CN111257485B - 一种使用多肽标志物区分西洋参和人参的方法 - Google Patents

一种使用多肽标志物区分西洋参和人参的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种使用多肽标志物区分西洋参和人参物种的方法，包括下述步骤：西洋参与人参提取物经液相色谱分离后通过质谱分析；采集质谱数据并通过数据处理软件对齐每个特征的m/z，滞留时间，峰强度等；使用提取目标多肽色谱峰的分析方法确定西洋参和人参的共有多肽以及多肽标志物；基于液质联用分析对西洋参和人参的目标多肽进行质量和碎片离子的匹配，实现表征；使用多肽标志物对西洋参和人参进行鉴定，并通过西洋参标志物皂苷F11和人参标志物皂苷Rf验证鉴定结果。利用本发明的方法可以快速地、准确地将人参和西洋参的生物标志物寻找出来并用来鉴定未知样本。

Description

一种使用多肽标志物区分西洋参和人参的方法
技术领域
本发明属于植物多肽及生物技术领域，涉及一种从植物复杂成分中有效筛选多肽标志物并用于区分相似物种，并通过现代质谱技术表征多肽标志物。
背景技术
西洋参和人参具有相似的化学成分和药理活性，但两种人参物种之间的化学差异尚未得到充分阐明。文献中已经报道的西洋参的标志物皂苷F11和人参的标志物皂苷Rf具有相同的分子量，它们在大多数LC条件下通常共洗脱。并且文献中报道亚洲人参中存在微量的F11。因此，有限的西洋参和人参的标志物不能用于完全描绘两种物种之间的化学差异，可能会发生西洋参和人参的错误识别，需要建立可分辨的新的标志物以区分人参属物种。
特征标志物定义为在独特物种中可检测到，多肽能够有效地研究基因的动态表达，可能具有新的治疗选择的潜力，是有前途的理想候选标志物。良好的生物标志物具有高灵敏度(识别真阳性的可能性)和特异性(确认真阴性的可能性)，从而提供明确的确认/排除信息。
使用液质分析具有高分辨率，高灵敏度和高通量，可以发现新的多肽，依赖于蛋白质数据库的持续更新,在多肽的研究中具有很大的潜力。
发明内容
本发明公开了一种使用多肽标志物区分西洋参和人参的方法，包括下述步骤：西洋参与人参提取物经液相色谱分离后通过质谱分析；采集质谱数据并通过数据处理软件对齐每个特征的m/z，滞留时间(Retention time)，峰强度等筛选多肽候选物；使用提取目标多肽色谱峰的分析方法确定西洋参和人参的共有多肽以及多肽标志物；基于液质联用分析对西洋参和人参的目标多肽进行质量和碎片离子的匹配，实现表征；使用多肽标志物对西洋参和人参进行鉴定，并通过西洋参标志物皂苷F11和人参标志物皂苷Rf验证鉴定结果。利用本发明的方法可以快速地、准确地将人参和西洋参的多肽标志物寻找出来并用来鉴定未知样本，这些生物标志物将为药理研究和掺假预防提供科学依据，同时也为其他中药材寻找生物标记物提供新的思路和方法。获得的关于西洋参和人参中特定肽表达的知识构成了我们未来努力的基础。
本发明提供了一种使用多肽标志物区分西洋参和人参的方法，所述方法至少包括以下步骤：
a)制备西洋参和人参化合物的提取液；
b)通过液质联用对所述西洋参和所述人参的提取液进行非靶向分析；
c)通过数据处理软件对步骤b)采集得到的数据进行预处理筛选多肽候选物；
d)依次提取步骤c)得到的候选多肽的色谱峰的分析方法，以确定西洋参和人参的共有多肽及各自的多肽标志物；
e)通过液质联用对所述共有多肽及多肽标志物进行二级碎裂；
f)通过数据库检索对所述共有多肽及多肽标志物进行表征；
g)对待测样本进行所述a)和b)的操作，获得待测样本的质谱数据，通过步骤d)得到的多肽标志物判断待测样本属于西洋参或人参并进行验证。
在优选的实施方式中，所述步骤a)包括：
1)将西洋参或人参样本中加入体积比为0％-80％乙醇水溶液为提取溶剂，样本粉末与溶剂的质量体积比为0.1g/ml-0.4g/ml；
2)将步骤1)中的混合物超声分离，收集溶剂；
3)将步骤2)所得溶液在氮气氛下干燥，然后将所得干燥物用水重新溶解，离心收集上清。
在优选的实施方式中，所述步骤b)采用二元梯度洗脱系统，其中，流动相A为浓度为0.2％～0.5％的甲酸水，B为乙腈。
洗脱梯度如下：0min:2～5％B,流速0.3～0.4mL/min；5～7min:100％B,流速0.3～0.4mL/min；在色谱柱温为40℃-60℃下进行色谱分离；进样体积为1-5μl。
