WO2008074595A1 - Verfahren zur molekularen charakterisierung von ergrautem und pigmentiertem haar - Google Patents

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WO2008074595A1
WO2008074595A1 PCT/EP2007/062838 EP2007062838W WO2008074595A1 WO 2008074595 A1 WO2008074595 A1 WO 2008074595A1 EP 2007062838 W EP2007062838 W EP 2007062838W WO 2008074595 A1 WO2008074595 A1 WO 2008074595A1
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protein
genes
pigmented
hair
tyrosinase
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PCT/EP2007/062838
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Melanie Giesen
Olaf HOLTKÖTTER
Dirk Petersohn
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Henkel Ag & Co. Kgaa
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for the molecular characterization of grayed and pigmented hair in humans and to a hair treatment composition containing at least one compound which is capable of positively or negatively affecting the expression of at least one of the genes differentially expressed in graying hair follicles and in pigmented hair follicles.
  • Pigmentation in the hair follicle is controlled by a defined complex set of molecular signals. Since melanogenesis in gray follicles is obviously influenced, it can be assumed that parts of this network are modified in the gray follicle. However, the regulated and regulated components are still largely unknown to the human follicle.
  • the regulation of melanogenesis and thus the pigmentation in the hair follicle is subject to a complicated interaction of different ligands, receptors, transcription factors and effector genes. If the pigmentation is to be modulated by the application of a cosmetic or pharmacological formulation, then it is important to consider the global To understand the connections between the signals and their regulation, so that later on the appropriate molecular control molecules can be acted upon.
  • Agouti protein for example, is one of the most important modulators and inhibitors of melanin synthesis in the hair follicle in the animal organism, but this is not true for humans (Slominski et al (2005) J Investig Dermatol 124: 13-21). Agouti protein is responsible for both the intensity of pigmentation and the type of melanin that is formed. Its expression in the mouse results in a specific coat pattern of yellow bands in otherwise black hair. Expression of human agouti protein in transgenic mice results in complete yellowing of the coat, although no case of such staining in humans is known (Slominski et al (2004) Physiol Rev. 84: 1155-228). This shows the importance of using human follicles in the cause of hair graying.
  • the object of the present invention is to identify the largest possible part of the genes important for the graying of human hair follicles.
  • a method for the molecular characterization of human greyed and pigmented hair which is characterized in that a) a first mixture of human hair follicles grown in gray, d. H. b) a second mixture of human hair follicles expressed in pigmented human hair follicles, i. e. transcribed, and optionally also translated, genetically encoded factors, ie from proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules from grayed human hair follicles; H.
  • transcribed and possibly also translated genetic encoded factors ie from proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules from pigmented human hair follicles, and c) subjecting the mixtures obtained in a) and b) to a differential analysis of gene expression, and thereby identifies the genes that express differentially (differentially) in gray or pigmented hair follicles.
  • the adherent biological material consists of cells of the outer connective tissue sheath (CTS fibroblasts), keratinocytes of the outer and inner root sheath (ORS and IRS keratinocytes), matrix and root sheath melanocytes, and matrix keratinocytes.
  • CTS fibroblasts outer connective tissue sheath
  • ORS and IRS keratinocytes keratinocytes of the outer and inner root sheath
  • matrix and root sheath melanocytes matrix and root sheath melanocytes
  • matrix keratinocytes matrix keratinocytes.
  • the method according to the invention thus makes it possible for the first time to comprehensively systematically identify the mutagenicity-relevant changes in the hair follicle and to describe the gene and protein expression status of human graying versus pigmented hair follicles by quantifying relevant proteins and mRNA using kits or methods suitable according to the invention.
  • Another advantage of the present invention is the ability to develop and evaluate drugs and their effects on a variety of hair follicle markers characteristic of graying-related changes in the hair follicle by quantifying the expression of marker genes and proteins using kits useful in the invention or methods.
  • steps a) and b) mixtures of hair follicles hairy scalp.
  • the investigation in step c) is carried out by means of a method which is selected from i.
