CN106568868A - 金花茶指纹图谱的建立方法和在原料、产品质量控制中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种金花茶指纹图谱的建立方法，和在原料、产品质量控制中的应用，建立方法包括样品溶液制备，共有成分的确立，对照品溶液制备，色谱条件的选择，然后得到金花茶指纹图谱，采用软件进行相似度分析，定性的对金花茶原料及产品做出鉴别、质量评价和工艺指导。在定性分析的基础上，还选择两个关键组分建立图谱，对金花茶及其产品进行定量分析，并进行了方法学研究，该方法稳定可靠，客观准确的、定量的反映了金花茶及其产品质量，可以推广应用于质量控制及工艺指导中，同时对相关行业标准的修订也具有积极的意义。
Description
技术领域
本发明属于植物天然成分分离、分析技术领域，涉及金花茶指纹图谱的建立方法，及由该方法获得的指纹图谱在原料、产品质量控制中的应用。
背景技术
金花茶组(camelliasectchrysantha)植物属山茶科山茶属常绿灌木或小乔木，是世界上著名的观赏植物。金花茶是金花茶组植物的统称，95％野生金花茶植物分布于广西防城港等16个市(县)，是广西特色植物资源之一。在广西民间，金花茶有着漫长的饮用历史，也是广西民间的传统药用植物。实验研究表明，金花茶植物富含黄酮、皂苷、茶多酚及茶多糖等多种有益人体健康的活性成分，具有抑制移植性恶性肿瘤生长，降血压、降血脂、降低胆固醇，防止动脉粥样硬化、延衰老，提高肌体免疫功能等作用。
因此，金花茶植物具有很高的开发利用价值，产品具有广阔的市场前景。近十年，广西金花茶的种植、加工发展迅速，据统计，截止到2012，广西年人工种植金花茶面积达到3万亩，育苗300万株，以金花茶为原料开发、生产了金花茶叶茶、金花茶浓缩液、金花茶口服液、金花茶饮料等系列产品，产值达到2亿元。
随着金花茶加工产业的迅速发展，对金花茶产品的质量监管日趋迫切，目前，金花茶类产品生产存在几个主要问题：
1.金花茶原料来源对产品质量影响较大。目前，广西加工利用的金花茶植物有普通金花茶、显脉金花茶等多个品种，不同金花茶品种中黄酮、皂苷、茶多酚类成分分布、含量差异较大，以不同金花茶原料生产的同一类型金花茶产品质量差异较大；即如何有效的区分上述不同品种的金花茶原料、如何保证某一金花茶产品是由同种金花茶原料制成的，这是目前较为棘手的难题。
2. 2016年5月1号，由广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心起草的、由广西壮族自治区卫生和计划生育委员会发布的《食品安全地方标准金花茶叶茶》正式发布，标准号为DBS45033-2016。
上述标准较为完整的规定了金花茶叶茶的术语和定义、产品分类、要求、食品添加剂、生产加工过程的卫生要求、检验方法、检验规则、标签、标志、包装、运输、贮存和保质期。
其中该标准对于金花茶叶茶的理化指标做出如下规定：
金花茶产品中黄酮、皂苷类等成分的含量是衡量产品质量的一个重要指标，标准中用于金花茶产品质量分析评价的几个黄酮、茶多酚等成分在诸多植物中也有分布，市场上金花茶产品有可能出现以次充好，甚至弄虚作假的现象。
所以，上述标准以黄酮或皂苷等某类总成分含量为指标不能真正反映金花茶产品的质量，缺乏能表征金花茶类产品内在质量特性的分析、检测及监管方法。
假如用上述标准以黄酮或皂苷等某类总成分含量为指标来评价金花茶原料，也不能真正反映金花茶本身的质量。
因此，有必要对金花茶特征性成分进行分析与评估，建立起相应的分析检查方法，从而更客观、科学的对金花茶及其相关产品做出评价。
指纹图谱技术是分析天然产物和产品的有效手段，是指经过光谱或色谱测定得到的组分群体的特征图谱或图像，可以经济、可靠、便捷的表征产品特性，反应产品的全貌，实现对内在质量的综合评价和整体物质的全面控制。
HPLC指纹图谱技术是以植物化学成分为基础，采用HPLC分析方法得到的能够标示其化学特征的色谱图，是一种综合的，可量化的鉴定手段，常用于中药材及其产品质量控制，评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。现已经广泛应用到食品、生命科学等各方面。
在茶叶品种鉴别和质量控制等方面，普洱青毛茶、苦丁茶、云南普洱茶、广东单枞茶等均有指纹图谱的相关研究。
通过目前相关文献的研究分析，金花茶的指纹图谱报道较少，且针对不同品种的指纹图谱比较研究较少。
发明内容
本发明的目的之一就是，寻找不同金花茶品种的特征性成分，并对其建立HPLC指纹图谱；目标之二在于寻找分离测试方法，使得特征性成分分离度良好、特征峰明显、结果可靠、方法简便。
为解决上述问题，本发明的具体方案如下：
金花茶指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、样品溶液的制备：金花茶新鲜叶子，洗净、烘干、粉碎，得到粉末，乙醇提取，过滤，留滤液备用；
