CN102893160B - 经由评估蛋白质片段检测并展示毛发损伤的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于展示毛发损伤类型和/或来源的方法的实施方案，该实施方案包括用水溶液从毛发样品中提取蛋白质片段、用MALDI-MS测试法测试所得蛋白质片段、然后比较损伤的样品和未损伤的样品之间的结果或比较损伤的样品和已知的标记蛋白质片段列表之间的结果，以鉴定损伤类型和/或来源。

Description

经由评估蛋白质片段检测并展示毛发损伤的系统和方法
发明领域
本公开的实施方案涉及通过评估和鉴定提取的蛋白质片段来测量毛发损伤的方法。
发明背景
由蛋白质损失导致的毛发损伤是一个已知的问题；然而，一般来讲，大多数人未认识到他们的毛发遭受的蛋白质损失量或他们的毛发健康水平。蛋白质损失可由每天的事件和环境因素如紫外线暴露、漂白、着色、烫发、拉直、机械操纵和盐水接触引起。
分子水平上的适当的毛发构造是具有健康的外观、光泽和触感的毛发的重要特征。毛发主要由蛋白质组成，并且在它长出头皮后是可再生的。因此，保护毛发的总体蛋白质完整性的产品是有价值的。因此，在蛋白质和纤维水平上保护毛干对确保毛发具有健康的外观是重要的。
鉴定从毛发中提取的蛋白质片段，并将蛋白质片段类型与毛发损伤类型相关联：1)使得能够正确鉴定毛发损伤的类型，并且2)可提供设计在使用漂白剂时防止损伤的产品和/或不产生损伤的其它组合物所必需的信息。此外，鉴定特定的毛发疾病类型也是有价值的。患有毛发疾病的个体的毛发对损伤和/或处理的反应不同于正常毛发。因此，基于毛发在蛋白质水平上对特定损伤类型的响应表征何种类型的毛发疾病是可能的。
当鉴定出蛋白质片段时，也可产生由蛋白质损失得到的利用可用键的产品，具体地为专用于特定损伤类型的产品。
发明概述
本公开一般涉及通过将从毛发中提取的蛋白质片段与毛发损伤类型相关联来检测毛发损伤类型的系统和方法。
将毛发损伤类型或来源与标记蛋白质片段相关联的方法包括：产生两个相同的毛发样品：样品A和样品B；向样品A施用损伤组合物或处理剂(treatment)；向样品B施用无损伤组合物或处理剂；使用合适的溶剂样品从样品A和样品B的每个中提取所述不稳定蛋白质(liable protein)；用MALDI-MS分析得自样品A和样品B的蛋白质片段样品；比较样品A和样品B的MALDI-MS结果；通过鉴定所述存在于样品A中而不存在于样品B中的独特修饰模式(unique modification pattern)来鉴定所述标记蛋白质片段。
用于展示毛发损伤类型或来源的方法，所述方法包括：使用合适的溶剂从毛发样品中提取所述不稳定蛋白质；用MALDI-MS分析所述蛋白质片段样品；得到蛋白质片段结果；以及通过比较所述蛋白质片段结果与对于特定损伤的标记蛋白质片段列表来鉴定所述毛发损伤。
附图概述
图1：该图是漂白剂导致的损伤毛发的标记蛋白质片段的MALDI-MS结果与未损伤毛发的蛋白质片段的MALDI-MS结果的比较。
发明详述
如本文所用，“毛发”指人或动物来源的角质纤维，例如头发或睫毛。此外，如本文所用，将术语“角质蛋白质”理解为指毛发中存在的那些蛋白质。如本文所用，术语“蛋白质片段”指在角质蛋白质结构损伤后脱离的氨基酸和较大的蛋白质，它们通过静电相互作用、结合基质蛋白质和脂质的弱氢键、或者不包括混入角质蛋白质结构的任何其它力而保持在毛发结构内。
如本文所用，“标记蛋白质片段”指已经与特定毛发损伤和/或损伤处理类型相关联的蛋白质片段。
如本文所用，“洗脱物”“洗脱”等指经由接触毛发与未添加任何还原剂或萃取剂的水溶液从毛发中移除蛋白质，从而不改变角质蛋白质结构并且不中断或还原毛发样品中存在的化学键，所述化学键不是静电相互作用、结合基质蛋白质和脂质的弱氢键、或者不包括混入角质蛋白质结构的任何其它力。
