CN110361495B - 一种生物基质中的靶标代谢物含量的检测方法 - Google Patents
一种生物基质中的靶标代谢物含量的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110361495B CN110361495B CN201910772860.XA CN201910772860A CN110361495B CN 110361495 B CN110361495 B CN 110361495B CN 201910772860 A CN201910772860 A CN 201910772860A CN 110361495 B CN110361495 B CN 110361495B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- biological matrix
- mass spectrometry
- standard substance
- mobile phase
- liquid chromatography
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 title claims abstract description 97
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 title claims abstract description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 54
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 53
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 25
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 14
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 66
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 46
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 20
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 20
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 16
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 11
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 6
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims description 6
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 claims 4
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 claims 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 abstract description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 abstract description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 38
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 24
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 238000010811 Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Methods 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 10
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 9
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 9
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 9
- 150000002066 eicosanoids Chemical class 0.000 description 8
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 7
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 7
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 7
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 7
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 6
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 description 4
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 3
- 238000010813 internal standard method Methods 0.000 description 3
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 3
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 3
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 3
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- KUKJHGXXZWHSBG-GMPNNLDHSA-N 12-HHTrE Chemical compound CCCCCC(O)\C=C\C=C\C\C=C\CCCC(O)=O KUKJHGXXZWHSBG-GMPNNLDHSA-N 0.000 description 2
- CYTYCFOTNPOANT-UHFFFAOYSA-N Perchloroethylene Chemical compound ClC(Cl)=C(Cl)Cl CYTYCFOTNPOANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 2
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 2
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 2
- 238000000065 atmospheric pressure chemical ionisation Methods 0.000 description 2
- 150000001841 cholesterols Chemical class 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 2
- 239000013062 quality control Sample Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 2
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 2
- 238000000672 surface-enhanced laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- DXOYQVHGIODESM-MFYAFOOZSA-N (11R,12S)-EET Chemical compound CCCCC\C=C/C[C@@H]1O[C@@H]1C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O DXOYQVHGIODESM-MFYAFOOZSA-N 0.000 description 1
- HNICUWMFWZBIFP-BSZOFBHHSA-N 13-HODE Chemical compound CCCCCC(O)\C=C\C=C/CCCCCCCC(O)=O HNICUWMFWZBIFP-BSZOFBHHSA-N 0.000 description 1
- JSFATNQSLKRBCI-VAEKSGALSA-N 15(S)-HETE Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O JSFATNQSLKRBCI-VAEKSGALSA-N 0.000 description 1
- NNDIXBJHNLFJJP-UHFFFAOYSA-N 20-Hydroxyeicosatetraenoic acid Chemical compound OCCCCCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O NNDIXBJHNLFJJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MEASLHGILYBXFO-XTDASVJISA-N 5-oxo-ETE Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C=C/C(=O)CCCC(O)=O MEASLHGILYBXFO-XTDASVJISA-N 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- GTGVXSPHRZRBCH-UHFFFAOYSA-N CO.[C](Cl)Cl Chemical compound CO.[C](Cl)Cl GTGVXSPHRZRBCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102100029100 Hematopoietic prostaglandin D synthase Human genes 0.000 description 1
- 101000988802 Homo sapiens Hematopoietic prostaglandin D synthase Proteins 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000000451 chemical ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000010265 fast atom bombardment Methods 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009616 inductively coupled plasma Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- VNYSSYRCGWBHLG-AMOLWHMGSA-N leukotriene B4 Chemical compound CCCCC\C=C/C[C@@H](O)\C=C\C=C\C=C/[C@@H](O)CCCC(O)=O VNYSSYRCGWBHLG-AMOLWHMGSA-N 0.000 description 1
- 230000006372 lipid accumulation Effects 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- -1 methanol-chloroform methanol-carbon dichloride Chemical compound 0.000 description 1
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N methyl tert-butyl ether Substances COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- 230000004065 mitochondrial dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- BHMBVRSPMRCCGG-OUTUXVNYSA-N prostaglandin D2 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](C\C=C/CCCC(O)=O)[C@@H](O)CC1=O BHMBVRSPMRCCGG-OUTUXVNYSA-N 0.000 description 1