步骤二、对照品溶液的制备：分别取(+)-儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、山奈酚、槲皮素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、菠菜甾醇-3-O-β-D葡萄糖苷标准品，甲醇溶解，定容，摇匀，备用；
(+)-儿茶素中的(+)表示为右旋体；
步骤三、对照指纹图谱的建立：分别取对照品溶液和由不同批次金花茶制备得到的样品溶液，注入高效液相色谱仪检测，得到色谱数据，色谱条件如下：
C18色谱柱，流动相为乙腈A-0.1％磷酸水溶液B，采用UV检测器，检测波长220nm；
洗脱梯度：0-2min，2％A；2-10min，2％-12％A；10-25min，12％-18％A；25-30min，18％-25％A；30-50min，25％-50％A；50-60min，50％-70％A；60-70min，70％-75％A；70-85min，75％A；
对经过色谱后的数据进行处理，建立金花茶的指纹图谱。
进一步的，所述步骤一中的乙醇提取是在超声条件下进行的，超声时间为40-50分钟；所述过滤工序包括：超声提取完后用布氏漏斗过滤，得到的滤液再用0.45μm微孔滤膜过滤。
进一步的，所述步骤一中的乙醇体积分数为70％，70％乙醇与金花茶粉末的体积质量比为5mL：1g。
进一步的，所述C18色谱柱为Agilent TC C18柱，长度为250mm，内径为4.6mm，填料的粒径为5μm。
进一步的，色谱条件为：流速为1.0mL/min，柱温25℃。
本发明还提供了上述建立方法得到的指纹图谱在金花茶原料、产品的质量控制中的应用。
进一步的，所述应用包括对金花茶原料的鉴定、评估，包括如下步骤：
(1)按步骤一和二所述的方法分析待测样品的图谱；
(2)将待测样品的图谱与金花茶标准指纹图谱对比，可鉴别出是否为金花茶及其质量状况。
进一步的，所述应用包括应用于以金花茶为原料的叶茶的质量控制和工艺指导。
面对如何对市面上各种金花茶及其产品，如何提供有效可靠的鉴别方法，以及如何对从事金花茶相关产品的生产企业在质量管控上提出行之有效的解决方案，本发明的主要思路如下：
首先对金花茶进行成分定性分析，摸清楚其含有什么类型的成分、不含有什么类型成分，为后续做准备工作。
其次，对金花茶的化学成分进行分离和鉴定，找出各种金花茶的共有成分，从这些共有成分中选择出能反映金花茶内在属性的，我们将其定义为特征性成分。
特征性成分的确定基于以下两方面考虑：(1)成分能表征金花茶原料的内在属性，能明确区分金花茶与其他植物原料；(2)成分的选择能反映现有金花茶产品的生产方法及工艺特点，是现有金花茶产品生产中可从金花茶原料转移至金花茶产品的功能性成分。
然后，将特征性成分的标准样品与金花茶进行色谱分析，处理数据得到金花茶指纹图谱。
将得到的指纹图谱应用于金花茶鉴定或金花茶相关产品的质量控制、工艺指导。
上述技术方案，利用金花茶指纹图谱，对金花茶原料以及叶茶进行了定性分析，在一定程度上起到了质量控制、工艺指导的作用，比如，市面上金花茶原料是否确实为金花茶、或其属于哪一类金花茶，市面上的金花茶产品，如叶茶，是否含有金花茶，含有何种金花茶，这些都可以通过上述定性方法得到。
但是如果要进行更深入的质量分析，上述定性方法就无法满足，比如，生产企业想得到并管控金花茶原料的纯度，生产企业想得知其产品的质量状况，生产企业想根据其产品质量反推其工艺参数是否合理等，这个时候就必须采取定量手段。
而采用何种或何些成分来表征原料及产品的质量，又通过什么测试条件来分析原料及产品，这种或这些成分是否能和其他成分有效分离，都是需要探索的。
本发明为了解决该问题，再提出如下技术方案：
在上述利用指纹图谱定性分析的基础上，所述质量控制还包括原料及产品的定量分析，具体步骤如下：
步骤A、样品溶液的制备：取烘干的金花茶原料或产品粉末，加体积分数70％乙醇索氏提取，提取液减压浓缩，甲醇定容，用0.45μm微孔滤膜过滤，作待测样品溶液；
步骤B、对照品溶液的制备：称取槲皮素及槲皮素-7-O-葡萄糖苷标准品，用无水甲醇溶解，定容，使得槲皮素对照品溶液浓度为0.3680mg/mL，槲皮素-7-O-葡萄糖苷对照品溶液浓度为0.3240mg/mL
步骤C、色谱条件：AgilentTC-C18色谱柱，检测波长270nm；
槲皮素分析流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液，体积比为52：48，等度洗脱，流速1.0mL/min；
槲皮素-7-O-葡萄糖苷分析流动相为乙腈A-0.1％磷酸水溶液B；
梯度洗脱：0-20min，15％A-30％A；20-25min，30％A-15％A；