如本文所用，“可洗脱的”指毛发样品中存在的蛋白质片段，其在不加入任何还原剂或萃取剂的情况下可在水溶液中从毛发结构中移除。此外，“可洗脱的”指在基本上由水组成的溶液中可移出毛发结构的蛋白质，所述溶液不中断或还原角质蛋白质结构中存在的化学键，所述化学键不是静电相互作用、结合基质蛋白质和脂质的弱氢键、或者不包括混入角质蛋白质结构的任何其它力。
已经开发了一种方法，该方法利用水溶液从毛发中提取蛋白质片段，不改变角质蛋白质结构，用于检测和展示毛发损伤。在提交于2010年5月17日的专利申请61/345,321中描述了一种此类方法。在从毛发中提取出蛋白质片段时分析该蛋白质片段。从对该蛋白质片段的分析中，鉴定毛发已经发生的损伤类型是可能的，尤其是测定毛发损伤的来源是可能的。一种此类特异性标记蛋白质片段包括当漂白毛发时产生的那些标记蛋白质片段。可使用基于抗体的检测和/或质谱仪技术测试一种毛发样品，提取蛋白质片段并测试所得蛋白质片段。在一个实施方案中使用Matrix Assisted Laser DesorptionIonization(“MALDI”)，也称为MALDI-TOF质谱仪“MALDI-MS”，来评估蛋白质片段。这种技术是质谱仪中使用的软电离技术。MALDI-MS可用于分析生物分子如肽和蛋白质以及大的有机分子如聚合物。在MALDI中，分析物首先与UV吸收基质如α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)共结晶，然后经受脉冲激光(YAG或氮激光)辐射。这引起分析物/基质结晶的蒸发/解吸并产生离子，所述离子被传送到质谱分析仪中进行检测。在MALDI-TOF中，使用了飞行时间质谱分析仪。可以MS模式获取MALDI-TOF数据，从而产生分子量信息(例如肽)，并且可使用MS/MS模式(例如肽序列/结构信息)。典型的MALDI质谱采集需要小于一分钟的时间，因此它可用于快速筛选受关注样品中的分子种类。可通过比较在不同条件下处理的样品(如原始毛发对漂白的毛发样品)中获取的质谱检测改变和分子标记。
可在发生或不发生酶消化蛋白质的情况下进行MALDI-MS。然后将蛋白质片段测试结果与已知的标记蛋白质片段库进行比较，以鉴定毛发损伤为何种类型，以及在一些情况下，毛发损伤的初始来源，即漂白。这使得能对损伤进行“指纹识别”；意指如果测试毛发样品并且所述结果包括某些标记蛋白质片段，那么所述毛发样品已经受到特定来源的损伤。
用于评估蛋白质片段的附加方法包括但不限于液相色谱法-电喷雾串联质谱，可产生对蛋白质片段的抗体并且可开发出ELISA测定法。
此外可使用iTRAQ方法，通过Applied Biosystems，Carlsbad California可用的试剂产生同位素标记与每个赖氨酸侧链和蛋白质片段游离N-末端基团的共价胺键。这使得多个样品可同时通过MALDI MS进行分析。多个样品可同时通过MALDI MS进行分析，以最小化由于测试变异性引起的测试数据的差异。
可通过用多种不同组合物或处理剂损伤毛发样品，然后通过比较所得蛋白质片段与未损伤的类似毛发样品进行分析来产生这些标记蛋白质片段的库。可通过MALDI-MS鉴定标记蛋白质片段，因为据信基于毛发遭受的损伤类型将产生相同的标记蛋白质结果。这意味着标记蛋白质片段指示毛发损伤的类型或来源。漂白引起的毛发损伤导致特定的标记蛋白质片段，UV引起的毛发损伤导致特定的标记蛋白质片段等。
据信漂白引起的毛发损伤导致蛋白质片段N-末端的+28和+71修饰，所述蛋白质片段具有以下结构：