- UQOQENZZLBSFKO-POPPZSFYSA-N prostaglandin J2 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](C\C=C/CCCC(O)=O)C=CC1=O UQOQENZZLBSFKO-POPPZSFYSA-N 0.000 description 1
- BHMBVRSPMRCCGG-UHFFFAOYSA-N prostaglandine D2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(CC=CCCCC(O)=O)C(O)CC1=O BHMBVRSPMRCCGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001814 protein method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- XNRNNGPBEPRNAR-JQBLCGNGSA-N thromboxane B2 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1OC(O)C[C@H](O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XNRNNGPBEPRNAR-JQBLCGNGSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明提供了一种生物基质中的靶标代谢物含量的检测方法，所述方法包括：提供一液相色谱串联质谱测试平台，采用多反应检测模式调整质谱参数；通过所述液相色谱串联质谱测试平台检测所述生物基质，测定所述生物基质中的靶标代谢物含量，其中，所述生物基质通过一提取体系进行预处理，所述提取体系包括有机溶剂。根据本发明提供的检测方法，能够快速、准确、特异、灵敏地定量生物基质中的多种靶标代谢物的含量，为肝胆疾病非侵入式临床诊断标志物的筛选以及发病机制的研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物分析与检测技术领域，具体地说，涉及一种生物基质中靶标代谢物含量检测的方法。
背景技术：
肝脏是体内生物转化作用的重要器官之一，综合研究表明，肝脏代谢紊乱与肝病发病率及疾病进程发展息息相关，尤其是脂质代谢稳态破坏(包括磷脂类、胆固醇类物质)会导致肝细胞线粒体功能紊乱及脂质堆积，而肝脏中脂质和胆汁酸的过度积累可能为诱发肝细胞癌的主要原因。随着肝脏细胞不可逆的危害加重，胆汁酸、磷脂类、固醇类和类二十烷酸代谢特征均会产生不同程度的变化，因此，定量分析检测这些重要代谢物对于跟踪肝病的进展、肝癌的早期防治以及肝病的发病机制均具有重要意义。
然而目前，由于对这些代谢物的理化性质差异大，且在生物体内丰度跨越几个数量级，因此想要在一个平台上实现对胆汁酸、磷脂类、固醇类和类二十烷酸类代谢物的高通量分析方法难度非常大，因此，设计一种生物基质中靶标代谢物含量的检测方法十分重要。
发明内容：
本发明的目的之一提供一种生物基质中的靶标代谢物含量的检测方法，用于解决现有技术过程中在一个平台上实现对生物基质中靶标代谢物的高通量分析方法难以实现的问题，所述方法操作简便、运行时间短，测定效果理想。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明是通过包括以下技术方案实现的：
一种生物基质中的靶标代谢物含量的检测方法，其特征在于，所述方法包括：提供一液相色谱串联质谱测试平台，采用多反应检测模式调整质谱参数；通过所述液相色谱串联质谱测试平台检测所述生物基质，测定所述生物基质中的靶标代谢物含量，其中，所述生物基质通过一提取体系进行预处理，所述提取体系包括有机溶剂。
在本发明的一实施方式中，所述质谱参数选自母子离子的质荷比、保留时间、去簇电压，及碰撞电压中的至少一项。
在本发明的一实施方式中，所述液相色谱柱选自C8或C18色谱柱。
在本发明的一实施方式中，所述提取体系中所述有机溶剂选自甲醇、乙腈、二氯甲烷、异丙醇及上述任意两者的混合溶剂。
在本发明的一实施方式中，所述生物基质选自体液，所述有机溶剂与所述体液的体积比为(1～20):1。
在本发明的一实施方式中，所述有机溶剂为体积比选自(30-70):(70-30)的甲醇与二氯甲烷组合。
在本发明的一实施方式中，所述生物基质选自组织，所述有机溶剂-组织的质量比为(2～20):1。
在本发明的一实施方式中，所述提取体系中还包括抗氧化剂。
在本发明的一实施方式中，所述生物基质中靶标代谢物选自类二十烷酸、磷脂类、胆固醇类、胆汁酸类中任意一种或上述其任意组合。
在本发明的一实施方式中，所述检测方法还选用了内标物质，所述内标物质质谱参数选自内标母子离子的质荷比、保留时间、去簇电压，及碰撞电压中的至少一项。
如上所述，根据本发明所提供的一种生物基质中的靶标代谢物含量的检测方法，基于液相色谱串联质谱的检测平台，利用靶标代谢物的标准品调整质谱检测参数和色谱分离条件；接着利用调整后的色谱质谱方法进一步探索生物基中靶标代谢物的提纯方法，在包含通过有机溶剂和抗氧化剂的提纯体系中，提取的回收率高、背景基质干扰少，在上述的分析方法下，本发明建立的液相色谱串联三重四级杆质谱的检测方法能快速、准确、特异、灵敏地定量生物基质中靶标代谢物的含量，为肝胆疾病非侵入式临床诊断标志物的筛选以及发病机制的研究奠定了基础。其他特征、益处和优势将通过本文详述的包括说明书和权利要求在内的本公开而显而易见。
附图说明
图1示出了实施例2中检测生物基质中的靶标代谢物时使用的MRM参数图。
图2示出了实施例2中基于100mm BEH C18柱、正离子模式下，所述生物基质中的靶标代谢物的UPLC-MS/MS多反应监测色谱分离图。
图3示出了实施例2中基于100mm BEH C18柱、负离子模式，下所述生物基质中的靶标代谢物的UPLC-MS/MS多反应监测色谱分离图。
图4示出了实施例2中基于100mm BEH C8柱、正离子模式下，所述生物基质中的靶标代谢物的UPLC-MS/MS多反应监测色谱分离图。
图5示出了实施例2中基于100mm BEH C8柱、负离子模式下，所述生物基质中的靶标代谢物的UPLC-MS/MS多反应监测色谱分离图。