步骤D、测试金花茶原料以及产品中槲皮素及槲皮素-7-O-葡萄糖苷的含量，用此数据来鉴定、控制金花茶及产品质量，或对金花茶产品进行工艺指导。
进一步的，取烘干的金花茶原料或产品粉末10g，加300mL 70％乙醇索氏提取8h，提取液减压浓缩，置于250mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，作待测样品溶液；色谱条件为：色谱柱的长度为250mm，内径为4.6mm，填料的粒径为5μm，柱温25℃，流速为1.0mL/min。
本发明有益效果如下：
1、确定了金花茶的共有化学成分、特征性成分；
2、建立了金花茶的指纹图谱；
3、得到了建立指纹图谱中的色谱条件，使得特征性成分分离度良好、特征峰明显、结果可靠、方法简便；
4、特征图谱的建立，不同金花茶品种原料特征明显，为金花茶原料鉴别、相关产品的质量控制提供了有效的解决方案；
5、在指纹图谱定性分析的基础上，采用两种关键组分，对金花茶原料及产品进行了定量分析，方法稳定可靠，客观准确的、定量的反映了金花茶及其产品质量，可以推广应用于质量控制及工艺指导中，同时对相关行业标准的修订也具有积极的意义。
附图说明
图1为实施例3中，普通金花茶样品在不同检测波长下的HPLC图。
图2为实施例3中，普通金花茶样品在不同流动相下的HPLC图。
图3为实施例3中，普通金花茶样品在不同色谱柱的HPLC图。
图4为实施例3中，四种金花茶样品在该洗脱梯度下的HPLC图。
图5为实施例3中，对照品溶液在最优色谱条件下的HPLC图。
图6为实施例3中，东兴金花茶、普通金花茶、显脉金花茶、长柱金花茶原料在最优色谱条件下的HPLC图。
图7为实施例3中，东兴金花茶经中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件2004版进行数据处理的图谱结果。
图8为实施例3中，普通金花茶经中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件2004版进行数据处理的图谱结果。
图9为实施例3中，显脉金花茶经中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件2004版进行数据处理的图谱结果。
图10为实施例3中，长柱金花茶经中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件2004版进行数据处理的图谱结果。
图11为实施例4中，两种产品与四种金花茶原料的HPLC指纹图谱对比。
图12为实施例5中，槲皮素对照品图谱。
图13为实施例5中，槲皮素-7-O-葡萄糖苷对照品图谱
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种修改或改动，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
主要原料说明
甲醇、乙腈为色谱纯，水为去离子水。
本发明选择资源最丰富、品种最广、最多的显脉金花茶、普通金花茶、东兴金花茶、长柱金花茶为实验对象，上述品种均采自广西防城港，均经过广西中医学院专家鉴定。
本发明用到的标准品如下表：
(+)-儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、山奈酚、槲皮素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、菠菜甾醇-3-O-β-D葡萄糖苷的英文名依次为：catechin、epicatechin、epicatechingallate、kaempferol、quercetin、quercetin-7-O-beta-D-glucopyranoside、alpha-spinasterol-3-O-beta-D-glucoside。
实施例1 四种金花茶大类成分定性分析
显脉金花茶、普通金花茶、东兴金花茶、长柱金花茶新鲜叶子，洗净，60℃烘干，粉碎，过40目筛，避光保存，备用。金花茶以1:15固液比用95％乙醇回流提取3次，合并滤液，减压挥去乙醇，得金花茶提取物浸膏。
“+”表示可能含有该成分，“－”表示可能不含该成分。
由上表结果可知，四种金花茶提取物含有黄酮类、酚类或鞣质、三萜类、甾体类，不含生物碱，蒽醌及香豆素类化合物。
实施例2 金花茶化学成分分离和鉴别
四种金花茶原料及处理方式与实施例1相同。
取金花茶乙醇提取物浸膏，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水饱和正丁醇萃取。氯仿及乙酸乙酯部位合并，用5％NaOH溶液萃取，过滤，滤液中和后脱盐、挥去溶剂后备用。碱液萃取部位、正丁醇萃取部位依次采用大孔树脂吸附、硅胶柱层析及制备色谱等分离方法和技术对上述部位的化学成分进行分离和纯化，利用UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、MS等波谱方法对分离纯化的到的单体化合物进行结构鉴定。
