CN110579555A - 一种拟靶向代谢组学分析的离子对挑选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种拟靶向代谢组学分析的最优离子对挑选方法。该方法采用液相色谱‑质谱运用可变质量窗口的信息非依赖采集模式对不同碰撞能下生物样本中代谢物信息进行采集；原始数据经峰识别软件处理得到母离子信息；将原始数据格式转化后经去卷积软件处理得到二级质谱碎片信息；随后通过Matlab算法自动挑选不同碰撞能下的候选离子对；在液相色谱‑三重四级杆质谱中采用动态多反应监测模式对候选离子对进行检测、去除假阳性、整合，最终得到用于拟靶向代谢组学分析的离子对。此发明具有代谢物离子对覆盖度大，离子对碰撞能量优化，实验过程和数据处理简单，时间和人力成本低等优点，并在未来代谢组学研究中具有一定的前景。

Description

一种拟靶向代谢组学分析的离子对挑选方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，是一种基于液相色谱-质谱信息非依赖采集模式进行代谢物信息采集后通过数据分析、处理，结合液相色谱-三重四级杆质谱检测、去除假阳性，得到拟靶向最优离子对的新方法，具体为一种拟靶向代谢组学分析的离子对挑选方法。

背景技术

代谢组学是继基因组学与蛋白质组学之后迅速发展起来的一门新兴学科，旨在对生物体内所有小分子代谢物进行定性、定量分析，寻找代谢物与生理、病理变化的相对关系。代谢组学研究主要可分为非靶向和靶向，其中非靶向代谢组学是采用无偏差的检测，以便尽可能多的覆盖代谢物种类；靶向代谢组学主要针对于若干个代谢物，进行有选择性的检测并对目标代谢物质进行定量分析。由于标准品的限制，因此靶向代谢组学所能覆盖的代谢物数量受到限制。在2012年一种基于实际样本中代谢物来建立离子对的拟靶向技术被提出，它能有效综合了代谢物检测数量和定量准确优势的新技术首次被提出，并展现出其在代谢组学研究中的前景。

目前已建立了多种基于液相色谱-质谱的拟靶向代谢组学分析方法，如有采用基于质谱信息依赖采集模式(IDA)的拟靶向技术筛选出518对正离子对用于肝癌患者血清代谢组学研究和筛选出419对正离子对用于肝癌患者尿样代谢组学研究等。但是由于这些传统的拟靶向代谢组学方法的建立基于质谱信息依赖采集模式，由于这个模式下每个质谱数据点只能采集10-20个母离子的二级质谱信息，因此其代谢物离子对的覆盖度上具有明显的局限性。信息非依赖质谱采集模式作为一种全景式的二级质谱获取技术在2012年被提出。这项技术首先被用于蛋白质组学定性定量研究，随后逐渐被运用于代谢组学领域，例如药物代谢研究，毒理研究，食品品质研究等。最近有一篇文献报道了一种基于质谱信息非依赖采集模式的靶向代谢组学分析转换方法并用于大肠癌研究[3]。但是该方法采用了固定隔离质量窗口的SWATH(Sequential Windowed Acquisition of all Theoreticalfragment ions)质谱采集模式，而且只是筛选了单一能量下的离子对，没有对不同碰撞能下的离子对进行优化，这在代谢组学研究中是不利的。可变隔离质量窗口在质谱信息非依赖采集模式中使用能明显提高母离子选择性和减少交叉离子干扰[4]，因此采用可变窗口可以明显改善数据复杂性，简化后续数据处理。

针对上述拟靶向分析方法的不足，本发明中建立了一种拟靶向代谢组学分析的离子对挑选方法，该方法不仅能够有效扩大代谢物的检测范围和挑选最优碰撞能下离子对，而且方便简单、节省时间和人力成本。

参考文献：

[1]L.Zhou,Y.Liao,P.Yin,Z.Zeng,J.Li,X.Lu,L.Zheng,G.Xu,Metabolicprofiling study of early and late recurrence of hepatocellular carcinomabased on liquid chromatography-mass spectrometry,Journal of chromatography.B,Analytical technologies in the biomedical and life sciences,966(2014)163-170.

[2]Z.Zeng,X.Liu,W.Dai,P.Yin,L.Zhou,Q.Huang,X.Lin,G.Xu,Ion fusion ofhigh-resolution LC-MS-based metabolomics data to discover more reliablebiomarkers,Analytical chemistry,86(2014)3793-3800.

