DE102006060154A1

DE102006060154A1 - Verfahren zur molekularen Charakterisierung von ergrautem und pigmentiertem Haar

Info

Publication number: DE102006060154A1
Application number: DE200610060154
Authority: DE
Inventors: Melanie Dr. Giesen; Olaf Dr. Holtkötter; Dirk Dr. Petersohn
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2006-12-18
Filing date: 2006-12-18
Publication date: 2008-06-19
Also published as: WO2008074595A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur molekularen Charakterisierung von ergrautem und pigmentiertem menschlichen Haar in vitro sowie ein Haarbehandlungsmittel, enthaltend mindestens eine Verbindung, die die Expression mindestens eines der in ergrauten menschlichen Haarfollikeln und in pigmentierten menschlichen Haarfollikeln differentiell exprimierten Gene positiv oder negativ zu beeinflussen vermag.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur molekularen Charakterisierung von ergrautem und pigmentiertem Haar bei Menschen sowie ein Haarbehandlungsmittel, enthaltend mindestens eine Verbindung, die die Expression mindestens eines der in ergrauten Haarfollikeln und in pigmentierten Haarfollikeln differentiell exprimierten Gene positiv oder negativ zu beeinflussen vermag.
Die Ursachen für Haarergrauung sind bislang nur unzureichend untersucht. Es gibt verschiedene theoretische Ansätze, deren Zusammenhänge bisher aber weitestgehend unklar bleiben. Als Gründe für die Haarergrauung werden beispielsweise fehlende Tyrosinaseaktivität, suboptimale Melanozyten-Keratinozyten-Interaktion oder oxidativer Stress diskutiert. Einige Theorien gehen zudem von einer unzureichenden Nachlieferung aktiver Melanozyten aus dem Stammzellreservoir aus, die zu fehlender Pigmentierung führen soll.
Der Stand der Technik beschreibt dabei vor allem isolierte Einzeluntersuchungen, die dem gesamten Kontext der komplexen Vorgänge während der Haarergrauung nicht gerecht werden. Zum anderen handelt es sich in der Regel um Untersuchungen an der Maus. Da sich der Haarzyklus der Maus jedoch stark von dem des Menschen unterscheidet, die Haarpigmentierung aber fest an den Haarzyklus gekoppelt zu sein scheint, kann auch davon ausgegangen werden, dass es signifikante Unterschiede in den Ergrauungsmechanismen gibt. Darüber hinaus sind verschiedene Proteine an der Farbgebung des Mausfells beteiligt, die kein funktionales menschliches Homolog haben. Die umfassende Untersuchung der molekularen und zellphysiologischen Gründe für die phänotypischen Veränderungen während des Ergrauungsprozesses beim Menschen sowie die Analyse von geschlechtsspezifischen Unterschieden fehlen daher weitestgehend.
Die Pigmentierung im Haarfollikel wird durch ein definiertes komplexes Set molekularer Signale gesteuert. Da die Melanogenese in ergrauten Follikeln offensichtlich beeinflusst ist, kann davon ausgegangen werden, dass im ergrauten Follikel Teile dieses Netzwerkes in ihrer Funktion modifiziert sind. Welche Komponenten wie reguliert sind ist für den humanen Follikel jedoch noch weitestgehend unbekannt.
Die Regulation der Melanogenese und damit der Pigmentierung im Haarfollikel unterliegt einem komplizierten Zusammenspiel unterschiedlicher Liganden, Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren und Effektorgenen. Soll durch die Anwendung einer kosmetischen oder pharmakologischen Formulierung die Pigmentierung moduliert werden, so ist es zunächst von Bedeutung, die globalen Zusammenhänge zwischen den Signalen und ihre Regulation zu begreifen, damit später gezielt auf die entsprechenden molekularen Steuermoleküle eingewirkt werden kann.
Bisher sind die Veränderungen, die zum Ergrauen des Haares führen, nur teilweise und bruchstückhaft untersucht. Die umfassende Untersuchung der globalen molekularen und zellphysiologischen Zusammenhänge für die phänotypischen Veränderungen während des Ergrauungsprozesses beim Menschen fehlen. Statt dessen werden oft einfache in vitro Zellkulturen eingesetzt, die die tatsächliche in vivo Situation nur eingeschränkt Wiederspiegeln.
Da es bisher keine hochentwickelten dreidimensionalen Zellkulturmodelle gibt, kann in diesen Einzelzellkulturen der Komplexität des menschlichen Haarfollikels kaum Rechnung getragen und globale Zusammenhänge können nur unzureichend beschrieben werden. Die meisten Studien zur Untersuchung molekularer Mechanismen der Haarergrauung in vivo lassen sich derzeit nur mit Hilfe von Versuchtieren, z. B. Mäusen durchführen. D.h. die bisherigen Erkenntnisse hinsichtlich der Ursachen der Haarergrauung beruhen auf murinen Daten. Dass solche Daten nicht uneingeschränkt auf humane Haarfollikel übertragen werden können, zeigt sich bereits durch die unterschiedliche Expression einiger, bei der Maus an der Pigmentierung beteiligten Proteine. Agouti Protein beispielsweise ist im tierischen Organismus einer der wichtigsten Modulatoren und Inhibitoren der Melaninsythese im Haarfollikel, dies gilt jedoch nicht für den Menschen (Slominski et al (2005) J Investig Dermatol 124:13-21). Agouti Protein ist sowohl für die Intensität der Pigmentierung als auch für den Typus Melanin, der gebildet wird verantwortlich. Seine Expression in der Maus führt zu einem spezifischen Fellmuster aus gelben Bändern im ansonsten schwarzen Haar. Die Expression von humanen Agouti Protein in transgenen Mäusen führt zu einer kompletten Gelbfärbung des Fells, obwohl kein Fall von einer solchen Färbung beim Menschen bekannt ist (Slominski et al. (2004) Physiol Rev. 84:1155-228). Dies zeigt die Bedeutung der Verwendung humaner Follikel bei der Ursachenforschung der Haarergrauung.
Eine umfassende Charakterisierung von ergrautem und pigmentiertem Haar ist bislang aus dem Stand der Technik nicht bekannt.
Das bruchstückhafte Verständnis der molekularen Mechanismen, die bei der Haarergrauung bedeutsam sind, führt zu einer unzureichenden Anzahl von Targets, die für eine biologische Einflussnahme auf den Haarfollikel zur Verfügung stehen. Daher werden bisher nicht die Ursachen der Haarergrauung bekämpft, sondern die Haare zur Grauabdeckung mit Hilfe von chemischen, oft aggressiven und damit das Haar schädigenden Colorationen behandelt. Die Wirksamkeit der zur Zeit vereinzelt auf dem Markt befindlichen biologischen Produkte ist wissenschaftlich nicht erwiesen und oft zweifelhaft. Signifikant wirksame, biologisch aktive Wirkstoffe, die den Ergrauungssprozess direkt an der Wurzel beeinflussen, kommen aufgrund fehlender Targets nicht zum Einsatz.
Durch geeignete Wirkstoffformulierungen die Pigmentierung und damit Jugendlichkeit der Haare zu erhalten ist somit eine Herausforderung für die kosmetische Forschung und Entwicklung.
Es besteht daher ein Bedarf an der Identifikation möglichst vieler, vorzugsweise aller, für Ergrauungsprozess im menschlichen Haarfollikel wichtigen Gene.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen möglichst großen Teil der für die Ergrauung der menschlichen Haarfollikel bedeutsamen Gene zu identifizieren.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur molekularen Charakterisierung von menschlichem ergrautem und pigmentiertem Haar, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man

a) ein erstes Gemisch von in ergrauten menschlichen Haarfollikeln exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus ergrauten menschlichen Haarfollikeln gewinnt,
b) ein zweites Gemisch von in pigmentierten menschlichen Haarfollikeln exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus pigmentierten menschlichen Haarfollikeln gewinnt und
c) die in a) und b) gewonnenen Gemische einer differentiellen Analyse der Genexpression unterwirft, und dadurch die Gene identifiziert, die in ergrauten bzw. pigmentierten Haarfollikeln unterschiedlich stark (differentiell) exprimiert werden.