图6示出了实施例2中所述生物基质为肝癌血浆样本时，基于100mm BEH C8柱、正离子模式下，生物基质中的靶标代谢物的UPLC-MS/MS多反应监测色谱分离图。
图7示出了实施例2中所述生物基质为肝癌血浆样本时，基于100mm BEH C8柱、负离子模式下，生物基质中的靶标代谢物的UPLC-MS/MS多反应监测色谱分离图。
图8示出了实施例2中所述生物基质为肝癌组织样本时，基于100mm BEH C8柱、正离子模式下，生物基质中的靶标代谢物的UPLC-MS/MS多反应监测色谱分离图。
图9示出了实施例2中所述生物基质为肝癌组织样本时，基于100mm BEH C8柱、负离子模式下，生物基质中的靶标代谢物的UPLC-MS/MS多反应监测色谱分离图。
图10示出了实施例3中生物基质为体液样本时的内标物质提取回收率。
图11示出了实施例3中生物基质为组织样本时的内标物质提取回收率。
图12示出了实施例4中体液样本为血液时的提取回收率及基质效应。
图13示出了实施例4中体液样本为尿液时的提取回收率及基质效应。
图14示出了实施例4中生物基质为组织样本时的提取回收率及基质效应。
图15示出了生物基质中的104种靶标代谢物线性范围、相关系数、最低检测限(定量限)。
图16示出了生物基质中的104靶标代谢物分析检测的精密度和准确度。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明提供了一种生物基质中的靶标代谢物含量的检测方法，所述方法包括：步骤S1，提供一液相色谱串联质谱测试平台，采用多反应检测模式调整质谱参数；步骤S2，通过所述液相色谱串联质谱测试平台检测所述生物基质，测定所述生物基质中的靶标代谢物含量，其中，所述生物基质通过一提取体系进行预处理，所述提取体系包括有机溶剂。
在步骤S1中，具体地描述了通过液相色谱-串联质谱的测试平台(LC-MS/MS)，对样本进行定量和定性检测。“液相色谱-串联质谱的测试平台(LC-MS/MS)”通常是指，将液相色谱技术与串联质谱分析技术结合，以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，经纯化后的物质在液相色谱和质谱部分经过分离和离子化，经由检测器检测样本。
在步骤S1中，需要说明的是，在本发明中的样本为生物基质，即，获得自任何生物来源的样本，如动物、细胞培养物、器官培养物等。例如为来自男性或女性人类的包括体液(例如血浆、血清、尿液等)肝脏组织或其它组织样本。进一步地，这种生物基质获得自男性或女性患者，其本人为了疾病或病症的诊断、预后或治疗出现在临床环境中。
在步骤S1中，本发明的一个实施方式中，所述液相色谱例如可以采用超高效液相色谱(UPLC)。色谱柱一般包含填料物质从而促进化学部分的分离，所述色谱柱填料物质为C18、C8、C6、C4，例如C-8(100mm×2.1mm，1.7μm，Waters，USA)或C-18填料柱(100mm×2.1mm，1.7μm，Waters，USA)。在超高效液相色谱(UPLC)中，将预处理后的生物基质施用于色谱柱，用溶剂或溶剂混合物洗脱，可应用梯度模式、等度模式或其他模式进行液相色谱法，物质的分离通过变量实现，该变量如流动相的选择、洗脱模式、梯度条件、温度等。例如水溶液为流动相A、纯有机相溶液为流动相B，进行梯度洗脱，所述柱温为30-70℃，自动进样器温度为0-10℃，进样量为5-20μL。流速为0.1-1mL/min。当然，此处仅列举了一具体实现方式，其并不限定于此。
在步骤S1中，本发明的一个实施方式中，在运用包含“串联质谱法(MS/MS)”的质谱仪进行质谱分析时，该质谱仪包含电离已分级样本和产生带电分子以用于进一步分析的离子源。例如，可通过下列进行样本的电离：电子电离、化学电离、电子电离、化学电离、电喷雾离子化(ESI)、光子电离、大气压化学电离(APCI)、光致电离、大气压光致电离(APPI)、快原子轰击(FAB)、液体二次电离(LSI)、基质辅助激光解吸离子化(MALDI)、场电离、场解吸、热喷射/等离子体喷射电离、表面增强激光解吸离子化(SELDI)、电感耦合等离子体(ICP)和粒子束电离。在本发明公开的一具体实施方式中，例如，可通过电喷雾离子化(ESI)电离生物基质，例如，分别通过正离子模式和负离子模式加热电喷雾离子化(HESI)电离所述生物基质，进行串联质谱法(MS/MS)分析。
在步骤S1中，需要说明的是，本发明采用多反应检测模式(Multi ReactionMonitor,MRM)进行测定，所述“多反应检测模式(Multi Reaction Monitor,MRM)”通常是指，质谱分析中的一种扫描模式——基于已知或假定的反应离子信息，有针对性地选择数据进行质谱信号采集，对符合规则的离子进行信号记录，去除不符合规则离子信号的干扰，通过对数据的统计分析从而获取质谱定量信息的质谱技术。
在步骤S1中，在进行MRM测定时，仅使规定质荷比的离子分别通过质谱分析部，例如采用三重四级杆来进行MS/MS测定。由此，MRM测定时，可以进行设定了多个将母离子的质荷比(m/z)和子离子的质荷比(m/z)作为一组的通道的测定，例如包括选择母子离子的荷质比，及/或保留时间，及/或去簇电压，及/或碰撞电压调整MRM测定的参数。所述母离子质荷比选自300～905，所述子离子质荷比选自70～670，所述保留时间选自3～13分钟，去簇电压选自-193～215伏，碰撞电压选自-300～200伏。
在步骤S1中，本发明的一个实施方式中，所述生物基质中的靶标代谢物及其相应的液相色谱-串联质谱的检测条件包含选自由下述靶标代谢物及其相应液相色谱-串联质谱的检测条件中的至少一种：
在步骤S1中，本发明的另一个实施方式中，所述生物基质中的靶标代谢物及其相应的液相色谱-串联质谱的检测条件包含选自由下述靶标代谢物及其相应液相色谱-串联质谱的检测条件中的至少一种：
在步骤S1中，在本发明中，所述检测过程选用了内标，所述的内标物质选自(d4)TXB2,(d4)PGD2,(d4)15d PGJ2,(d4)LTB4,(d4)13-HODE,(d7)5-oxoETE,(d11)11,12EET,(d8)Arachidonic Acid,(d8)5(s)-HETE,(d6)20-HETE,(d8)15(S)-HETE,17:0Lyso PC,17:0Lyso PA,17:1Lyso PS,17:1Lyso PI,15:0PG,17:1Lyso PE,(C13-7)7ahc,(C13)GCA。本发明的一个实施方式中，所述内标物质及其相应的液相色谱-串联质谱的检测条件包含选自由下述相应液相色谱-串联质谱的检测条件中的至少一种：