[3]H.Zha,Y.Cai,Y.Yin,Z.Wang,K.Li,Z.J.Zhu,SWATHtoMRM:Development ofHigh-Coverage Targeted Metabolomics Method Using SWATH Technology forBiomarker Discovery,Analytical chemistry,DOI10.1021/acs.analchem.7b05318(2018).

[4]Y.Zhang,A.Bilbao,T.Bruderer,J.Luban,C.Strambio-De-Castillia,F.Lisacek,G.Hopfgartner,E.Varesio,The Use of Variable Q1Isolation WindowsImproves Selectivity in LC-SWATH-MS Acquisition,Journal of proteome research,14(2015)4359-4371.

发明内容

本发明为了建立了一种拟靶向代谢组学分析的离子对挑选方法，把质量控制样本作为实验样本，液相色谱-质谱采用可变质量窗口的信息非依赖采集模式对不同碰撞能下的质量控制样本代谢物信息进行采集，得到的原始数据经峰识别，格式转化，MS-DIAL去卷积等处理后自动进行候选离子对挑选，最后采用液相色谱-三重四级杆质谱对候选离子对进行检测、去除假阳性、整合得到拟靶向最优离子对列表可以用于代谢组学研究。此方法不仅能够有效扩大代谢物的检测范围和挑选最优碰撞能下离子对，而且操作方便、数据处理简单、节省时间和人力成本。

为实现上述目的，本发明采用的具体技术方法如下：

一种拟靶向代谢组学分析的最优离子对挑选方法，液相色谱-质谱采用可变质量窗口的信息非依赖采集模式对待分析质量控制样本在10V到60V碰撞能范围内进行两个及以上不同能量下(由实验者自己选择，如使用3个能量，具体能量可以是10v，20v，30v；也可以是15v，30v，45v等)的代谢物信息采集；利用软件从原始数据获取代谢物的一级质谱保留时间，母离子和母离子强度以及各碰撞能量下母离子对应的二级质谱子离子，子离子强度信息；根据子离子强度筛选最优碰撞能量，得到代谢物的候选最优离子对，组成候选离子对列表；对候选离子对进行验证，去除假阳性后整合得到用于拟靶向代谢组学分析的最优离子对。

待分析质量控制样本和液相色谱-质谱可变质量窗口信息非依赖采集的获取步骤如下,

1)质量控制样本是通过将要进行代谢组学分析的两个以上来自同一物种的相同类型生物样本进行等体积移取或等质量称量合并制备；质量控制样本按实验需求完成相应的代谢组学前处理([可参考文献1]，采用乙腈对样本除蛋白并提取代谢物等)得到可用于色谱/质谱分析的进样溶液；上述的生物样本具体可以为植物的花、叶、茎、根、种子等，动物(包括人)的体液(如尿、血、唾液、胆汁、胃液、淋巴液及生物体的其他分泌液等)、毛发、肌肉和一些组织器官(如胸腺、胰腺、肝、肺、脑、胃、肾等)以及各种微生物等中的一种；

2)液相色谱-质谱可变质量窗口信息非依赖采集方法为首先在SWATH VariableWindow Calculator_V 1.0软件上设定10个及以上可变质量窗口数目后依据代谢物一级质量分布情况自动分配可变质量窗口，然后根据可变质量窗口采用信息非依赖质谱采集模式在不同碰撞能下对代谢物二级信息进行采集。

一级质谱母离子信息和母离子对应的二级质谱信息的获取步骤如下,

1)原始数据通过峰识别软件处理获得一级质谱信息，包括母离子m/z，保留时间，母离子面积信息；

2)原始数据经abf格式转换后，经去卷积软件MS-DIAL处理，获得单个碰撞能下二级质谱信息，包含进行二级质谱碎裂的母离子m/z，保留时间，子离子m/z，子离子强度信息。

最优离子对的获取步骤如下，

1)若碰撞能个数是n，则用户根据需求选择在n/2到n之间的任意一个整数设为母离子出现频数阈值(根据碰撞能个数多少来进行自定义，例如进行了3个碰撞能的实验，设定阈值为2；)，用户根据需求设定200及以上的整数作为子离子强度阈值，根据代谢物质谱碎裂最小碎片为-CH₂-设定二级质谱信息中的母离子与子离子的质量差阈值来去除噪音干扰；

2)将一级质谱中的母离子与每个碰撞能下的二级质谱中母离子的保留时间和m/z分别作差，并分别设定它们的阈值，其中保留时间阈值根据实验中色谱保留时间稳定性进行设定(一般设为0.1min至0.3min中的某一个值；色谱保留时间稳定，重复性好则设阈值为0.1min即可满足要求)，m/z阈值根据实验所使用质谱仪的分辨率进行设定(一般设为0.005Da至0.01Da中的某一个值；如爱博才思的飞行时间质谱仪，一般设定为0.01Da；赛默飞的obitrap/QE质谱，一般设为0.005Da)；若保留时间和m/z的差值同时满足小于设定的阈值，则一级质谱产生的母离子和进行二级质谱碎裂的母离子产生的子离子相互对应，定义母离子和与之匹配的子离子构成离子对；