  • One- or two-dimensional gel electrophoresis ii. Affinity chromatography iii. Protein-protein complexation in solution iv. ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) v. enzyme-linked metabolic assays vi. Mass spectrometry, in particular Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI), vii. Use of Protein Chips, Northern Blots, viii. Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), ix. Multiplex PCR, x. RNase Protection Experiments, xi. Dot blots, xii.
  • RT-PCR Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction
  • PCR polymerase chain reaction
  • the quantification is carried out by means of fluorescence measurements at the end or during a PCR cycle and thus differs from other quantitative PCR methods (qPCR), which are quantitatively evaluated only after the end of the PCR (for example, competitive PCR).
  • qPCR quantitative PCR methods
  • the fluorescence increases proportionally with the amount of PCR products, which makes quantification possible. Gel electrophoretic separation of the fragments is not necessary, the data are immediately available and the risk of contamination is advantageously low ("A-Z of Quantitative PCR" IUL Biotechnology Series, ed. By Stephen A. Bustin).
  • SAGE TM serial analysis of gene expression
  • MPSS Massive Parallel Signiture Sequencing
  • the analysis by means of a whole-gen microarray may also be used according to the invention, for example the Agilent Whole Human Genome Microarray. This includes about 34,000 genes.
  • 2D gel electrophoresis is described in L.D. Adams, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the Isodalt System, or in L.D. Adams & S.R. Gallagher, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell System; both in Current Protocols in Molecular Biology (1997, Eds. F.M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1 - 10.4.13; or in 2-D electrophoresis manual; T. Berkelman, T. Senstedt; Amersham Pharmacia Biotech, 1998 (Order No. 80-6429-60).
  • Example 1 Ligands involved in melanogenesis The regulation of melanogenesis and thus the pigmentation in the hair follicle is subject to a complicated interaction of different ligands, receptors, transcription factors and effector genes. Since melanogenesis in gray follicles is obviously influenced, it can be assumed that parts of this network are modified in the gray follicle. However, which components are regulated is still largely unknown to humans. At the beginning of the signal chain are the ligands. Therefore, the expression of SCF (star cell factor), the receptor c-kit ligand, in plucked gray and pigmented hair follicles was examined by a quantitative real-time PCR method. It is known from the literature that SCF plays a role in melanogenesis in murine hair follicles. However, the importance of SCF for the human follicle and its regulation in gray hair is unknown.
  • SCF star cell factor
  • RNA was separately isolated using the RNeasy Mini Kit from Qiagen.
  • the RNA was then rewritten by reverse transcription into cDNA.
  • the formation of the PCR products is detected online via a fluorescence signal.
  • the fluorescence signal is proportional to the amount of the PCR product formed. The stronger the expression of a particular gene, the greater the amount of PCR product produced and the higher the fluorescence signal.
  • RNA from the gray and pigmented follicles were subdivided into pools of 2-4 volunteers each (a total of 23 subjects in 8 pools), whereby the expression change in the gray follicle was calculated by normalization to the corresponding pigmented control group.
  • Table 1 Shown in Table 1 is the differential gene expression of the subject pools (expression in gray follicles relative to the corresponding pigmented follicles).
  • ⁇ -MSH alpha melanocyte stimulating hormone
  • the ligands involved in melanogenesis bind to various receptors, through which the corresponding signal is transmitted to the cell interior.
  • the receptor for SCF is c-kit
  • the receptor for ⁇ -MSH is MCR-1 (Melanocortin Receptor 1).
  • the expression of c-kit and MCR-1 was examined by means of the Real Time PCR method described in Example 1. Protein expression of c-kit was analyzed by Western blot. The expression change in the gray follicle was calculated by normalization to the appropriate pigmented control group.
  • Table 2 Shown in Table 2 is the differential gene expression of the subject pools (expression in gray follicles relative to the corresponding pigmented follicles).
  • Table 3 shows the differential protein expression of the subject pools (expression in gray follicles relative to the corresponding pigmented follicles)
  • Transcription factors are proteins that are important for the initiation of RNA polymerase during transcription. In addition, they are involved in the regulation of elongation and termination. Transcription factors bind the DNA and activate or repress it so the corresponding promoter. In addition, there are other transcription factors that do not bind directly to the DNA but, for example, to other DNA-binding proteins.
