JP5513679B2 - タンパク質フラグメントの評価によって毛髪損傷を検出し示すシステム及び方法 - Google Patents

Description

本開示の実施形態は、抽出されたタンパク質フラグメントの評価及び識別によって毛髪への損傷を測定するためのプロセスを目的とする。

タンパク質損失による毛髪損傷は周知の問題であるが、ほとんどの人は毛髪に生じているタンパク質損失の量又は毛髪の一般的健康レベルを認識していない。タンパク質損失は毎日の出来事及び環境因子、例えば紫外線への曝露、漂白、染毛、パーマ、機械的な操作、及び塩水との接触によって引き起こされ得る。

分子レベルでの適正な毛髪構造は、健康な外観、艶、及び感触を有する毛髪の重要な特徴である。毛髪はほとんどタンパク質からなり、頭皮から出た後は再生不可能である。したがって、毛髪の全体的なタンパク質の健全性を保護する製品を有することが重要である。したがって、タンパク質及び繊維レベルでの毛幹の保護は、毛髪の健全な外観の確保のために重要である。

毛髪から抽出したタンパク質フラグメントを識別し、タンパク質フラグメントの種類を毛髪損傷の種類と相関させることは、１）毛髪への損傷の種類を正しく識別することを可能にし、２）損傷を予防する製品、あるいは漂白剤及び／又は他の組成物の場合は損傷を起こさない製品を設計するために必要な情報を提供できる。加えて、毛髪疾患の特定の種類を識別することも重要である。損傷及び／又は処置に対する反応は、毛髪疾患のある人の毛髪と正常な毛髪とでは異なる。したがって、特定の種類の損傷に対するタンパク質レベルでの毛髪の反応に基づいて、存在する毛髪疾患の種類を示すことが可能であり得る。

また、タンパク質フラグメントが識別されれば、タンパク質損失の結果である利用可能な結合を利用する製品、特に特定の損傷種類のための製品を製造できる。

本開示は概して、毛髪から抽出されたタンパク質フラグメントを毛髪損傷の種類と相関させることによって毛髪損傷の種類を検出するためのシステム及び方法に関する。

毛髪損傷の種類又は原因を標識タンパク質フラグメントと相関させる方法であって、この方法は、２つの全く同じ毛髪試料、すなわち試料Ａ及び試料Ｂを生成する工程と、損傷を及ぼす組成物又は処理を試料Ａに適用し、損傷を及ぼす組成物又は処理を試料Ｂには適用しない工程と、好適な溶媒を用いて試料Ａ及び試料Ｂのそれぞれからタンパク質フラグメントを抽出する工程と、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて試料Ａ及び試料Ｂからのタンパク質フラグメント試料を分析する工程と、試料Ａ及び試料ＢからのＭＡＬＤＩ−ＭＳの結果を比較する工程と、試料Ｂには存在せず試料Ａに存在する特有の修飾パターンを識別することによって標識タンパク質フラグメントを識別する工程とを含む。

毛髪損傷の種類又は原因を示す方法であって、この方法は、好適な溶媒を用いて毛髪試料からタンパク質フラグメントを抽出する工程と、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いてタンパク質フラグメント試料を分析する工程と、タンパク質フラグメントの結果を得る工程と、タンパク質フラグメント結果を特定の損傷の標識タンパク質フラグメントのリストと比較することによって毛髪損傷を識別する工程とを含む。

漂白による損傷を受けた毛髪の標識タンパク質フラグメントのＭＡＬＤＩ−ＭＳの結果と、損傷を受けていない毛髪のタンパク質フラグメントのＭＡＬＤＩ−ＭＳの結果との比較。

本明細書で使用するとき、「毛髪」は、頭髪又はまつげのような、人又は動物由来のケラチン繊維を意味する。更に、本明細書で使用するとき、「ケラチンタンパク質」という用語は、毛髪に存在するタンパク質を意味するものと理解される。本明細書で使用するとき、「タンパク質フラグメント」という用語は、損傷されケラチンタンパク質構造体から剥がれたアミノ酸及びアミノ酸より大きいタンパク質であるが、静電相互作用、又は弱い水素結合マトリックスのタンパク質及び脂質、あるいはケラチンタンパク質構造体への組み込みを含まないその他の任意の力によって、毛髪構造体内に保持されているものを意味する。