Einzelnen gezupften humanen Haarfollikeln haftet ausreichend biologisches Material an, um relevante Parameter, die gegebenenfalls bei der Haarergrauung eine Rolle spielen, auf zellulärer Ebene zu erfassen. Das anhaftende biologische Material besteht aus Zellen der äußeren Bindegewebsscheide (CTS-Fibroblasten), Keratinozyten der äußeren und inneren Wurzelscheide (ORS- und IRS-Keratinozyten), Matrix- und Wurzelscheidenmelanozyten sowie Matrixkeratinozyten. Makroskopische Veränderungen der Pigmentierung des Haares sind unmittelbare Folgen einer Modulation von Genen, Proteinen und Stoffwechselprodukten in den Haarfollikelzellen. Durch die molekulare Analyse von ergrauten Haarfollikeln gegenüber pigmentierten Haarfollikeln kann eine umfassende Charakterisierung der ergrauungsbedingten Veränderungen im Haarfollikel durchgeführt und neue Targets und Signalwege können so identifiziert werden, die die Depigmentierung entscheidend beeinflussen. Durch die Analyse und Quantifizierung der bei der Haarergrauung auftretenden zellulären Effekte können somit Rückschlüsse auf die zu erwartenden makroskopischen Veränderungen des Haares gezogen werden, bevor sich diese im sichtbaren Haarschaft manifestieren. Die globalen Steuerungsmechanismen auf Genebene unter Berücksichtigung des zellulären Zusammenspiels der verschiedenen Zelltypen lassen sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren direkt bestimmen. Mittels verschiedener proteinanalytischer Methoden wie beispielsweise Westernblot oder Proteinarray können die pigmentierungsrelevanten Marker Marker auch auf Proteinebene bestimmt und ergrauungsabhängige Effekte auf das Proteinexpressionsmuster untersucht werden.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es vorteilhafterweise möglich, den komplexen Prozess der Haarergrauung und die kausalen Zusammenhänge der Veränderungen am ergrauten Haar zu begreifen. Nur mit diesem Wissen können neue Konzepte für kosmetische Haar-Produkte entwickelt werden, die ihre Wirkung auf das breite Spektrum der Genexpression im ergrauten Haarfollikel ausüben. Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführte differentielle Analyse zeigt erstmals in umfassender Weise, welche Gene in ergrautem und pigmentiertem Haar exprimiert werden, und welche Gene in ergrautem Har anders exprimiert werden als in pigmentiertem Haar.
Erst durch die systematische und umfassende Identifizierung der während der Haarergrauung modifizierten zellulären Prozesse wird die gezielte Entwicklung biologisch aktiver Haarpflegeprodukte, die die Haarergrauung wirksam bekämpfen, ermöglicht.
Vorteilhafterweise ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren somit erstmals eine umfassende systematische Identifikation der pigemtierungsrelevanten Veränderungen im Haarfollikel sowie eine Beschreibung des Gen- und Proteinexpressionsstatus humaner ergrauter versus pigmentierter Haarfollilkel durch Quantifizierung relevanter Proteine und mRNA mit erfindungsgemäß geeigneten Kits oder Methoden.
Die vorliegende Erfindung leistet auch einen Beitrag zur Aufklärung der mechanistischen Zusammenhänge der Pigmentierung und Haarergrauung in vivo im komplexen Zellverband des humanen Haarfollikels und zur Identifikation von Zielparametern zur effektiven biologischen Verhinderung der Haarergrauung und zur Re-Pigmentierung Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt in der Möglichkeit zur Entwicklung bzw. Evaluierung von Wirkstoffen und deren Effekte auf eine Vielzahl von Markern im Haarfollikel, die für ergrauungsbedingten Veränderungen im Haarfollikel charakteristisch sind, durch Quantifizierung der Expression von Markergenen und -proteinen mit erfindungsgemäß geeigneten Kits oder Methoden.
Vorzugsweise erhält man die in den Schritten a) und b) zu gewinnenden Gemische aus Haarfollikeln behaarter Kopfhaut.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die Untersuchung in Schritt c) mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter

i. Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese
ii. Affinitätschromatographie
iii. Protein-Protein-Komplexierung in Lösung
iv. ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
v. enzymgekoppelte Stoffwechselassays
vi. Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MAIDI),
vii. Einsatz von Proteinchips, Northern Blots,
viii. Real Time Quantitative Polymerasekettenreaktion (RT-PCR),
ix. Multiplex-PCR,
x. RNase-Schutzexperimente,
xi. Dot-Blots,
xii. CDNA-Sequenzierung,
xiii. Klon-Hybridisierung,
xiv. Differential Display,
xv. Subtraktive Hybridisierung,
xvi. cDNA-Fragment-Fingerprinting,
xvii. Durchflusszytometrieanalysen,
xviii. Serielle Analyse der Genexpression (SAGE) und insbesondere
xix. Einsatz von Nukleinsäurechips, • oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.

Besonders bevorzugt ist im Sinne der vorliegenden Erfindung die Quantitative Real Time Polymerasekettenreaktion (RT-PCR). Die RT-PCR ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) beruht, und zusätzlich die Möglichkeit der Quantifizierung bietet. Die Quantifizierung wird mit Hilfe von Fluoreszenz-Messungen am Ende bzw. während eines PCR-Zykluses durchgeführt und unterscheidet sich somit von anderen quantitativen PCR-Methoden (qPCR), die erst nach Ablauf der PCR quantitativ ausgewertet werden (z. B. Kompetitive PCR). Die Fluoreszenz nimmt proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu, was eine Quantifizierung möglich macht. Eine Gelelektrophoretische Auftrennung der Fragmente ist nicht nötig, die Daten sind sofort verfügbar und das Kontaminationsrisiko ist vorteilhafterweise gering („A-Z of Quantitative PCR" IUL Biotechnology Series, ed. by Stephen A. Bustin).
Zur Erfassung der differentiellen Genexpression ergrauter bzw. pigmentierter Haarfollikel können aber auch andere dem Fachmann bekannten Methoden eingesetzt werden, beispielsweise die Technik der _"Seriellen Analyse der Genexpression" (SAGE^TM). Diese Technik erlaubt gleichzeitig die Identifikation und Quantifizierung aller in ergrauten bzw. pigmentierten Haarfollikeln exprimierten Gene. Die Analyse der Genexpression ist auch mit der Quantifizierung spezifischer mRNA-Moleküle möglich (z. B. Northern-Blot, RNase-Schutzexperimente). Außerdem können die Techniken MPSS (Massive Parallel Signiture Sequencing) oder Techniken, die auf Differential display beruhen, erfindungsgemäß eingesetzt werden.
Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Methoden sind in den Übersichtsartikeln von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837-846 (2000), und „Genomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788, 827-836 (2000), und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Zur Erfassung der differentiellen Genexpression ergrauter bzw. pigmentierter Haarfollikel kann erfindungsgemäß auch die Analyse mittels Ganzgenom-Microarray eingesetzt werden, beispielsweise der Whole Human Genome Microarray der Firma Agilent eingesetzt. Dieser umfasst ca. 34.000 Gene.
Die 2D-Gelelektrophorese wird beispielsweise in L.D. Adams, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the Isodalt System oder in L.D. Adams & S.R. Gallagher, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell System; beide in Current Protocols in Molecular Biology (1997, Eds. F.M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1-10.4.13; oder in 2-D Electrophoresis-Manual; T. Berkelman, T. Senstedt; Amersham Pharmacia Biotech, 1998 (Bestell-Nr. 80-6429-60), beschrieben.
Die massenspektrometrische Charakterisierung der Proteine oder Proteinfragmente erfolgt in der Fachwelt bekannter Weise, beispielsweise wie in den folgenden Literaturstellen beschrieben:
Methods in Molecular Biology, 1999; Vol 112; 2-D Proteome Analysis Protocols; Editor: A. J. Link; Humana Press; Totowa; New Jersey. Darin insbesondere: Courchesne, P. L. und Patterson, S. D.; S. 487-512.
Carr, S. A. und Annan, R. S.; 1997; in: Current Protocols in Molecular Biology; Editor: Ausubel, F. M. et al.; John Wiley and Sons, Inc. 10.2.1-10.21.27.
Es können jedoch erfindungsgemäß auch andere dem Fachmann bekannte Methoden zur Erfassung der differentiellen Genexpression ergrauter bzw. pigmentierter Haarfollikel eingesetzt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken.
Beispiele:
Beispiel 1: An der Melanogenese beteiligte Liganden
Die Regulation der Melanogenese und damit der Pigmentierung im Haarfollikel unterliegt einem komplizierten Zusammenspiel unterschiedlicher Liganden, Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren und Effektorgene. Da die Melanogenese in ergrauten Follikeln offensichtlich beeinflusst ist, kann davon ausgegangen werden, dass im ergrauten Follikel Teile dieses Netzwerkes in ihrer Funktion modifiziert sind. Welche Komponenten wie reguliert sind ist für den Menschen jedoch noch weitestgehend unbekannt. Am Anfang der Signalkette stehen die Liganden. Daher wurde die Expression von SCF (Stem cell Factor), dem Liganden des Rezeptors c-kit, in gezupften ergrauten und pigmentierten Haarfollikel mit Hilfe eines quantitativen Real-Time-PCR-Verfahrens untersucht. Aus der Literatur ist bekannt, dass SCF eine Rolle bei der Melanogenese in murinen Haarfollikeln spielt. Die Bedeutung von SCF für den humanen Follikel und seine Regulation im ergrauten Haar ist bisher jedoch unbekannt.
Jeweils 15 graue und 15 pigmentierte Haarfollikel wurden von jeweils einem Probanden entnommen und die RNA mit Hilfe des RNeasy Mini Kits der Fa. Qiagen jeweils getrennt isoliert. Zur Durchführung der PCR wurde die RNA anschließend mittels reverser Transkription in cDNA umgeschrieben. Bei der anschließenden PCR Reaktion, die mit Hilfe genspezifischer Primer für die jeweiligen Haarkeratine durchgeführt wird und die der Amplifikation der gesuchten Genabschnitte dient, wird die Bildung der PCR-Produkte online über ein Fluoreszenzsignal detektiert. Das Fluoreszenzsignal ist dabei proportional zur Menge des gebildeten PCR-Produktes. Je stärker die Expression eines bestimmten Gens ist, desto größer ist die Menge an gebildetem PCR-Produkt und um so höher ist das Fluoreszenzsignal. Üblicherweise kann bei einer Expressionsänderung um den Faktor 1,8 der Kontrolle von einer echten Regulation ausgegangen werden. Sowohl die RNA aus den grauen als auch aus den pigmentierten Follikeln wurde in Pools aus jeweils 2-4 Probanden unterteilt (insgesamt 23 Probanden in 8 Pools), wobei die Expressionsänderung im ergrauten Follikel durch Normierung auf die entsprechende pigmentierte Kontrollgruppe berechnet wurde.
Gezeigt ist in Tabelle 1 die differentielle Genexpression der Probandenpools (Expression in grauen Follikeln bezogen auf die entsprechenden pigmentierten Follikel).

