CN110850072B - 肝癌阴离子标志物的筛选方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肝癌阴离子标志物的筛选方法，包括以下步骤：第一步，提取待检样本中的代谢混合物，备用；第二步，将第一步得到的代谢混合物用液相色谱进行分离，分离后的样品用质谱仪鉴定分析，采集质谱数据；第三步，确定代谢混合物中的每种代谢物质；第四步，筛选出肝癌样本与肝硬化样本之间的显著性差异代谢物质即为肝癌阴离子标志物。本发明首次建立了一种与肝癌诊断相关阴离子标志物的筛选方法，筛选出酮异己酸阴离子、2,4‑硝基苯酚阴离子、4‑壬基酚阴离子和异丁酸阴离子四个显著性差异小分子，为日后肝癌药物的研发提供新的靶点和思路，具有重要意义。

Description

肝癌阴离子标志物的筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及生化检测领域，尤其是涉及一种肝癌阴离子标志物的筛选方法，还涉及筛选出的肝癌阴离子标志物在制备肝癌诊断药物或诊断试剂盒中的应用。
背景技术
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma ，即HCC），是一种高死亡率的原发性肝癌，它是一种全球范围最常见的恶性肿瘤，尤其是在亚洲、非洲和南部欧洲。全球每年新发病例数约65万，其发病率占所有恶性肿瘤的第5位，死亡数约为60万，为所有恶性肿瘤的第3位。在我国，肝癌的发生主要与乙型肝炎相关，每年的新发病例占全世界新发病例的55%左右。
肝癌早期症状不明显，具有进展迅速、易早期转移的特点，在临床上存在早诊困难、预后效果差的问题。目前，临床上的肝癌筛查方法是B型超声显像（即B超）、肿瘤标志物甲胎蛋白（α-fetoprotein，即AFP）的血清含量或两者结合进行筛查。然而，B超很难鉴别小肝癌或肝硬化结节，而甲胎蛋白血清水平在诊断肝癌时存在敏感性和特异性较低的缺陷，单独用于确诊时的检出率一般只有50％—75％左右。现有筛查方法的局限性极大地限制了肝细胞癌的早期有效诊断，预警作用有限。对于肝细胞癌的早期有效诊断有助于显著提高患者的生存率，因此，开发具有临床早诊潜力的新方法对于降低肝细胞癌的发病率和死亡率具有非常重要的现实意义。
近年来，代谢组学技术作为一个新的有力工具，被广泛运用于疾病研究中。将疾病状态下异常的或者数量变化极大的代谢小分子作为标志物，以用于诊断疾病的进程具有重要意义。质谱技术是代谢组学的主要研究手段，其检测小分子代谢物在疾病诊断中的应用已有成功的案例，包括基于检测多种氨基酸的新生儿疾病筛查、检测肌氨酸的前列腺癌判别等。但目前还未有关于小分子代谢物阴离子作为由肝癌筛查相关的标志物的报道。
发明内容
本发明提供了一种肝癌阴离子标志物的筛选方法，还涉及筛选出的肝癌阴离子标志物在制备肝癌诊断药物或诊断试剂盒中的应用，对肝癌的筛查具有重要意义，为日后肝癌的诊断乃至治疗药物的研发提供了新的靶点和思路。
为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：
本发明提供了一种肝癌阴离子标志物的筛选方法，包括以下步骤：
第一步，提取待检样本中的代谢混合物，备用；所述待检样本包括肝癌样本和肝硬化样本；
第二步，将第一步得到的代谢混合物用高效液相色谱进行分离，分离后的样本用质谱仪鉴定分析，采集代谢混合物的质谱数据；
第三步，将第二步得到的质谱数据转换成.mzXML格式，采用精确质量数匹配<25ppm和二级谱图匹配的方式确定代谢混合物中的每种代谢物质；
第四步，以变量权重值>1为筛选标准，用OPLS-DA对第三步确定的每种代谢物质进行初步筛选，初筛出肝癌样本与肝硬化样本之间的差异代谢物质，差异代谢物质的变量权重值>1，且差异倍数>2或<0. 5；用单变量统计对初筛得到的差异代谢物质再次筛选，筛选出肝癌样本与肝硬化样本之间的显著性差异代谢物质（P值<0.05）即为肝癌阴离子标志物，即酮异己酸阴离子、2,4-硝基苯酚阴离子、4-壬基酚阴离子和异丁酸阴离子。