本明細書で使用するとき、「標識タンパク質」は、特定の毛髪損傷の種類及び／又は損傷を及ぼす処置と相関しているタンパク質フラグメントを意味する。

本明細書で使用するとき、「溶出する」、「溶出している」などは、還元剤又は抽出剤を一切添加せずに水溶液と毛髪を接触させることによって、ケラチンタンパク質構造を変更せずに、かつ毛髪試料に存在する（静電相互作用、弱い水素結合マトリックスのタンパク質及び脂質、又はケラチンタンパク質構造体への組み込みを含まないその他の任意の力による結合以外の）化学結合を破壊若しくは還元せずに、毛髪からタンパク質を取り出すことを意味する。

本明細書で使用するとき、「溶出可能」とは、毛髪試料に存在するタンパク質フラグメントが、還元剤又は抽出剤を一切添加せずに水溶液において毛髪構造体から取り出されることが可能なことを意味する。更に、「溶出可能」は、タンパク質が、本質的に水からなる水溶液において、静電相互作用、弱い水素結合マトリックスのタンパク質及び脂質、又はケラチンタンパク質構造体への組み込みを含まないその他の任意の力による結合以外のケラチンタンパク質構造体に存在する化学結合の破壊又は還元を伴わずに、毛髪構造体から運び出すことができることを意味する。

ケラチンタンパク質構造を変更せずに毛髪からタンパク質フラグメントを抽出するために水溶液を用いて毛髪損傷を検出し示すための方法が開発されてきた。そのような方法の１つは、２０１０年５月１７日付で出願された特許出願第６１／３４５，３２１号に記載されいる。毛髪から抽出されたタンパク質フラグメントを分析する。タンパク質フラグメントの分析を基に、毛髪に及んだ損傷の種類を特定すること、特に毛髪に及んだ損傷の原因を決定することが可能である。そのような特定の標識タンパク質フラグメントとしては、毛髪が漂白されたときに生成される標識タンパク質フラグメントが挙げられる。毛髪試料を検査し、タンパク質フラグメントを抽出し、抗体に基づく検出及び／又は質量分析法を用いて、得られたタンパク質フラグメントの試験を行うことができる。一実施形態では、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法すなわち「ＭＡＬＤＩ−ＭＳ」としても知られているマトリックス支援レーザー脱着イオン化法（「ＭＡＬＤＩ」）を用いてタンパク質フラグメントの評価を行う。この技法は質量分析法で用いられるソフトイオン化法である。ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、ペプチド及びタンパク質のような生体分子、並びにポリマーのような大きい有機分子の分析に用いることができる。ＭＡＬＤＩでは、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）のような紫外線吸収性マトリックスで検体を最初に共結晶化してからパルスレーザー（ＹＡＧ又は窒素レーザー）放射線に曝す。これは検体／マトリックス結晶の蒸発／脱着を引き起こし、質量分析質に伝達されて検出されるイオンを生成する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦでは飛行時間質量分析質が用いられる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータは、分子量の情報を生成するためにＭＳモード（例えばペプチド）で収集してもよく、ＭＳ／ＭＳモード（例えばペプチド配列／構造情報）で収集してもよい。典型的なＭＡＬＤＩ質量スペクトル収集は１分未満で行われるので、関心のある試料の分子種の高速スクリーニングに使用することができる。未処置の毛髪及び漂白された毛髪のような異なる条件下で処置された試料で得られた質量スペクトルの比較によって、変化及び分子標識を検出することができる。

ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、酵素によるタンパク質の分解とともに行っても、それを用いずに行ってもよい。次いで、タンパク質フラグメントの試験結果を既知の標識タンパク質フラグメントのライブラリと比較して毛髪損傷の種類を識別し、場合によっては毛髪損傷の発生源（すなわち漂白）を識別する。これは損傷の「フィンガープリンティング」を可能にする。すなわち、毛髪試料を試験し、その結果に特定の標識タンパク質フラグメントが含まれていれば、それは毛髪試料が特定の原因によって損傷されていることを意味する。