在优选的实施方式中，所述步骤c)通过Progenesis QI软件对质谱仪采集到的数据进行预处理，筛选出候选肽的电荷数是4<z<7的多电荷离子。优选地，所述预处理包括对特征峰的m/z和滞留时间进行对齐和相同的特征进行合并中的至少一种。
在优选的实施方式中，在所述步骤d)中，通过所述多电荷离子判断西洋参和人参的共有多肽以及各自的多肽标志物，将所述共有多肽以及各自的多肽标志物的离子从总离子流图上提取出来，以绘制肽谱。
在优选的实施方式中，在所述步骤e)，筛选出共有多肽以及各自的多肽标志物进行靶向二级碎裂表征，所述液质联用包括二元洗脱系统，其中流动相A为浓度为0.2％～0.5％的甲酸水，B为乙腈；
洗脱梯度如下：0min:2～5％B,流速0.3～0.4mL/min；5～7min:100％B,流速0.3～0.4mL/min；在色谱柱温为40℃-60℃下进行色谱分离；进样体积为1-5μl。
优选地，选择碰撞诱导解离和碰撞解离碎裂，归一化碰撞能量设定为20％-50％。
在优选的实施方式中，在所述步骤f)中通过蛋白组学质谱数据分析软件，利用多肽二级谱图上的碎片离子质量差，进行denovo从头测序和搜索数据库。优选地，所述蛋白质组学质谱数据分析软件进行过滤、解卷积、二级质谱图简化、从头测序和搜索数据库以确定多肽的一级结构。
在优选的实施方式中，在所述步骤g)中，分别提取待测样本的步骤d)得到的多肽标志物的色谱图，以判断待测样本属于西洋参或人参。
在优选的实施方式中，在所述步骤b)和e)，质谱采集为正离子模式。在优选的实施方式中，在所述步骤g)中所述方法还包括使用已知的西洋参的皂苷标志物F11和人参的皂苷标志物Rf来验证所述多肽标志物，质谱采集为负离子模式。
本申请能产生的有益效果包括：
1)本发明建立了基于液质联用技术，发现了多肽标志物可用于西洋参和人参的鉴别；
2)通过未知的大量的药材样本，监测已知的皂苷标志物(包括皂苷Rf和F11)，验证了这些多肽标志物的可靠性，为进一步的药理学研究和临床应用提供理论基础；
3)本发明使用液质联用为分析检测手段，具有高通量和高灵敏度，分离度好和分析速度快，有助于多肽的发现和表征；
4)本发明通过Progenesis QI软件处理质谱数据，ESI源的电离过程会使大部分多肽带有多电荷(z>1)，据此特征，可以快速筛选多肽；
5)报道的标志物F11和Rf具有相同的分子量，它们通常在大多数LC条件下共洗脱，亚洲人参中还存在微量的F11。已知的标志物不能用于完全描绘两种物种之间的化学差异。本发明研究的多肽广泛参与生物系统，它们能够有效地研究基因的动态表达，多肽标志物具有新的治疗选择的潜力，是有前途的理想候选者；
6)本发明对西洋参和人参的多肽标志物的发现和表征有助于了解这两种相似草药的药理活性，为药理研究和掺假预防提供科学依据，适用于未来西洋参和人参在加工过程中的质量控制；
7)本发明所建立的使用多肽标志物区分人参和西洋参属种的通用技术体系，可辐射应用到植物和微生物代谢组学分析、食品安全代谢组学分析等领域。
附图说明
图1-1使用线性溶剂A/溶剂B洗脱梯度以正离子模式记录人参样品的总离子色谱图。
图1-2使用线性溶剂A/溶剂B洗脱梯度以正离子模式记录西洋参样品的总离子色谱图。
图2-1代表西洋参标志物B1的提取色谱图，前5个药材代表西洋参和后五个药材代表人参。
图2-2代表人参标志物D1的提取色谱图，前5个药材代表西洋参和后五个药材代表人参。
图3-1代表西洋参的肽图谱，E1,F1,G1,H1和I1代表和人参共有的多肽。A1和B1代表西洋参特有的多肽。
图3-2代表人参的肽图谱，E1,F1,G1,H1和I1代表和人参共有的多肽。C1和D1代表人参特有的多肽。
图4代表两种人参皂甙参考化合物Rf和F11的色谱图。
图5-1分别表示西洋参皂苷标志物F11在西洋参的提取色谱图。
图5-2分别表示人参皂苷标志物Rf在人参的提取色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
本发明的技术方案概述如下：
(1)西洋参和人参化合物的提取；(2)通过液质联用对西洋参和人参进行非靶向分析；(3)数据处理软件处理筛选多肽候选物；(4)提取候选多肽的色谱峰,确定西洋参和人参的共有多肽以及多肽标志物；(5)通过液质联用对所述共有多肽及多肽标志物进行二级碎裂；(6)通过数据库检索对所述共有多肽及多肽标志物进行表征(7)使用多肽标志物对西洋参和人参进行鉴定(8)通过西洋参标志物皂苷F11和人参标志物皂苷Rf验证多肽标志物。
