CN114166980A - 银杏叶药材、提取物及其单味制剂中木脂素指纹图谱的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种银杏叶药材、提取物及其单味制剂中木脂素指纹图谱的构建方法，能够为银杏叶药材、提取物及其单味制剂质量研究及质量控制提供技术方法。本发明中共指认14个木脂素成分共有峰，且在14个木脂素成分共有峰中共指认出16种木脂素类化合物，更加全面阐明银杏叶药材、提取物及其制剂中的物质基础，为其质量控制提供依据。本发明建立的UPLC木脂素指纹图谱检测方法可以用于银杏叶药材、提取物及其制剂的成分检测，有利于更加全面地进行其质量控制，为其临床疗效及安全性提供保障。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种银杏叶药材、提取物及其单味制剂中木脂素指纹图谱的构建方法。
背景技术
银杏叶提取物及其制剂是临床上用于治疗心脑血管疾病的主要中药之一，具有确切的疗效。银杏叶及其制剂中含的化学成分复杂，研究表明其主要为黄酮和银杏内酯类成分。最新研究发现银杏叶及其制剂中含有木脂素类成分，且研究表明木脂素类成分对脑缺血性损伤、高脂血症、心肌缺血再灌注损伤等均有较好的治疗效果。然而，目前银杏叶药材、提取物及其制剂的现有质量研究及质量标准中，质控指标主要为黄酮醇苷类和萜类内酯类成分，缺少木脂素成分质量控制方法，无法全面、科学控制银杏叶提取物及其制剂的质量，以及保障银杏叶提取物及其制剂临床有效性及安全性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：本发明提供一种银杏叶药材、提取物及其制剂中木脂素指纹图谱的构建方法，能够有效地控制银杏叶药材提取物及其制剂的质量，从而保证其临床疗效。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种银杏叶药材、提取物及其单味制剂中木脂素指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
步骤1：制备对照样品溶液
将各对照样品分别用20％-100％甲醇-水溶液制成的浓度为0.01mg/mL-2mg/mL溶液，备用；
步骤2：供试品溶液的制备
步骤2.1，选取不同批次的舒血宁注射液，并用纯水稀释；
步骤2.2，将中性氧化铝萃取柱活化，分别用4-8mL浓度为50％-100％的甲醇和4-8mL的纯水淋洗中性氧化铝萃取柱，流速为0.5-5mL/min；
步骤2.3，然后将稀释后的舒血宁注射液分别置于活化后的中性氧化铝萃取柱中，并以0.1-3mL/min的流速上样，收集洗脱液；
步骤2.4，再用1-5mL的甲醇以0.1-3mL/min的流速洗脱，合并步骤2.3中的洗脱液并转移至容量瓶，加水定容至固定刻度，作为供试品溶液；
步骤3：将制备好的供试品溶液注入色谱仪中，获得指纹图谱，然后再将各对照品溶液注入色谱仪中，以相同的色谱条件获得对照样品的色谱图，色谱条件为：采用C18色谱柱；流动相A为含0％-1％甲酸或乙酸的乙腈、流动相B为含0％-1％甲酸或乙酸的超纯水，利用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱，洗脱条件：0-5min，5-15％A；5-25min，5％-15A→15-25％A；25-34min，15-25％A→30-40％A；流速为0.1mL/min-1mL/min，采用PDA检测器，检测波长为200nm-300nm，柱温20℃-45℃，进样体积为1μl-20μl；
步骤4：标定供试品溶液指纹图谱的共有峰；
步骤5：利用对照样品的色谱图指认供试品指纹图谱中的共有峰；
步骤6：将10批供试品溶液指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件并计算相似度。
进一步的，所述C18色谱柱为Waters BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)。
进一步的，所述中性氧化铝固相萃取柱为Cleanert Alumina N中性氧化铝固相萃取柱(1g/6mL)。
进一步的，所述PDA检测器的检测波长为225mm。
进一步的，所述色谱柱的柱温为40℃。
进一步的，所述流速为0.2mL/min。
进一步的，所述进样体积为2μl。