例如图1中所示，从漂白的毛发中释放出特定的片段组并用水提取它们，这些片段不存在于未损伤的(原始毛发)样品中。各组MS峰由两个未改变的蛋白质峰(966和1568)以及对应于未修饰的蛋白质峰分子量加上28道尔顿的峰(966+28=994和1568+28=1596)组成。附加的峰由片段氨基端的化学改性导致。将对应于特征峰的蛋白质片段测序(参见表1)。用于表示蛋白质序列的字母是单字母氨基酸代码(即E=谷氨酸，I=异亮氨酸等)。这些蛋白质的附加修饰形式也能被检测出来，包括甲硫氨酸、半胱氨酸和色氨酸残基的氧化，以及天冬酰胺和谷氨酰胺残基的脱酰胺。所述蛋白质片段位于角蛋白31上，说明该蛋白质在漂白毛干时降解。
表1：漂白的毛发中的蛋白质损伤标记的实例
此外，也可使用这种方法指示是否个人的毛发对处理剂具有正常响应。例如，如果个人具有特定的毛发疾病，这个人的毛发样品可能不产生与具有“正常”响应的人相同的标记蛋白质片段。具有毛发疾病的个人相比于正常响应显现的标记蛋白质片段可产生附加的、较少的和/或甚至不同的标记蛋白质片段。毛发疾病响应的库的建立方法也可与如上所述损伤的标记蛋白质片段的库相似。因此，对这种毛发疾病的测试可包括将个人的毛发暴露于特定的损伤处理，然后通过由损伤处理产生的标记蛋白质片段鉴定毛发疾病。
在该毛发蛋白质损失测试方法的一个实施方案中，分别分析可溶的和不溶的蛋白质片段。分别分析可溶的和不溶的蛋白质片段能得到较高灵敏度的蛋白质片段检测。此外，分别分析这些蛋白质片段还可精确确定毛发损伤的位置。为了分别测量可溶的和不溶的蛋白质片段，在移除毛发纤维后，可离心水中的样品或使不溶部分与可溶部分分开。
实施例A：
1.漂白毛发以产生指示漂白损伤的标记蛋白质片段：
使用以下规程漂白毛发样品：
规程#1：
制备漂白溶液，该溶液由2%的氢氧化铵、0.2%的乙二胺四乙酸四钠(用乙酸将pH调节至10.3)、和6%的过氧化氢组成。将长毛发(棕色和自然白色)浸入漂白溶液中并置于40℃的烘箱中。在30-90分钟的时间点上，从漂白溶液中移除长毛发，在DI自来水下洗涤两分钟并干燥。
规程#2：
与规程#1相同，不同的是漂白溶液不包括过氧化氢(H2O2)。
规程#3：
与规程#1相同，不同的是漂白溶液不包含乙二胺四乙酸四钠(C10H12N2O8Na4)。
2.长毛发漂白后的蛋白质损失分析：
作为漂白处理的结果，通过测量毛发中的总蛋白质损失来评估由长毛发提供的蛋白质损伤总量。简而言之，将来自每个长发的0.2-0.3g毛发修剪成2英寸的片段并加到玻璃闪烁小瓶中。以1.0mL DI水对0.1g毛发的比率加入DI水，并将样品在涡旋平台上以2,500rpm物理搅拌60分钟。使用Lowry蛋白质定量测定法分析水提取物的总蛋白质浓度。结果总结于表2中。
3.长毛发漂白后的MALDI-TOF分析：
通过MALDI-TOF分析上述水提取物来测定经由漂白处理的长毛发提供的特定蛋白质损伤。将水提取物直接与MALDI基质溶液(溶解在1ml的80:20:0.1的乙腈：水：三氟乙酸中的5mgα-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA))混合(1∶1)。将约1uL每个样品涂布在MALDI板上并通过MALDI-TOF/TOF 4800plus系统(AB-Sciex)进行分析。在漂白的毛发的水提取物中检测到的毛发损伤蛋白质标记包括具有m/z 994/1037、1596/1639、1204、1278等的峰。注意峰1038是1037的脱酰胺形式，并且994/1037和1596/1639等峰之间的Δ质量是43Da。标记1037和1204的结果总结于表1中。
4.来自漂白的毛发的蛋白质损伤标记的测序结果：
