CN103969361A - 一种正品半夏的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种半夏的检测方法，它是以HPLC指纹图谱进行测定的，包括如下操作步骤：（1）取待见样品，粉碎后，以水或甲醇为溶剂提取，制备供试品溶液；（2）将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，测定即可，色谱条件如下：检测波长：254～265nm；色谱柱：十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相：以甲醇-水系统洗脱。本发明正品半夏的检测方法精密度高、重现性好、准确，操作方便，成本低廉，市场应用前景良好。

Description

一种正品半夏的检测方法

技术领域

本发明涉及正品半夏的检测方法，属于中药领域。

背景技术

半夏来源于天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）breit.的干燥块茎。我国半夏资源分布广泛，国内除吉林、黑龙江、内蒙古、新疆、青海、西藏以外，其余省区均有分布。

近几年半夏的市场需求量持续增加，而野生资源逐年减少，加之半夏人工栽培发展缓慢，使得半夏资源蕴藏量和产量都在大幅下降。另外，近几年半夏药材的行情较好，在其流通环节出现了很多伪品、混淆品，给半夏药材的质量、用药的安全性及有效性带来了很大的冲击。通过对中药材市场的调研发现，半夏的伪品主要为水半夏，主要的混淆品有虎掌南星、天南星、山珠半夏等，近年来发现也有以天南星小块茎充当半夏使用的情况，现行中国药典的方法又很难区别半夏及其混伪品。目前报道的半夏检测方法，其中HPLC法流动相选择及洗脱的梯度条件各不相同；需寻找一种更为简便、准确、可靠的方法鉴定正伪半夏方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种正品半夏的检测方法。

本发明半夏的检测方法，它是以HPLC指纹图谱进行测定的，包括如下操作步骤：

（1）取待见样品，粉碎后，以水或甲醇为溶剂提取，制备供试品溶液；

（2）将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，测定即可，色谱条件如下：检测波长：254～265nm；

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填充剂；

流动相：以甲醇-水系统洗脱。

其中，步骤（1）中，所述溶剂为水。

其中，步骤（1）中，所述提取的方法为超声提取，提取时间45min。

其中，步骤（2）中，检测波长为256nm。

其中，步骤（2）中，检测柱温为30℃，流速为1ml/min。

步骤（2）中，所述洗脱为梯度洗脱，梯度条件如下：

本发明还提供了一种正品半夏的检测方法，它包括如下步骤：

a、取待检样品；采用权利要求1～7任意一项所述HPLC方法检测；

b、分析图谱；

c、若图谱的特征峰共有11个，其保留时间分别为：1号峰：5.802min；2号峰：6.782min；3号峰：7.155min；4号峰：8.535min；5号峰：12.516min；6号峰：13.876min；7号峰：15.903min；8号峰：19.129min；9号峰：20.227min；10号峰：30.182min；11号峰：38.628min；即可判定为正品半夏。

其中，正品半夏的HPLC图谱如图24所示。

本发明方法可以准确检测待检样品是否正品半夏，准确度高，且检测方法简单、快速，可以替代传统检测方法，具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1制样方法的检测结果；