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

SCF 1,64 1,02 1,22 1,84 –1,66 –1,14 –2,11 3,02

(Tabelle 1)
Darüber hinaus wurden die Ergebnisse auf Proteinebene mit Hilfe immunhistologischer Färbungen in grauen und pigmentierten Haaren bestätigt (1 und 2). Die Ergebnisse verdeutlichen, dass SCF durch die Haarergrauung vermutlich nicht beeinflusst wird.
Ein weiterer wichtiger melanogenese-assoziierter Ligand ist α-MSH (alpha melanocyte stimulating hormone). Da α-MSH als ein Spaltprodukt eines größeren Proteinkomplexes in den Zellen vorliegt, kann sein Gehalt nicht mit Hilfe der RT-PCR bestimmt werden. α-MSH wurde daher auf Proteinebene mittels immunhistologischer Färbungen in grauen und pigmentierten Follikeln nachgewiesen (3 und 4). Die Ergebnisse zeigen, dass α-MSH durch die Haarergrauung vermutlich nicht beeinflusst wird.
Beispiel 2: Rezeptoren
Die an der Melanogenese beteiligten Liganden wie SCF oder α-MSH (Melanocyte Stimulating Hormone alpha) binden an verschiedene Rezeptoren, durch die das entsprechende Signal ins Zellinnere weitergeleitet wird. Der Rezeptor für SCF ist c-kit, der Rezeptor für α-MSH ist MCR-1 (Melanocortin Rezeptor 1). Die Expression von c-kit und MCR-1 wurde mittels des in Beispiel 1 beschriebenen Real Time PCR-Verfahrens untersucht. Die Proteinexpression von c-kit wurde mittels Western Blot analysiert. Die Expressionsänderung im ergrauten Follikel wurden durch Normierung auf die entsprechende pigmentierte Kontrollgruppe berechnet.
Gezeigt ist in Tabelle 2 die differentielle Genexpression der Probandenpools (Expression in grauen Follikeln bezogen auf die entsprechenden pigmentierten Follikel).

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

c-kit –2,23 –18,28 –10,34 –11,13 –10,56 –6,26 –22,73 –22,06

MCR1 1,17 –3,71 –1,91 –1,85 –3,83 –3,29 –3,46 –1,74

(Tabelle 2)
Tabelle 3 zeigt die differentielle Proteinexpression der Probandenpools (Expression in grauen Follikeln bezogen auf die entsprechenden pigmentierten Follikel)

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

c-kit - -3,53 –3,38 –2,88 4,47 –16,71 –3,83 –1,29

(Tabelle 3)
Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl auf Gen- als auch auf Proteinebene die Expression von c-kit in depigmentierten Haarfollikeln signifikant gegenüber den pigmentierten Follikeln verringert ist. Für MCR-1 konnte ebenfalls eine signifikante Repression in ergrauten gegenüber pigmentierten Follikeln nachgewiesen werden. c-kit und MCR-1 sind damit wichtige potentielle Parameter zur Beeinflussung der Haarergrauung.
Beispiel 3: Transkriptionsfaktoren
Transkriptionsfaktoren sind Proteine, die für die Initiation der RNA-Polymerase bei der Transkription von Bedeutung ist. Außerdem sind sie bei der Regulation der Elongation und Termination beteiligt. Dabei binden Transkriptionsfaktoren die DNA und aktivieren bzw repremieren so den entsprechenden Promotor. Daneben gibt es weitere Transkriptionsfaktoren, die nicht direkt an die DNA, sondern zum Beispiel an andere DNA-bindende Proteine binden. Ein in Mäusen beschriebener melanogenese-assoziierter Transkriptionsfaktor ist MITF (Microphthalmia transcription factor). Darüber hinaus spielen die Transkriptionsfaktoren Pax3, Sox10 und β-catenin in murinen Systemen eine Rolle. Die Expression von MITF, Pax3 und Sox10 wurde mittels des in Beispiel 1 beschriebenen Real Time PCR-Verfahrens untersucht. Die Expressionsänderung im ergrauten Follikel wurden durch Normierung auf die entsprechende pigmentierte Kontrollgruppe berechnet. Die Proteinexpression von MITF wurde mittels immunhistochemischer Färbungen an grauen und pigmentierten Follikeln untersucht. Die Proteinexpression von β-catenin wurde mittels Western Blot analysiert.

Gezeigt ist in Tabelle 4 die differentielle Genexpression der Probandenpools (Expression in grauen Follikeln bezogen auf die entsprechenden pigmentierten Follikel).

	P1	P2	P3	P4	P5	P6	P7	P8
MITF	–1,2	–1,1	–1,2	1,23	–1,1	–1,0	–1,2	–1,1
Pax3	–22,0	–30,9	–36,6	–13,0	–24,4	–42,2	–6,37	-39,8
Sox10	–5,4	–32,7	–22,5	–12,3	–5,9
β-catenin	–1,0	1,0	–1,1	1,3	–1,8	–1,2	–1,0	–1,0

(Tabelle 4)

Die 5 und 6 zeigen MITF als immunhistologische Färbung an pigmentierten und grauen Follikeln.
Gezeigt ist in Tabelle 5 die Proteinexpression der Probandenpools (Expression in grauen Follikeln bezogen auf die entsprechenden pigmentierten Follikel).