上述方法中，步骤(1)取10个以上的不同来源(不同产地或不同季节生产或不同药房的西洋参与人参药材进行粉碎，加入体积比为0％-80％乙醇水溶液为提取溶剂，药材粉末与溶剂的质量体积比为0.1g/ml-0.4g/ml,混合均匀；超声10-30分钟，分离，收集溶剂，得到提取液；将所得溶液在温和的氮气流下干燥，分别在0.1-0.4mL水中重新溶解。4-10℃下超速离心10-20分钟，收集上清。
上述的方法中，步骤(2)流动相A为浓度为0.2％～0.5％的醋酸水，B为乙腈。使用Agilent 1290LC系统(Agilent Technologies，Waldbronn，Germany)。色谱柱：ZORBOXEclipse plus RR HD C18柱(2.1mm×50mm，2.7μm，Agilent，USA)，在40℃-60℃下进行色谱分离,进样体积为1-5μl。二元洗脱系统梯度如下：0min:2～5％B,流速0.3～0.4mL/min；5～10min:100％B,流速0.3～0.4mL/min。
上述的方法中，步骤(2)由超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱分析过程采用电喷雾离子源正离子模式进行检测；质谱参数如下：毛细管电压为2500V-3000V，锥孔电压为80-150V，电喷雾气温度为340-360℃，数据采集范围在100-2000m/z。电喷雾气流量流量＝6.0-10L/min；离子源电压＝80V。
上述的方法中，步骤(3)通过Progenesis QI软件提取步骤(2)所采集到的数据，对数据进行预处理(包括对特征的m/z和Retention time进行对齐和相同的特征进行合并等)来筛选多肽候选物,生成峰强度列表。Progenesis QI参数如下：Filiter:0.2-1；Absoluteion intensity:100-5000。筛选出候选肽的电荷数是多电荷离子(4<z<7)，这些不同电荷的中性质量值在计算后属于同一种化合物。
上述的方法中，步骤(4)将步骤(3)得到的有多重电荷形式的离子，以某个电荷(4或者5或者7或者7)的离子为例，判断西洋参和人参的共有多肽以及各自的多肽标志物，将所述共有多肽以及各自的多肽标志物的离子从总离子流图上提取出来，以绘制肽谱；
上述的方法中，步骤(5)质谱分析过程通过LTQ-Orbitrap Elite(Thermo FisherScientific，Bremen，Germany)靶向表征人参和西洋参的共有多肽和多肽标志物。数据采集m/z范围为500-1700，分辨率(半高全宽)＝6,000。电喷雾离子源正离子模式进行检测，通过碰撞诱导解离(CID)和更高能量的碰撞解离(HCD)碎裂。归一化碰撞能量设定为20％-50％。
上述的方法中，步骤(6)搜库软件表征多肽：通过蛋白组学质谱数据分析软件Peaks Studio 7(BSI,Canada)，进行过滤、解卷积、二级质谱图简化及从头测序以确定这些肽的一级结构。数据细化允许校准母离子的m/z值和电荷状态，从而提供更准确的单同位素m/z值。严格控制误差容限(前体：10.0ppm；在MS/MS谱中观察到的主要碎片也应满足误差小于0.5Da的结果)进行峰质心，电荷解卷积和去极化。数据过滤阈值为>0.3，没有指定用于切割的酶。选择可变翻译后修饰(PTM)，包括甲基化(Δmass，+14.02)，脱氧(Δmass，-15.99)，脱水(Δmass，-18.01)，己糖(Δmass，+162.052)，加入2个己糖(Δmass，+324.11)，氧化(Δmass，+15.99)；固定的PTM是二硫键形成(Δmass，-1.0078)。数据检索来自于从SwissProt数据库www.uniprot.org网站下载的特定人参蛋白质数据库。利用多肽二级谱图上的碎片离子质量差，denovo从头测序。denovo测序从波谱的高质量端开始，找到可以互为印证的a,b离子，为了确保正确还要找到-NH3和H2O的丢失，接着用尽可能小的氨基酸跨度找到下一个b离子，一直到波谱低端的b1离子，实现从C端到N端的测序；另一个方向上的测序则是通过从高质量端开始跟踪y离子实现的。