图2制样方法二检测结果；

图3制样方法三检测结果；

图4制样方法四检测结果；

图5制样方法五检测结果；

图6样品220nm色谱图；

图7样品225nm色谱图；

图8样品254nm色谱图；

图9样品256nm色谱图；

图10样品265nm色谱图；

图11样品275nm色谱图；

图12乙腈-水（35:65）色谱图；

图13甲醇-0.01%醋酸溶液（10:90）色谱图；

图14梯度洗脱（甲醇-水）色谱图；

图15梯度洗脱条件1色谱图；

图16梯度洗脱条件2色谱图；

图17梯度洗脱条件3色谱图；

图18梯度洗脱条件4色谱图；

图19梯度洗脱条件5色谱图；

图20精密度试验色谱图，（S1～S5为五次进样色谱图；R为共有模式图）；

图21重现性试验色谱图（S1～S5为五份供试品色谱图；R为共有模式图）

图22稳定性试验色谱图（S1：0h；S2：4h；S3：8h；S4：12h；S5：24h；R：共有模式图）

图23半夏HPLC指纹图谱

图24半夏HPLC指纹图谱共有模式

图25水半夏HPLC指纹图谱

图26水半夏HPLC指纹图谱共有模式

图27虎掌南星HPLC指纹图谱

图28虎掌南星HPLC指纹图谱共有模式图

图29白附子HPLC指纹图谱

图30白附子HPLC指纹图谱共有模式图

图31半夏腺苷、鸟苷图谱（1:腺苷2:鸟苷）

具体实施方式

实验材料和试剂

1.仪器、试剂与试药

安捷伦1200液相色谱系统：包括1200泵，DAD检测器，waterse2695液相色谱仪，waters e2998检测器，Millipore Milli-Q超纯水系统，岛津十万分之一电子天平。Brasson超声波清洗仪；KQ-100超声波清洗仪。

甲醇、乙醇等试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司），HPLC用甲醇、乙腈均为进口色谱纯试剂。

2.实验材料

半夏半夏样品经成都中医药大学李敏教授鉴定，均为天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit的干燥块茎，样品收集情况见表1，编号B1～B18。

水半夏水半夏样品经成都中医药大学李敏教授鉴定，均为天南星科植物鞭檐犁头尖Typhonium flagelliforme（Lodd.）Blume.的干燥块茎，样品收集情况见表1，编号S1～S12。

虎掌南星虎掌南星样品经成都中医药大学李敏教授鉴定，均为天南星科植物虎掌Pinelliae Pedatisecta Schott的干燥块茎，样品收集情况见1，编号N1～N16。

白附子白附子样品经成都中医药大学李敏教授鉴定，均为天南星科植物独角莲Typhonium giganteum Engl.的干燥块茎，样品收集情况见1，编号F1～F5。

表1 半夏、水半夏、白附子及虎掌南星药材收集情况

实施例1 检测方法参数优选

一、样品制备方法的筛选

1、实验方法

制样方法一：取半夏药材2g(过40目筛)，加石油醚20ml，超声提取30min，弃去石油醚，加95%的乙醇20ml，超声提取3次，提取液合并蒸干，定容至2ml。

制样方法二：取半夏药材2g(过40目筛)，加水20ml超声提取30min，取上清液，蒸干后用水定容至2ml。

制样方法三：取半夏药材2g(过40目筛)，加甲醇20ml超声提取30min，取上清液，蒸干后用甲醇定容至2ml。

制样方法四：取半夏药材2g(过40目筛)，加70%乙醇20ml超声提取30min，取上清液，蒸干后用甲醇定容至2ml。

制样方法五：取半夏药材2g(过40目筛)，加乙醚20ml超声提取30min，过滤，滤液蒸干后用甲醇定容至2ml。

2、实验结果

如图1～5所示，通过对以上五种制样方法的考察发现，制样方法二和三出峰较多，其分离度较好。另外，制样方法二为水制样，并且其基线较平，故选用制样方法二。

在此基础上，又对该方法的提取时间、提取方式（超声和回流）进行了优化，最后确定的制样方法为：精密称取半夏粉末约2g（过40目筛），加纯净水20ml，超声提取45min，离心，取上清液蒸干，然后用纯净水溶解，定容至10ml。用0.22μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

二、测定波长的筛选

1、检测方法

半夏成分复杂，为了能充分反应其质量信息的完整性，本试验对检测波长进行了筛选，对同一样品在不同波长下进行了样品的色谱图比较。

2、检测结果

(结果见图6～11)，由色谱图可见，在检测波长256nm条件下色谱峰数量多、分离度好、峰吸光度较大并且峰形好，故选择256nm作为测定波长。

三、流动相的筛选

1、检测方法

本试验对流动相进行了筛选，分别采用乙腈-水（35:65）、甲醇-0.01%醋酸溶液（10:90）和梯度洗脱（甲醇-水）三种方式，流速为1.0mL/min，检测波长为256nm，进样量20μl。