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

β-catenin –1,1 1,0 –1,0 –1,2 –1,2 –1,1 –1,3 1,2

(Tabelle 5)
Die Ergebnisse zeigen, dass die Transkriptionsfaktoren MITF, Sox10 sowie Pax3 am Ergrauungsprozess beteiligt sind. Dabei ist zu berücksichtigen, dass die Regulation von MITF nicht auf Genexpressionsebene erfolgt, sondern entweder posttranslational z. B. durch Beeinflussung der Stabilität von MITF oder durch direkte Effekte auf die Translation. β-catenin ist nicht vom Ergrauungsprozess betroffen.
Beispiel 4: Effektorgene
Durch die vorausgeschaltete Kaskade von Liganden, Rezeptoren und Transkriptionsfaktoren wird die Expression der Effektorgene beeinflusst. Im Fall der Melanogenese sind dies beispielsweise TRP1 (Tyrosinase related Protein 1) und TRP2, beides Enzyme, die an der Verstoffwechselung von Tyrosin zu Melanin beteiligt sind, gp100, ein in der Membran von Melanosomen lokalisiertes Protein oder MART1 (Melanoms Antigen Recognized by T cells 1), welches eine wichtige Rolle für die Funktionalität (z. B. Stabilität) von gp100 spielt.
Die Expression von TRP1, TRP2, gp100 und MART1 wurde mittels des in Beispiel 1 beschriebenen Real Time PCR-Verfahrens untersucht. TRP2 wurde in den Haarfollikeln darüber hinaus auch auf Proteinebene mittels Western Blot analysiert. TRP1, gp100 und MART1 wurden immunhistologisch an grauen und pigmentierten Follikeln untersucht.

Gezeigt ist in Tabelle 6 die differentielle Genexpression der Probandenpools (Expression in grauen Follikeln bezogen auf die entsprechenden pigmentierten Follikel).

		P1	P2	P3	P4	P5	P6	P7	P8
TRP1		–2,1	–52,1	–15,2	–291,3	–15,7	–22,5	–97,7	–103,7
TRP2		–1,2	–3,5	1,1	–1,2	1,1	–1,8	–1,7	2,2
gp100		–2,9	–33,9	–12,0	–30,6	–23,5	–18,4	–39,1	-23,9
MART1	–44,2	–144,7	–90,1	–159,2	–248,8	–117,4	–172,4	–66,7

(Tabelle 6)

Tabelle 7 zeigt die differentielle Proteinexpression der Probandenpools (Expression in grauen Follikeln bezogen auf die entsprechenden pigmentierten Follikel)

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

TRP2 –6,13 –32,00 1,18 –2,33 –1,11 –1,44 –1,66 –24,63

(Tabelle 7)
Die 7-12 zeigen TRP1, gp100 sowie MART1 in einer immunhistologischen Färbung in pigmentierten und grauen Follikeln.
Beispiel 5: cDNA Microarray Daten
Um die molekularen Veränderungen im ergrauten Haarfollikel umfassend zu charakterisieren, sowie zusammenhängende Pathways und mögliche Targets zu identifizieren, wurde die Genexpression mit Hilfe eines cDNA Microarrays untersucht.

Die Ganzgenomanalyse ergab ein Set an Regulationen im ergrauten Follikelwobei Tabelle 8 die 30 am stärksten differentiell expremierten Gene zeigt.

Sequence Name(s)	Log2 Ratio	P-value	Accession #	Sequence Description
TYRP1	–5,90	0	NM_000550	tyrosinase-related protein 1 (TYRP1)
MLANA	–4,95	0	NM_005511	melan-A (MLANA)
THC2100046	–4,75	4,25E-42	THC2100046	Myelin gene expression factor 2, partial (10%)
TYR	–4,72	0	NM_000372	tyrosinase (oculocutaneous albinism IA) (TYR)
KRTHA7	3,68	6,43E-20	NM_003770	keratin, hair, acidic, 7 (KRTHA7)
				v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral
KIT	–3,30	0	NM_000222	oncogene homolog (KIT)
SILV	–2,97	0	NM_006928	silver homolog (mouse) (SILV)
CSAG2	2,34	0,00002	NM_004909	taxol resistance associated gene 3 (TRAG3)
RNF28	–2,20	7,60E-38	NM_032588	ring finger protein 28 (RNF28)
C16orf30	–2,18	0	NM_024600	hypothetical protein FLJ20898 (FLJ20898)
GJB1	–2,11	0,00016	NM_000166	gap junction protein, beta 1,32 kDa
				AV656516 AV656516 GLC cDNA clone
THC2230388	1,77	0,00031	THC2230388	GLCES607 3'
THC2058421	1,74	3,62E-08	THC2058421	Unknown transient receptor potential cation channel,
TRPM1	–1,71	6,71E-19	NM_002420	subfamily M, member 1 (TRPM1)
GPR143	–1,64	2,80E-45	NM_000273	G protein-coupled receptor 143 (GPR143)
				AGENCOURT_6414428 NIH_MGC_72 cDNA
BM459062	–1,64	9,15E-18	BM459062	clone IMAGE:5557378 5'
MC1R	–1,64	0,00067	NM_002386	melanocortin 1 receptor (alpha melanocyte stimulating hormone receptor) (MC1R)
EDNRB	–1,56	0	NM_003991	endothelin receptor type B (EDNRB), transcript variant 2
C17	–1,51	1,55E-06	NM_018659	cytokine-like protein C17 (C17)
A_24_P843335	1,51	0,00004	A_24_P843335	Unknown
				paired box gene 3 (PAX3), transcript variant
PAX3	–1,49	3,69E-38	NM_181458	PAX3D
RUNX3	–1,48	1,38E-09	NM_004350	runt-related transcription factor 3 (RUNX3
PLP1	–1,47	1,03E-11	M54927	Human myelin proteolipid protein mRNA
				S100 calcium binding protein, beta (neural)
S100B	–1,41	9,75E-09	NM_006272	(S100B)
ZNF258	–1,36	0,00012	NM_007167	zinc finger protein 258 (ZNF258)
RGS1	–1,33	1,09E-09	NM_002922	regulator of G-protein signalling 1 (RGS1)
LPPR4	–1,31	1,45E-21	NM_014839	plasticity related gene 1 (LPPR4)
A_32_P22245	1,30	0,00004	A_32_P22245	Unknown
THC2113405	1,30	0,00002	THC2113405	ALU2_HUMAN (P39189)
OLFM1	–1,27	9,29E-10	NM_006334	olfactomedin 1 (OLFM1), transcript variant 2

Davon werden folgende Parameter als hochrelevant eingestuft:

Sequence	Log2
Name(s)	Ratio	Accession #	Sequence Description
Melanogenese
TYRP1	–5,9	NM_000550	tyrosinase-related protein 1 (TYRP1)
MLANA	–4,95	NM_005511	melan-A (MLANA)
TYR	–4,72	NM_000372	tyrosinase (oculocutaneous albinism IA) (TYR)
			v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral
KIT	–3,3	NM_000222	oncogene homolog (KIT)
SILV	–2,97	NM_006928	silver homolog (mouse) (SILV)
RNF28	–2,2	NM_032588	ring finger protein 28 (RNF28)
GJB1	–2,11	NM_000166	gap junction protein, beta 1, 32kDa
			transient receptor potential cation channel, subfamily
TRPM1	–1,71	NM_002420	M, member 1 (TRPM1)
GPR143	–1,64	NM_000273	G protein-coupled receptor 143 (GPR143)
			melanocortin 1 receptor (alpha melanocyte
MC1R	–1,64	NM_002386	stimulating hormone receptor) (MC1R)
			endothelin receptor type B (EDNRB), transcript
EDNRB	–1,56	NM_003991	variant 2
PAX3	–1,49	NM_181458	paired box gene 3 (PAX3), transcript variant PAX3D
S1006	–1,41	NM_006272	S100 calcium binding protein, beta (neural) (S1006)
Signaltransduktion
RGS1	–1,33	NM_002922	regulator of G-protein signalling 1 (RGS1)
C17	–1,51	NM_018659	cytokine-like protein C17 (C17)
Transkription
RUNX3	–1,48	NM_004350	runt-related transcription factor 3 (RUNX3
Cytoskelett
KRTHA7	3,68	NM_003770	keratin, hair, acidic, 7 (KRTHA7)
Unbekannte Gene
THC2058421	1,74	THC2058421	Unknown
A_24_P843335	1,51	A_24_P843335	Unknown
A_32_P22245	1,3	A_32_P22245	Unknown