上述的方法中，步骤(7)对市面上的50批以上的西洋参和50批以上的人参样品如步骤(1)制备，用来用于随后的如步骤(2)UHPLC-Q-TOF-MS分析；质谱采集为正离子模式；正离子模式是为了通过肽标志物鉴定西洋参和人参；从所有的药材样本中，提取步骤(4)得到的多肽标志物的离子的色谱图来进行鉴定人参物种。
上述的方法中，步骤(8)使用西洋参标志物皂苷F11和人参标志物皂苷Rf验证多肽标志物。质谱采集为负离子模式；负离子模式是为了通过文献中已有的西洋参的皂苷标志物F11和人参的皂苷标志物Rf来验证多肽标志物。制备人参皂苷F11和Rf标准品，通过步骤(2)UHPLC-Q-TOF-MS分析，质谱采集为负离子模式，使人参皂甙Rf和F11在基线分离。从所有的步骤(7)的药材样本中，提取人参皂苷F11和Rf的离子的色谱图来进行验证标志物鉴定的人参物种结果。
实施例1
1.西洋参和人参化合物的提取
溶剂提取：分别称量10个100mg不同药房的西洋参与人参药材粉末，置于2ml离心管中，加入1ml体积浓度为50％的乙醇水溶液为提取液，混合均匀；超声(1130W，37千赫)30分钟，分离，收集溶剂，得到提取液；将所得溶液在温和的氮气流下干燥，分别在0.2ml水中重新溶解。4℃下超速离心10分钟，收集上清。
2.通过UHPLC-TOF-MS对西洋参和人参进行非靶向分析，对其组分进行测定
①超高相液相色谱测定步骤1获得样品成分及相对峰强度，色谱柱为DB-5MS，液相系统为Agilent 1290LC(Agilent Technologies，Waldbronn，Germany)，色谱柱的规格为ZORBOX Eclipse plus RR HD C18柱(2.1mm×50mm，2.7μm，Agilent，USA)，在60℃下进行色谱分离。二元洗脱系统包含0.5％乙酸水溶液，梯度如下：0min:5％B,流速0.3mL/min；7min:100％B,流速0.3mL/min；9min:100％B,流速0.3mL/min。进样体积为5μl。
②Agilent 1290LC连接电喷雾离子化(ESI)的Agilent 6520Q-TOF质谱仪(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)，采集模式为正离子模式。质谱参数如下：毛细管电压为2500V，锥孔电压为80V，电喷雾气温度为350℃，数据采集范围在100-2000m/z。电喷雾气流量流量＝8.0L/min；离子源电压＝80V
图1-1和图1-2分别显示了西洋参和人参的总离子流图。
3.数据处理软件处理筛选多肽候选物
通过Progenesis QI软件提取步骤(2)由超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪所采集到的数据，对数据进行预处理(包括对特征的m/z和Retention time进行对齐和相同的特征进行合并等),生成峰强度列表。Progenesis QI参数如下：Filiter:0.3；Absoluteion intensity:2000。检测到的大量组分是多电荷离子(z>4)，这被认为是候选多肽。西洋参和人参肽容易形成不同电荷的离子，包括4正电荷，5正电荷，6正电荷和7正电荷的离子，这些不同电荷的中性质量值在计算后属于同一种化合物。
4.提取候选多肽的色谱峰,确定西洋参和人参的共有多肽以及多肽标志物；
将此步骤得到的有多重电荷形式的离子，以6电荷的离子为例，分别提取色谱图进行分析，判断它们在西洋参和人参中的存在情况，来分析共有多肽以及多肽标志物。对两个属种的比较分析表明，人参中肽的数量与西洋参中的相似，并且一些肽如E1，F1，G1，H1，I1属于两个人参属共有的多肽(表1-1)。除了这些共有肽之外，还发现具有特异性的多肽，用作鉴定西洋参和人参。A1和B1在西洋参中是特异性的，属于西洋参的标志物，在人参中不存在(表1-2)。C1和D1对人参是特异性的(表1-3)。图2-1为5批次西洋参和5批人参样品的B1的提取离子色谱图，B1被认为是西洋参的生物标志物。图2-2为5批次西洋参和5批人参样品的D1的提取离子色谱图，D1被认为是人参的生物标志物。我们总结了西洋参和人参的上述肽的图谱，如图3-1和图3-2所示。图3-1代表西洋参的肽图谱，E1,F1,G1,H1和I1代表和人参共有的多肽。A1和B1代表西洋参特有的多肽。图3-2代表人参的肽图谱，E1,F1,G1,H1和I1代表和人参共有的多肽。C1和D1代表人参特有的多肽。横坐标代表保留时间，纵坐标代表m/z。