进一步的，所述供试品溶液指纹图谱共标定29个共有峰，所述29个共有峰的相对保留时间分别为：0.145±0.001(峰1),0.171±0.001(峰2),0.219±0.001(峰3)，0.287±0.001(峰4)，0.330±0.005(峰5),0.347±0.001(峰6),0.388±0.002(峰7),0.438±0.007(峰8)，0.511±0.002(峰9)，0.530±0.002(峰10)，0.675±0.002(峰11)，0.779±0.002(峰12)，0.852±0.001(峰13)，0.892±0.001(峰14)，0.915±0.001(峰15)，0.940±0.001(峰16)，0.963±0.002(峰17)，1.000(S,峰18)，1.130±0.002(峰19)，1.196±0.002(峰20)，1.270±0.002(峰21)，1.320±0.013(峰22)，1.370±0.002(峰23)，1.389±0.002(峰24)，1.418±0.002(峰25)，1.576±0.003(峰26)，1.599±0.003(峰27)，1.751±0.005(峰28)，1.826±0.006(峰29)。
本发明的有益效果是：
本发明首次建立银杏叶药材、提取物及其单味制剂中木脂素指纹图谱的构建方法，能够为银杏叶药材、提取物及其单味制剂质量研究及质量控制提供技术方法。本发明中共指认14个木脂素成分共有峰，且在14个木脂素成分共有峰中共指认出16种木脂素类化合物，能更加全面的阐明银杏叶药材、提取物及其制剂中的物质基础，为银杏叶药材、提取物及其制剂的质量控制提供依据。本发明建立的UPLC木脂素指纹图谱检测方法可以用于银杏叶药材、提取物及其制剂的成分检测，有利于更全面地对银杏叶药材、提取物及其制剂进行质量控制，为银杏叶药材、提取物及其制剂的临床疗效及安全性提供保障。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是10批舒血宁供试品的指纹图谱叠加图；
图2是银杏叶药材提取物及其单味制剂中木脂素的相对指纹图谱。
具体实施方式
本发明中涉及的仪器有：Waters H-Class超高效液相色谱系统(WatersCorporation，美国)；Mettler Toledo MS105电子分析天平(Mettler Toledo,瑞士)；Milli-Q Advantange A10纯水机(Millipore,美国)；KQ-250DE超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。本发明中所使用的试剂有：甲醇(色谱纯，Admas，中国)；乙腈(色谱纯，Admas，中国)；磷酸(分析纯，沪试，中国)。Cleanert Alumina N中性氧化铝固相萃取柱(1g/6mL)购于天津博纳艾杰尔科技有限公司。
步骤1：制备对照样品溶液
本发明所需的对照样品有：橄榄树脂素-4,4'-双葡萄糖苷、马尾松苷D、新银杏木脂素B、落叶松脂醇-4,4’-二葡萄糖苷、Glehlinoside C、松脂醇二葡萄糖苷、β-D-Glucopyranoside,3-[2-[4-(β-D-glucopyranosyloxy)-3-methoxyphenyl]-2,3-dihydro-3-(hydroxymethyl)-7-methoxy-5-benzofuranyl]propyl,(2R-trans)-(9CI)、刺五加甘E、新银杏木脂素A、Urolignoside、β-D-Glucopyranoside,4-[3-hydroxy-2-[4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenoxy]propyl]-2-methoxyphenyl、(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、二氢去氢二愈创木基醇9-O-β-D-葡萄糖苷、(+)丁香树脂酚-4-O-β-D-葡萄糖苷、(-)丁香树脂酚-4-O-β-D-葡萄糖苷、Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol9'-O-α-L-rhamnoside，其中，松脂醇二葡萄糖苷(纯度91.7％，批号111537-201706)和刺五加苷E(纯度97.9％，批号111713-201804)购于中国药品生物制品检定所(含量测定用)，(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷购于成都埃法生物科技有限公司，其余对照品均为自制，并且经HPLC面积归一法测定纯度均大于97％。上述对照品均为银杏叶药材提取物及其单味制剂中的化学成分，并在研究中得到光谱解析鉴定的结构。
分别精密量取上述各对照样品适量，并分别置于5mL容量瓶中，向容量瓶中加20％-100％甲醇-水溶液制成的浓度为0.01mg/mL-2mg/mL溶液。
步骤2：供试品溶液的制备
步骤2.1，选取不同批次的舒血宁注射液，并用纯水稀释。具体地，选择10批次舒血宁注射液，再分别精密量取10批舒血宁注射液2.0mL，并用纯水将舒血宁注射液稀释0-10倍，具体为5倍；
步骤2.2，将中性氧化铝萃取柱活化，分别用4-8mL浓度为50％-100％的甲醇和4-8mL的纯水淋洗中性氧化铝萃取柱，流速为0.5-5mL/min。具体为：用6mL浓度为60％的甲醇和6mL水先后淋洗中性氧化铝萃取柱两次，流速为2mL/min；
