、重复性(B)和响应强度(D)比较图。
附图3:大鼠肝脏两种脂质组学提取方法脂质类别差异分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1大鼠干燥样品亲水性和亲脂性样品提取和分析
A)采用一只正常大鼠肝脏，称量18份样品于具塞离心管，每份样品200-300mg。
B)按照每28mg组织样本加入100μL的溶剂比例加入适当体积的亲水性代谢物提取溶液冻MeOH-水(1/1，v/v)，然后在离心管中加入事先分别用MeOH和MTBE超声波清洗过的钢珠，密封后置于干冰30s，取出后立即置于全自动样品快速研磨仪中研磨2次，研磨频率为60Hz，研磨时间为20s。
C)研磨完毕，立即取出样品在13,000rpm转速下低温(4℃)离心20min，离心完毕，准确移取50μL上清液于全回收的进样瓶(最小进样量为10μL)中，置于离心旋转蒸发器(操作温度：45℃，真空：0.1psi，转速：3000rpm)中浓缩之干，作为亲水性部分提取物。
D)待取完亲水性样品提取液，立即将离心管中剩余的溶液彻底移除(操作小心，防止移除组织残渣)，移除后，在剩余的组织残渣中加入与亲水性代谢物提取溶液体积相同的脂质代谢物提取溶液(即，立即置于全自动样品快速研磨仪研磨2次(60Hz×20s)，研磨完毕按照亲水性代谢物提取的方法进行样品离心、50μL样品转移和浓缩，作为脂质部分提取物。
E)在上述亲水性提取物和脂质类提取物中分别加入250μL预先冷冻(4℃)的95％ACN和水-ACN-ISP(1/1/2，v/v/v)，剧烈震荡30s，超声波辅助复溶1min，在13,000rpm条件下低温(4℃)离心20min，取上清液过0.22μm的过滤膜，分别作为亲水性和脂质类代谢物进样分析样品，置于-20℃待上机检测分析。
F)亲水性样品采用HILIC-HRMS进行数据采集，亲脂性样品采用RPC-HRMS进行数据采集。
G)亲水性样品HILIC分离，UPLC色谱分离采用ACQUITY
BEH HILIC(2.1×100mm，1.7μm Waters公司)色谱柱，流动相A为ACN-H2O(95/5，v/v)，流动相B为ACN-H2O(50/50，v/v)，流动相A、B均含有10mM甲酸铵及0.1％甲酸。色谱分离的洗脱梯度参照文献，设定为1％B(0.0-2.0min，0.4mL/min)，1％-55％A(2.0-8.0min，0.4mL/min)，55％-99％B(8.0-9.0min，0.4mL/min)，99％B(9.0-9.1min，0.4-0.8mL/min)，99％B(9.1-11.0min，0.8mL/min)，99％-1％B(11.0-11.1min，0.8mL/min)，1％B(11.1-19.0min，0.8mL/min)，1％B(19.0-19.1min，0.8-0.4mL/min)，1％B(19.1-23.0min，0.4mL/min)；柱温箱和样品盘的温度分别设定为35℃和4℃，进样量为5μL。脂类样品RPC分离：采用反相色谱柱ACQUITY CSHC18(2.1×100mm，1.7μm，Waters公司)；流动相A为ACN:水(60:40，v/v)，流动相B为ISP:ACN(90:10，v/v)，流动相A和B中均含有10mM甲酸铵和0.1％甲酸，采用0.4min/mL的流速梯度洗脱，洗脱程序为40％-43％B(0.0-2.0min)，43％-50％B(2.0-2.1min)，50％-54％B(2.1-12.0min)，54％-70％B(12.0-12.1min)，70％-99％B(12.1-18.0min)，99％-40％B(18.0-18.1min)，40％B(18.1-20.0min)。柱温箱和样品盘温度分别设定为55和4℃，样品进样量为5μL。