优选地，第一步中代谢混合物的具体提取方法为：将样本组织用4℃的PBS溶液清洗两次后，加入超纯水破碎匀浆，涡旋，加入提取液后再次涡旋，低温超声提取，沉淀，离心，冷冻干燥得到代谢混合物，将代谢混合物于-80℃下冷冻冻存，备用。
优选地，所述第一步中提取液为体积比=1:1的甲醇和乙腈混合液。
优选地，第二步中高效液相分离条件为：流动相A：水+25 mM乙酸铵+25 mM氨水，流动相B：乙腈；梯度洗脱条件为：梯度洗脱程序如下：0～0.5 min：95%流动相B；0.5～7 min：流动相B从95%线性变化至65%，7～8 min：流动相B从65%线性变化至40%，8～9 min：流动相B维持在40%，9～9.1 min：流动相B从40%线性变化至95%，9.1～12 min：流动相B维持在95%。
优选地，第二步中采用质谱仪Ⅰ采集数据，其检测条件为：所述第二步中采用质谱仪Ⅰ采集数据，其检测条件为：ESI源条件如下：气体温度：250℃，干燥气体：16 L/min，Nebulizer喷雾器：20 psig，鞘气体温度：400 ℃，鞘气体流速：12 L/min， Vcap升压电容负极：3000 V，喷嘴电压：0 V；碎裂电压：175V，质量范围：50-1200，采集速率：4 HZ，循环时间：250 ms；
采用质谱仪Ⅱ进行鉴定，质谱条件为：离子源气体1：40，离子源气体2：80，气帘气：30，离子源温度：650℃，离子喷雾电压：-5000 V，负离子模式；二级质谱采用高灵敏度模式采集模式获得，去集群电势：±60 V，负离子模式；碰撞能量：35±15eV，IDA的排除同位素参数设置为4 Da，每个周期要监测的候选离子：10；质谱数据采集按50-300，290-600，590-900，890-1200分段采集。
优选地，本发明所述第四步筛选得到的显著性差异代谢物质包括酮异己酸阴离子、2,4-硝基苯酚阴离子、4-壬基酚阴离子和异丁酸阴离子。
本发明提供了肝癌阴离子标志物在制备肝癌诊断药物或诊断试剂盒中的应用。
优选地，本发明提供了酮异己酸阴离子作为阴离子标志物在制备肝癌诊断药物或诊断试剂盒中的应用，本发明还提供了2,4-硝基苯酚阴离子作为阴离子标志物在制备肝癌诊断药物或诊断试剂盒中的应用，本发明还提供了4-壬基酚阴离子作为标志物在制备肝癌诊断药物或诊断试剂盒中的应用，本发明提供了异丁酸阴离子作为标志物在制备肝癌诊断药物或诊断试剂盒中的应用。
更优选地，本发明还提供了2,4-硝基苯酚阴离子和4-壬基酚阴离子的组合物作为标志物在制备肝癌诊断药物或诊断试剂盒中的应用。
单变量分析方法是最简单常用的实验数据分析方法。在进行两组样本间的差异代谢物分析时，常用的单变量分析方法包括变异倍数分析（Fold Change Analysis，FCAnalysis）、T检验，以及综合前两种分析方法的火山图（Volcano Plot）。利用单变量分析可以直观地显示两样本间代谢物变化的显著性，从而帮助我们筛选潜在的标志代谢物。筛选出FC > 1.5且P value < 0.05的代谢物，即单变量统计分析筛选的差异代谢物。
同时研究发现很多动植物及微生物的生理和病理变化通常伴随着代谢过程的异常改变，但是这些生理病理的变化通常只与部分代谢物的表达水平变化特异相关。因此，从海量的代谢组学数据中筛选标志代谢物并建立准确的判别模型，对于疾病的早期诊断和预后、以及生理过程的类型和时期的判别等具有重要意义。利用多变量统计分析方法建模，可以更好的筛选出差异代谢物。
本发明利用多变量统计分析法（即OPLS-DA分析法）对质谱数据进行初筛，得到差异性小分子，再用单变量分析方法对初筛得到的差异性小分子再次筛选，得到显著性差异小分子，即为肝癌阴离子标志物。