表1-1筛选出的西洋参和人参的共有肽的详细信息
Figure BDA0001888436970000091
表1-2筛选出的西洋参特有肽的详细信息
Figure BDA0001888436970000092
表1-3筛选出的人参特有肽的详细信息
Figure BDA0001888436970000093
5.通过LTQ-Orbitrap对所述共有多肽及多肽标志物进行二级碎裂
通过LTQ-Orbitrap Elite(Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany)对上述多肽靶向二级碎裂来鉴定。
①液相色谱为二元洗脱系统，流动相A为浓度为0.5％的甲酸水，B为乙腈。梯度如下：0min:5％B,流速0.3mL/min；7min:100％B,流速0.3mL/min；9min:100％B,流速0.3mL/min；11min:5％B,流速0.3mL/min；在色谱柱温为60℃下进行色谱分离；进样体积为5μl。
②质谱分辨率(半高全宽)＝6,000。电喷雾离子源正离子模式进行检测，选择在上述多肽用于靶向碎裂，包括碰撞诱导解离(CID)和更高能量的碰撞解离(HCD)碎裂。归一化碰撞能量设定为22％和30％。
6.通过数据库检索对所述共有多肽及多肽标志物进行表征
通过蛋白组学质谱数据分析软件Peaks Studio 7(BSI,Canada)，进行过滤、解卷积、二级质谱图简化及从头测序以确定这些肽的一级结构。数据细化允许校准母离子的m/z值和电荷状态，从而提供更准确的单同位素m/z值。严格控制误差容限(前体：10.0ppm；在MS/MS谱中观察到的主要碎片也应满足误差小于0.5Da的结果)进行峰质心，电荷解卷积和去极化。数据过滤阈值为>0.3，没有指定用于切割的酶。选择可变翻译后修饰(PTM)，包括甲基化(Δmass，+14.02)，脱氧(Δmass，-15.99)，脱水(Δmass，-18.01)，氧化(Δmass，+15.99)；固定的PTM是二硫键形成(Δmass，-1.0078)。数据检索来自于从SwissProt数据库www.uniprot.org网站下载的特定人参蛋白质数据库。利用多肽二级谱图上的碎片离子质量差，denovo测序从波谱的高质量端开始，找到可以互为印证的a,b离子，为了确保正确还要找到-NH3和H2O的丢失，接着用尽可能小的氨基酸跨度找到下一个b离子，一直到波谱低端的b1离子，实现从C端到N端的测序；另一个方向上的测序则是通过从高质量端开始跟踪y离子实现的。对搜索和测序得到的肽序列，结合其可信度(-10logP)、肽链断裂情况、子离子的分配情况及误差的范围逐个进行人工确认，搜索鉴定的假阳性率FDR<1％。
我们分别确认了E1，F1，G1，H1和I1的身份为M2+CH3，M1，M1+CH3，M1+O和M1+CH3+O。A1和B1被鉴定为M2-O和M1-O，质量分别为4716.4272和4975.4770kDa。当与质量分别为4968.3710和4984.3639kDa的M1相比时，离子C1和D1之间的分子量差异分别为-23.0968和-7.1039。在这些常见肽中，PTM的特征在于甲基化，氧化和己糖加成，M1和M2的分子量分别为4991.4678和4732.3741。M1和M2的序列片段分别是SEYVLTDINVC(-1.01)VNQQATRFVDC(-1.01)PTDDATDDYRLKFVRLPSKMK(186-228)和SEYVLTDINVC(-1.01)VNQQATRFVDC(-1.01)PTDDATDDYRLKFVRLPSK(186-226)。
7.使用多肽标志物对西洋参和人参进行鉴定
对市面上的74批西洋参和72批的人参样品如步骤(1)制备，用来用于随后的如步骤(2)UHPLC-Q-TOF-MS分析；质谱采集为正离子模式；正离子模式是为了通过肽标志物鉴定西洋参和人参。在所有药材的总离子流图中，分别提取西洋参的标志物A1和B1以及人参的标志物C1和D1的提取色谱图来鉴别西洋参和人参。
8.通过西洋参标志物皂苷F11和人参标志物皂苷Rf验证多肽标志物
质谱采集为负离子模式。负离子模式是为了通过文献中已有的西洋参的皂苷标志物F11和人参的皂苷标志物Rf来验证多肽标志物。制备人参皂苷F11和Rf标准品，通过步骤(2)UHPLC-Q-TOF-MS分析，使人参皂甙Rf和F11在基线分离如图4，保留时间分别为4.33和4.40分钟。从所有的步骤(7)的药材样本中，提取人参皂苷F11和Rf的离子的色谱图来进行验证标志物鉴定的人参物种结果如图5-1和图5-2。