在步骤S1中，本发明的另一个实施方式中，所述内标物质及其相应的液相色谱-串联质谱的检测条件包含选自由下述相应液相色谱-串联质谱的检测条件中的至少一种：
在步骤S2中，所述生物基质通过提取体系进行预处理，在本发明公开的一个实施方式中，所述的生物基质为体液(血浆、血清、尿液)时，所述的靶标代谢物的提取条件例如为，有机溶剂:血浆＝(1～20):1(v/v)，所述的有机溶剂例如选自甲醇、乙腈、二氯甲烷、异丙醇及其任意两者的混合溶剂。所述的靶标代谢物的提取条件例如为：有机溶剂中甲醇:二氯甲烷＝(30-70):(70-30)(v/v)，例如，65:35，进一步地，体系中包含抗氧化剂，例如BHT抗氧化剂。
在步骤S2中，在本发明公开的另一个实施方式中，所述的生物基质为组织时，所述的靶标代谢物的提取条件例如为，有机溶剂-组织＝(2～20):1(w/w)，其中有机溶剂例如选自甲醇、乙腈、二氯甲烷、异丙醇及其任意两者的混合溶剂。所述的靶标代谢物的提取条件例如为，甲醇：水＝(2-10):1(v/v)，例如4:1，进一步地，体系中包含抗氧化剂，例如BHT抗氧化剂。
本发明公开了生物基质中多种靶标代谢物，例如104种靶标代谢物(包括44个类二十烷酸，32个磷脂类，13个胆固醇类和15个胆汁酸类代谢物)液相色谱-串联质谱的检测条件和预处理条件，从而快速、准确、特异、灵敏地定量生物基质中靶标代谢物的含量，为肝胆疾病非侵入式临床诊断标志物的筛选以及发病机制的研究奠定了基础。
本发明进行了生物基质在超高效液相色谱-串联质谱中的检测条件实验，在其中的一个实施例中，通过多个靶标代谢物的标准品逐个调整其质谱检测参数和色谱分离条件，从而使得满足生物样本定量分析要求。
本发明还进行了生物基质提取体系的提取实验，在其中的一个实施例中，通过内标法对各溶剂体系提取效率进行评估和优化，分别采用了蛋白沉淀法、液液萃取法、脂质提取法等三种前处理方法。从而确定包括机溶剂和抗氧化剂的提取体系可以高效地沉淀生物基质中的蛋白成分，避免其对色谱柱和离子源的污染，且背景干扰小。
本发明还进行了方法学验证实验，对所述生物基质进行检测和预处理的条件进行方法学验证。包括提取回收率和基质效应，线性范围、最低检测限、最低定量限，精密度和准确度评价实验。标准品定量分析方法采用内标法，并使用氘代类标准品作为内标。
具体地，在本发明的一个实施例中，通过引入内标物质(例如氘代标准品)进行提取回收率和基质效应测定实验，在所述检测条件和预处理条件下，所生物基质的回收率在50-120％，基质效应在50-120％的范围内，满足生物样本分析要求。
在本发明的另一个实施例中，通过以标准品与其对应内标的峰面积比值和标准品浓度(梯度)进行线性回归，线性拟合生物基质中的靶标代谢物的标准曲线和方程，进行线性范围和定量下限实验，在所述检测条件和预处理条件下，该线性范围宽，线性相关系数可达0.99及以上，洗脱效果理想；该最低检测限范围为0.3-3pg/ul，灵敏度高，满足后续生物样本中分析检测要求。
在本发明的另一个实施例中，通过低、中、高三个加标浓度水平质控生物基质样本进行日内和日间精密度和准确度实验，在所述检测条件和预处理条件下，其准确度正负误差小于20％，而且日内和日间检测的相对标准偏差(RSD)均低于20％，满足后续生物样本定量分析要求。
以下，将引入具体的实施例对本发明进行更详细的阐述。当然这些实施例决非意为限制本方法的范围。
实施例1生物基质样本和试剂制备
试剂：
Milli-Q纯水(购自Millipore，USA)，色谱纯的有机试剂(购自Aladdin，China)用于蛋白沉淀，质谱纯试剂(购自Merck，Germany)用于液相色谱质谱联用分析实验。
磷脂标准品(购自Avanti Polar Lipids Inc，USA)，类二十烷酸标准品(购自Cayman Chemical，USA)；胆固醇标准品(购自Sigma-Aldrich，USA)，及胆汁酸标准品(购自Sigma-Aldrich，USA)。
生物基质样本：
所述生物基质样本分别来自于四个肝癌患者以及四个健康人。其体液(血浆、血清、尿液)的生物基质样本分别用抗凝管和促凝管收集，抗凝管收集的全血低温条件下离心(4℃，1000g)10分钟，分离上清血浆，分装后于-80℃冻存；促凝管收集的全血在4℃静置30分钟，低温条件下离心(4℃，1000g)10分钟，分离血清，分装后于-80℃冻存；尿液初步离心，分装后于-80℃冻存。其肝脏组织的生物基质样本收集于1.5mL的离心管中于-80℃冻存。
标准品配制：
储备液：类二十烷酸、胆汁酸、胆固醇标准品均用甲醇溶解。磷脂：标准品除PI外，所有磷脂标准品均用氯仿溶解，形成1mg/mL的储备液，用甲醇将储备液稀释至不同浓度的标准品溶液。对于PI，用氯仿：甲醇：水(20:9:1，v/v)溶解标准品，形成0.5mg/mL的储备液。所有标准品储备溶液均保存在-80℃冰箱。
标准品混合液：精密吸取适量各类标准品储备液和氘代类内标标准品，配制浓度分别2.5ng/μL类二十烷酸，10ng/μLPC，6ng/μL PA及PS，2ng/μL PI，5ng/μL PG及PE，2ng/μL胆固醇，5ng/μL胆汁酸混标储备液，该混合溶液储备液浓度设定为10X，保存在-80℃冰箱。
实际检测时，用流动相(mobile phase A：mobile phase B＝50:50(v/v)将标准品混合溶液配制成系列梯度工作液。
实施例2生物基质在超高效液相色谱-串联质谱中的检测条件
液相色谱部：
色谱柱：Acquity UPLC BEH Shield C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm，Waters，USA)和Acquity UPLC BEH Shield C8色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm，Waters，USA)
流动相：水：纯有机相溶液＝50：50(v/v)；
流速：0.4ml/min；
柱温：50℃；
自动进样器温度：4℃；
检测波长：280nm；
进样体积：10μl；
其中，梯度洗脱表如下：
串联质谱(MS/MS)部：
质谱分析部:三重四极杆；
标准品浓度：1ng/μL；
流量：10μL/min；
其中，MS/MS部中ESI+模式ESI-模式质谱离子源参数如下：
且MS/MS部中的MRM测定使用生物基质中的靶标代谢物的MRM参数按图1中进行。
图2至图5分别示出了所述生物基质中的正负模式下所有靶标代谢物的UPLC-MS/MS多反应监测色谱分离图，使用BEH C8色谱柱时，靶标代谢物在13.5min内均能达到标准分离，且峰形尖锐，每个色谱峰宽在0.1min左右，信噪比较高，可以充分满足后续的定量分析。