普通金花茶中分离后经鉴定分别含有如下单体化合物：catechin、epicatechin、epicatechin gallate、quercetin、quercetin-7-O-beta-D-glucopyranoside、kaempferol、alpha-spinasterol-3-O-beta-D-glucoside、kaempferol-3-O-rutinoside、3,4-O,O-methylideneellagic acid、ellagic acid-4-O-beta-D-glucopyranoside、oleanicacid、3-beta-acetoxy-20-lupanol、3beta,6alpha,13beta-trihydroxyoean-7-one。
东兴金花茶中分离后经鉴定分别含有如下单体化合物：catechin、epicatechin、epicatechin gallate、quercetin、quercetin-7-O-beta-D-glucopyranoside、kaempferol、alpha-spinasterol-3-O-beta-D-glucoside、apigenin、kaempferol-3-O-rutinoside、beta-sitosterol、oleanic acid。
显脉金花茶中分离后经鉴定分别含有如下单体化合物：catechin、epicatechin、epicatechin gallate、quercetin、quercetin-7-O-beta-D-glucopyranoside、kaempferol、alpha-spinasterol-3-O-beta-D-glucoside、alpha-spinasterol、beta-amyrin、beta-sitosterol、oleanic acid。
长柱金花茶中分离后经鉴定分别含有如下单体化合物：catechin、epicatechin、epicatechin gallate、quercetin、quercetin-7-O-beta-D-glucopyranoside、kaempferol、alpha-spinasterol-3-O-beta-D-glucoside、6-hydroxykaempferol、3,5,6,7,4'-pentahydroxy dihydroflavone、astilbin、(-)-epiafzelechin、stigmasterol、stigmasterol-7-en-3-ol、quercetin-3-O-beta-D-glucopyranoside、quercetin-3-O-alpha-L-rhamnopyranoside。
特征性成分的确定基于以下两方面考虑：(1)成分能表征金花茶原料的内在属性，能明确区分金花茶与其他植物原料；(2)成分的选择能反映现有金花茶产品的生产方法及工艺特点，是现有金花茶产品生产中可从金花茶原料转移至金花茶产品的功能性成分。
本实施例中，依据显脉金花茶、普通金花茶、东兴金花茶、长柱金花茶化学成分分离、鉴定结果，在四种金花茶叶中，均含有(+)-儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、山奈酚、槲皮素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷及菠菜甾醇-3-O-β-D葡萄糖苷成分，考虑到普通茶叶及其他茶饮植物的化学成分种类及分布特点，上述化学成分可以作为金花茶的特征性成分。
实施例3 金花茶指纹图谱建立及应用于金花茶原料的分析、鉴别
1、样品溶液的制备
分别称取东兴金花茶、显脉金花茶、普通金花茶、长柱金花茶粉末各4g，置于100mL具塞锥形瓶中，加入20mL 70％乙醇，超声辅助提取40min，静置12h，离心，取滤液用布氏漏斗过滤，得到的滤液再用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液备用。
2、色谱条件的确立
C18色谱柱(Φ4.6mm×250mm，5μm)，流动相流速为1.0mL/min，柱温25℃。考察了不同检测波长，不同流动相体系、不同公司的C18色谱柱、流动相组成对样品溶液组分分离效果的影响，选取最优色谱分离条件作为金花茶样品溶液组分的HPLC分析条件
2.1波长
取普通金花茶样品溶液，Grace VisionHT C18色谱柱，流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液体系，梯度洗脱0-30min，5％-40％(A)，进样量5μL，选用220nm、254nm、270nm、360nm进行HPLC分析，实验结果见图1。在254nm和360nm检测波长下，样品中部分组分未出峰或响应值过低，270nm检测波长下样品中槲皮素-7-O-葡萄糖苷的响应值过高，不便于后续操作，故检测波长取220nm。