本发明首次建立了一种与肝癌诊断相关阴离子标志物的筛选方法，具体利用LC-MS/MS质谱分析方法检测待测样本，通过大量的临床样本进行质谱分析后，通过肝癌组织与肝硬化组织中相应分子含量的差异倍数（大于2或小于0.5）筛选出了4个具有良好差异性的代谢阴离子。本发明的4个代谢小分子可以分别单独作为肝癌诊断的新的标志物，并且2,4-硝基苯酚阴离子和4-壬基酚阴离子的组合物也可作为肝癌诊断的新的标志物，该组合标志物特别适用于筛查肝癌高危人群。
本发明还发现可通过4个代谢小分子的信号强度来诊断肝癌，日后肝癌药物的研发提供新的靶点和思路，具有重要意义。
附图说明
图1是酮异己酸阴离子的信号响应强度的ROC曲线。
图2是肝癌样本与肝硬化样本中酮异己酸阴离子的信号强度比较。
图3是2,4-二硝基苯酚阴离子的信号响应强度的ROC曲线。
图4是肝癌样本与肝硬化样本中2,4-二硝基苯酚阴离子的信号强度比较。
图5是4-壬基酚阴离子的信号响应强度的ROC曲线。
图6是肝癌样本与肝硬化样本中4-壬基酚阴离子的信号强度比较。
图7是异丁酸阴离子的信号响应强度的ROC曲线。
图8是肝癌样本与肝硬化样本中异丁酸阴离子的信号强度比较。
图9是2,4-二硝基苯酚阴离子与4-壬基酚阴离子组合的信号响应强度的ROC曲线。
图10是肝癌样本与肝硬化样本中2,4-二硝基苯酚阴离子与4-壬基酚阴离子组合的信号强度比较。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语 “包含”和/或 “包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现有技术中还未有关代谢物阴离子小分子作为肝癌标志物的相关报道。因而，本发明提出了一种肝癌阴离子标志物的筛选方法，包括以下步骤：
第一步，提取待检（包括肝癌样本和肝硬化样本）中的代谢混合物，具体方法为：将样本组织用4℃的PBS溶液清洗两次后，加入超纯水用匀浆机匀浆，涡旋，加入提取液后再次涡旋，低温超声破碎，重复破碎两次，沉淀，离心，冷冻干燥得到代谢混合物，将代谢混合物于-80℃下冷冻冻存，备用；
第二步，将第一步得到的代谢混合物用高效液相色谱仪（安捷伦1290 InfinityLC超高效液相色谱系统并联合HILIC色谱柱（Waters Acquity UPLC BEH Amide Waters色谱柱和三乙胺流动相体系1.7 μm，2.1×100 mm））进行分离，分离后的样本用电喷雾电离（Electro-spray Ionization，ESI）负离子模式进行检测，用质谱仪Ⅰ（安捷伦6550 质谱仪）采集数据，用质谱仪Ⅱ（AB Triple TOF 6600质谱仪）鉴定质谱数据；
其中，高效液相分离条件为：流动相A：水+25mM乙酸铵+25mM氨水，流动相B：乙腈；梯度洗脱条件为：梯度洗脱程序如下：0～0.5min：95%流动相B；0.5～7min：流动相B从95%线性变化至65%，7～8min：流动相B从65%线性变化至40%，8～9min：流动相B维持在40%，9～9.1min：流动相B从40%线性变化至95%，9.1～12min：流动相B维持在95%；
质谱仪Ⅰ检测条件为：ESI源条件如下：Gas Tem气体温度：250℃，Drying gas干燥气体：16L/min，Nebulizer喷雾器：20 psig，Sheath gas Tem鞘气体温度：400 ℃，sheathGas Flow鞘气体流速：12 L/min， Vcap升压电容负极：3000 V，Nozzle voltage喷嘴电压：0V；Fragment碎裂电压：175 V，Mass Range质量范围：50-1200，Acquisition rate（采集速率）：4 HZ，cycle time循环时间：250 ms；