图6至图7分别示出了实施例1中，所述生物基质为肝癌血浆样本时，24sHY靶标代谢物和12-HHT靶标代谢物的多反应监测色谱分离图；图8和图9分别示出了所述生物基质为肝癌组织样本时，24sHY靶标代谢物和12-HHT靶标代谢物的多反应监测色谱分离图。运用来自于肝癌患者的生物基质样本，靶标代谢物达到标准分离效果，可以定量地进行分析，为肝胆疾病非侵入式临床诊断标志物的筛选奠定了基础。
实施例3生物基质的预处理条件
对所述生物基质进行预处理，使得所述生物基质在进行超高效液相色谱-串联质谱检测时，可以得到预期的测试结果。根据生物基质中的靶标代谢物及相应氘代内标的理化性质，采用内标法对各溶剂体系提取效率进行评估和优化，实验过程中分别采用了较为经典的蛋白沉淀法、液液萃取法、脂质提取法等三种前处理方法，每种方法对比使用不同的溶剂比例提取效率。
生物基质为体液(血浆、血清、尿液)样本时的预处理：使用13种的提取体系用于体液中蛋白的沉淀以及靶标代谢物的提取，所述13种的提取体系，分别为甲醇：二氯化碳＝65：35(v/v)、甲醇:异丙醇＝13:87(v/v)、甲醇:异丙醇＝26:74(v/v)、甲醇:异丙醇＝35:65(v/v)、甲醇:异丙醇＝50:50(v/v)、甲醇:异丙醇＝65:35(v/v)、甲醇:乙腈:丙酮＝1:1:1(v/v)、甲醇:乙腈＝50:50(v/v)的多组分提取体系，以及氯仿、异丙醇、乙酸乙酯、ACN、甲醇的单组分提取体系。所述提取体系中添加有抗氧化剂。
生物基质为组织样本时的预处理：共使用三种方法，蛋白沉淀法采用4种溶剂，分别为甲醇:异丙醇:丙酮:水＝65:25:10(v/v)、甲醇:异丙醇:水＝65:25:10(v/v)、甲醇:乙腈:水＝2:1:1(v/v)、甲醇:水＝4:1(v/v)的提取体系。脂质提取法(经典BD法)采用2种体系，分别为、甲醇-甲基叔丁基醚、甲醇-二氯化碳的的提取体系。液液萃取法采用2种体系，分别为甲醇-氯仿甲醇-二氯化碳的提取体系。所述提取体系中添加有抗氧化剂。
图10和图11分别示出了生物基质为体液(血浆、血清、尿液)样本时和组织样本时的内标物质提取回收率。所述内标的提取回收率以及基质干扰是评价溶剂体系的判断标准，最优的溶剂体系应该获得高回收率以及低的基质干扰效应。所述选择的提取体系都能高效地沉淀体液中的蛋白成分，避免其对色谱柱和离子源的污染。且其中，对于体液样本，选择溶剂体系A即甲醇：二氯化碳＝65：35(v/v)时，对生物基质中靶标代谢物的提取效率最高，且背景干扰也最小。对于组织样本，蛋白沉淀法中溶剂体系D，即甲醇:水＝4:1(v/v)的提取效率最高。
实施例4方法学验证-提取回收率和基质效应实验
对所述生物基质的检测条件和预处理条件，进行方法学验证，例如提取回收率和基质效应实验。磷脂、类二十烷酸、胆固醇、胆汁酸为内源性物质，而标准品与其相应的内标结构相似，且内标均为非内源性物质，避免了生物样本中物质干扰，在提取过程中与标准品效果相同，因此，使用内标进行提取回收率和基质效应测定。经研究表明，在血浆中过滤掉纤维蛋白原等凝血因子剩下即是血清，血浆及血清中小分子代谢物并无太大差异，因此在下文中，均使用血浆作为血液基质样本进行统一处理。
采用沉淀蛋白法提取体液生物样本，精密吸取100ul空白(健康人对照)体液加入10ul内标混标，置于1.5mlEP管中，加入沉淀剂甲醇：二氯甲烷＝65:35(v:v)，沉淀剂体系为包含BHT溶液(整个体系需要预先在4℃冰箱预冷)。涡旋15min，超声提取10min，-20℃下静置60min，15000rpm离心15min后取上清置于玻璃离心管中，氮气吹干后残留复溶，进行UPLC-MS/MS分析。
同样，采取沉淀蛋白法处理肝脏组织生物基质样本，称量适量组织样本，加入10ul内标混标，置于1.5mlEP管中，加入两颗提前在-80℃冰箱中预冷的陶瓷研磨珠，60Hz，研磨匀浆120s，随后加入沉淀剂甲醇：水＝4:1(v/v)，涡旋15min，超声提取10min，-20℃下静置60min，15000rpm离心15min后取上清200ul置于进样小瓶中，直接进行UPLC-MS/MS分析。
经过以上前处理后，提取回收率(RR％)为提取后内标的峰面积与内标溶液峰面积的百分比，即RR％＝内标提取后峰面积÷内标的峰面积×100％。基质效应的测定则是向100ul空白体液提取物中加入10μL内标混标，分别测定提取物中内标峰面积与内标峰面积，计算峰面积比。所有的测定均进行六组平行。
图12至图13分别示出了生物基质为体液时，其血液样本和尿液样本提取回收率及基质效应数据值。图14示出了生物基质为组织时，其组织样本提取回收率及基质效应数据值。满足生物样本的分析要求。
实施例5方法学验证-线性和定量下限实验
对所述生物基质的检测条件和预处理条件，进行方法学验证，例如线性和定量下限实验。生物基质中的靶标代谢物的标准曲线和方程通过线性拟合得到。由于体液(血浆、血清及尿液)及肝脏组织基质较为复杂，目标物较多，因此实验选择在甲醇基质中，以分析物浓度作为自变量X，以分析物峰面积/内标峰面积作为因变量Y进行线性回归，得到甲醇中分析物的标准曲线方程和相关系数。最低检出限的信噪比设为3，最低定量限的信噪比设为10。
具体地，取标准品混标储备液10X，用甲醇稀释为3X、1X、0.7X、0.5X、0.3X、0.1X、0.07X、0.05X、0.03X、0.01X、0.007X梯度溶液，并分别加入0.1X的氘代类内标混标。以标准品与其对应内标的峰面积比值和标准品浓度(梯度)进行线性回归，得到线性回归方程，并用于后续的样品中浓度的计算。定量下限为标准曲线的最低浓度点，在建立的标准品定量分析方法中，定量下限的浓度应使信噪比(S/N)大于7:1，即S/N＞7。
图15示出了本发明的生物基质中的104种靶标代谢物的线性范围、标准方程、相关系数以及检出限和定量限的数据值。结果表明该方法线性范围较宽，大部分线性相关系数达到0.99及以上要求。最低检测限范围为0.420-2.10pg/ul，证明该方法灵敏度高，满足后续生物基质中靶标代谢物含量的分析要求。
实施例6方法学验证-精密度和准确度实验
对所述生物基质的检测条件和预处理条件，进行方法学验证，例如精密度和准确度实验。准确度是指在确定的分析条件下测得的体内样品浓度和真实浓度的接近程度，精密度是指在确定的分析条件下相同生物介质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。
具体地，在本研究中，准确度和精密度的测定分别选用高中低三个浓度的质控(QC)样品，其中低浓度质控样品(LQC)为0.03X，中浓度质控样品(MQC)为0.3X，高浓度质控样品(HQC)为1X。准确度通常使用标准偏差(RE％)表示。标准偏差(RE％)为测得浓度和真实浓度的差值与真实浓度的百分比，即RE％＝(测得浓度-真实浓度)÷真实浓度×100％。当标准偏差RE％不超过±15％时，该方法准确度良好。精密度的测定通常包括日内(批内)精密度和日间(批间)精密度。本研究在标准曲线范围的高中低三个浓度分别制备5个质控样品，连续测定三批，以测定该方法的精密度。变异系数(CV％)常用于表示精密度，当批间和批内精密度的变异系数CV％不超过±15％时，该方法精密度良好。