2.2流动相
Grace VisionHT C18色谱柱，进样量5μL，检测波长220nm，在纯甲醇作为流动相的分离效果基础上，选用甲醇-0.1％磷酸水溶液、乙腈-0.1％磷酸水溶液两种流动相体系对普通金花茶样品溶液进行了HPLC分析，实验结果见图2，图中，标号为1/2/3/4曲线依次代表为：纯甲醇；等度洗脱，甲醇：0.1％磷酸水溶液＝70:30；0-35min，甲醇95％-30％；乙腈-0.1％磷酸水溶液。
乙腈-0.1％磷酸水溶液体系可将槲皮素-7-O-葡萄糖苷与其他成分完全分离，与其相比，甲醇-0.1％磷酸水溶液体系得到的分离效果较差。故选择乙腈-0.1％磷酸水溶液体系作为金花茶样品组分分离的HPLC流动相。
2.3色谱柱
乙腈-0.1％磷酸水溶液体系为流动相，进样量5μL，检测波长220nm，实验对比了两个不同公司的C18色谱柱，分别为Grace VisionHT C18柱和Agilent TC C18柱，考察了对普通金花茶样品溶液的分离效果。结果，HPLC图谱结果见图3显示，Agilent TC C18柱的分离效果优于Grace VisionHT C18柱。
2.4洗脱梯度
Agilent TC C18柱，检测波长220nm，采用乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)的流动相体系，梯度：0-2min，2％-2％A；2-10min，2％-12％A；10-25min，12％-18％A；25-30min，18％-25％A；30-50min，25％-50％A；50-60min，50％-70％A；60-70min，70％-75％A；70-85min，75％-75％A。在该洗脱程序下，保留时间适中，各组分峰形较好，分离效果良好，见图4。图中，1/2/3/4依次代表东兴金花茶、普通金花茶、长柱金花茶、显脉金花茶。
综上所述，确定了HPLC分析金花茶样品组分最优的色谱条件为：Agilent TC C18色谱柱柱，检测波长220nm，柱温25℃，流动相：乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)，流速：1mL/min，梯度洗脱程序：0-2min，2％-2％A；2-10min，2％-12％A；10-25min，12％-18％A；25-30min，18％-25％A；30-50min，25％-50％A；50-60min，50％-70％A；60-70min，70％-75％A；70-85min，75％-75％A。
3、对照品溶液的制备
取(+)-儿茶素、齐墩果酸、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、山奈酚、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、菠菜甾醇-3-O-β-D葡萄糖苷、槲皮素标准品10mg置于25mL容量瓶中，甲醇溶解，定容，摇匀，作为对照品溶液备用。
4、HPLC对照结果
根据上述确定的HPLC分析金花茶样品组分最优的色谱条件，对照品溶液色谱图如图5所示，其中图上的标号依次为：1代表(+)-儿茶素，2代表表儿茶素，3代表表儿茶素没食子酸酯，4代表槲皮素-7-O-葡萄糖苷，5代表槲皮素，6代表山奈酚，7代表菠菜甾醇-3-O-β-D葡萄糖苷。
东兴金花茶、普通金花茶、显脉金花茶、长柱金花茶原料的HPLC指纹图谱，见图6，图上的标号依次为：1代表东兴金花茶，2代表普通金花茶，3代表显脉金花茶，4代表长柱金花茶。
东兴金花茶指纹图谱是由22个峰构成，普通金花茶由19个峰构成，显脉金花茶指纹图谱是由25个峰构成，长柱金花茶由22个峰构成。
5、金花茶原料HPLC指纹图谱相似度评价
将不同批次的金花茶提取样品的信号转为数据值后，采用国家药典会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件2004版(国家药典委员会)进行数据处理，将不同批次样品的色谱图进行校正匹配并比较，生成可全面反映多个色谱图特征的对照图谱，并以此为基准，计算每个色谱图与之比较的相似度。
图谱结果见图7至10，相似度计算对照结果表1和2。
表1
表2 四种金花茶的HPLC指纹图谱对比结果
| 东兴金花茶 | 普通金花茶 | 显脉金花茶 | 长柱金花茶 | |
| 东兴金花茶 | 1.000 | 0.286 | 0.671 | 0.551 |
| 普通金花茶 | 0.286 | 1.000 | 0.355 | 0.325 |