采用质谱仪Ⅱ进行鉴定，质谱条件为：Ion Source Gas1（离子源气体1）：40，IonSource Gas2（离子源气体2）：80，气帘气（Curtain gas）：30，source temperature（离子源温度）：650℃，IonSapary Voltage Floating （离子喷雾电压）：-5000 V，负离子模式；二级质谱采用高灵敏度模式采集模式获得，Declustering potential（去集群电势）：±60 V，负离子模式；Collision Energy（碰撞能量）：35±15 eV，IDA的 排除同位素参数设置为4 Da，Candidate ions to monitor per cycle（每个周期要监测的候选离子）：10；质谱数据采集按50-300m/z，290-600 m/z，590-900 m/z，890-1200 m/z分段采集。
第三步，将第二步得到的质谱数据转换成.mzXML格式，采用精确质量数匹配<25ppm和二级谱图匹配的方式确定代谢混合物中的每种代谢物质；
第四步，以变量权重值>1为筛选标准，用OPLS-DA对第三步确定的每种代谢物质进行初步筛选，初筛出肝癌样本与肝硬化样本之间的差异代谢物质，差异代谢物质的变量权重值>1，且差异倍数>2或<0.5；用单变量统计对初筛得到的差异代谢物质再次筛选，筛选出P值<0.05的显著性差异代谢物质即为肝癌阴离子标志物。
本发明采用ROC曲线验证分析每个显著性代谢物质，AUC为ROC曲线下的面积，是最常用的评价ROC曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。若AUC在0.7以下，则表示诊断的准确率较低；AUC在0.7以上，则可以满足临床诊断的要求。
采用本发明的筛选方法，筛选得到了四个显著性差异代谢物质：酮异己酸（即ketoisocaproic acid）阴离子、2,4-硝基苯酚（即2,4-Dinitrophenol）阴离子、4-壬基酚（4-Nonylphenol）阴离子和异丁酸（Isobutyric acid）阴离子。
本发明还提供了上述四种肝癌阴离子标志物在制备肝癌诊断药物或诊断试剂盒中的应用，即提供了一种肝癌诊断试剂盒或诊断药物，包括上述特异性的肝癌阴离子标志物，具体包括以下诊断试剂盒或诊断药物：
本发明提供了酮异己酸阴离子作为标志物在制备肝癌诊断药物或诊断试剂盒中的应用，即本发明提供了一种肝癌的诊断试剂盒或诊断药物，包括酮异己酸阴离子；
本发明提供了2,4-硝基苯酚阴离子作为标志物在制备肝癌诊断药物或诊断试剂盒中的应用，即本发明提供了一种肝癌的诊断试剂盒或诊断药物，包括2,4-硝基苯酚阴离子；
本发明提供了4-壬基酚阴离子作为标志物在制备肝癌诊断药物或诊断试剂盒中的应用，即本发明提供了一种肝癌的诊断试剂盒或诊断药物，包括4-壬基酚阴离子；
本发明提供了异丁酸阴离子作为标志物在制备肝癌诊断药物或诊断试剂盒中的应用，即本发明提供了一种肝癌的诊断试剂盒或诊断药物，包括异丁酸阴离子；
本发明还提供了2,4-硝基苯酚阴离子和4-壬基酚阴离子的组合物作为标志物在制备肝癌诊断药物或诊断试剂盒中的应用，即本发明提供了一种肝癌的诊断试剂盒或诊断药物，包括2,4-硝基苯酚阴离子和4-壬基酚阴离子的组合。
通过对上述标志物进行检测，可以实现对肝癌的诊断。
为了使本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作更加详细的说明。本发明实施例中用到的所有试剂设备均为现有市售产品。
实施例1  本发明所述的肝癌阴离子标志物的筛选方法，包括以下具体步骤：