为了鉴定在MALDI-TOF分析中观察到的标记蛋白质并对其测序，通过反相HPLC(2mm×15cm，Jupiter，C4，300A柱，HP1100系统)分离漂白的水提取物来人工收集并冻干级份。将每个级份重溶解在20μL的0.02%的三氟乙酸(TFA)/水溶液中，与MALDI基质以1:1混合，并涂布在MALDI板上用于MALDI测序。为了较完全地鉴定除了那些损伤标记之外的蛋白质/水提取物中的蛋白质，真空干燥漂白毛发的另一种水提取物并将其重溶解在50mM NH4Ac的缓冲液(pH 8)中。将10uL的胰蛋白酶(水中浓度为0.25μg/uL)加到缓冲液中并在37C孵育4小时。真空干燥胰酶消化产物并重溶解在50μL的0.02& TFA/水中，随后进行HPLC分离。收集LC级份、干燥、并通过MALDI-测序进行分析。从非胰酶级份和胰酶LC级份中收集MALDI原始数据，使用ProteinPilot软件(AB-Sciex)对蛋白质数据库进行搜索。结果总结于下文中。
在胰酶消化后，检测漂白的毛发的水提取物中的多种不同形式的毛发角蛋白。角蛋白81、85、31、86、33a、33b和83是主要的角蛋白。
检测修饰形式，其包括Met、Cys和Trp的氧化；Asn和Gln的脱酰胺；N-末端残基上的甲酰化(未修饰的序列+28da)和未知修饰(+71da，待进一步确定)。
观察到有多对蛋白质具有在水提取物中的Δ质量43da，例如994/1037和1596/1639，以及漂白的毛发的胰酶水提取物中的1513/1556、1954/1997等。这些蛋白质对可能是甲酰化(+28Da)和蛋白质N-末端的未知组成(+71Da)修饰形式的结果。这些可能的修饰形式的精确反应化学是不清楚的。可使用这些峰和对(模式)作为毛发损伤的标记。
表2：
毛发类型 Rx时间 漂白规程 蛋白质浓度(μg/mL) 标记1037 标记1204
自然白色 50分钟 规程#3 8176.3μg/mL x x
自然白色 80分钟 规程#3 26505.1μg/mL x
自然白色 90分钟 规程#3 5849.3μg/mL x x
棕色 90分钟 规程#3 230.9μg/mL
自然白色 30分钟 规程#1 876.0μg/mL xxx xxx
自然白色 60分钟 规程#1 1079.0μg/mL xxx xxx
自然白色 90分钟 规程#1 2322.8μg/mL xx xx
棕色 90分钟 规程#1 1097.8μg/mL x x
自然白色 90分钟 规程#2 503.8μg/mL x
棕色 90分钟 规程#2 330.0μg/mL
x指示标记存在
信号强度xxx>xx>x
实施例B：
已经证明暴露于紫外线时对毛发纤维的损伤，包括损伤机械特性、形态学损伤和蛋白质损失。通过UV引起特异性蛋白质降解，从而经由下述方法检查毛发UV损伤的肽标记。
1.毛发暴露于紫外线(UV)辐射以产生标记蛋白质片段，它们指示UV 造成的损伤：
规程：长毛发(一般人群的棕色毛发)在Atlas Ci3000+Xenon ArcFade-Ometer中暴露于紫外线至多75h，辐射率设置为在420nm处1.48W/m2，室温为35℃，并且相对湿度为80%。根据用制造商(Atlas Material TestingTechnology LLC)提供的Outdoor to Xenon Radiant Energy Conversion程序进行的计算，在这些条件下一小时的紫外线曝光大约等同于在Florida暴露于外部阳光7.5小时。
2.UV处理后的长毛发蛋白质损失分析：(注意：这是与用于漂白的毛 发的规程相同的规程)
作为暴露于UV的结果，通过测量毛发中的总蛋白质损失来评估由长毛发提供的蛋白质损伤总量。简而言之，将来自每个长毛发的0.2-0.3g毛发修剪成2英寸的片段并加到玻璃闪烁小瓶中。以1.0mL DI水对0.1g毛发的比率加入DI水，并将样品在涡旋平台上以2,500rpm物理搅拌60分钟。使用Lowry蛋白质定量测定法分析水提取物的总蛋白质浓度。结果总结于表3中。
3.长毛发UV处理后的MALDI-TOF分析：