步骤2.3，然后将稀释后的10批舒血宁注射液分别置于活化后的中性氧化铝萃取柱中，并以0.1-3mL/min的流速上样，具体为：2mL/min，收集洗脱液；
步骤2.4，再用1-5mL的甲醇以0.1-3mL/min的流速洗脱，具体为：用3mL甲醇以1mL/min的流速洗脱，合并步骤2.3中的洗脱液并转移至容量瓶，加水定容至5mL，作为供试品溶液。
其中在稀释溶剂以及洗脱流速的选择上，舒血宁注射液采用纯水稀释至5倍，并以2mL/min的流速洗脱时，在洗脱液中未检测到明显黄酮类成分，当以4mL/min的流速洗脱时，在洗脱液中能够检测到少量黄酮类成分；当舒血宁注射液用甲醇稀释至5.0倍，并1mL/min的流速洗脱时，在洗脱液中仍可检测到黄酮类成分；因此，为了使黄酮类成分尽可能吸附于中性氧化铝固相萃取柱，采用纯水稀释至5倍，并以2mL/min的流速洗脱。
步骤3：将制备好的供试品溶液注入色谱仪中，获得指纹图谱，然后再将各对照品溶液注入色谱仪中，以相同的色谱条件获得对照样品的色谱图，色谱条件为：以Waters BEHC18(2.1×100mm，1.7μm)为色谱柱；流动相A为含0％-1％甲酸或乙酸的乙腈、流动相B为含0％-1％甲酸或乙酸的超纯水，利用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱，洗脱条件：0-5min，10％A；5-25min，10％A→20％A；25-34min，20％A→35％A；流速为0.1mL/min-1mL/min，优选0.2ml/min，检测波长为200nm-300nm，优选225nm；柱温20℃-45℃，优选40℃；进样体积1μl-3μl，优选2μl。采用该最佳流动相系统和洗脱比例，色谱图中峰信息全面，峰形好，基线平稳。采用225nm作为检测波长对木脂素类化合物吸收较强，可以获得最佳的各色谱图中的峰数、峰高、峰面积和分离度。流速为0.2mL/min时色谱图分离度较好，且在不影响分离度和峰数的情况下洗脱时间更短。
步骤4：共有峰的标定
取10批舒血宁供试品溶液分别以上述方法进样，所有色谱峰在40分钟内全部出完，比较10批舒血宁供试品的指纹图谱共标定了29个共有峰。以18号峰为参考峰，保留时间为1.000计，其它共有指纹峰的相对保留时间见表1，10批舒血宁供试品的指纹图谱叠加图见图1。
表1舒血宁供试品指纹图谱(相对保留时间)
步骤5：共有峰的指认
将制备好的对照样品溶液进样并得到对照样品的液相谱图，10批舒血宁注射液供试品指纹图谱与对照样品的液相谱图比较，在10批舒血宁供试品指纹图谱中共指认出14个木脂素成分共有峰，在14个木脂素成分共有峰中共指认出16种木脂素类化合物，因为舒血宁注射液中木脂素类化合物数目众多、极性相近，所以峰7指认出落叶松脂醇-4,4’-二葡萄糖苷、Glehlinoside C、新银杏木脂素B三种化合物，其余木脂素类化合物共有峰指认见表2。
表2木脂素类化合物共有峰指认
步骤6：将10批舒血宁供试品指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，在软件中生成10批舒血宁供试品指纹图谱叠加图谱，见图1，然后在软件中生成相对指纹图谱，见图2，然后计算10批舒血宁供试品指纹图谱与相对指纹图谱之间的相似度，结果如表3所示，10批舒血宁供试品指纹图谱相似度均大于0.97，本发明的舒血宁供试品的指纹图谱可作为用于鉴定银杏叶药材、提取物及其制剂质量的标准指纹图谱。
在利用上述标准指纹图谱鉴定银杏叶药材、提取物及其制剂的质量时，只需将待测样品按照上述制备供试品的方法制备待测样品溶液，并按照上述色谱条件制备进样得到待测样品的指纹图谱，然后将待测样品的指纹图谱与上述标准指纹图谱进行比对，并计算相似度，既可完成待测样品的质量鉴定。
本发明建立的银杏叶药材、提取物及其单味制剂中木脂素指纹图谱能够为银杏叶药材、提取物及其单味制剂质量研究及质量控制提供技术方法。本发明建立的UPLC木脂素指纹图谱检测方法可以用于银杏叶药材、提取物及其制剂的成分检测，有利于更全面地对银杏叶药材、提取物及其制剂进行质量控制，为银杏叶药材、提取物及其制剂的临床疗效及安全性提供保障。
表3 10批舒血宁供试品指纹图谱编号与批次
方法学验证
1、重复性实验
取舒血宁注射液6份(批号1906192)，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液。分别进样，测得各共有峰的相对保留时间的RSD均小于1％，表明该方法的重复性良好，测试结果如表4所示。
表4重复性考察(相对保留时间)
2、稳定性实验
同一供试品溶液(批号1906192)，间隔一定时间进行测定，测得各共有峰的相对保留时间的RSD均小于2％，结果表明样品至少在24小时内稳定，测试结果见表5。
表5稳定性考察(相对保留时间)