  • a melanogenesis-associated transcription factor described in mice is MITF (Microphthalmia transcription factor).
  • the transcription factors Pax3, Sox10 and ß-catenin play a role in murine systems. The expression of MITF, Pax3 and Sox10 was examined by means of the Real Time PCR method described in Example 1.
  • the expression change in the gray follicle was calculated by normalization to the appropriate pigmented control group.
  • the protein expression of MITF was examined by immunohistochemical staining on gray and pigmented follicles. Protein expression of ⁇ -catenin was analyzed by Western blot.
  • Table 4 Shown in Table 4 is the differential gene expression of the subject pools (expression in gray follicles relative to the corresponding pigmented follicles).
  • Figures 5 and 6 show MITF as immunohistological staining on pigmented and gray follicles.
  • Table 5 Shown in Table 5 is the protein expression of the subject pools (expression in gray follicles relative to the corresponding pigmented follicles).
  • TRP1 tyrosinase related protein 1
  • TRP2 melanogenesis enzymes involved in the metabolism of tyrosine to melanin, gp100, a melanosome-localized protein or MART1 (Melanoma Antigen Recognized by T cells 1), which play an important role for the functionality (eg stability) of gp100 plays.
  • TRP1, TRP2, gp100 and MART1 were examined by means of the Real Time PCR method described in Example 1.
  • TRP2 was analyzed in hair follicles at the protein level using Western Blot.
  • TRP1, gp100 and MART1 were examined immunohistologically on gray and pigmented follicles.
  • Table 6 Shown in Table 6 is the differential gene expression of the subject pools (expression in gray follicles relative to the corresponding pigmented follicles).
  • Table 7 shows the differential protein expression of the subject pools (expression in gray follicles relative to the corresponding pigmented follicles)
  • Figures 7-12 show TRP1, gp100 and MART1 in an immunohistological staining in pigmented and gray follicles.
  • TYRP 1 -5 90 0 NM_000550 tyrosinase-related protein 1 (TYRP1)
  • KRTHA7 3, 68 6,43E-20 NM_003770 keratin, hair, acidic, 7 (KRTHA7)
  • KRTHA7 v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral
  • KIT KIT -3, 30 0 NM_000222 oncogene homologue (KIT)
  • SILV -2 97 0 NM_006928 silver homologue (mouse) (SILV)
  • RNF28 NM_032588 ring finger protein 28
  • GJB1 -2 11 0.00016 NM_000166 gap junction protein, beta 1, 32kDa
  • THC2058421 1 1, 74 3,62E-08 THC2058421 Unknown transient receptor potential cation channel
  • TRPM1 71 6.71 E-19 NM_002420 subfamily M, member 1 (TRPM1)
  • GPR143 GPR143-1, 64 2.80E-45 NM_000273 G protein-coupled receptor 143 (GPR143)
  • BM459062 -1 64 9,15E-18 BM459062 clone IMAGE: 5557378 5 'melanocortin 1 receptor (alpha melanocyte
  • C17-1 51 1, 55E-06 NM_018659 cytokine-like protein C17 (C17)
  • A_24_P843335 1, 51 0.00004 A_24_P843335 Unknown paired box gene 3 (PAX3), transcript variant
  • RUNX3 -1 48 1, 38E-09 NM_004350 runt-related transcription factor 3 (RUNX3
  • ZNF258 -1 36 0.00012 NM_007167 zinc finger protein 258 (ZNF258)
  • LPPR4 -1 31 1, 45E-21 NM_014839 plasticity related gene 1 (LPPR4)
  • THC2113405 1 30 0.00002 THC2113405 ALU2_HUMAN (P39189)
  • TYRP 1 -5.9 NM_000550 tyrosinase-related protein 1 TYRP1
  • TYR -4.72 NM_000372 tyrosinase (oculocutaneous albinism IA) (TYR)
  • KIT Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homologue
  • TRPM1 71 NM_002420 M, member 1 (TRPM1)
  • GPR143 -1 64 NM_000273
  • G protein-coupled receptor 143 GPR143
  • melanocortin 1 receptor alpha melanocyte
  • PAX3-1 49 NM_181458 paired box gene 3 (PAX3), transcript variant PAX3D
  • S100B-1 41 NM_006272 S100 calcium binding protein, beta (neural) (S100B)
  • RGS1 -1 33 NM_002922 regulator of G-protein signaling 1 (RGS1)
  • C17-1 51 NM_018659 cytokine-like protein C17 (C17)
  • KRTHA7 3.68 NM_003770 keratin, hair, acidic, 7 (KRTHA7)
  • the network shown in FIG. 13 can be derived from these data, wherein the parameters framed in black are re-expressed in gray follicles which do not regulate non-framed ones.
