CN110940750A - 一种五味子uplc指纹图谱的构建方法 - Google Patents

一种五味子uplc指纹图谱的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物分析及药物质量控制技术领域，具体涉及一种五味子药材UPLC指纹图谱的构建方法。本发明以五味子醇甲为参照物，所建立的UPLC指纹图谱可以检测到9个共有峰，并识别出五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H、五味子甲素、五味子乙素等6个共有峰。该方法较普通HPLC法，能大幅度节约检测时间及试剂，可以作为快速评价五味子药材与相关制剂，以及鉴别五味子伪品的方法。

Description

一种五味子UPLC指纹图谱的构建方法
技术领域
本发明属于药物分析及药物质量控制技术领域，具体涉及一种五味子UPLC指纹图谱的构建方法。
背景技术
五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实。习称“北五味子”。始载于《神农本草经》，并列为上品，能收敛固涩，益气生津，补肾宁心。用于久嗽虚喘，梦遗滑精，遗尿尿频，久泻不止，自汗盗汗，津伤口渴，内热消渴，心悸失眠。
近年来五味子价格持续走高，采用南五味子等伪品掺假现象屡禁不绝。现有2015年版《中国药典》收载的质量控制方法仅从性状、鉴别、检查和含量测定对五味子质量加以规定，不能全面的反映药材的质量，因此也难以杜绝上述掺假行为。
超高效液相色谱(UPLC)技术具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点，目前已经成为一种常规的分析方法，并为使用者大幅度节约检测时间及试剂成本。
中药指纹图谱技术，尤其是高效液相指纹图谱技术，能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价，目前已成为控制中药材及制剂的关键技术。
因此，有必要结合以上技术，开发一种快速评价五味子药材与相关制剂，以及鉴别五味子伪品的方法。
发明内容
本发明结合上述技术各自的优点，提供一种五味子UPLC指纹图谱的构建方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种五味子药材UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)参照物溶液的制备取五味子醇甲对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成每1ml含五味子醇甲60μg的溶液，即得。
(2)供试品溶液的制备取五味子药材粉末(过三号筛)约0.25g，精密称定，置125ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率1130W，频率37kHz)20分钟，取出，放冷，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(3)色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.30～0.40ml；柱温为25～35℃；检测波长为251nm。五味子醇甲与邻近色谱峰的分离度应大于1.5。
Figure BSA0000197392840000021
(4)测定法分别精密吸取参照物溶液及供试品溶液各1.5μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
(5)对照指纹图谱的建立将35批基地样品图谱生成AIA文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行评价，剪切5～30min图谱并生成对照图谱。
(6)评价方法供试品指纹图谱应分别呈现与对照指纹图谱对应的9个共有峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，5分钟后的色谱峰，其相似度不得低于0.90。
所述步骤(3)，其特征在于，色谱条件与系统适用性试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱型号为Waters HSS T3(2.1×150mm，1.8μm)。
所述步骤(3)，其特征在于，色谱条件与系统适用性试验，流速为每分钟0.30～0.40ml。
所述步骤(3)，其特征在于，色谱条件与系统适用性试验，流速为每分钟0.35ml。
所述步骤(3)，其特征在于，色谱条件与系统适用性试验，柱温为25～35℃。
所述步骤(3)，其特征在于，色谱条件与系统适用性试验，柱温为30℃。
所述步骤(6)，其特征在于，供试品指纹图谱应分别呈现与对照指纹图谱对应的9个共有峰中，识别出6个共有峰，分别为1号峰：五味子醇甲；2号峰：戈米辛D；4号峰：五味子醇乙；5号峰：当归酰基戈米辛H；7号峰：五味子甲素；9号峰：五味子乙素。
有益效果
本发明较普通HPLC法，能大幅度节约检测时间及试剂，可以作为快速评价五味子药材与相关制剂，以及鉴别五味子伪品的方法。
附图说明
图1为色谱柱考察色谱图
图2为流速考察色谱图
图3为柱温考察色谱图
图4为专属性考察色谱图
图5为35批基地样品色谱图
图6为35批基地样品所生成的对照图谱
图7为各批次样品色谱图
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
1.设备与材料
1.1.仪器
超纯水仪(Milli-Q Synthesis A10，USA)
超声清洗仪(Elma p180H，Germany)
安捷伦1290高效液相色谱系统(Agilent 1290 Infinity，USA)：
表1仪器信息
Figure BSA0000197392840000031
1.2.试剂
乙腈(色谱纯，Merck，KGaA 64271 Darmstadt Germany，UN1648)
甲醇(色谱纯，Merck，KGaA 64271 Darmstadt Germany，UN1230)
甲醇(色谱纯，20181218国药集团(上海)化学试剂有限公司)
1.3.供试品、对照品信息
表2样品信息
Figure BSA0000197392840000032
Figure BSA0000197392840000041