第一步，称取30 mg样本组织（包括40个肝癌样本和40个肝硬化样本），用4 ℃预冷的PBS溶液清洗两次，再向每个样本中分别加入200 μL超纯水，用匀浆机匀浆，涡旋60 s，加入800 μL甲醇和乙腈混合液（V/V=1:1），涡旋60 s，低温（4 ℃）超声破碎30 min，重复两次，-20℃孵育60 min使样本液中的蛋白质沉淀下来，用离心机在4 ℃、14000 rcf下离心分离20 min，取上清液冷冻干燥得到代谢混合物，将代谢混合物于-80 ℃下冷冻冻存，备用；
第二步，将第一步得到的代谢混合物用高效液相色谱仪（安捷伦1290 InfinityLC超高效液相色谱系统并联合HILIC色谱柱（Waters Acquity UPLC BEH Amide Waters色谱柱和三乙胺流动相体系1.7 μm，2.1×100 mm））进行分离，分离后的样本用电喷雾电离（Electro-spray Ionization，ESI）负离子模式进行检测，用质谱仪Ⅰ（安捷伦6550 质谱仪）采集数据，用质谱仪Ⅱ（AB Triple TOF 6600质谱仪）鉴定质谱数据；
其中，高效液相分离条件为：流动相A：水+25mM乙酸铵+25mM氨水，流动相B：乙腈；梯度洗脱条件为：梯度洗脱程序如下：0～0.5min：95%流动相B；0.5～7min：流动相B从95%线性变化至65%，7～8min：流动相B从65%线性变化至40%，8～9min：流动相B维持在40%，9～9.1min：流动相B从40%线性变化至95%，9.1～12min：流动相B维持在95%；
质谱仪Ⅰ检测条件为：ESI源条件如下：质谱仪Ⅰ检测条件为：ESI源条件如下：GasTem气体温度：250℃，Drying gas干燥气体：16L/min，Nebulizer喷雾器：20 psig，Sheathgas Tem鞘气体温度：400 ℃，sheath Gas Flow鞘气体流速：12 L/min， Vcap升压电容负极：3000 V，Nozzle voltage喷嘴电压：0 V；Fragment碎裂电压：175 V，Mass Range质量范围：50-1200，Acquisition rate（采集速率）：4 HZ，cycle time循环时间：250 ms；
采用质谱仪Ⅱ进行鉴定，质谱条件为：Ion Source Gas1（离子源气体1）：40，IonSource Gas2（离子源气体2）：80，气帘气（Curtain gas）：30，source temperature（离子源温度）：650℃，IonSapary Voltage Floating （离子喷雾电压）：-5000 V，负离子模式；二级质谱采用高灵敏度模式采集模式获得，Declustering potential（去集群电势）：±60 V，负离子模式；Collision Energy（碰撞能量）：35±15 eV，IDA的 排除同位素参数设置为4 Da，Candidate ions to monitor per cycle（每个周期要监测的候选离子）：10；质谱数据采集按50-300m/z，290-600 m/z，590-900 m/z，890-1200 m/z分段采集，从而扩大二级谱图的采集率，每段采集四个重复；
第三步，将第二步得到的质谱数据（即原始数据）经ProteoWizard转换成.mzXML格式，采用精确质量数匹配<25 ppm和二级谱图匹配的方式确定代谢混合物中的每种代谢物质；
第四步，以变量权重值>1为筛选标准，用OPLS-DA对第三步确定的每种代谢物质进行初步筛选，变量权重值>1，且差异倍数>2或<0. 5的代谢物质即为肝癌样本与肝硬化样本之间的差异代谢物质；用单变量统计对初筛得到的差异代谢物质再次筛选，筛选出P值<0.05的显著性差异代谢物质即为肝癌阴离子标志物。