表2-1和表2-2总结了用于验证两种类型标志物的样品数。如表2-1所示，在这些产品中，发现69个被认为西洋参的样品含有来自西洋参的标志物B1和F11。在69个西洋参样品中，100％的样本都存在标志物B1；并且，它们在所有人参样品中都检测不到或不存在。这证实了B1作为西洋参生物标志物的稳健性。在69个西洋参品中91.13％的样本中含有A1，并且在所有人参样品中检测不到或不存在。我们推测某些西洋参样品的A1峰强度很弱，所以没有检测到。市场上购买的作为西洋参种类的其他五批样本，却含有Rf，C1或D1的人参标志物。其中两批来自人参，因为不含有西洋参标志物F11，A1和B1。另外三批由西洋参和人参的混合物制成，还存在F11，A1或B1，这些西洋参标志物。因此，B1和F11一样，是西洋参的强健标志物。
尽管人参多肽大部分与西洋参相似，但在几种人参样品中并未检测到多肽。然而，所开发的方法仍然用于人参的分析。Rf，C1和D1是人参的特征标志物。表2-2所示。如果样品含有肽C1和D1和Rf，则它是人参样品。将市场上69批人参的样本经过标志物进行鉴定和验证。采购的市面上的人参中，多肽标志物C1和D1在56批人参(69批人参中，只有56批人参含有多肽)中100％都存在，并且在所有西洋参样品中检测不到。一个来自市面上的人参被鉴定为西洋参，而有两批为来自西洋参和人参的混合物。
基于以上分析，我们得出以下总结：(1)所有西洋参样品富含肽，而少量人参样品中不存在(即，如果来自人参或者西洋参的样本中则不存在多肽，并且存在Rf，则被鉴定为人参；(2)F11，B1或A1的存在对西洋参的鉴别是非常有效的；以及(3)Rf，C1或D1的存在可以鉴定人参。
表2-1总结将多肽标志物用于识别西洋参，并通过皂苷标志物进行验证
Figure BDA0001888436970000121
表2-2总结将多肽标志物用于识别人参，并通过皂苷标志物进行验证
Figure BDA0001888436970000122
实施例2
1.西洋参和人参化合物的提取
溶剂提取：分别称量12个100mg不同药房的西洋参与人参药材粉末，置于2ml离心管中，加入2ml体积浓度为10％的乙醇水溶液为提取液，混合均匀；超声(1130W，37千赫)30分钟，分离，收集溶剂，得到提取液；将所得溶液在温和的氮气流下干燥，分别在0.4ml水中重新溶解。4℃下超速离心10分钟，收集上清。
2.通过UHPLC-TOF-MS对西洋参和人参进行非靶向分析，对其组分进行测定
①超高相液相色谱测定步骤1获得样品成分及相对峰强度，色谱柱为DB-5MS，液相系统为Agilent 1290LC(Agilent Technologies，Waldbronn，Germany)，色谱柱的规格为ZORBOX Eclipse plus RR HD C18柱(2.1mm×50mm，2.7μm，Agilent，USA)，在50℃下进行色谱分离。二元洗脱系统包含0.2％乙酸水溶液，梯度如下：0min:5％B,流速0.3mL/min；7min:100％B,流速0.3mL/min；9min:100％B,流速0.3mL/min。进样体积为2μl。
②Agilent 1290LC连接电喷雾离子化(ESI)的Agilent 6520Q-TOF质谱仪(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)，采集模式为正离子模式。质谱参数如下：毛细管电压为2700V，锥孔电压为100V，电喷雾气温度为340℃，数据采集范围在100-2000m/z。电喷雾气流量流量＝7.0L/min；离子源电压＝80V
西洋参和人参的总离子流图与图1-1，图1-2相似。
3.数据处理软件处理筛选多肽候选物
通过Progenesis QI软件提取步骤(2)由超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪所采集到的数据，对数据进行预处理(包括对特征的m/z和Retention time进行对齐和相同的特征进行合并等),生成峰强度列表。Progenesis QI参数如下：Filiter:0.5；Absoluteion intensity:1000。检测到的大量组分是多电荷离子(z>4)，这被认为是候选多肽。西洋参和人参肽容易形成不同电荷的离子，包括4正电荷，5正电荷，6正电荷和7正电荷的离子，这些不同电荷的中性质量值在计算后属于同一种化合物。