Figure BSA0000197392840000051
表3对照品信息
Figure BSA0000197392840000054
2.供试品制备考察
2.1.提取溶剂考察
取本品粉末(过三号筛)约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇：水(9∶1)混合溶液、甲醇、乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟(140W，42kHz)，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
分别精密吸取上述供试品溶液各1.5μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。结果见表4-5。
表4相似度-提取溶剂考察
Figure BSA0000197392840000052
表5提取溶剂考察
Figure BSA0000197392840000053
Figure BSA0000197392840000061
结果表明，不同溶剂提取对相似度无显著影响，综合考虑峰形等因素，选择甲醇为提取溶剂。
2.2.提取方式考察
超声：取本品粉末(过三号筛)约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟(1130W，37kHz)，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
回流：取本品粉末(过三号筛)约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
分别精密吸取上述供试品溶液各1.5μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。结果见表6-7。
表6相似度-提取方式考察
Figure BSA0000197392840000062
表7提取方式考察
Figure BSA0000197392840000063
Figure BSA0000197392840000071
结果表明，提取方式对相似度无显著影响，选择较简便的超声法进行提取。
2.3.提取时间考察
取本品粉末(过三号筛)约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理10、20、30分钟(1130W，37kHz)，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
分别精密吸取上述供试品溶液各1.5μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。结果见表8-9。
表8相似度-提取时间考察
Figure BSA0000197392840000072
表9提取时间考察
Figure BSA0000197392840000073
结果表明，超声时间对相似度无显著影响，考虑到各批样品可能存在的差异，选择适中的20min进行提取。
2.4.溶剂体积考察
取本品粉末(过三号筛)约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml、25ml、50ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟(1130W，37kHz)，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
分别精密吸取上述供试品溶液各1.5μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。结果见10-11。
表10相似度-溶剂体积考察
Figure BSA0000197392840000081
表11溶剂体积考察
Figure BSA0000197392840000082
结果表明，溶剂体积对相似度无显著影响，综合考虑峰面积和分离情况，选择25ml进行提取。
2.5.提取次数考察
一次：取本品粉末(过三号筛)约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟(1130W，37kHz)，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
二次：取本品粉末(过三号筛)约0.25g，精密称定，置50ml塑料离心管中，精密加入甲醇25ml，密塞，超声处理20分钟(1130W，37kHz)，放冷，离心，上清转移至50ml容量瓶，残渣加甲醇15ml，重复上述提取步骤，最后用5ml洗涤残渣，合并上清液，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得。
分别精密吸取上述供试品溶液各1.5μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。结果见表12-13。
表12相似度-提取次数考察
Figure BSA0000197392840000091
表13提取次数考察
Figure BSA0000197392840000092
结果表明，提取次数对相似度无显著影响，综合考虑峰面积情况和制备简易程度，选择1次进行提取。
最终确定供试品制备方法为：取本品粉末(过三号筛)约0.25g，精密称定，置125ml具塞锥形瓶中，加甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率1130W，频率37kHz)20分钟，取出，放冷，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.色谱系统考察
3.1.波长选择
根据木脂素类紫外吸收光谱结果，考察了248nm、251nm、254nm下五味子图谱，统计各共有峰相对保留时间、相对峰面积、理论塔板数、分离度、拖尾因子等参数，并记录各条件下的色谱图，结果见表14。
表14系统适用性参数-波长考察
Figure BSA0000197392840000101
Figure BSA0000197392840000111
结果表明，波长对分离度等影响不大，选择木脂素类物质的最大吸收波长254nm作为检测波长。
3.2.色谱柱考察