| 显脉金花茶 | 0.671 | 0.355 | 1.000 | 0.661 |
| 长柱金花茶 | 0.551 | 0.325 | 0.661 | 1.000 |
从结果看同种品种金花茶间相似度较高，均高于0.9；不同品种金花茶的对照指纹图谱的相似度较低，存在明显差异，特别是特征性成分含量差异明显，不同品种的金花茶原料特征明显，所建立的指纹图谱可作为原料是否为金花茶、金花茶不同品种的鉴别手段。
实施例4 指纹图谱应用于金花茶叶茶的产品质量定性分析，用于质量控制
原料：市售金花茶产品。
产品名：防城金花茶(配料：金花茶)，广西国茗金花茶科技有限公司。
产品名：金花茶袋泡茶(配料：金花茶，桑叶茶)，广西桂人堂金花茶产业集团股份有限公司。
按实施例3中分析方法，分别对上述两种市售产品的质量进行了分析评价。两种金花茶产品都能检出前述特征性成分，指纹图谱比对分析如表3和图11。
图11中，标号1-6分别代表东兴金花茶、普通金花茶、长柱金花茶、显脉金花茶、国茗产品、桂人堂产品。
表3 两种市售金花茶产品特征性成分分析结果
| 特征性成分 | 桂人堂 | 国茗 |
| (+)-儿茶素 | ++ | + |
| 表儿茶素 | ++ | ++ |
| 表儿茶素没食子酸酯 | ++ | + |
| 槲皮素7-O-葡萄糖苷 | ++ | ++ |
| 槲皮素 | + | + |
| 山奈酚 | ++ | ++ |
| 菠菜甾醇-3-O-β-D葡萄糖苷 | ++ | + |
“+”表示含有该成分，“++”表示含有更多该成分。
表4 两种产品与东兴金花茶相似度分析结果
| 东兴金花茶 | 国茗产品 | 桂人堂产品 | 对照指纹谱 | |
| 东兴金花茶 | 1 | 0.165 | 0.068 | 0.714 |
| 国茗产品 | 0.165 | 1 | 0.112 | 0.388 |
| 桂人堂产品 | 0.068 | 0.112 | 1 | 0.692 |
| 对照指纹谱 | 0.714 | 0.388 | 0.692 | 1 |
表5 两种产品与普通金花茶相似度分析结果
| 普通金花茶 | 国茗产品 | 桂人堂产品 | 对照指纹谱 | |
| 普通金花茶 | 1 | 0.237 | 0.176 | 0.646 |
| 国茗产品 | 0.237 | 1 | 0.117 | 0.433 |
| 桂人堂产品 | 0.176 | 0.117 | 1 | 0.75 |
| 对照指纹谱 | 0.646 | 0.433 | 0.75 | 1 |
表6 两种产品与显脉金花茶相似度分析结果
| 显脉金花茶 | 国茗产品 | 桂人堂产品 | 对照指纹谱 | |
| 显脉金花茶 | 1 | 0.167 | 0.102 | 0.715 |
| 国茗产品 | 0.167 | 1 | 0.123 | 0.401 |
| 桂人堂产品 | 0.102 | 0.123 | 1 | 0.678 |
| 对照指纹谱 | 0.715 | 0.401 | 0.678 | 1 |
表7 两种产品与长柱金花茶茶相似度分析结果
| 显脉金花茶 | 国茗产品 | 桂人堂产品 | 对照指纹谱 | |
| 长柱金花茶 | 1 | 0.221 | 0.162 | 0.655 |
| 国茗产品 | 0.221 | 1 | 0.091 | 0.403 |
| 桂人堂产品 | 0.162 | 0.091 | 1 | 0.718 |
| 对照指纹谱 | 0.655 | 0.403 | 0.718 | 1 |
实施例5 金花茶指纹图谱应用于金花茶叶茶的定量分析，用于质量控制
实施例1-4，利用金花茶指纹图谱，对金花茶原料以及叶茶进行了定性分析，在一定程度上起到了质量控制的作用，比如，市面上金花茶原料是否确实为金花茶、或其属于哪一类金花茶，市面上的金花茶产品，如叶茶，是否含有金花茶，含有何种金花茶，这些都可以通过上述定性方法得到。
但是如果要进行更深入的质量分析，上述定性方法就无法满足，比如，生产企业想得到并管控金花茶原料的纯度，生产企业想得知其产品的质量状况，生产企业想根据其产品质量反推其工艺参数是否合理等，这个时候就必须采取定量手段。
本实施例就是基于该问题，提出的解决方案。
1、样品溶液的制备
取烘干的金花茶原料或产品粉末10g，加300mL 70％乙醇索氏提取8h，提取液减压浓缩，置于250mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀。
用0.45μm微孔滤膜过滤，作待测样品溶液。
2、对照品溶液的制备
分别称取槲皮素及槲皮素-7-O-葡萄糖苷对照品，用无水甲醇溶解，定容至25mL。槲皮素对照品溶液浓度0.3680mg/mL，槲皮素-7-O-葡萄糖苷对照品溶液浓度为0.3240mg/mL。
3、HPLC条件