4.提取候选多肽的色谱峰,确定西洋参和人参的共有多肽以及多肽标志物；
将此步骤得到的有多重电荷形式的离子，以5电荷的离子为例，分别提取色谱图进行分析，判断它们在西洋参和人参中的存在情况，来分析共有多肽以及多肽标志物。
对两个属种的比较分析表明，人参中肽的数量与西洋参中的相似，得到的共有肽和各自的多肽标志物与表1-1，表1-2和表1-3相似。得到标志物B1和D1的提取色谱法结果也分布与图2-1和2-2相似。绘制的西洋参和人参的肽图相同。
5.通过LTQ-Orbitrap对所述共有多肽及多肽标志物进行二级碎裂
通过LTQ-Orbitrap Elite(Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany)对上述多肽靶向二级碎裂来鉴定。
①液相色谱为二元洗脱系统，流动相A为浓度为0.2％的甲酸水，B为乙腈。梯度如下：0min:5％B,流速0.3mL/min；7min:100％B,流速0.3mL/min；9min:100％B,流速0.3mL/min；11min:5％B,流速0.3mL/min；在色谱柱温为50℃下进行色谱分离；进样体积为2μl。
②质谱分辨率(半高全宽)＝6,000。电喷雾离子源正离子模式进行检测，选择在上述多肽用于靶向碎裂，包括碰撞诱导解离(CID)和更高能量的碰撞解离(HCD)碎裂。归一化碰撞能量设定为28％和30％。
6.通过数据库检索对所述共有多肽及多肽标志物进行表征
通过蛋白组学质谱数据分析软件Peaks Studio 7(BSI,Canada)，进行过滤、解卷积、二级质谱图简化及从头测序以确定这些肽的一级结构。数据细化允许校准母离子的m/z值和电荷状态，从而提供更准确的单同位素m/z值。严格控制误差容限(前体：10.0ppm；在MS/MS谱中观察到的主要碎片也应满足误差小于0.5Da的结果)进行峰质心，电荷解卷积和去极化。数据过滤阈值为>0.3，没有指定用于切割的酶。选择可变翻译后修饰(PTM)，包括甲基化(Δmass，+14.02)，脱氧(Δmass，-15.99)，脱水(Δmass，-18.01)，氧化(Δmass，+15.99)；固定的PTM是二硫键形成(Δmass，-1.0078)。数据检索来自于从SwissProt数据库www.uniprot.org网站下载的特定人参蛋白质数据库。利用多肽二级谱图上的碎片离子质量差，denovo测序从波谱的高质量端开始，找到可以互为印证的a,b离子，为了确保正确还要找到-NH3和H2O的丢失，接着用尽可能小的氨基酸跨度找到下一个b离子，一直到波谱低端的b1离子，实现从C端到N端的测序；另一个方向上的测序则是通过从高质量端开始跟踪y离子实现的。对搜索和测序得到的肽序列，结合其可信度(-10logP)、肽链断裂情况、子离子的分配情况及误差的范围逐个进行人工确认，搜索鉴定的假阳性率FDR<1％。
我们分别确认了E1，F1，G1，H1和I1的身份为M2+CH3，M1，M1+CH3，M1+O和M1+CH3+O。A1和B1被鉴定为M2-O和M1-O，质量分别为4716.4272和4975.4770kDa。当与质量分别为4968.3710和4984.3639kDa的M1相比时，离子C1和D1之间的分子量差异分别为-23.0968和-7.1039。与实施例1结果相同。
7.使用多肽标志物对西洋参和人参进行鉴定
对市面上的74批西洋参和72批的人参样品如步骤(1)制备，用来用于随后的如步骤(2)UHPLC-Q-TOF-MS分析；质谱采集为正离子模式；正离子模式是为了通过肽标志物鉴定西洋参和人参。在所有药材的总离子流图中，分别提取西洋参的标志物A1和B1以及人参的标志物C1和D1的提取色谱图来鉴别西洋参和人参。
8.通过西洋参标志物皂苷F11和人参标志物皂苷Rf验证多肽标志物
质谱采集为负离子模式。负离子模式是为了通过文献中已有的西洋参的皂苷标志物F11和人参的皂苷标志物Rf来验证多肽标志物。制备人参皂苷F11和Rf标准品，通过步骤(2)UHPLC-Q-TOF-MS分析，使人参皂甙Rf和F11在基线分离与图相似。从所有的步骤(7)的药材样本中，提取人参皂苷F11和Rf的离子的色谱图来进行验证标志物鉴定的人参物种结果与图5-1和图5-2相同。