(Tabelle 9)

Aus diesen Daten lässt sich unter anderem das in 13 dargestellte Netzwerk ableiten, wobei die schwarz umrahmten Parameter in ergrauten Follikeln repremiert sind, die nicht umrahmten nicht reguliert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Haarbehandlungsmittel, enthaltend mindestens einen Wirkstoff, der die Expression mindestens eines der in ergrauten Haarfollikeln und in pigmentierten Haarfollikeln differentiell exprimierten Gene positiv oder negativ zu beeinflussen vermag.
Erfindungsgemäß bevorzugte Gene sind ausgewählt unter Tyrosinase, Tyrosinase related Protein 1, Tyrosinase related Protein 2, Melanocortin Receptor 1, c-kit, MITF (microphthalmia-associated transcription factor), Pax3, Sox10, MART1 und gp100 sowie unter den in den Tabellen 8 und 9 aufgelisteten Genen. Besonders bevorzugte Gene sind die als hochrelevant in Tabelle 9 aufgelisteten Gene.
In den Tabellen 1 bis 9 ist die Stärke der differentiellen Expression angegeben, d. h., um welchen Faktor das jeweilige Gen in pigmentierten Haarfollikeln stärker exprimiert wird, als in ergrauten Haarfollikeln, oder umgekehrt.
Unter ihrer UniGene-Accession-Number oder unter ihrem Namen sind die jeweiligen Gene bzw. Genprodukte in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) offenbart. Diese Datenbank ist im Internet unter folgender Adresse zugänglich: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Die Gene bzw. Genprodukte sind außerdem unter den Internet-Adressen
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/Hs.Home.html oder
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/quide direkt zugänglich.
Das erfindungsgemäße Mittel kann zusätzlich Proteinhydrolysate umfassen, vorzugsweise kationisierte Proteinhydrolysate, wobei das zugrunde liegende Proteinhydrolysat vom Tier, beispielsweise aus Collagen, Milch oder Kerstin, von der Pflanze, beispielsweise aus Weizen, Mais, Reis, Kartoffeln, Soja oder Mandeln, von marinen Lebensformen, beispielsweise aus Fischcollagen oder Algen, oder biotechnologisch gewonnenen Proteinhydrolysaten, stammen kann. Die den kationischen Derivaten zugrunde liegenden Proteinhydrolysate können aus den entsprechenden Proteinen durch eine chemische, insbesondere alkalische oder saure Hydrolyse, durch eine enzymatische Hydrolyse und/oder einer Kombination aus beiden Hydrolysearten gewonnen werden. Die Hydrolyse von Proteinen ergibt in der Regel ein Proteinhydrolysat mit einer Molekulargewichtsverteilung von etwa 100 Dalton bis hin zu mehreren tausend Dalton. Bevorzugt sind solche kationischen Proteinhydrolysate, deren zugrunde liegender Proteinanteil ein Molekulargewicht von 100 bis zu 25000 Dalton, bevorzugt 250 bis 5000 Dalton aufweist. Weiterhin sind unter kationischen Proteinhydrolysaten quaternierte Aminosäuren und deren Gemische zu verstehen. Die Quaternisierung der Proteinhydrolysate oder der Aminosäuren wird häufig mittels quarternären Ammoniumsalzen wie beispielsweise N,N-Dimethyl-N-(n-Alkyl)-N-(2-hydroxy-3-chloro-n-propyl)-ammoniumhalogeniden durchgeführt. Weiterhin können die kationischen Proteinhydrolysate auch noch weiter derivatisiert sein. Als typische Beispiele für die kationischen Proteinhydrolysate und -derivate seien die unter den INCI – Bezeichnungen im "International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook", (seventh edition 1997, The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association 1101 17^th Street, N.W., Suite 300, Washington, DC 20036-4702) genannten und im Handel erhältlichen Produkte genannt: Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Collagen, Cocodimopnium Hydroxypropyl Hydrolyzed Casein, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Collagen, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Hair Kerstin, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Kerstin, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Rice Protein, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Silk, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Soy Protein, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Wheat Protein, Cocodimonium Hydroxypropyl Silk Amino Acids, Hydroxypropyl Arginine Lauryl/Myristyl Ether HCl, Hydroxypropyltrimonium Gelatin, Hydroxypropyltrimonium Hydrolyzed Casein, Hydroxypropyltrimonium Hydrolyzed Collagen, Hydroxypropyltrimonium Hydrolyzed Conchiolin Protein, Hydroxypropyltrimonium Hydrolyzed keratin, Hydroxypropyltrimonium Hydrolyzed Rice Bran Protein, Hydroxyproypltrimonium Hydrolyzed Silk, Hydroxypropyltrimonium Hydrolyzed Soy Protein, Hydroxypropyl Hydrolyzed Vegetable Protein, Hydroxypropyltrimonium Hydrolyzed Wheat Protein, Hydroxypropyltrimonium Hydrolyzed Wheat Protein/Siloxysilicate, Laurdimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Soy Protein, Laurdimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Wheat Protein, Laurdimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Wheat Protein/Siloxysilicate, Lauryldimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Casein, Lauryldimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Collagen, Lauryldimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Kerstin, Lauryldimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Silk, Lauryldimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Soy Protein, Steardimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Casein, Steardimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Collagen, Steardimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Kerstin, Steardimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Rice Protein, Steardimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Silk, Steardimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Soy Protein, Steardimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Vegetable Protein, Steardimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Wheat Protein, Steartimonium Hydroxyethyl Hydrolyzed Collagen, Quaternium-76 Hydrolyzed Collagen, Quaternium-79 Hydrolyzed Collagen, Quaternium-79 Hydrolyzed Kerstin, Quaternium-79 Hydrolyzed Milk Protein, Quaternium-79 Hydrolyzed Silk, Quaternium-79 Hydrolyzed Soy Protein, Quaternium-79 Hydrolyzed Wheat Protein.
Obwohl das erfindungsgemäße Mittel prinzipiell auf dem Haar verbleiben kann, wird das Mittel vorzugsweise nach einer Einwirkzeit von 10 Sekunden bis 60 Stunden ausgespült. Dieses Ausspülen kann mit reinem Wasser oder einem marktüblichen Shampoo erfolgen. Einwirkzeiten von 1 bis 15 Minuten haben sich in den meisten Fällen als ausreichend erwiesen.
Unabhängig von dem genauen Ablauf der Behandlung hat es sich als vorteilhaft erwiesen, das erfindungsgemäße Mittel bei einer Temperatur von 20 bis 55°C, insbesondere von 35 bis 40°C, anzuwenden.
Hinsichtlich der Art, gemäß das erfindungsgemäße Mittel auf das Haar, aufgebracht wird, bestehen keine prinzipiellen Einschränkungen.
Erfindungsgemäß von besonderem Interesse sind Haartonics, insbesondere als leave an Formulierung. Diese werden vorzugsweise bei Raumtemperatur angewendet, der alkoholische Gehalt liegt bevorzugtermaßen im Bereich von etwa 30% bis etwa 35% und der pH-Wert sollte etwa bei pH 7 liegen.
Als Konfektionierung der das erfindungsgemäße Mittel enthaltenden Zubereitungen sind beispielsweise Cremes, Lotionen, Lösungen, Wässer, Emulsionen wie W/O-, O/W-, PIT-Emulsionen (Emulsionen nach der Lehre der Phaseninversion, PIT genannt), Mikroemulsionen und multiple Emulsionen, Gele, Sprays, Aerosole und Schaumaerosole geeignet. Diese werden in der Regel auf wäßriger oder wäßrig-alkoholischer Basis formuliert. Als alkoholische Komponente kommen dabei niedere Alkanole sowie Polyole wie Propylenglykol und Glycerin zum Einsatz. Ethanol und Isopropanol sind bevorzugte Alkohole. Wasser und Alkohol können in der wäßrig alkoholischen Basis in einem Gewichtsverhältnis von 1:10 bis 10:1 vorliegen. Wasser sowie wäßrig-alkoholische Mischungen, die bis zu 50 Gew.-%, insbesondere bis zu 25 Gew.-%, Alkohol, bezogen auf das Gemisch Alkohol/Wasser, enthalten, können erfindungsgemäß bevorzugte Grundlagen sein. Der pH-Wert dieser Zubereitungen kann prinzipiell bei Werten von 2-11 liegen. Er liegt bevorzugt zwischen 2 und 7, wobei Werte von 3 bis 5 besonders bevorzugt sind. Zur Einstellung dieses pH-Wertes kann praktisch jede für kosmetische Zwecke verwendbare Säure oder Base verwendet werden. Üblicherweise werden als Säuren Genußsäuren verwendet. Unter Genußsäuren werden solche Säuren verstanden, die im Rahmen der üblichen Nahrungsaufnahme aufgenommen werden und positive Auswirkungen auf den menschlichen Organismus haben. Genußsäuren sind beispielsweise Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Apfelsäure, Ascorbinsäure und Gluconsäure. Im Rahmen der Erfindung ist die Verwendung von Zitronensäure und Milchsäure besonders bevorzugt. Bevorzugte Basen sind Ammoniak, Alkalihydroxide, Triethanolamin sowie N,N,N',N'-Tetrakis-(2-hydroxypropyl)-ethylendiamin.
Das Mittel kann als Einkammersystem oder als Zweikammersystem konfektioniert werden.
Neben der erfindungsgemäß zwingend erforderlichen Verbindung, die die Expression mindestens eines der in älteren Haarfollikeln und in jungen Haarfollikeln differentiell exprimierten Gene positiv oder negativ zu beeinflussen vermag, kann das Mittel prinzipiell alle weiteren, dem Fachmann für solche kosmetischen Mittel bekannten Komponenten enthalten.
Weitere Wirk-, Hilfs- und Zusatzstoffe sind beispielsweise