AgilentTC-C18色谱柱，(4.6mm×250mm，5μm)，柱温25℃，检测波长270nm。槲皮素分析流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液体积比52：48，等度洗脱，流速1.0mL/min。槲皮素-7-O-葡萄糖苷分析流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱：0-20min，15％A-30％A；20-25min，30％A-15％A。
槲皮素及槲皮素-7-O-葡萄糖苷对照品图谱见图12、13，图中的标号1分别代表槲皮素及槲皮素-7-O-葡萄糖苷峰。
4、结果
4.1标准曲线
分别取2μL、4μL、6μL、8μL、10μL槲皮素对照品溶液进样，对照品进样量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，线性回归。槲皮素回归方程Y＝313849X+6026.6，R2＝0.9991，在0.0368μg-0.1840μg范围内，峰面积与进样量呈良好线性关系。分别取1μL、3μL、5μL、7μL、9μL槲皮素-7-O-葡萄糖苷对照品溶液进样分析，经线性回归，Y＝305809.6X+27138.6，R2＝0.9999，在0.324μg-2.916μg范围内，Y-X呈良好线性关系。
4.2金花茶原料及产品中槲皮素及槲皮素-7-O-葡萄糖苷含量测定结果
表8 金花茶原料中槲皮素及槲皮素-7-O-葡萄糖苷含量(n＝3)
| 原料 | 槲皮素含量mg/g | RSD/％ | 槲皮素-7-O-葡萄糖苷含量mg/g | RSD/％ |
| 东兴金花茶 | 0.0927 | 1.82 | 1.783 | 0.89 |
| 普通金花茶 | 0.1390 | 1.14 | 0.6739 | 1.02 |
| 显脉金花茶 | 0.2044 | 1.06 | 0.8415 | 0.92 |
表9 产品中槲皮素及槲皮素-7-O-葡萄糖苷含量(n＝3)
| 原料 | 槲皮素含量mg/g | RSD/％ | 槲皮素-7-O-葡萄糖苷含量mg/g | RSD/％ |
| 桂人堂袋泡茶 | 0.1047 | 2.32 | 0.9923 | 1.88 |
| 国茗袋泡茶 | 0.0806 | 2.84 | 0.3796 | 2.05 |
4.3方法学分析
精密度试验 分别精密吸取槲皮素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷对照品溶液20μL，重复进样5次，测定峰面积，计算得槲皮素峰面积的RSD为1.47％，槲皮素-7-O-葡萄糖苷峰面积的RSD为0.85％，表明仪器精密度良好，见表10。
表10 精密度实验
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | RSD/％ | |
| 槲皮素 | 517733 | 515988 | 533782 | 528381 | 528824 | 1.47 |
| 槲皮素-7-O-葡萄糖苷 | 5439428 | 5428908 | 5539426 | 5450261 | 5499632 | 0.85 |
稳定性试验 分别于0，10，18，24，32h精密吸取对照品溶液20μL进样分析，测得槲皮素峰面积的RSD为1.32％，槲皮素-7-O-葡萄糖苷峰面积的RSD为1.18％，表明分析方法稳定、可靠，见表11。
表11 稳定性实验
| 0h | 10h | 18h | 24h | 32h | RSD/％ | |
| 槲皮素 | 281065 | 289536 | 290023 | 288094 | 289805 | 1.32 |
| 槲皮素-7-O-葡萄糖苷 | 1378119 | 1356239 | 1348937 | 1355249 | 1385789 | 1.18 |
回收率试验 采用加样回收法，精密称定已知含量的金花茶茶叶粉末5份，加入已知含量的槲皮素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷对照品溶液5mL，按供试品溶液制备方法平行处理，按本实施例色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表12和13。
表12 槲皮素回收率试验结果
表13 槲皮素-7-O-葡萄糖苷回收率试验结果
本实施中，在定性分析的基础上，以金花茶特征性成分中的槲皮素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷为关键组分，建立了两种成分的定量分析方法，并进行了方法学研究。
该方法稳定可靠，客观准确的、定量的反映了金花茶及其产品质量，可以推广应用于质量控制及工艺指导中，同时对相关行业标准的修订也具有积极的意义。