将肝癌样本和肝硬化样本的质谱数据进行筛选分析，得到四个差异性代谢小分子：酮异己酸阴离子、2,4-硝基苯酚阴离子、4-壬基酚阴离子和异丁酸阴离子。研究发现，酮异己酸阴离子、2,4-硝基苯酚阴离子、4-壬基酚阴离子和异丁酸阴离子可以单独作为标志物用于诊断肝癌，2,4-硝基苯酚阴离子、4-壬基酚阴离子的组合物也可作为标志物用于诊断肝癌，具体如下：
1、酮异己酸阴离子通过样品LC-MS/MS质谱分析方法检测到在肝癌组织与肝硬化组织中存在显著性差异，经对比，酮异己酸阴离子在肝癌样本显著性上调了2.06倍，且其P值为0.000811199<0 .05。
为评酮异己酸阴离子的信号响应强度对肝癌的诊断效能，本发明采用了ROC曲线分析，AUC为ROC曲线下的面积，是最常用的评价ROC曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。若AUC在0 .7以下，则表示诊断的准确率较低；AUC在0 .7以上，则可以满足临床诊断的要求。
酮异己酸阴离子的信号响应强度的ROC曲线如图1所示。ROC分析显示酮异己酸阴离子的AUC为0 .712>0 .7，说明具有较好的诊断效果，即酮异己酸阴离子可以作为肝癌的诊断标志物。在信号响应强度为226098.6674时，灵敏度为77.5％，特异度为55％。当进行个体检测时，信号响应强度大于226098.6674时，被判为肝癌患者，否则判断为肝硬化患者（假阳性率为45％）。
肝癌组织和肝硬化组织中酮异己酸阴离子信号响应强度比较结果见图2。由图2可以看出，这一分子在肝癌组织中的平均信号响应强度为499055.6093，肝硬化组织中的平均信号响应强度242528.7051，并且肝癌组织样本主要分布在检测阈值（图2中实线）以上，肝硬化组织主要分布在检测阈值以下，说明肝癌组织和肝硬化组织的信号响应强度相差甚大，该检测阈值检测效果良好。
所以，酮异己酸阴离子可以作为肝癌的诊断标志物，从而对肝癌进行预测，为肝癌的确诊提供了一种新的靶点，具有重要意义。
2、2,4-硝基苯酚阴离子通过样品LC-MS/MS质谱分析方法检测到在肝癌组织与肝硬化组织中存在差异。经对比，2,4-硝基苯酚阴离子在肝癌样本显著性下调了0.35倍，P值为7.81138E-11<0 .05。
为评价2,4-硝基苯酚阴离子的信号响应强度对肝癌的诊断效能，本发明采用了ROC曲线分析，AUC为ROC曲线下的面积，是最常用的评价ROC曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。若AUC在0 .7以下，则表示诊断的准确率较低；AUC在0 .7以上，则可以满足临床诊断的要求。
2,4-硝基苯酚阴离子的信号响应强度的ROC曲线如图3所示。ROC分析显示2,4-硝基苯酚阴离子的AUC为0 .784>0 .7，说明具有较好的诊断效果，即2,4-硝基苯酚阴离子可以作为肝癌的诊断标志物。在信号响应强度为52635.1136时，灵敏度为100％，特异度为72.5％。当进行个体检测时，信号响应强度小于52635.1136时，被判为肝癌患者，否则判断为肝硬化患者（假阳性率为27.5%）。
肝癌组织和肝硬化组织中2,4-硝基苯酚阴离子信号响应强度比较结果见图4。由图4可以看出，这一分子在肝癌组织中的平均信号响应强度为28306.30003，肝硬化组织中的平均信号响应强度81596.51182，并且肝癌组织样本主要分布在检测阈值（图4中实线）以下，肝硬化组织主要分布在检测阈值以上，说明肝癌组织和肝硬化组织的信号响应强度相差甚大，该检测阈值检测效果良好。
所以，2,4-硝基苯酚阴离子可以作为肝癌的诊断标志物，从而对肝癌进行预测，为肝癌的确诊提供了一种新的靶点，具有重要意义。
3、4-壬基酚阴离子通过样品LC-MS/MS质谱分析方法检测到在肝癌组织与肝硬化组织中存在差异。经对比，4-壬基酚阴离子在肝癌样本显著性下调了0.10倍，P值为8.04975E-12<0.05。