3)根据一级质谱中母离子信息进行离子融合得到唯一代谢物的离子对，其中母离子融合步骤[可参考文献2]包含同位素离子峰去除、中性丢失离子峰去除(例如：H₂O，NH₃等)、不同加和形式离子峰去除(例如：[M+Na]⁺，[M+NH4]⁺等)；

4)从离子融合后唯一代谢物(根据离子融合后的代谢物进行筛选)的离子对中依次选出每个代谢物中子离子强度最大的离子对作为最优离子对，由此可得到每个碰撞能下最优离子对列表。

验证最优离子对和适用于拟靶向代谢组学分析的最优离子对列表的步骤如下，

1)采用液相色谱-三重四级杆质谱对候选离子对列表中的离子对检测，经过谱图分析后将能检测到的离子对保留，不能检测到的去除；

2)统计被保留的离子对，若同一代谢物在多个碰撞能下均存在离子对，则优先保留特征离子对响应最大者，得到用于拟靶向代谢组学分析的最优离子对列表。

具体为：

1)将要进行代谢组学分析的每个样本进行等体积移取或等质量称量合并成质量控制样本，根据代谢分析需要选择合适的代谢组学前处理方法进行蛋白质去除和代谢物提取(例如：采用乙腈或者甲醇对样本除蛋白并提取代谢物，采用甲醇对样本除蛋白和甲基叔丁基醚提取代谢物等)，经过离心、冻干、复溶等步骤即可用于后续的色谱-质谱检测；

2)液相色谱-质谱采用可变质量窗口的信息非依赖采集模式对不同碰撞能下的质量控制样本代谢物信息进行采集，原始数据经峰识别软件(Thermofisher SIEVE或ABSCIEX MarkerView^TM等)处理得到一级质谱产生的母离子列表，包含一级质谱母离子m/z，保留时间，峰面积信息；原始数据文件通过AnalysisBaseFileConverter软件进行格式转化为abf后利用MS-DIAL软件去卷积获得单个碰撞能下二级质谱信息文件，包含进行二级质谱碎裂的母离子m/z，保留时间，子离子m/z，子离子强度信息；

3)分别设定母离子频次阈值2，子离子强度的阈值500，去除噪音干扰；

4)将二级质谱信息中的母离子与子离子m/z作差，以-CH2-基团为最低丢失质量设定阈值13.9，去掉母离子与子离子m/z差值小于阈值的子离子。

5)将一级质谱中的母离子与每个碰撞能下的二级质谱中母离子的保留时间和m/z分别作差，并分别设定保留时间和m/z差值的阈值为0.1min和0.01Da。若保留时间和m/z差值同时满足小于设定的阈值，则一级质谱产生的母离子和进行二级质谱碎裂的母离子产生的子离子相互对应，定义母离子和与之匹配的子离子为特征离子对。若保留时间和m/z差值不能同时满足小于设定的阈值，则将母离子作为其子离子，并构成非特征离子对；

6)将得到离子对根据一级质谱中母离子信息进行离子融合得到唯一代谢物的离子对，其中母离子融合步骤包含同位素离子峰去除、中性丢失离子峰去除、不同加和形式离子峰去除；

7)从唯一代谢物的离子对中依次选出每个代谢物中子离子强度最大的离子对作为最优离子对，由此可得到每个碰撞能下最优离子对列表；

8)采用液相色谱-三重四级杆质谱对每个碰撞能下最优离子对列表中的离子对检测，经过谱图分析后将能检测到的离子对保留，不能检测到的去除；

9)统计被保留的离子对，若同一代谢物在多个碰撞能下均存在离子对，则优先保留特征离子对响应最大者，得到用于拟靶向代谢组学分析的最优离子对列表。

本方法建立了一种拟靶向代谢组学分析的离子对挑选方法，由于液相色谱-质谱采用可变质量窗口的信息非依赖采集模式对不同碰撞能下的质量控制样本代谢物信息进行采集，所以代谢物离子对覆盖度上有明显地提升，且简化了数据复杂性和方便后续数据处理，实验过程简单；而且采用采用自动化的离子对挑选模式，明显节省时间和人力，提升了整个实验过程的工作效率；最后将得到的离子对在液相色谱-三重四级杆质谱上进行检测、去除假阳性后整合得到拟靶向离子对列表，能够确保离子对的准确性，适合后续代谢组学研究。