通过MALDI-TOF分析上述水提取物来测定由暴露于UV的长毛发提供的特定蛋白质损伤。将水提取物直接与MALDI基质溶液(溶解在1mL的80:20:0.1的乙腈：水：三氟乙酸中的5mgα-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA))混合(1∶1)。将约1uL的每个样品涂布在MALDI板上并通过MALDI-TOF/TOF4800plus系统(AB-Sciex)进行分析。用m/z 1278检测水提取物中由UV造成的毛发损伤的蛋白质标记。虽然在漂白的毛发提取物中也检测到低水平的这种标记，但该标记在UV损伤后较为丰富并且是在UV损伤毛发后发现的主要的低分子量片段。也发现这种标记在消费者相关的暴露范围内随着紫外线曝光的量而增加(表3)。
表3：
本文所公开的量纲和值不旨在被理解为严格地限于所述的精确值。相反，除非另外指明，每个上述尺寸旨在表示所述值以及该值附近的函数等效范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。
除非明确地不包括在内或换句话讲限制，本文所引用的每篇文献，包括任何交叉引用的或相关的专利或专利申请，均特此以引用方式全文并入本文。任何文献的引用不是对其作为本文所公开的或受权利要求书保护的任何发明的现有技术，或者其单独地或者与任何其它参考文献的任何组合，或者参考、提出、建议或公开任何此类发明的认可。此外，当本发明中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文件中术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本发明中赋予该术语的含义或定义。
尽管已用具体实施方案来说明和描述了本发明，但是对那些本领域的技术人员显而易见的是，在不背离本发明的精神和范围的情况下可作出许多其它的改变和变型。因此，所附权利要求书中旨在涵盖本发明范围内的所有这些改变和变型。

Claims (5)

1.一种将毛发损伤类型或来源与标记蛋白质片段相关联的方法，所述方法包括：
a)产生两种相同的毛发样品：样品A和样品B；
b)向样品A施用损伤组合物或处理剂；向样品B施用无损伤组合物或处理剂；
c)使用合适的溶剂样品从样品A和样品B的每个中提取不稳定蛋白质；
d)用MALDI-MS分析来自样品A和样品B的蛋白质片段样品，其中分别分析可溶的和不溶的蛋白质片段；
e)比较样品A和样品B的MALDI-MS结果；
f)通过鉴定存在于样品A中而不存在于样品B中的独特修饰模式来鉴定所述标记蛋白质片段；
其中步骤c)包括经由接触毛发与未添加任何还原剂或萃取剂的水溶液从毛发中移除蛋白质。
2.如权利要求1所述的方法，其中MALDI-MS在蛋白质的酶消化后进行。
3.如权利要求1所述的方法，其中MALDI-MS在不发生蛋白质的酶消化的情况下进行。
4.一种用于展示毛发损伤类型或来源的方法，所述方法包括：
a)使用合适的溶剂从毛发样品中提取不稳定蛋白质；
b)用MALDI-MS分析所述蛋白质片段样品，其中分别分析可溶的和不溶的蛋白质片段；得到蛋白质片段结果；
c)通过比较所述蛋白质片段结果与对于特定损伤的标记蛋白质片段列表来鉴定所述毛发损伤；
其中步骤a)包括经由接触毛发与未添加任何还原剂或萃取剂的水溶液从毛发中移除蛋白质。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述MALDI-MS蛋白质片段结果包括对蛋白质片段的N-末端的+28Da和+71Da修饰，所述MALDI-MS蛋白质片段结果具有以下结构：
CN201180024698.5A 2010-05-17 2011-05-17 经由评估蛋白质片段检测并展示毛发损伤的系统和方法 Active CN102893160B (zh)

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