为评4-壬基酚阴离子的信号响应强度对肝癌的诊断效能，本发明采用了ROC曲线分析，AUC为ROC曲线下的面积，是最常用的评价ROC曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。若AUC在0.7以下，则表示诊断的准确率较低；AUC在0 .7以上，则可以满足临床诊断的要求。
4-壬基酚阴离子信号响应强度的ROC曲线如图5所示。ROC分析显示4-壬基酚阴离子的AUC为0.978>0.7，说明具有较好的诊断效果，即4-壬基酚阴离子可以作为肝癌的诊断标志物。在信号响应强度为36989.6091时，灵敏度为95％，特异度为95％。当进行个体检测时，信号响应强度大于36989.6091时，被判为肝癌患者，否则判断为肝硬化患者（假阳性率为5％）。
肝癌组织和肝硬化组织中4-壬基酚阴离子信号响应强度比较结果见图6。由图6可以看出，其在肝癌中的平均信号响应强度为16413.61107，在肝硬化组织中的平均信号响应强度165800.7169，肝癌组织样本主要分布在检测阈值（图6中实线）以下，肝硬化组织主要分布在检测阈值以上，说明肝癌组织和肝硬化组织的信号响应强度相差甚大，该检测阈值检测效果良好。
所以，4-壬基酚阴离子可以作为肝癌的诊断标志物，从而对肝癌进行预测，为肝癌的确诊提供了一种新的靶点，具有重要意义。
4、异丁酸阴离子通过样品LC-MS/MS质谱分析方法检测到在肝癌组织与肝硬化组织中存在差异。经对比，异丁酸阴离子在肝癌样本显著性下调了10.73倍，P值为1.36512E-19<0.05。
为评价异丁酸阴离子的信号响应强度对肝癌的诊断效能，本发明采用了ROC曲线分析，AUC为ROC曲线下的面积，是最常用的评价ROC曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。若AUC在0 .7以下，则表示诊断的准确率较低；AUC在0 .7以上，则可以满足临床诊断的要求。
异丁酸阴离子信号响应强度的POC曲线如图7所示。ROC分析显示异丁酸阴离子的AUC为0 .98>0 .7，说明具有较好的诊断效果，即异丁酸阴离子可以作为肝癌的诊断标志物。在信号响应强度为38212.2645时，灵敏度为97.5％，特异度为95％。当进行个体检测时，信号响应强度大于38212.2645时，被判为肝癌患者，否则判断为肝硬化患者（假阳性率为5％）。
肝癌组织和肝硬化中异丁酸阴离子信号响应强度比较结果见图8。由图8可以看出，其在肝癌中的平均信号响应强度为235311.985，在肝硬化组织中的平均信号响应强度21926.23933；并且肝癌组织样本主要分布在检测阈值（图8中实线）以上，肝硬化组织主要分布在检测阈值以下，说明肝癌组织和肝硬化组织的信号响应强度相差甚大，该检测阈值检测效果良好。
所以，异丁酸阴离子可以作为肝癌的诊断标志物，从而对肝癌进行预测，为肝癌的确诊提供了一种新的靶点，具有重要意义。
5、2,4-硝基苯酚和4-壬基酚的组合物在肝癌组织和肝硬化组织中存在差异。
本发明采用二元逻辑回归分析计算P（肝癌概率），SPSS软件二元逻辑回归后得到的公式为： P=1/（1+e-(5.185-0.000034a-0.000082b)）
其中， P为肝癌概率，a为2,4-硝基苯酚阴离子信号响应强度，b为4-壬基酚阴离子的信号响应强度，若检测P＞0.6441则判断为肝癌患者，否则判断为肝硬化患者。
为评价2,4-硝基苯酚阴离子+4-壬基酚阴离子的组合对肝癌的诊断效能，本发明采用了ROC曲线分析，AUC为ROC曲线下的面积，是最常用的评价ROC曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。若AUC在0 .7以下，则表示诊断的准确率较低；AUC在0 .7以上，则可以满足临床诊断的要求。