附图说明

图1基于液相色谱-质谱信息非依赖采集模式的拟靶向最优离子对挑选流程图，

图2建立的拟靶向方法提取离子色谱图，

图3代谢物在日内和日间的变异系数分布图，A为代谢物在日内的变异系数分布图图和B为日间的变异系数分布图。

附表说明

表1质谱信息非依赖采集模式可变质量窗口实际分布情况

具体实施方式

下面结合附表附图对本发明的实施例作详细说明：实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

基于质谱信息非依赖采集模式的血清样本拟靶向代谢组学分析方法建立：

1)依次从10个健康人血清样本中取200μL进行混合作为质量控制样本，取100μL质量控制样本于1.5mL ep管中并加入400μL甲醇溶剂进行涡旋以去除蛋白和提取代谢物，涡旋30s将溶剂和样本充分混合后将样品立即放入离心机中，在4℃，14000rpm的条件下离心15min。离心之后吸取400μL上清液于1.5mL ep管中进行低温离心冻干。最后将冻干样本中加入50μL的20％乙腈水(乙腈：水＝4:1，V/V)进行复溶，在4℃，14000rpm的条件下离心10min，吸取上清液用于之后的液相色谱-质谱检测分析；

2)采用液相色谱-四级杆飞行时间质谱进行信息非依赖模式采集和数据处理：

①液相色谱条件：Waters BEH C8色谱柱2.1mm×100mm，1.7μm；柱温50℃；流动相：A相为体积浓度0.1％甲酸的纯水，B相为体积浓度0.1％甲酸的纯乙腈；流速设置为0.35mL/min；柱温50℃；总的色谱运行时间为30min，洗脱梯度为：0～1min，5％B(V/V)，1～23min，梯度从5％B(V/V)线性增加到100％B(V/V)，23～27min，保持100％B(V/V)，27～27.1min，梯度从100％B(V/V)线性降到5％B(V/V)，27.1～30min，保持5％B；进样室温度为4℃；进样体积为5μL；

②质谱条件：质谱采用AB5600质谱，采用SWATH模式采集。ESI源，GAS1、GAS2、CUR的流速分别为50、50、35L/min，电离电压5500v，接口温度500℃，CE分别为15v，30v，45v，母离子扫描范围100-1250，子离子扫描范围80-1250。使用SWATH Variable WindowCalculator_V 1.0根据母离子的分布计算出60个可变窗口用于质谱信息非依赖采集模式，详见表1；

3)原始数据在AB SCIEX MarkerView^TM对峰进行识别和匹配，其中强度参数设置为5000，保留时间参数设置为30min，得到母离子的保留时间、m/z、母离子面积信息。将原始数据通过格式转化软件Analysis Base File Converter转化为abf格式，然后将abf格式文件导入去卷积MS-DIAL之后得到二级质谱信息文件mgf并导出；

4)在MATLAB算法中分别设定母离子出现频次阈值为2，子离子强度阈值为500，DifΔm/z阈值为13.9，ΔRT和Δm/z阈值为0.1min和0.01Da，得到碰撞能为15v，30v，45v的3个候选离子对列表；

5)采用液相色谱-三重四杆质谱对离子对进行验证后，将碰撞能为15v，30v，45v下能测到的离子对筛选、整合得到拟靶向最优离子对列表：

①液相色谱条件：Waters BEH C8色谱柱2.1mm×100mm，1.7μm；柱温50℃；流动相：A相为0.1％甲酸的纯水，B相为0.1％甲酸的纯乙腈；流速设置为0.35mL/min；柱温50℃；总的色谱运行时间为30min，质谱采集前24min；洗脱梯度为：0～1min，5％B，1～23min，5％-100％B，23～27min，100％B，27～27.1min，100％-5％B，27.1～30min，5％B；色谱分析时，进样室温度为4℃；进样体积为5μL；

②质谱条件：ESI源，GAS1、GAS2、CUR的流速分别为50、50、35L/min，电离电压5500v，接口温度500℃，时间偏差设置为50s，扫描速度为0.8s。

③将3个碰撞能下能检测的离子对统计、筛选出每个代谢物的最优离子对和碰撞能后，在液相色谱-三重四级杆质谱上建立的拟靶向方法检测的血清提取离子流图如图1所示，共计1120个离子对；