2、检测结果

色谱图见图12～14，梯度洗脱分离效果好且出峰较多，故选用梯度洗脱，并在此条件的基础上对洗脱梯度进行了调整和优化。

四、洗脱条件的筛选

1、检测方法

梯度洗脱条件1：流动相A相为甲醇，B相为水溶液，梯度洗脱条件见表2。流速：1.0mL/min，检测波长：256nm，进样量10μl，HPLC色谱图见图15。

表2 梯度洗脱条件1

梯度洗脱条件2：流动相A相为甲醇，B相为水，梯度洗脱条件见表3。流速：1.0mL/min，检测波长：256nm，进样量10μl，HPLC色谱图见图16。

表3 梯度条件2

梯度洗脱条件3：流动相A相为甲醇，B相为水，梯度洗脱条件见表4，流速：1.0mL/min，检测波长：256nm，进样量10μl，结果见色谱图17。

表4 梯度洗脱条件3

梯度洗脱条件4：流动相A相为甲醇，B相为水，梯度洗脱条件见表5，流速：1.0mL/min，检测波长：256nm，进样量10μl，结果见色谱图18。

表5 梯度洗脱条件4

梯度洗脱条件5：流动相A相为甲醇，B相为水，梯度洗脱条件见表6，流速：1.0mL/min，检测波长：256nm，进样量10μl，结果见色谱图19。

表6 梯度洗脱条件5

小结：综合上述试验结果，梯度洗脱条件5的色谱峰分离效果好、基线较平、保留时间适中。因此色谱条件确定为：以甲醇-水为流动相，按表6中的梯度变化进行洗脱，检测波长为256nm，柱温为30℃，流速为1ml/min，记录时间为40min。

五、色谱条件

采用月旭AQ-C18（200×4.6mm，5μm）色谱柱；以甲醇为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为256nm；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；记录时间：40min。

实施例2 本发明方法的方法学考察

采用实施例2优选的方法，进行方法学考察：

1、精密度试验

取同一半夏样品粉末，粉末过四号筛，按上述方法制样，进样5次，每次10μl，按照上述梯度条件测定，考察各色谱峰保留时间的一致性，各主要色谱峰保留时间的RSD<2%；利用相似度评价软件对5个图谱进行了相似度分析，测得的色谱指纹图谱与其所得的共有模式图的相似度分别为：0.978、0.989、0.983、0.992、0.985，均大于0.97，表明仪器稳定，精密度良好。见图20。

2、重现性试验

取同一半夏药材粉末5份，粉末过四号筛，按上述制样方法及色谱条件进行测定，记录色谱图，考察各色谱峰保留时间的一致性，各主要色谱峰保留时间的RSD<2%。利用相似度评价软件对色谱指纹图谱进行了相似度分析，测得的色谱指纹图谱与其所得的共有模式图的相似度分别为：0.993、0.996、0.993、0.998、0.994，相似度均大于0.99，表明本实验方法重复性好。见图21。

3、稳定性试验

取同一半夏供试品溶液，分别于0、4、8、12、24h测定一次，记录特征图谱，考察各色谱峰保留时间的一致性，各主要色谱峰保留时间的RSD<2%；利用相似度评价软件对各色谱图进行了相似度分析，测得的色谱指纹图谱与其所得的共有模式图的相似度分别为：0.993、0.987、0.992、0.996、0.987，相似度均大于0.98，表明供试品溶液在24h内稳定。见色谱图22。