图16示出了生物基质中的104靶标代谢物分析检测的精密度和准确度。从图中可以看到各待测物的测量准确度误差为0.49％-21.71％，日内和日间精密度分别为：0.93％-24.74％和2.57％-25.53％。该检测方法的准确度正负误差小于20％(在较低低浓度质控样本检测时，误差小于22％)，而且日内和日间检测的相对标准偏差(RSD)均低于20％(在较低低浓度质控样本检测时，误差小于25％)，满足后续定量分析要求。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (4)
1.一种生物基质中的靶标代谢物含量的检测方法，其特征在于，所述方法包括：
提供一液相色谱串联质谱测试平台，采用多反应检测模式调整质谱参数；
通过所述液相色谱串联质谱测试平台检测所述生物基质，测定所述生物基质中的靶标代谢物含量，其中，所述生物基质通过提取体系进行预处理，所述提取体系包括有机溶剂；
所述生物基质为体液；
所述靶标代谢物和相应的所述质谱参数为：
所述提取体系中所述有机溶剂为体积比选自(30～70):(70～30)的甲醇与二氯甲烷组合，所述有机溶剂与所述体液的体积比为(1～20):1；
所述液相色谱串联质谱的检测条件为：
液相色谱部：
色谱柱：Acquity UPLC BEH Shield C18色谱柱或Acquity UPLC BEH Shield C8色谱柱；
流动相：使用体积比为50:50的流动相A和流动相B的组合将标准品混合溶液配制成系列梯度工作液，其中，所述流动相A为水，所述流动相B为纯有机相溶液，所述标准品混合液由所述靶标代谢物标准品溶液和所述氘代类内标标准品配置而成；
流速：0.4ml/min；
柱温：50℃；
自动进样器温度：4℃；
检测波长：280nm；
进样体积：10μl；
其中，梯度洗脱表如下：
串联质谱部：
质谱分析部:三重四极杆；
标准品浓度：1ng/μL；
流量：10μL/min；
其中，MS/MS部中ESI+模式ESI-模式质谱离子源参数如下：
2.如权利要求1所述的生物基质中的靶标代谢物含量的检测方法，其特征在于，所述提取体系中还包括抗氧化剂。
3.一种生物基质中的靶标代谢物含量的检测方法，其特征在于，所述方法包括：
提供一液相色谱串联质谱测试平台，采用多反应检测模式调整质谱参数；
通过所述液相色谱串联质谱测试平台检测所述生物基质，测定所述生物基质中的靶标代谢物含量，其中，所述生物基质通过提取体系进行预处理，所述提取体系包括有机溶剂；
所述生物基质为组织；
所述靶标代谢物和相应的所述质谱参数为：
所述提取体系中所述有机溶剂为体积比选自4:1的甲醇与水组合，所述有机溶剂-组织的质量比为(2～20):1；
所述液相色谱串联质谱的检测条件为：
液相色谱部：
色谱柱：Acquity UPLC BEH Shield C18色谱柱或Acquity UPLC BEH Shield C8色谱柱；
流动相：使用体积比为50:50的流动相A和流动相B的组合将标准品混合溶液配制成系列梯度工作液，其中，所述流动相A为水，所述流动相B为纯有机相溶液，所述标准品混合液由所述靶标代谢物标准品溶液和所述氘代类内标标准品配置而成；
流速：0.4ml/min；
柱温：50℃；
自动进样器温度：4℃；
检测波长：280nm；
进样体积：10μl；
其中，梯度洗脱表如下：
串联质谱部：
质谱分析部:三重四极杆；
标准品浓度：1ng/μL；
流量：10μL/min；
其中，MS/MS部中ESI+模式ESI-模式质谱离子源参数如下：
4.如权利要求3所述的生物基质中的靶标代谢物含量的检测方法，其特征在于，所述提取体系中还包括抗氧化剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910772860.XA CN110361495B (zh) | 2019-08-21 | 2019-08-21 | 一种生物基质中的靶标代谢物含量的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910772860.XA CN110361495B (zh) | 2019-08-21 | 2019-08-21 | 一种生物基质中的靶标代谢物含量的检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110361495A CN110361495A (zh) | 2019-10-22 |
| CN110361495B true CN110361495B (zh) | 2021-07-27 |
Family
ID=68224841
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910772860.XA Active CN110361495B (zh) | 2019-08-21 | 2019-08-21 | 一种生物基质中的靶标代谢物含量的检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110361495B (zh) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110850074B (zh) * | 2019-11-08 | 2023-04-11 | 郑州大学第一附属医院 | 肝硬化阴离子标志物的筛选方法和应用 |
| CN110850072B (zh) * | 2019-11-08 | 2023-05-05 | 郑州大学第一附属医院 | 肝癌阴离子标志物的筛选方法和应用 |
| CN110850075B (zh) * | 2019-11-08 | 2023-04-07 | 郑州大学第一附属医院 | 肝癌阳离子标志物的筛选方法和应用 |
| CN111474288A (zh) * | 2020-01-07 | 2020-07-31 | 美康生物科技股份有限公司 | 一种用于准确测定血清中胆汁酸浓度的质谱试剂盒 |
| CN111505141B (zh) * | 2020-04-26 | 2021-01-26 | 南京大学 | 一种基于污染物代谢扰动的非目标生物标志物高通量筛查方法 |