2,4-硝基苯酚阴离子与4-壬基酚阴离子的ROC曲线如图9所示。ROC分析显示，组合诊断的AUC为0 .978>0 .7，说明具有较好的诊断效果，即2,4-硝基苯酚阴离子与4-壬基酚阴离子的组合可以作为肝癌的诊断标志物。在cut off值为0.4082时，灵敏度为97.5％，特异度为97.5％。当进行个体检测时P＞0.6441时，被判为肝癌患者，否则判断为肝硬化患者（假阳性率为2.5％）。
肝癌组织和肝硬化组织中P（肝癌概率）比较结果见图10。由图10可以看出，肝癌中的平均P值为0.916367686，肝硬化组织的平均P值为0.083580214；且肝癌组织样本主要分布在检测阈值（图10中实线）以上，肝硬化组织主要分布在检测阈值以下，说明肝癌组织和肝硬化组织的信号响应强度相差甚大，该检测阈值检测效果良好。
所以，2,4-二硝基苯酚阴离子和4-壬基酚阴离子的组合可以作为肝癌的诊断标志物，从而对肝癌进行预测，为肝癌的确诊提供了一种新的靶点，具有重要意义。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种肝癌阴离子标志物的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
第一步，提取待检样本中的代谢混合物，备用；所述待检样本包括肝癌样本和肝硬化样本；代谢混合物的提取方法为：将样本组织用4℃预冷的PBS溶液清洗两次后，加入超纯水匀浆，涡旋，加入提取液后再次涡旋，低温超声破碎，沉淀，离心，冷冻干燥得到代谢混合物；提取液为体积比=1:1的甲醇和乙腈混合液；
第二步，将第一步得到的代谢混合物用液相色谱进行分离，分离后的样品用质谱仪鉴定分析，采集质谱数据；
高效液相分离条件为：流动相A：水+25mM乙酸铵+25mM氨水，流动相B：乙腈；梯度洗脱条件为：梯度洗脱程序如下：0～0.5min：95%流动相B；0.5～7min：流动相B从95%线性变化至65%，7～8min：流动相B从65%线性变化至40%，8～9min：流动相B维持在40%，9～9.1min：流动相B从40%线性变化至95%，9.1～12min：流动相B维持在95%；
质谱仪I采集数据，其检测条件为：ESI源条件如下：气体温度：250℃，干燥气体：16L/min，Nebulizer喷雾器：20psig，鞘气体温度：400℃，鞘气体流速：12L/min，Vcap升压电容负极：3000V，喷嘴电压：0V；碎裂电压：175V，质量范围：50-1200，采集速率：4HZ，循环时间：250ms；
采用质谱仪II进行鉴定，质谱条件为：离子源气体1：40，离子源气体2：80，气帘气：30，离子源温度：650℃，离子喷雾电压：-5000V，负离子模式；二级质谱采用高灵敏度模式采集模式获得，去集群电势：±60V，负离子模式；碰撞能量：35±15eV，IDA的排除同位素参数设置为4Da，每个周期要监测的候选离子：10；质谱数据采集按50-300，290-600，590-900，890-1200分段采集；
第三步，将第二步得到的质谱数据采用精确质量数匹配<25ppm和二级谱图匹配的方式确定代谢混合物中的每种代谢物质；
第四步，以变量权重值>1为筛选标准，用OPLS-DA对第三步确定的每种代谢物质进行初步筛选；初筛出肝癌样本与肝硬化样本之间的差异代谢物质后，用单变量统计对初筛得到的差异代谢物质再次筛选，筛选出肝癌样本与肝硬化样本之间的显著性差异代谢物质即为肝癌阴离子标志物；肝癌阴离子标志物包括酮异己酸阴离子、2,4-硝基苯酚阴离子、4-壬基酚阴离子和异丁酸阴离子。
2.样本组织中的酮异己酸阴离子、2,4-硝基苯酚阴离子、4-壬基酚阴离子和异丁酸阴离子作为肝癌阴离子标志物在制备肝癌诊断试剂盒或诊断药物中的应用。
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