考察了Waters HSS T3(2.1×150mm，1.8μm)、Agilent SB C18(2.1×150mm，1.8μm)以及Agilent Plus C18(2.1×150mm，1.8μm)三种色谱柱，统计各共有峰相对保留时间、相对峰面积、理论塔板数、分离度、拖尾因子等参数，结果见表15。并记录各条件下的色谱图，结果见附图1。
表15系统适用性-色谱柱考察
Figure BSA0000197392840000112
Figure BSA0000197392840000121
结果表明，Agilent SB C18中间小峰分离度较低，且21min和22min色谱峰位置对换；Agilent Plus C1g中间小峰分离度较低，且21min和22min色谱峰分离度较低。选择Waters HSS T3进行分析。
3.3.流动相系统考察
考察了乙腈-0.1％甲酸、乙腈-纯水系统，统计各共有峰相对保留时间、相对峰面积、理论塔板数、分离度、拖尾因子等参数，结果见表16。并记录各条件下的色谱图。
表16系统适用性参数-流动相系统考察
Figure BSA0000197392840000122
Figure BSA0000197392840000131
结果表明，乙腈-0.1％甲酸系统与乙腈-纯水系统图谱无显著性区别，乙腈-0.1％甲酸系统基线略有漂移，24min色谱峰与前一小峰分离度小于1.5，故选择乙腈-纯水系统进行分析。
3.4.流动相比例考察
调整比例，考察以下3种流动相比例：
比例1：0/23/30min，41/63/77％乙腈
比例2：0/23/30min，40/62/76％乙腈
比例3：0/23/30min，39/61/75％乙腈
统计各共有峰相对保留时间、相对峰面积、拖尾因子、理论塔板数、分离度等参数，结果见表17。并记录各条件下的色谱图。
表17系统适用性-流动相比例考察
Figure BSA0000197392840000141
Figure BSA0000197392840000151
结果表明，比例略变动对无显著影响，综合考虑分离度和分析时间选择比例2进行测定分析。
3.5.流速考察
考察了0.30ml/min、0.35ml/min、0.40ml/min下图谱，统计各共有峰相对保留时间、相对峰面积、拖尾因子、理论塔板数、分离度等参数，结果见表18。并记录各条件下的色谱图，结果见附图2。
表18系统适用性-流速考察
Figure BSA0000197392840000152
Figure BSA0000197392840000161
结果表明，流速0.30ml/min时，26min色谱峰与前一小峰分离度较低，综合考虑峰面积及柱压等因素，选择0.35ml/min进行分析。
3.6.柱温考察
考察了25℃、30℃、35℃下色谱图，统计各共有峰相对保留时间、相对峰面积、拖尾因子、理论塔板数、分离度等参数，结果见表19。并记录各条件下的色谱图，结果见附图3。
表19系统适用性-柱温考察
Figure BSA0000197392840000171
Figure BSA0000197392840000181
结果表明，柱温25℃时，25min色谱峰与前一小峰分离度较低；柱温35℃时，26min和27min色谱峰分离度小于30℃时的分离度，故选择30℃进行分析。
3.7.进样量考察
考察了进样量1μl、1.5μl、2μl下色谱图，统计各共有峰相对保留时间、相对峰面积、拖尾因子、理论塔板数、分离度等参数，结果见表20。并记录各条件下的色谱图。
表20系统适用性-进样量考察
Figure BSA0000197392840000182
Figure BSA0000197392840000191
结果表明，进样量对图谱无显著性区别，综合考虑峰面积等因素，选择1.5μl进行进样分析。
最终确定液相条件为：
色谱柱：Waters HSS T3(2.1×150mm，1.8μm)
流动相：乙腈-纯水
洗脱程序如下：
Figure BSA0000197392840000192
柱温：30℃
进样量：1.5μl
流速：0.35ml/min
检测波长：251nm
4.方法学验证
4.1.精密度考察
4.1.1.中间精密度
由不同人员在不同日期平行制备三份样品，用同一色谱柱分别在不同仪器进行测定，图谱生成AIA文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行评价，剪切5～30min图谱，结果见表21：
表21相似度-中间精密度
Figure BSA0000197392840000201
结果表明，中间精密度符合要求，相似度大于0.99。
4.1.2.日内精密度
制备一份样品进样六次进行测定，图谱生成AIA文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行评价，剪切5～30min图谱，结果表22：
表22相似度-日内精密度
Figure BSA0000197392840000202
结果表明，日内精密度符合要求，相似度大于0.99。
4.1.3.重复性考察
平行制备六份样品进行测定，图谱生成AIA文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行评价，剪切5～30min图谱，结果见表23：
表23相似度-重复性考察
Figure BSA0000197392840000211
结果，重复性符合要求，相似度＞0.99。
4.2.专属性考察
将空白溶液、样品溶液及对照品溶液进测定，并根据对照品保留时间及光谱信息等对样品中的色谱峰进行指认，结果见附图4：
结果表明，样品溶液中9个测定指标色谱峰的保留时间与对照品溶液色谱峰的保留时间相对应，空白溶剂无干扰，专属性考察结果符合规定。
4.3.稳定性考察
制备一份样品，分别在0、3、6、9、12、18、24h进行测定，图谱生成AIA文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行评价，剪切5～30min图谱，结果见表24和25：
表24相似度-稳定性
Figure BSA0000197392840000212
表25相对峰面积-稳定性考察
Figure BSA0000197392840000213
Figure BSA0000197392840000221
结果表明，24h内稳定性符合要求，相似度＞0.99，6号峰随时间变小。
4.4.耐用性