6)对建立的方法稳定性采用日内和日间精密度来进行考察，其中日内精密度为重复同一个样本进样10次，日间精密度为同一样本在连续三天每天进样6次，对代谢物峰面积计算变异系数分布来对方法进行评价。具体结果如图3所示。日内精密度结果显示95.2％代谢物的RSD<15％，且加和面积占总面积的97％。日间精密度结果显示88.6％代谢物的RSD<15％，且加和面积占总面积的96％。因此本发明所建立的方法稳定可靠，能满足代谢组学研究的要求。

表1质谱信息非依赖采集模式可变窗口实际分布情况

本发明公开了一种拟靶向代谢组学分析的离子对挑选方法。该方法可以有效增加离子对的覆盖度，挑选最优碰撞能下离子对，整个过程简单方便，建立的拟靶向方法稳定可靠。

Claims (5)

1.一种拟靶向代谢组学分析的最优离子对挑选方法，其特征在于：液相色谱-质谱采用可变质量窗口的信息非依赖采集模式对待分析质量控制样本在10V到60V碰撞能范围内进行两个及以上不同能量下的代谢物信息采集；利用软件从原始数据获取代谢物的一级质谱保留时间，母离子和母离子强度以及各碰撞能量下母离子对应的二级质谱子离子，子离子强度信息；根据子离子强度筛选最优碰撞能量，得到代谢物的候选最优离子对，组成候选离子对列表；对候选离子对进行验证，去除假阳性后整合得到用于拟靶向代谢组学分析的最优离子对。

2.根据权利要求1所述的拟靶向最优离子对挑选方法，其特征在于：待分析质量控制样本和液相色谱-质谱可变质量窗口信息非依赖采集的获取步骤如下,

1)质量控制样本是通过将要进行代谢组学分析的两个以上来自同一物种的相同类型生物样本进行等体积移取或等质量称量合并制备；质量控制样本按实验需求完成相应的代谢组学前处理得到可用于色谱/质谱分析的进样溶液；

2)液相色谱-质谱可变质量窗口信息非依赖采集方法为：首先在软件上设定10个及以上可变质量窗口数目后依据代谢物一级质量分布情况自动分配可变质量窗口，然后根据可变质量窗口采用信息非依赖质谱采集模式在不同碰撞能下对代谢物二级信息进行采集。

3.根据权利要求1所述的拟靶向最优离子对挑选方法，其特征在于：一级质谱母离子信息和母离子对应的二级质谱信息的获取步骤如下,

1)原始数据通过峰识别软件处理获得一级质谱信息，包括母离子m/z，保留时间，母离子面积信息；

2)原始数据经abf格式转换后，经去卷积软件MS-DIAL处理，获得单个碰撞能下二级质谱信息，包含进行二级质谱碎裂的母离子m/z，保留时间，子离子m/z，子离子强度信息。

4.根据权利要求1所述的拟靶向最优离子对挑选方法，其特征在于：最优离子对的获取步骤如下，

1)若碰撞能个数是n，则用户根据需求选择在n/2到n之间的任意一个整数设为母离子出现频数阈值，用户根据需求设定200及以上的整数作为子离子强度阈值，根据代谢物质谱碎裂最小碎片为-CH₂-设定二级质谱信息中的母离子与子离子的质量差阈值来去除噪音干扰；

2)将一级质谱中的母离子与每个碰撞能下的二级质谱中母离子的保留时间和m/z分别作差，并分别设定它们的阈值，其中保留时间阈值根据实验中色谱保留时间稳定性进行设定，m/z阈值根据实验所使用质谱仪的分辨率进行设定；若保留时间和m/z的差值同时满足小于设定的阈值，则一级质谱产生的母离子和进行二级质谱碎裂的母离子产生的子离子相互对应，定义母离子和与之匹配的子离子构成离子对；

3)根据一级质谱中母离子信息进行离子融合得到唯一代谢物的离子对，其中母离子融合步骤包含同位素离子峰去除、中性丢失离子峰去除、不同加和形式离子峰去除；

4)从离子融合后唯一代谢物的离子对中依次选出每个代谢物中子离子强度最大的离子对作为最优离子对，由此可得到每个碰撞能下最优离子对列表。

5.根据权利要求1所述的拟靶向最优离子对挑选方法，其特征在于：验证最优离子对和适用于拟靶向代谢组学分析的最优离子对列表的步骤如下，

1)采用液相色谱-三重四级杆质谱对候选离子对列表中的离子对检测，经过谱图分析后将能检测到的离子对保留，不能检测到的去除；

2)统计被保留的离子对，若同一代谢物在多个碰撞能下均存在离子对，则优先保留特征离子对响应最大者，得到用于拟靶向代谢组学分析的最优离子对列表。