タンパク質フラグメントを評価するための更なる方法としては、液体クロマトグラフィー電気スプレー質量分析が挙げられ（ただしこれに限定されず）、タンパク質フラグメントに対する抗体を生成することができ、ＥＬＩＳＡ検定を開発することができる。

更に、ｉＴＲＡＱ法で、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）から入手可能な試薬を使用して、タンパク質フラグメントの各リシン側鎖及び遊離Ｎ末端基に対するアイソバリックタグの共有結合アミン連鎖を確立することができる。これは、ＭＡＬＤＩ ＭＳによって同時に複数の試料の試験を実行することを可能にする。複数の試料の試験をＭＡＬＤＩ ＭＳで同時に実行することは、試験のばらつきによる試験データの変動を最小限にする。

多様な異なる組成物又は処置によって毛髪見本を損傷して、得られたタンパク質フラグメントを損傷されていない同様の毛髪見本と比較分析することによって、これらの標識タンパク質フラグメントのライブラリを生成できる。毛髪が受けた損傷の種類に基づいて同じ標識タンパク質の結果が見出されるであろうと考えられるので、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって標識タンパク質フラグメントを識別できる。これは、標識タンパク質フラグメントが毛髪損傷の種類又は原因の指標となることを意味する。例えば、漂白による毛髪損傷は特定の標識タンパク質フラグメントをもたらし、紫外線による毛髪損傷は特定の標識タンパク質フラグメントをもたらすなどである。

漂白による損傷を受けた毛髪は、次の構造を有するタンパク質フラグメントのＮ末端に＋２８及び＋７１の修飾をもたらすと考えられる。

例えば図１に示したように、漂白された毛髪からは、損傷されていない（未処置の毛髪）試料には存在しない特定のフラグメントのセットが放出され、水を用いて抽出されている。ＭＳピークのセットは、２つの修飾されていないタンパク質のピーク（９６６及び１５６８）と、修飾されていないタンパク質のピーク＋２８ダルトン（９６６＋２８＝９９４及び１５６８＋２８＝１５９６）の分子量に相当するピークとからなる。追加的なピークはフラグメントのアミン末端での化学修飾による。この特徴的なピークに相当するタンパク質フラグメントの配列を表１に示す。タンパク質の配列の記述に用いる文字は１文字アミノ酸コードを指す（すなわちＥ＝グルタミン酸、Ｉ＝イソロイシンなど）。これらのタンパク質への更なる修飾としては、メチオニン、システイン、及びトリプトファン残基の酸化が挙げられ、アスパラギン及びグルタミン残基での脱アミド化も検出される場合がある。タンパク質フラグメントはケラチン３１に位置し、これはこのタンパク質が毛幹の漂白により劣化していることを示唆する。

加えて、この方法を使用して個人の毛髪が処置に対して正常な反応を有するかどうかを示すこともできる。例えば、特定の毛髪疾患を有する個人の場合、その人からの毛髪試料は「正常な」反応を有する人からのものと同じ標識タンパク質フラグメントを生成しない可能性がある。毛髪疾患を有する人は、正常な反応によって示されるより多い、少ない、及び／又は場合によってはそれと異なる標識タンパク質フラグメントを生成する可能性がある。毛髪疾患反応ライブラリもまた、上述のような損傷に関する標識タンパク質フラグメントのライブラリと同様に作製できる。したがって、この毛髪疾患用の検査には、個人の毛髪を特定の損傷を及ぼす処置に曝露し、次いでその損傷を及ぼす処置から生成された標識タンパク質フラグメントによって毛髪疾患を識別することが含まれ得る。