H)HRMS分析条件：Q Extract质谱仪使用前先用调谐液进行正负离子模式调谐，调谐通过后方可进行脂质样品分析。ESI(+)电离电压：3.8Kev(亲水)和3.3KeV(亲脂)，ESI(-)电离电压：3.3KeV(亲水)和2.5KeV(亲脂)；数据采集时间为23min；离子传输毛细管温度：350℃；鞘气(氮气)流速：40arb，辅助气流速：10arb；数据采集包括全MS扫描和全MS扫描+CID-DDMS2两种模式，全扫描描参数为：分辨率：70,000，自动增益(AGC)：1×106，最大离子化时间(IT)：120ms，扫描质量范围：m/z 55–825(亲水)和m/z120–1800(亲脂)；DDMS2参数为：分辨率：17,500，自动增益(AGC)：1×105，最大离子化时间(IT)：120ms，循环扫描次数(Loop count)：5，TopN＝5，离子化窗口(Isolation window)：m/z1.0，扫描范围：m/z 55–825，碰撞能量(NCE/stepped NCE)：30、40和50，Underfill ratio：1.0％，强度阈值(intensity threshold)：8.3×103，先端触发(Apex trigger)：2–6s，动态排除(Dynamicexclusion)：6s。
I)亲水性代谢物采用Compound discoverer 2.0(Thermo fisher)软件进行数据处理，获得的特征数据经过噪音/干扰/稳定性过滤以及标化、对数转换和Pareto缩放(Pareto Scaling)等数据预处理后，采用Simca-P进行PCA、PLS-DA和OPLS-DA等多元差异识别分析，特异性特征基于代谢物库匹配筛选鉴定、MS/MS质谱数据计算机模拟(In silico)推断以及标准对照品核对进行化学结构确证。亲脂性代谢物采用Lipidsearch 4.1(Thermofisher)进行代谢物鉴定和数据分析。
实施例2不同提取方法效果对比
MeOH-H2O亲水部分提取已有大量研究报道，本发明数据和这些报道基本一致。本发明主要针对对亲水部分提取后剩余组织残渣继续进行脂质部分提取，相关验证数据主要在脂质提取方面，为了突出本发明的优点，在进行亲水部分提取后，采用MTBE(本发明方法)和文献报道方法-DCM-MeOH(3:1,v/v)(简称DCM-MeOH方法)进行同步分析，以评价本发明的优越性(详细见附图1-3)。
(1)对大鼠肝脏两种脂质组学提取方法数据轮廓分析比较，如图1所示。本发明的MTBE具有比DCM-MeOH提取方法更好的提取效率。
(2)对大鼠肝脏两种脂质组学提取方法特征信息量、重复性和响应强度进行比较，如图2所示。图2A显示两种方法所制备的样品的ESI(-)特征数差距不大，DCM-MeOH(330个)略少于MTBE(370个)，但ESI(+)特征数据差距大，MTBE方法获得的特征数(1691个)是DCM-MeOH特征数(635个)的2.7倍；在这些所有特征分析中，统计结果(见图2C)发现除了两种方法能同时获得891个[ESI(-)：319个，ESI(+)：572个]特征外，DCM-MeOH方法单独只能获得74个[ESI(-)：11个，ESI(+)：63个]特征，而MTBE方法单独能获得1170个[ESI(-)：51个，(ESI(+)：1119个]特征，这些数据突显了MTBE方法在脂质提取中具有比DCM-MeOH方法更大的优越性，能兼容覆盖更多的脂质代谢物。
同时，针对这两种提取方法都覆盖的891个特征进行了响应强度分析，结果见图2D，图2D显示69％的特征在MTBE方法中具有比DCM-MeOH方法更高的响应强度，而只有25％特征在DCM-MeOH方法中优于MTBE方法，这说明MTBE具有更好的组织浸润性以及组织脂质代谢物解离和溶出能力，更适合在脂质组学研究中作为提取溶剂。针对两种提取方法获得的特征进行重复性分析，将所有特征在样品间的重复性按照特征响应的RSD分为5个区段(即RSD≤5％、5％<RSD≤10％、10％<RSD≤20％、20％<RSD≤30％和RSD>30％)，计算这两种提取方法在这5个区段上对应特征的数量(这里采用百分比占有率表示，见图2B)，数据分析显示：在采用ESI(+)采集数据时，MTBE方法有17％的特征RSD≤5％，而DCM-MeOH方法有39％的特征RSD≤5％，出现MTBE方法差于DCM-MeOH方法，除此外，两种方法的重复差异不具有统计学差异。MTBE方法有86％以上的特征RSD≤30％，若考虑到由于取材组织部位不同所引起的重复性差异性，各个特征对应的RSD会更低。