实施例3 本发明方法检测正品半夏

1、实验方法

采用实施例2优选的方法制备供试品溶液，精密吸取10μl，分别注入液相色谱仪，按筛选后的色谱条件测定，记录45min的HPLC图，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）”进行数据分析处理，将半夏、水半夏、白附子、虎掌南星样品的图谱分别匹配并生成对照图谱，再将样品测得的色谱峰与参照图谱进行自动匹配，生成半夏、水半夏、白附子、虎掌南星指纹图谱共有模式。

以标准物质腺苷与鸟苷进行标定，结果显示，在半夏、水半夏、虎掌南星、白附子的HPLC指纹图谱共有模式图R中，在与腺苷、鸟苷相应的保留时间上具有相同的色谱峰（见图31）。

2、实验结果

半夏及其伪品、近缘品种的指纹图谱、共有模式图见图23～30。

1、半夏与其伪品水半夏的HPLC指纹图谱鉴别

通过对半夏与水半夏的共有模式图对比可知，半夏所共有的特征峰为11个，水半夏为10个；在保留时间0～10min之间，半夏出现特征峰4个，水半夏3个，在相对保留时间10～25min之间，半夏出现特征峰5个，水半夏6个，在相对保留时间25～40min之间，半夏出现特征峰2个，而水半夏仅有一个，因此可以根据出峰的时间，对半夏及水半夏进行有效的鉴别。

2、半夏与其近缘品种虎掌南星的HPLC指纹图谱鉴别

通过对半夏与虎掌南星的共有模式图对比可知，半夏所共有的特征峰为11个，虎掌南星为8个；在保留时间0～10min之间，半夏出现特征峰4个，虎掌南星3个，在相对保留时间10～25min之间，半夏出现特征峰5个，虎掌南星4个，在相对保留时间25～40min之间，半夏出现特征峰2个，而虎掌南星仅有1个；尤其是虎掌南星的8号峰，为虎掌南星的特征峰，根据出峰的时间及虎掌南星的特征峰进行有效的鉴别。

3、半夏与其近缘品种白附子的HPLC指纹图谱鉴别

通过对半夏与白附子的共有模式图对比可知，半夏所共有的特征峰为11个，白附子为9个；在保留时间0～10min之间，半夏出现特征峰4个，白附子3个，在相对保留时间10～25min之间，半夏出现特征峰5个，白附子4个，在相对保留时间25～40min之间，半夏出现特征峰2个，而白附子出现2个；白附子的8、9号峰为其所特有的特征峰。因此，可以通过出峰时间及白附子的特征峰进行有效的鉴别。

综上，本发明检测方法精密度高、重现性好，可以准确鉴定正品半夏，操作简便，成本低廉，具有良好的应用前景和经济效益。

Claims (9)

1.一种半夏的检测方法，其特征在于：它是以HPLC进行测定，包括如下操作步骤：

（1）取待检半夏样品，粉碎后，以水或甲醇为溶剂提取，制备供试品溶液；

（2）将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，测定即可，色谱条件如下：检测波长：254～265nm；

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填充剂；

流动相：以甲醇-水系统洗脱。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，所述溶剂为水。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，所述溶剂的用量为样品的10倍（v/w）。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，所述提取的方法为超声提取，提取时间45min。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，检测波长为256nm。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，检测柱温为30℃，流速为1ml/min。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，所述洗脱为梯度洗脱，梯度条件如下：

8.一种正品半夏的检测方法，其特征在于：它包括如下步骤：

a、取待检样品；采用权利要求1～7任意一项所述HPLC方法检测；

b、分析图谱；

c、若图谱的特征峰共有11个，其保留时间分别为：1号峰：5.802min；2号峰：6.782min；3号峰：7.155min；4号峰：8.535min；5号峰：12.516min；6号峰：13.876min；7号峰：15.903min；8号峰：19.129min；9号峰：20.227min；10号峰：30.182min；11号峰：38.628min；即可判定为正品半夏。

9.根据权利要求8所述的正品半夏的检测方法，其特征在于：正品半夏的HPLC图谱如图24所示。