この毛髪タンパク質損失検査法の一実施形態では、可溶性タンパク質フラグメントと不溶性タンパク質フラグメントを別々に分析する。可溶性タンパク質フラグメントと不溶性タンパク質フラグメントを別々に分析することは、タンパク質フラグメントの検出の感度を高めることができる。加えて、これらのタンパク質フラグメントを別々に分析することは、毛髪損傷の場所の決定を改善し得る。可溶性タンパク質フラグメントと不溶性タンパク質フラグメントを別々に測定するために、毛髪繊維を取り出した後、水中の試料を遠心分離するか、又は可溶性部分から不溶性の部分を沈殿させることができる。

（実施例Ａ）：
１．毛髪を漂白し、漂白による損傷の示す標識タンパク質フラグメントを生成する。
毛髪試料は以下のプロトコルを用いて漂白した。

プロトコル１：
水酸化アンモニウム２％、ＥＤＴＡ四ナトリウム０．２％（酢酸でｐＨを１０．３に調整）、及び過酸化水素６％からなる漂白液を調製した。毛房（茶色及び天然白色）を漂白液に浸し、４０℃の炉内に入れた。３０分後及び９０分後に毛房を漂白液から取り出し、ＤＩ水道水で２分間洗い、乾燥した。

プロトコル２：
過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を漂白液に含まないことを除き、プロトコル１と同じ。

プロトコル３：
ＥＤＴＡ四ナトリウム（Ｃ１０Ｈ１２Ｎ２Ｏ８Ｎａ４）を漂白液に含まないことを除き、プロトコル１と同じ。

２．漂白後の毛房のタンパク質損失分析
毛髪からの合計タンパク質損失を測定することにより、漂白処置の結果としての毛房の総合的なタンパク質損傷量を評価した。要約すると、各毛房からの０．２〜０．３ｇの毛髪を５ｃｍ（２インチ）の部分に切り分け、ガラスシンチレーションバイアルに加えた。毛髪０．１ｇに対してＤＩ水１．０ｍＬの比率でＤＩ水を加え、ボルテックスプラットホームで２５００ｒｐｍで６０分間試料を物理的に攪拌した。水抽出物の合計タンパク質濃度をＬｏｗｒｙタンパク質定量検定によって分析した。結果を表２に要約する。

３．漂白後の毛房のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析
漂白処理の結果として毛房が受けた特定のタンパク質損傷を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によって上述の水抽出物を分析して決定した。水抽出物をＭＡＬＤＩマトリックス溶液（８０：２０：０．１の比率のアセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸溶液１ｍＬに５ｍｇのα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）を溶解したもの）と直接混合（１：１）した。それぞれ約１μＬの試料をＭＡＬＤＩプレートに付け、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ ４８００プラスシステム（ＡＢ−Ｓｃｉｅｘ）で分析した。漂白された毛髪の水抽出物中に検出された毛髪損傷のタンパク質標識は、ｍ／ｚ ９９４／１０３７、１５９６／１６３９、１２０４、１２７８などのピークを含む。ピーク１０３８は１０３７の脱アミド化された形態であり、ピーク９９４／１０３７及び１５９６／１６３９などでのデルタ質量は４３Ｄａであることに留意されたい。標識１０３７及び１２０４の結果を表１にまとめた。

４．漂白された毛髪からのタンパク質損傷標識のシークエンシング
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析で観察された標識タンパク質の識別及び配列のために、漂白水抽出物を逆相ＨＰＬＳ（２ｍｍ×１５ｃｍ、Ｊｕｐｉｔｅｒ、Ｃ４、３００Ａカラム、ＨＰ１１００システム）で分離し、画分を手作業で収集し、凍結乾燥した。各画分を０．０２％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液に２０μＬに再溶解し、ＭＡＬＤＩマトリックスと１：１で混合し、ＭＡＬＤＩプレートに付けて、ＭＡＬＤＩシークエンシングを行った。タンパク質の／それらの損傷標識のほかに水抽出物中のタンパク質をより完全に識別するために、漂白された毛髪の別の水抽出物を真空下で乾燥し、５０ｍＭのＮＨ４Ａｃ緩衝液（ｐＨ ８）に再び溶解した。トリプシン（０．２５μｇ／μＬ水溶液）１０μＬを緩衝液に加え、３７℃で４時間培養した。そのトリプシン分解物を真空下で乾燥し、０．０２＆ ＴＦＡ／水５０μＬに再び溶解してから、ＨＰＬＣ分離を行った。ＬＣ画分を収集及び乾燥し、ＭＡＬＤＩシークエンシングにより分析した。ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウェア（ＡＢ−Ｓｃｉｅｘ）を用いて、非トリプシンとトリプシンのＬＣ画分の両方から収集されたＭＡＬＤＩの生データをタンパク質データベースに照合して検索した。結果は以下にまとめられる。