3、精密度试验
同一供试品溶液(批号1906192)，连续进样6次，测得各共有峰的相对保留时间的RSD均小于1％，测试结果见表6。
表6精密度考察(相对保留时间)
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关的工作人员完全可以在不偏离本发明的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (8)
1.一种银杏叶药材、提取物及其单味制剂中木脂素指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
步骤1：制备对照样品溶液
将各对照样品分别用20％-100％甲醇-水溶液制成的浓度为0.01mg/mL-2mg/mL溶液，备用；
步骤2：供试品溶液的制备
步骤2.1，选取不同批次的舒血宁注射液，并用纯水稀释；
步骤2.2，将中性氧化铝萃取柱活化，分别用4-8mL浓度为50％-100％的甲醇和4-8mL的纯水淋洗中性氧化铝萃取柱，流速为0.5-5mL/min；
步骤2.3，然后将稀释后的舒血宁注射液分别置于活化后的中性氧化铝萃取柱中，并以0.1-3mL/min的流速上样，收集洗脱液；
步骤2.4，再用1-5mL的甲醇以0.1-3mL/min的流速洗脱，合并步骤2.3中的洗脱液并转移至容量瓶，加水定容至固定刻度，作为供试品溶液；
步骤3：将制备好的供试品溶液注入色谱仪中，获得指纹图谱，然后再将各对照品溶液注入色谱仪中，以相同的色谱条件获得对照样品的色谱图，色谱条件为：采用C18色谱柱；流动相A为含0％-1％甲酸或乙酸的乙腈、流动相B为含0％-1％甲酸或乙酸的超纯水，利用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱，洗脱条件：0-5min，5-15％A；5-25min，5％-15A→15-25％A；25-34min，15-25％A→30-40％A；流速为0.1mL/min-1mL/min，采用PDA检测器，检测波长为200nm-300nm，柱温20℃-45℃，进样体积为1μl-20μl；
步骤4：标定供试品溶液指纹图谱的共有峰；
步骤5：利用对照样品的色谱图指认供试品指纹图谱中的共有峰；
步骤6：将供试品溶液的指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件并计算相似度。
2.根据权利要求1所述的一种银杏叶药材、提取物及其单味制剂中木脂素指纹图谱的构建方法，所述C18色谱柱为Waters BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)。
3.根据权利要求1所述的一种银杏叶药材、提取物及其单味制剂中木脂素指纹图谱的构建方法，所述中性氧化铝固相萃取柱为Cleanert Alumina N中性氧化铝固相萃取柱(1g/6mL)。
4.根据权利要求1所述的一种银杏叶药材、提取物及其单味制剂中木脂素指纹图谱的构建方法，所述PDA检测器的检测波长为225mm。
5.根据权利要求1所述的一种银杏叶药材、提取物及其单味制剂中木脂素指纹图谱的构建方法，所述色谱柱的柱温为40℃。
6.根据权利要求1所述的一种银杏叶药材、提取物及其单味制剂中木脂素指纹图谱的构建方法，所述流速为0.2mL/min。
7.根据权利要求1所述的一种银杏叶药材、提取物及其单味制剂中木脂素指纹图谱的构建方法，所述进样体积为2μl。
8.根据权利要求1所述的一种银杏叶药材、提取物及其单味制剂中木脂素指纹图谱的构建方法，所述供试品溶液指纹图谱共标定29个共有峰，所述29个共有峰的相对保留时间分别为：0.145±0.001(峰1),0.171±0.001(峰2),0.219±0.001(峰3)，0.287±0.001(峰4)，0.330±0.005(峰5),0.347±0.001(峰6),0.388±0.002(峰7),0.438±0.007(峰8)，0.511±0.002(峰9)，0.530±0.002(峰10)，0.675±0.002(峰11)，0.779±0.002(峰12)，0.852±0.001(峰13)，0.892±0.001(峰14)，0.915±0.001(峰15)，0.940±0.001(峰16)，0.963±0.002(峰17)，1.000(S,峰18)，1.130±0.002(峰19)，1.196±0.002(峰20)，1.270±0.002(峰21)，1.320±0.013(峰22)，1.370±0.002(峰23)，1.389±0.002(峰24)，1.418±0.002(峰25)，1.576±0.003(峰26)，1.599±0.003(峰27)，1.751±0.005(峰28)，1.826±0.006(峰29)。
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