– nichtionogene Tenside wie beispielsweise Alkylphenolpolyglycolether, Fettsäurepolyglycolester, Fettsäureamidpolyglycolether, Fettaminpolyglycolether, alkoxylierte Triglyceride, wie insbesondere ethoxyliertes Rizinusöl, Alk(en)yloligoglucoside, Fettsäure-N-alkylglucamide, Polyolfettsäureester, Zuckerester, Sorbitanester und Polysorbate. Sofern die nichtionischen Tenside Polyglycoletherketten enthalten, können sie eine konventionelle oder eingeengte Homologenverteilung aufweisen.
– anionische Tenside, insbesondere Alkylsulfate, Alkylpolyglykolethersulfate und Ethercarbonsäuren mit 10 bis 18 C-Atomen in der Alkylgruppe und bis zu 12 Glykolethergruppen im Molekül, Seifen sowie Sulfobernsteinsäuremono- und
– dialkylester mit 8 bis 18 C-Atomen in der Alkylgruppe und Sulfobernsteinsäuremono-alkylpolyoxyethyl-ester mit 8 bis 18 C-Atomen in der Alkylgruppe und 1 bis 6 Oxyethylgruppen,
– zwitterionische Tenside, insbesondere die sogenannten Betaine wie die N-Alkyl-N,N-dimethylammonium-glycinate, beispielsweise das Kokosalkyl-dimethylammonium-glycinat, N-Acylaminopropyl-N,N-dimethylammoniumglycinate, beispielsweise das Kokosacylaminopropyldimethylammoniumglycinat, und 2-Alkyl-3-carboxylmethyl-3-hydroxyethyl-imidazoline mit jeweils 8 bis 18 C-Atomen in der Alkyl- oder Acylgruppe sowie das Kokosacylaminoethylhydroxyethylcarboxymethylglycinat,
– ampholytische Tenside wie beispielsweise N-Alkylglycine, N-Alkylpropionsäuren, N-Alkylaminobuttersäuren, N-Alkyliminodipropionsäuren, N-Hydroxyethyl-N-alkylamidopropylglycine, N-Alkyltaurine, N-Alkylsarcosine, 2-Alkylaminopropionsäuren und Alkyl-aminoessigsäuren mit jeweils etwa 8 bis 18 C-Atomen in der Alkylgruppe,
– nichtionische Polymere wie beispielsweise Vinylpyrrolidon/Vinylacrylat-Copolymere, Polyvinylpyrrolidon und Vinylpyrrolidon/Vinylacetat-Copolymere und Polysiloxane,
– Verdickungsmittel wie Agar-Agar, Guar-Gum, Alginate, Xanthan-Gum, Gummi arabicum, Karaya-Gummi, Johannisbrotkernmehl, Leinsamengummen, Dextrane, Cellulose-Derivate, z. B. Methylcellulose, Hydroxyalkylcellulose und Carboxymethylcellulose, Stärke-Fraktionen und Derivate wie Amylose, Amylopektin und Dextrine, Tone wie z. B. Bentonit oder vollsynthetische Hydrokolloide wie z. B. Polyvinylalkohol,
– Strukturanten wie Maleinsäure und Milchsäure,
– haarkonditionierende Verbindungen wie Phospholipide, beispielsweise Sojalecithin, Ei-Lecitin und Kephaline, sowie Silikonöle,
– Parfümöle, Dimethylisosorbid und Cyclodextrine,
– Lösungsmittel und -vermittler wie Ethanol, Isopropanol, Ethylenglykol, Propylenglykol, Glycerin und Diethylenglykol,
– symmetrische und unsymmetrische, lineare und verzweigte Dialkylether mit insgesamt zwischen 12 bis 36 C-Atomen, insbesondere 12 bis 24 C-Atomen, wie beispielsweise Di-n-octylether, Di-n-decylether, Di-n-nonylether, Di-n-undecylether und Di-n-dodecylether, n-Hexyl-n-octylether, n-Octyl-n-decylether, n-Decyl-n-undecylether, n-Undecyl-n-dodecylether und n-Hexyl-n-Undecylether sowie Di-tert-butylether, Di-iso-pentylether, Di-3-ethyldecylether, tert.-Butyl-n-octylether, iso-Pentyl-n-octylether und 2-Methyl-pentyl-n-octylether,
– Fettalkohole, insbesondere lineare und/oder gesättigte Fettalkohole mit 8 bis 30 C-Atomen, und Monoester der Fettsäuren mit Alkoholen mit 6 bis 24 C-Atomen,
– faserstrukturverbessernde Wirkstoffe, insbesondere Mono-, Di- und Oligosaccharide, wie beispielsweise Glucose, Galactose, Fructose, Fruchtzucker und Lactose,
– konditionierende Wirkstoffe wie Paraffinöle, pflanzliche Öle, z. B. Sonnenblumenöl, Orangenöl, Mandelöl, Weizenkeimöl und Pfirsichkernöl sowie Phospholipide, beispielsweise Sojalecithin, Ei-Lecithin und Kephaline,
– quaternierte Amine wie Methyl-1-alkylamidoethyl-2-alkylimidazolinium-methosulfat,
– Entschäumer wie Silikone,
– Farbstoffe zum Anfärben des Mittels,
– Antischuppenwirkstoffe wie Piroctone Olamine, Zink Omadine und Climbazol,
– Lichtschutzmittel, insbesondere derivatisierte Benzophenone, Zimtsäure-Derivate und Triazine,
– weitere Substanzen zur Einstellung des pH-Wertes, wie beispielsweise α- und β-Hydroxycarbonsäuren
– Wirkstoffe wie Allantoin und Bisabolol,
– Cholesterin,
– Konsistenzgeber wie Zuckerester, Polyolester oder Polyolalkylether,
– Fette und Wachse wie Walrat, Bienenwachs, Montanwachs und Paraffine,
– Fettsäurealkanolamide,
– Komplexbildner wie EDTA, NTA, β-Alanindiessigsäure und Phosphonsäuren,
– Quell- und Penetrationsstoffe wie Glycerin, Propylenglykolmonoethylether, Carbonate, Hydrogencarbonate, Guanidine, Harnstoffe sowie primäre, sekundäre und tertiäre Phosphate,
– Trübungsmittel wie Latex, Styrol/PVP- und Styrol/Acrylamid-Copolymere
– Perlglanzmittel wie Ethylenglykolmono- und -distearat sowie PEG-3-distearat,
– Pigmente,
– Reduktionsmittel wie z. B. Thioglykolsäure und deren Derivate, Thiomilchsäure, Cysteamin, Thioäpfelsäure und α-Mercaptoethansulfonsäure,
– Treibmittel wie Propan-Butan-Gemische, N₂O, Dimethylether, CO₂ und Luft,
– Antioxidantien.