| CN113960221B (zh) * | 2021-12-23 | 2022-02-25 | 中国中医科学院医学实验中心 | 基于粪便样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法及其应用 |
| CN113960222B (zh) * | 2021-12-23 | 2022-02-25 | 中国中医科学院医学实验中心 | 基于血清样本的胆汁酸全通路代谢轮廓的检测方法及其应用 |
| CN117147735A (zh) * | 2023-10-26 | 2023-12-01 | 安徽医科大学 | 一种基于滤纸片干血斑检测人体血液中甘油三酯的方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101832977A (zh) * | 2009-03-09 | 2010-09-15 | 复旦大学附属妇产科医院 | 一种卵巢肿瘤血清标志物 |
| CN103728379B (zh) * | 2012-10-11 | 2015-06-10 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种判断用于科学研究的血液样本采集质量的方法 |
| US10948484B2 (en) * | 2016-04-11 | 2021-03-16 | Veravas, Inc. | Sample depletion and enrichment to improve the quality of diagnostic test results |
| CN107037144B (zh) * | 2016-11-22 | 2019-11-08 | 苏长青 | 一种检测体液中靶标代谢物含量的超高效液相色谱串联质谱方法 |
-
2019
- 2019-08-21 CN CN201910772860.XA patent/CN110361495B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110361495A (zh) | 2019-10-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110361495B (zh) | 一种生物基质中的靶标代谢物含量的检测方法 | |
| Ren et al. | Advances in mass spectrometry-based metabolomics for investigation of metabolites | |
| Hines et al. | Assessment of altered lipid homeostasis by HILIC-ion mobility-mass spectrometry-based lipidomics | |
| Cajka et al. | Comprehensive analysis of lipids in biological systems by liquid chromatography-mass spectrometry | |
| US11061005B2 (en) | Mass spectrometry assay method for detection and quantitation of organic acid metabolites | |
| Lu et al. | LC–MS-based metabonomics analysis | |
| EP3511973B1 (en) | Quantitation of insulin by mass spectrometry | |
| US10079138B2 (en) | Methods of detecting reverse triiodothyronine by mass spectrometry | |
| Chen et al. | Methods used to increase the comprehensive coverage of urinary and plasma metabolomes by MS | |
| Baghel et al. | Application of mass spectroscopy in pharmaceutical and biomedical analysis | |
| US11624737B2 (en) | Methods for detecting lacosamide by mass spectrometry | |
| US20240222102A1 (en) | Apolipoprotein e isotype detection by mass spectrometry | |
| Kartsova et al. | Current role of modern chromatography with mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy in the investigation of biomarkers of endometriosis | |
| Jain et al. | Method development and validation for detection of procaterol in human urine using gas chromatography-tandem mass spectrometry | |
| Ramkumar | A Perceptive of Mass Spectrometry in Clinical Chemistry: Hyphenation for Benefit of Mankind |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231218 Address after: Room 2039, 2nd Floor, Building 1, Caoqiao Village, Jingshan Town, Yuhang District, Hangzhou City, Zhejiang Province, 311100 Patentee after: Hangzhou Ningxiu Technology Co.,Ltd. Address before: 200240 No. 800, Dongchuan Road, Shanghai, Minhang District Patentee before: SHANGHAI JIAO TONG University |
|
| TR01 | Transfer of patent right |