鉴定和验证结果与表2-1和表2-2相同。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.一种使用多肽标志物区分西洋参和人参的方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：
a）制备西洋参和人参化合物的提取液；
b）通过液质联用对所述西洋参和所述人参的提取液进行非靶向分析；
c）通过数据处理软件对步骤b）采集得到的数据进行预处理筛选多肽候选物；
d）依次提取步骤c）得到的候选多肽的色谱峰的分析方法，以确定西洋参和人参的共有多肽及各自的多肽标志物；
e）通过液质联用对所述共有多肽及多肽标志物进行二级碎裂；
f）通过数据库检索对所述共有多肽及多肽标志物进行表征；
g）对待测样本进行所述a）和b）的操作，获得待测样本的质谱数据，通过步骤d）得到的多肽标志物判断待测样本属于西洋参或人参并进行验证；
所述步骤c）通过Progenesis QI软件对质谱仪采集到的数据进行预处理，筛选出候选肽的电荷数是4<z <7的多电荷离子；
所述步骤b）采用二元梯度洗脱系统，其中，流动相A为浓度为0.2%~0.5%的甲酸水，B为乙腈；
洗脱梯度如下：0 min: 2~5% B, 流速0.3~0.4 mL/min; 5~7 min: 100% B, 流速0.3~0.4 mL/min;在色谱柱温为40℃-60℃下进行色谱分离；进样体积为1-5μl；
所述步骤e）为筛选出共有多肽以及各自的多肽标志物进行靶向二级碎裂表征，所述液质联用包括二元洗脱系统，其中流动相A为浓度为0.2%~0.5%的甲酸水，B为乙腈；
洗脱梯度如下：0 min: 2~5% B, 流速0.3~0.4 mL/min; 5~7 min: 100% B, 流速0.3~0.4 mL/min;在色谱柱温为40℃-60℃下进行色谱分离；进样体积为1-5μl。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a）包括：
1）将西洋参或人参样本中加入体积比为0%-80%乙醇水溶液为提取溶剂，样本粉末与溶剂的质量体积比为0.1g/ml-0.4g/ml；
2）将步骤1）中的混合物超声分离，收集溶剂；
3）将步骤2）所得溶液在氮气氛下干燥，然后将所得干燥物用水重新溶解，离心收集上清。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理包括对特征峰的m/z和滞留时间进行对齐和相同的特征进行合并中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述步骤d）中，通过所述多电荷离子判断西洋参和人参的共有多肽以及各自的多肽标志物，将所述共有多肽以及各自的多肽标志物的离子从总离子流图上提取出来，以绘制肽谱。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，选择碰撞诱导解离和碰撞解离碎裂，归一化碰撞能量设定为20％-50％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤f）中通过蛋白组学质谱数据分析软件，利用多肽二级谱图上的碎片离子质量差，进行denovo从头测序和搜索数据库。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述蛋白组学质谱数据分析软件进行过滤、解卷积、二级质谱图简化、从头测序和搜索数据库以确定多肽的一级结构。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤g）中，分别提取待测样本的步骤d）得到的多肽标志物的色谱图，以判断待测样本属于西洋参或人参。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤b）和e），质谱采集为正离子模式。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤g）中所述方法还包括使用已知的西洋参的皂苷标志物F11和人参的皂苷标志物Rf来验证所述多肽标志物，质谱采集为负离子模式。
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