Das erfindungsgemäße Mittel kann außerdem Tenside enthalten. Bei diesen kann es sich sowohl um anionische, ampholytische, zwitterionische oder nichtionogene Tenside als auch um kationische Tenside handeln.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird, beispielsweise in einem Shampoo, eine Kombination aus anionischen und nichtionischen Tensiden oder eine Kombination aus anionischen und amphoteren Tensiden eingesetzt. In einem Haartonic kann der Fachmann jedoch auch weitgehend oder vollständig auf den Einsatz von Tensiden verzichten.
Es hat sich in Einzelfällen als vorteilhaft erwiesen, die Tenside aus amphoteren oder nichtionischen Tensiden auszuwählen.
Als anionische Tenside eignen sich in erfindungsgemäßen Mitteln alle für die Verwendung am menschlichen Körper geeigneten anionischen oberflächenaktiven Stoffe. Diese sind gekennzeichnet durch eine wasserlöslich machende, anionische Gruppe wie z. B. eine Carboxylat-, Sulfat-, Sulfonat- oder Phosphat-Gruppe und eine lipophile Alkylgruppe mit etwa 10 bis 22 C-Atomen. Zusätzlich können im Molekül Glykol- oder Polyglykolether-Gruppen, Ester-, Ether- und Amidgruppen sowie Hydroxylgruppen enthalten sein.
Nichtionogene Tenside enthalten als hydrophile Gruppe z. B. eine Polyolgruppe, eine Polyalkylenglykolethergruppe oder eine Kombination aus Polyol- und Polyglykolethergruppe. Solche Verbindungen sind beispielsweise

- Anlagerungsprodukte von 2 bis 30 Mol Ethylenoxid und/oder 0 bis 5 Mol Propylenoxid an lineare Fettalkohole mit 8 bis 22 C-Atomen, an Fettsäuren mit 12 bis 22 C-Atomen und an Alkylphenole mit 8 bis 15 C-Atomen in der Alkylgruppe,
– C₁₂-C₂₂-Fettsäuremono- und -diester von Anlagerungsprodukten von 1 bis 30 Mol Ethylenoxid an Glycerin,
– C₈-C₂₂-Alkylmono- und -oligoglycoside und deren ethoxylierte Analoga sowie
– Anlagerungsprodukte von 5 bis 60 Mol Ethylenoxid an Rizinusöl und gehärtetes Rizinusöl.

Bevorzugte nichtionische Tenside sind Alkylpolyglykoside der allgemeinen Formel R¹O-(Z)_x. Diese Verbindungen sind durch die folgenden Parameter gekennzeichnet.
Der Alkylrest R¹ enthält 6 bis 22 Kohlenstoffatome und kann sowohl linear als auch verzweigt sein. Bevorzugt sind primäre lineare und in 2-Stellung methylverzweigte aliphatische Reste. Solche Alkylreste sind beispielsweise 1-Octyl, 1-Decyl, 1-Lauryl, 1-Myristyl, 1-Cetyl und 1-Stearyl. Besonders bevorzugt sind 1-Octyl, 1-Decyl, 1-Lauryl, 1-Myristyl. Bei Verwendung sogenannter "Oxo-Alkohole" als Ausgangsstoffe überwiegen Verbindungen mit einer ungeraden Anzahl von Kohlenstoffatomen in der Alkylkette.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Alkylpolyglykoside können beispielsweise nur einen bestimmten Alkylrest R¹ enthalten. Üblicherweise werden diese Verbindungen aber ausgehend von natürlichen Fetten und Ölen oder Mineralölen hergestellt. In diesem Fall liegen als Alkylreste R Mischungen entsprechend den Ausgangsverbindungen bzw. entsprechend der jeweiligen Aufarbeitung dieser Verbindungen vor.
Besonders bevorzugt sind solche Alkylpolyglykoside, bei denen R¹

– im wesentlichen aus C₈- und C₁₀-Alkylgruppen,
– im wesentlichen aus C₁₂- und C₁₄-Alkylgruppen,
– im wesentlichen aus C₈- bis C₁₆-Alkylgruppen oder
– im wesentlichen aus C₁₂- bis C₁₆-Alkylgruppen besteht.