4.4.1.流动相中有机相的比例
将样品在不同比例下进行测定，考察以下3种流动相比例：
比例1：0/23/30min，41/63/77％乙腈
比例2：0/23/30min，40/62/76％乙腈
比例3：0/23/30min，39/61/75％乙腈
图谱生成AIA文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行评价，剪切5～30min图谱，结果见表26：
表26耐用性-不同比例
Figure BSA0000197392840000222
结果，流动相比例在-1％～+1％范围内耐用性符合要求，相似度＞0.99。
4.4.2.不同波长
将样品在248nm、251nm、254nm下进行测定，图谱生成AIA文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行评价，剪切5～30min图谱，结果见表27：
表27耐用性-不同波长
Figure BSA0000197392840000223
结果，波长在248nm～254nm条件下耐用性符合要求，相似度＞0.99。
4.4.3.色谱柱
制备一份样品，用相同填料不同批号色谱柱在相同仪器上进行测定，每个测定两份，图谱生成AIA文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行评价，剪切5～30min图谱，结果见表28：
表28耐用性-不同柱
Figure BSA0000197392840000231
结果，不同色谱柱耐用性符合要求，相似度＞0.99。
5.各批样品测定
5.1.基地样品
将35批基地样品图谱生成AIA文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行评价，剪切5～30min，图谱并生成对照图谱，结果见附图5和表29：
表29相似度-基地样品
Figure BSA0000197392840000232
结果，基地样品与对照图谱相似度为0.993～1.000。
5.2.对照图谱
35批基地样品生成对照图谱，结果见附图6。
5.3.指纹图谱限度
研究结果表明，各批样品与对照指纹图谱相似度均大于0.95。拟定限度为：供试品指纹图谱应分别呈现与对照指纹图谱对应的9个共有峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，5分钟后的色谱峰，其相似度不得低于0.90。
5.4.各批样品测定
将53批样品图谱生成AIA文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，用对照图谱进行评价，剪切5～30min，结果见附图7及表30：
Figure BSA0000197392840000241
Figure BSA0000197392840000251
结果表明，基地样品与对照图谱相似度为0.993～1.000；市场样品与对照图谱相似度为0.988～1.000；混淆品相似度为0.226～0.250。所建立方法可以作为快速评价五味子药材与相关制剂，以及鉴别五味子伪品的方法。
上述实施例说明，本领域专业技术人员能够实现或使用本发明，对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (5)

1.一种五味子药材UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)参照物溶液的制备 取五味子醇甲对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成每1ml含五味子醇甲60μg的溶液，即得。
(2)供试品溶液的制备 取五味子药材粉末(过三号筛)约0.25g，精密称定，置125ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率1130W，频率37kHz)20分钟，取出，放冷，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(3)色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.30～0.40ml；柱温为25～35℃；检测波长为251nm。五味子醇甲与邻近色谱峰的分离度应大于1.5。
表1
Figure FSA0000197392830000011
(4)测定法 分别精密吸取参照物溶液及供试品溶液各1.5μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
(5)对照指纹图谱的建立 将35批基地样品图谱生成AIA文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行评价，剪切5～30min图谱并生成对照图谱。
(6)评价方法 供试品指纹图谱应分别呈现与对照指纹图谱对应的9个共有峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，5分钟后的色谱峰，其相似度不得低于0.90。
2.根据权利要求1所述的一种五味子药材UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱型号为Waters HSS T3(2.1×150mm，1.8μm)。
3.根据权利要求1所述的一种五味子药材UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述色谱条件与系统适用性试验，流速为每分钟0.35ml。
4.根据权利要求1所述的一种五味子药材UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述色谱条件与系统适用性试验，柱温为30℃。
5.根据权利要求1所述的一种五味子药材UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(6)所述，供试品指纹图谱应分别呈现与对照指纹图谱对应的9个共有峰中，识别出6个共有峰，分别为1号峰：五味子醇甲；2号峰：戈米辛D；4号峰：五味子醇乙；5号峰：当归酰基戈米辛H；7号峰：五味子甲素；9号峰：五味子乙素。
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