トリプシンによる分解後、漂白された毛髪の水抽出物に多くの異なる形態の毛髪ケラチンが検出された。主なケラチンとしては、８１、８５、３１、８６、３３ａ、３３ｂ、及び８３が挙げられる。

Ｍｅｔ、Ｃｙｓ及びＴｒｐでの酸化、Ａｓｎ及びＧｌｎでの脱アミド、Ｎ末端のホルミル化（修飾されていない配列に＋２８ｄａ）及び未知の修飾（＋７１ｄａ（更に特定される））を含む修飾が検出された。

デルタ質量４３ｄａを有するいくつかのタンパク質対として例えば水抽出物中の９９４／１０３７及び１５９６／１６３９、並びに漂白された毛髪のトリプシン含有水抽出物中の１５１３／１５５６、１９５４／１９９７などが観察された。これらの対はおそらくタンパク質のＮ末端でのホルミル化（＋２８Ｄａ）及び未知の形成（formation）（＋７１Ｄａ）による修飾の結果であろう。これらの可能な修飾の正確な反応化学は不明である。これらのピーク及び対（パターン）を毛髪損傷の標識として使用することができる。

ｘは標識が存在することを示す。
信号強度ｘｘｘ＞ｘｘ＞ｘ

（実施例Ｂ）
機械的特性の損失、形態的な損傷、及びタンパク質の損失を含む紫外線曝露による毛髪繊維の損傷を記録した。毛髪に対する紫外線損傷のペプチド標識を識別するために、紫外線によって引き起こされる特定のタンパク質の分解を以下のプロセスによって調査した。

１．紫外線による損傷を示す標識タンパク質フラグメントを生成するための毛髪の紫外線（ＵＶ）曝露
プロトコル：Ａｔｌａｓ Ｃｉ３０００＋ Ｘｅｎｏｎ Ａｒｃ Ｆａｄｅ−Ｏｍｅｔｅｒにおいて放射照度の設定を４２０ｎｍで１．４８Ｗ／ｍ²とし、チャンバ温度３５℃、相対湿度８０％で毛房（一般人の茶色の毛髪）を最高７５時間まで紫外線に曝した。製造業者（Ａｔｌａｓ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＬＬＣ）により提供されているＯｕｔｄｏｏｒ ｔｏ Ｘｅｎｏｎ Ｒａｄｉａｎｔ Ｅｎｅｒｇｙ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎプログラムを用いて行った計算によると、これらの条件下での１時間の紫外線曝露はフロリダ州で７．５時間の屋外日光曝露にほぼ相当する。

２．紫外線後の毛房のタンパク質損失分析（注記：これは漂白した毛髪を使ったものと同じプロトコルである）
毛髪からの合計タンパク質損失を測定することにより、紫外線曝露の結果としての毛房の総合的なタンパク質損傷量を評価した。端的に述べると、各毛房からの０．２〜０．３ｇの毛髪を５ｃｍ（２インチ）の部分に切り分け、ガラスシンチレーションバイアルに加えた。毛髪０．１ｇに対してＤＩ水１．０ｍＬの比率でＤＩ水を加え、ボルテックスプラットホームで２５００ｒｐｍで６０分間試料を物理的に攪拌した。水抽出物の合計タンパク質濃度をＬｏｗｒｙタンパク質定量検定によって分析した。結果を表３に要約する。