(3)对鼠肝脏两种脂质组学提取方法脂质类别差异进行分析，如图3所示。DCM-MeOH方法获得了322个[ESI(-)：200个，ESI(+)：122个]脂质代谢物特征，而MTBE方法获得662个[ESI(-)：388个，ESI(+)：274个]脂质代谢物特征，是DCM-MeOH方法的两倍多，这些数量上的差异主要体现在Cer、DG、PC、PE、CL、PG、DMePE、PS和SM等脂质上。同时通过图2也能看出这两种方法所获得的脂质响应强度(面积)的差异，在所有脂质类，除LPI和LPS外，MTBE方法所提取的脂质响应强度总和都要优于DCM-MeOH方法，该强度差异基本和脂质特征数量一致，体现在Cer、DG、PC、PE、CL、PG、DMePE、PS和SM等脂质上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法，其特征在于，先后采用预冻的甲醇-水和预冻的叔丁基甲醚溶剂体系，分两步对组织样本进行提取，获得亲水性提取物和亲脂性提取物，具体地：预冻MeOH-水用于亲水性代谢物提取，预冻MTBE用于亲脂性代谢物提取，先进行亲水性代谢物的提取，待移除提取溶液后，其提取组织残渣用于亲脂性代谢物的提取，所述亲水性代谢物提取中MeOH与水的体积比为0.1-10:1，整个操作保持低温，所述低温是指≤4℃；所述组织样本为离体生物组织，提取的样本类型包括所有动物和人组织样本，采用新鲜冷冻组织进行提取；亲水性提取物采用亲水性作用色谱高分辨质谱分析用于代谢组学研究，亲脂性提取物采用反向色谱高分辨质谱分析用于脂质组学研究。
2.根据权利要求1所述用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法，其特征在于，提取方法包括：取微量组织样本于预冻的甲醇-水溶液中，经珠撞匀浆后，离心取上清液用于代谢组学研究，提取后的组织残渣加入预冻叔丁基甲醚，再次匀浆离心后用于脂质组学研究。
3.根据权利要求1所述用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法，其特征在于，具体步骤如下：
A)取新鲜组织或解冻组织样品200-300mg于具塞离心管；
B)按照每28mg组织样本加入100μL的溶剂比例加入适当体积的亲水性代谢物提取溶液预冻MeOH-水，所述预冻MeOH-水中甲醇和水的体积比为1/1，然后在离心管中加入事先分别用MeOH和MTBE超声波清洗过的钢珠，密封后置于干冰30s，取出后立即置于全自动样品快速研磨仪中研磨2次，研磨频率为60Hz，研磨时间为20s；
C)研磨完毕，立即取出样品在13,000rpm转速下低温即4℃离心20min，离心完毕，准确移取50μL上清液于全回收的进样瓶中，置于离心旋转蒸发器中浓缩之干，作为亲水性部分提取物；
D)待取完亲水性样品提取液，立即将离心管中剩余的溶液彻底移除，移除后，在剩余的组织残渣中加入与亲水性代谢物提取溶液体积相同的脂质代谢物提取溶液，研磨完毕按照亲水性代谢物提取的方法进行样品离心、50μL样品转移和浓缩，作为脂质部分提取物。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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