Als Zuckerbaustein Z können beliebige Mono- oder Oligosaccharide eingesetzt werden. Üblicherweise werden Zucker mit 5 bzw. 6 Kohlenstoffatomen sowie die entsprechenden Oligosaccharide eingesetzt. Solche Zucker sind beispielsweise Glucose, Fructose, Galactose, Arabinose, Ribose, Xylose, Lyxose, Allose, Altrose, Mannose, Gulose, Idose, Talose und Sucrose. Bevorzugte Zuckerbausteine sind Glucose, Fructose, Galactose, Arabinose und Sucrose; Glucose ist besonders bevorzugt.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Alkylpolyglykoside enthalten im Schnitt 1,1 bis 5 Zuckereinheiten. Alkylpolyglykoside mit x-Werten von 1,1 bis 1,6 sind bevorzugt. Ganz besonders bevorzugt sind Alkylglykoside, bei denen x 1,1 bis 1,4 beträgt.
Die Alkylglykoside können neben ihrer Tensidwirkung auch dazu dienen, die Fixierung von Duftkomponenten auf dem Haar zu verbessern. Der Fachmann wird also für den Fall, daß eine über die Dauer der Haarbehandlung hinausgehende Wirkung des Parfümöles auf dem Haar gewünscht wird, bevorzugt zu dieser Substanzklasse als weiterem Inhaltsstoff der erfindungsgemäßen Zubereitungen zurückgreifen.
Auch die alkoxylierten Homologen der genannten Alkylpolyglykoside können erfindungsgemäß eingesetzt werden. Diese Homologen können durchschnittlich bis zu 10 Ethylenoxid- und/oder Propylenoxideinheiten pro Alkylglykosideinheit enthalten.
Weiterhin können, insbesondere als Co-Tenside, zwitterionische Tenside verwendet werden. Als zwitterionische Tenside werden solche oberflächenaktive Verbindungen bezeichnet, die im Molekül mindestens eine quartäre Ammoniumgruppe und mindestens eine -COO^(–) oder -SO₃ ^(–)-Gruppe tragen. Besonders geeignete zwitterionische Tenside sind die sogenannten Betaine wie die N-Alkyl-N,N-dimethylammonium-glycinate, beispielsweise das Kokosalkyl-dimethylammonium-glycinat, N-Acyl-aminopropyl-N,N-dimethylammoniumglycinate, beispielsweise das Kokosacylaminopropyldimethylammoniumglycinat, und 2-Alkyl-3-carboxylmethyl-3-hydroxyethyl-imidazoline mit jeweils 8 bis 18 C-Atomen in der Alkyl- oder Acylgruppe sowie das Kokosacylaminoethylhydroxyethylcarboxymethylglycinat. Ein bevorzugtes zwitterionisches Tensid ist das unter der INCI-Bezeichnung Cocamidopropyl Betaine bekannte Fettsäureamid-Derivat.
Ebenfalls insbesondere als Co-Tenside geeignet sind ampholytische Tenside. Unter ampholytischen Tensiden werden solche oberflächenaktiven Verbindungen verstanden, die außer einer C₈-C₁₈-Alkyl- oder Acylgruppe im Molekül mindestens eine freie Aminogruppe und mindestens eine -COOH- oder -SO₃H-Gruppe enthalten und zur Ausbildung innerer Salze befähigt sind. Beispiele für geeignete ampholytische Tenside sind N-Alkylglycine, N-Alkylpropionsäuren, N-Alkylaminobuttersäuren, N-Alkyliminodipropionsäuren, N-Hydroxyethyl-N-alkylamidopropylglycine, N-Alkyltaurine, N-Alkylsarcosine, 2-Alkylaminopropionsäuren und Alkylaminoessigsäuren mit jeweils etwa 8 bis 18 C-Atomen in der Alkylgruppe. Besonders bevorzugte ampholytische Tenside sind das N-Kokosalkylaminopropionat, das Kokosacylaminoethylaminopropionat und das C_12-18-Acylsarcosin.
Erfindungsgemäß werden als kationische Tenside insbesondere solche vom Typ der quartären Ammoniumverbindungen, der Esterquats und der Amidoamine eingesetzt.
Bevorzugte quaternäre Ammoniumverbindungen sind Ammoniumhalogenide, insbesondere Chloride und Bromide, wie Alkyltrimethylammoniumchloride, Dialkyldimethylammoniumchloride und Trialkylmethylammoniumchloride, z. B. Cetyltrimethylammoniumchlorid, Stearyltrimethylammoniumchlorid, Distearyldimethylammoniumchlorid, Lauryldimethylammoniumchlorid, Lauryldimethylbenzylammoniumchlorid und Tricetylmethylammoniumchlorid, sowie die unter den INCI-Bezeichnungen Quaternium-27 und Quaternium-83 bekannten Imidazolium-Verbindungen. Die langen Alkylketten der oben genannten Tenside weisen bevorzugt 10 bis 18 Kohlenstoffatome auf.
Bei Esterquats handelt es sich um bekannte Stoffe, die sowohl mindestens eine Esterfunktion als auch mindestens eine quartäre Ammoniumgruppe als Strukturelement enthalten. Bevorzugte Esterquats sind quaternierte Estersalze von Fettsäuren mit Triethanolamin, quaternierte Estersalze von Fettsäuren mit Diethanolalkylaminen und quaternierten Estersalze von Fettsäuren mit 1,2-Dihydroxypropyldialkylaminen. Solche Produkte werden beispielsweise unter den Warenzeichen Stepantex^®, Dehyquart^® und Armocare^® vertrieben. Die Produkte Armocare^® VGH-70, ein N,N-Bis(2-Palmitoyloxyethyl)dimethylammoniumchlorid, sowie Dehyquart^® F-75 und Dehyquart^® AU-35 sind Beispiele für solche Esterquats.
Die Alkylamidoamine werden üblicherweise durch Amidierung natürlicher oder synthetischer Fettsäuren und Fettsäureschnitte mit Dialkylaminoaminen hergestellt. Eine erfindungsgemäß besonders geeignete Verbindung aus dieser Substanzgruppe stellt das unter der Bezeichnung Tegoamid^® S 18 im Handel erhältliche Stearamidopropyl-dimethylamin dar.
Bei den als Tensid eingesetzten Verbindungen mit Alkylgruppen kann es sich jeweils um einheitliche Substanzen handeln. Es ist jedoch in der Regel bevorzugt, bei der Herstellung dieser Stoffe von nativen pflanzlichen oder tierischen Rohstoffen auszugehen, so daß man Substanzgemische mit unterschiedlichen, vom jeweiligen Rohstoff abhängigen Alkylkettenlängen erhält.
Bei den Tensiden, die Anlagerungsprodukte von Ethylen- und/oder Propylenoxid an Fettalkohole oder Derivate dieser Anlagerungsprodukte darstellen, können sowohl Produkte mit einer "normalen" Homologenverteilung als auch solche mit einer eingeengten Homologenverteilung verwendet werden. Unter "normaler" Homologenverteilung werden dabei Mischungen von Homologen verstanden, die man bei der Umsetzung von Fettalkohol und Alkylenoxid unter Verwendung von Alkalimetallen, Alkalimetallhydroxiden oder Alkalimetallalkoholaten als Katalysatoren erhält. Eingeengte Homologenverteilungen werden dagegen erhalten, wenn beispielsweise Hydrotalcite, Erdalkalimetallsalze von Ethercarbonsäuren, Erdalkalimetalloxide, -hydroxide oder -alkoholate als Katalysatoren verwendet werden. Die Verwendung von Produkten mit eingeengter Homologenverteilung kann bevorzugt sein.
Bezüglich weiterer fakultativer Komponenten sowie die eingesetzten Mengen dieser Komponenten wird ausdrücklich auf die dem Fachmann bekannten einschlägigen Handbücher, z. B. Kh. Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika, 2. Auflage, Hüthig Buch Verlag, Heidelberg, 1989, verwiesen.
Abbildungen
1 und 2: Nachweis von SCF durch immunhistologische Färbungen in gezupften pigmentierten (1) und gezupften grauen Haaren (2). Die Ergebnisse verdeutlichen, dass SCF durch die Haarergrauung vermutlich nicht beeinflusst wird.
3 und 4: Nachweis von α-MSH durch immunhistologische Färbungen in gezupften pigmentierten (3) und gezupften grauen Haaren (4). Die Ergebnisse verdeutlichen, dass auch α-MSH durch die Haarergrauung vermutlich nicht beeinflusst wird.
5 und 6: Nachweis von MITF durch immunhistologische Färbungen in pigmentierten (5) und grauen (6) Follikeln. Die Ergebnisse zeigen, dass MITF am Ergrauungsprozess beteiligt ist.
7 und 8: Nachweis von TRP1 durch immunhistologische Färbung in pigmentierten (7) und grauen (8) Follikeln.
9 und 10: Nachweis von gp100 durch immunhistologische Färbung in pigmentierten (9) und grauen (10) Follikeln.
11 und 12: Nachweis von MART1 durch immunhistologische Färbung in pigmentierten ( 11) und grauen (12) Follikeln.
13: Netzwerk von Paramtern, wobei die schwarz umrahmten Parameter in ergrauten Follikeln repremiert sind, die nicht umrahmten hingegen nicht reguliert.

Claims

Verfahren zur molekularen Charakterisierung von menschlichem ergrautem und pigmentiertem Haar, dadurch gekennzeichnet, daß man a. ein erstes Gemisch von in ergrauten menschlichen Haarfollikeln exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus ergrauten menschlichen Haarfollikeln gewinnt, b. ein zweites Gemisch von in pigmentierten menschlichen Haarfollikeln exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus pigmentierten menschlichen Haarfollikeln gewinnt und c. die in a) und b) gewonnenen Gemische einer differentiellen Analyse der Genexpression unterwirft, und dadurch die Gene identifiziert, die in ergrauten und in pigmentierten menschlichen Haarfollikeln unterschiedlich stark exprimiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Untersuchung in Schritt c) mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter a) Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese b) Affinitätschromatographie c) Protein-Protein-Komplexierung in Lösung d) ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) e) enzymgekoppelte Stoffwechselassays f) Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MAIDI), g) Einsatz von Proteinchips, Northern Blots, h) Real Time Quantitative Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), i) Multiplex-PCR, j) RNase-Schutzexperimente, k) Dot-Blots, l) CDNA-Sequenzierung, m) Klon-Hybridisierung, n) Differential Display, o) Subtraktive Hybridisierung, p) cDNA-Fragment-Fingerprinting, q) Durchflusszytometrieanalysen, r) Serielle Analyse der Genexpression (SAGE) und insbesondere s) Einsatz von Nukleinsäurechips, • wobei die Real Time Quantitative Polymerasekettenreaktion bevorzugt ist; oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
Haarbehandlungsmittel, enthaltend mindestens einen Wirkstoff, der die Expression mindestens eines der in ergrauten menschlichen Haarfollikeln und in pigmentierten menschlichen Haarfollikeln differentiell exprimierten Gene positiv oder negativ zu beeinflussen vermag.
Haarbehandlungsmittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die zu beeinflussenden Gene ausgewählt sind unter Tyrosinase, Tyrosinase related Protein 1, Tyrosinase related Protein 2, Melanocortin Receptor 1, c-kit, MITF (microphthalmia-associated transcription factor), Pax3, Sox10, MART1 und gp100 sowie unter den in den Tabellen 8 und 9 aufgelisteten Genen. Besonders bevorzugte Gene sind die als hochrelevant in Tabelle 9 aufgelisteten Gene.
Haarbehandlungsmittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die zu beeinflussenden Gene ausgewählt sind unter den als hochrelevant in Tabelle 9 aufgelisteten Genen.