３．紫外線後の毛房のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析
紫外線曝露の結果として毛房が受けた特定のタンパク質損傷を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によって上述の水抽出物を分析して決定した。水抽出物をＭＡＬＤＩマトリックス溶液（８０：２０：０．１の比率のアセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸１ｍＬに５ｍｇのα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）を溶解したもの）と直接混合（１：１）した。約１μｌの各試料をＭＡＬＤＩプレートに付け、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ ４８００プラスシステム（ＡＢ−Ｓｃｉｅｘ）で分析した。水抽出物では、紫外線による毛髪損傷のタンパク質標識（ｍ／ｚ １２７８）が検出された。漂白した毛髪の抽出物にもこの標識は低レベルで検出されたが、この標識は紫外線損傷後により多く、毛髪の紫外線照射後に見つかった優勢な低分子量の画分である。この標識は、消費者に関連する曝露範囲内での毛髪への紫外線曝露量に比例して増加することも見出されている（表３）。

本明細書に開示した寸法及び値は、記述された正確な数値に厳しく限定されるものと理解すべきでない。むしろ、特に言及しない限り、そのようなそれぞれの寸法は、記述された値と、その値の周辺の機能的に同等の範囲との両方を意味することを意図する。例えば、「４０ｍｍ」として開示された寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することを意図する。

相互参照されるか又は関連するすべての特許又は特許出願を含む、本願に引用されるすべての文書を、特に除外すること又は限定することを明言しないかぎりにおいて、その全容にわたって本願に援用するものである。いずれの文献の引用も、こうした文献が本願で開示又は特許請求されるすべての発明に対する先行技術であることを容認するものではなく、また、こうした文献が、単独で、あるいは他のすべての参照文献とのあらゆる組み合わせにおいて、こうした発明のいずれかを参照、教示、示唆又は開示していることを容認するものでもない。更に、本文書において、用語の任意の意味又は定義の範囲が、参考として組み込まれた文書中の同様の用語の任意の意味又は定義と矛盾する場合には、本文書中で用語に割り当てられる意味又は定義に準拠するものとする。

本発明の特定の実施形態が例示され記載されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の様々な変更及び修正を実施できることが、当業者には自明であろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのようなすべての変更及び修正を添付の特許請求の範囲で扱うものとする。

Claims (5)

1. 毛髪損傷の種類又は原因を標識タンパク質フラグメントと相関させる方法であって、
   ａ）２つの全く同じ毛髪試料（試料Ａ及び試料Ｂ）を生成する工程と、
   ｂ）損傷を及ぼす組成物又は処理を試料Ａに適用し、損傷を及ぼす組成物又は処理を試料Ｂには適用しない工程と、
   ｃ）好適な溶媒試料を用いて試料Ａ及び試料Ｂのそれぞれからタンパク質フラグメントを抽出する工程と、
   ｄ）ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて試料Ａ及び試料Ｂからの前記タンパク質フラグメント試料を分析する工程と、
   ｅ）試料Ａ及び試料Ｂからの前記ＭＡＬＤＩ−ＭＳの結果を比較する工程と、
   ｆ）試料Ｂには存在せず試料Ａに存在する特有の修飾パターンを識別することによって前記標識タンパク質フラグメントを識別する工程と
   を含む、方法。
2. 酵素によるタンパク質分解の後に前記ＭＡＬＤＩ−ＭＳを行う、請求項１に記載の方法。
3. 前記酵素によるタンパク質分解をせずに前記ＭＡＬＤＩ−ＭＳを行う、請求項１に記載の方法。
4. 毛髪損傷の種類又は原因を示す方法であって、
   ａ）好適な溶媒を用いて毛髪試料からタンパク質フラグメントを抽出する工程と、
   ｂ）ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって前記タンパク質フラグメント試料を分析し、タンパク質フラグメントの結果を得る工程と、
   ｃ）前記タンパク質フラグメントの結果を特定の損傷の標識タンパク質フラグメントのリストと比較することによって毛髪損傷を識別する工程と
   を含む、方法。
5. 前記ＭＡＬＤＩ−ＭＳでのタンパク質フラグメントの結果が、次の構造を有する前記タンパク質フラグメントのＮ末端に＋２８及び＋７１の修飾を含む、請求項４に記載の方法。
   

   

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