上述方法来鉴定、控制金花茶及产品质量，或对金花茶产品进行工艺指导，可以作为金花茶及产品质量定量评价方法。
Claims (10)
1.金花茶指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、样品溶液的制备：金花茶新鲜叶子，洗净、烘干、粉碎，得到粉末，乙醇提取，过滤，留滤液备用；
步骤二、对照品溶液的制备：分别取(+)-儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、山奈酚、槲皮素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、菠菜甾醇-3-O-β-D葡萄糖苷标准品，甲醇溶解，定容，摇匀，备用；
步骤三、对照指纹图谱的建立：分别取对照品溶液和由不同批次金花茶制备得到的样品溶液，注入高效液相色谱仪检测，得到色谱数据，色谱条件如下：
C18色谱柱，流动相为乙腈A-0.1％磷酸水溶液B，采用UV检测器，检测波长220nm；
洗脱梯度：0-2min，2％A；2-10min，2％-12％A；10-25min，12％-18％A；25-30min，18％-25％A；30-50min，25％-50％A；50-60min，50％-70％A；60-70min，70％-75％A；70-85min，75％A；
对经过色谱后的数据进行处理，建立金花茶的指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤一中的乙醇提取是在超声条件下进行的，超声时间为40分钟；所述过滤工序包括：超声提取完后用布氏漏斗过滤，得到的滤液再用0.45μm微孔滤膜过滤。
3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤一中的乙醇体积分数为70％，70％乙醇与金花茶粉末的体积质量比为5mL：1g。
4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述C18色谱柱为Agilent TC C18柱，长度为250mm，内径为4.6mm，填料的粒径为5μm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱条件为：流速为1.0mL/min，柱温25℃。
6.根据权利要求1-5任一项所述的建立方法得到的指纹图谱在金花茶原料、产品的质量控制中的应用。
7.根据权利要求6所述的鉴定金花茶原料中的应用，其特征在于，所述应用包括对金花茶原料的鉴定、评估，包括如下步骤：
(1)按权利要求1中的步骤一和二所述的方法分析待测样品的图谱；
(2)将待测样品的图谱与金花茶指纹图谱对比，可鉴别出是否为金花茶及其质量状况。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括应用于以金花茶为原料的叶茶的质量控制和工艺指导。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述质量控制还包括原料及产品的定量分析，具体步骤如下：
步骤A、样品溶液的制备：取烘干的金花茶原料或产品粉末，加体积分数70％乙醇索氏提取，提取液减压浓缩，甲醇定容，用0.45μm微孔滤膜过滤，作待测样品溶液；
步骤B、对照品溶液的制备：称取槲皮素及槲皮素-7-O-葡萄糖苷标准品，用无水甲醇溶解，定容，使得槲皮素对照品溶液浓度为0.3680mg/mL，槲皮素-7-O-葡萄糖苷对照品溶液浓度为0.3240mg/mL
步骤C、色谱条件：AgilentTC-C18色谱柱，检测波长270nm；
槲皮素分析流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液，体积比为52：48，等度洗脱，流速1.0mL/min；
槲皮素-7-O-葡萄糖苷分析流动相为乙腈A-0.1％磷酸水溶液B；
梯度洗脱：0-20min，15％A-30％A；20-25min，30％A-15％A；
步骤D、测试金花茶原料以及产品中槲皮素及槲皮素-7-O-葡萄糖苷的含量，用此数据来鉴定、控制金花茶及产品质量，或对金花茶产品进行工艺指导。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，样品制备条件为：取烘干的金花茶原料或产品粉末10g，加300mL 70％乙醇索氏提取8h，提取液减压浓缩，置于250mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，作待测样品溶液；色谱条件为：色谱柱的长度为250mm，内径为4.6mm，填料的粒径为5μm，柱温25℃，流速为1.0mL/min。
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