  • a further subject matter of the present invention is a hair treatment composition containing at least one active substance which is capable of positively or negatively influencing the expression of at least one of the genes differentially expressed in graying hair follicles and in pigmented hair follicles.
  • Genes preferred according to the invention are selected from tyrosinase, tyrosinase-related protein 1, tyrosinase-related protein 2, melanocortin receptor 1, c-kit, MITF (microphthalmia-associated transcription factor), Pax3, Sox10, MART1 and gp100, as well as those shown in Tables 8 and 9 listed genes. Particularly preferred genes are the genes listed as highly relevant in Table 9.
  • Tables 1 to 9 indicate the extent of differential expression, ie, by what factor the respective gene is expressed more strongly in pigmented hair follicles than in graying hair follicles, or vice versa. Under their UniGene Accession Number or under their name, the respective genes or gene products are disclosed in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database. This database is available on the Internet at the following address: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
  • genes or gene products are also available at the following Internet addresses: http: //www.ncbi.nlm.nih.qov/UniGene/Hs.Home.html or http://www.ncbi.nlm.nih.gov/qenome/ quide directly accessible.
  • composition according to the invention may additionally comprise protein hydrolysates, preferably cationized protein hydrolysates, wherein the protein hydrolyzate on which the animal is based, for example from collagen, milk or keratin, from the plant, for example from wheat, maize, rice, potatoes, soya or almonds, from marine life forms, from fish collagen or algae, or biotechnologically derived protein hydrolysates.
  • the protein hydrolyzates on which the cationic derivatives are based can be obtained from the corresponding proteins by chemical, in particular alkaline or acid hydrolysis, by enzymatic hydrolysis and / or a combination of both types of hydrolysis.
  • cationic protein hydrolyzates are to be understood as meaning quaternized amino acids and mixtures thereof.
  • the quaternization of the protein hydrolyzates or amino acids is often carried out using quaternary ammonium salts such as N, N-dimethyl-N- (n-alkyl) -N- (2-hydroxy-3-chloro-n-propyl) ammonium halides.
  • the cationic protein hydrolysates may also be further derivatized.
  • the cationic protein hydrolysates and derivatives those listed under the INCI names in the "International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook", (seventh edition 1997, The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association 1101 17 th Street, NW, Suite 300, Washington, DC 20036-4702) and cited: Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Collagen, Cocodimopnium Hydroxypropyl Hydrolyzed Casein, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Collagen, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Hair Keratin, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Keratin, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Rice Protein, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed SiC, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Soy Protein, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Wheat Protein, Coco
  • composition according to the invention can in principle remain on the hair, the agent is preferably rinsed out after an exposure time of 10 seconds to 60 hours. This rinsing can be done with pure water or a commercially available shampoo. Action times of 1 to 15 minutes have proven sufficient in most cases.
  • the agent according to the invention at a temperature of 20 to 55 0 C, in particular from 35 to 40 0 C, apply.
  • composition according to the invention is applied to the hair, there are no fundamental restrictions.
  • Haartonics are of particular interest according to the invention, in particular as a leave on formulation. These are preferably used at room temperature, the alcoholic content is preferably in the range of about 30% to about 35% and the pH should be about pH 7.
  • creams, lotions, solutions, waters, emulsions such as W / O, O / W, PIT emulsions (known as phase inversion emulsions, PIT), microemulsions and multiple emulsions, are packaged as formulations of the preparations containing the agent according to the invention.
  • Gels, sprays, aerosols and foam aerosols. are usually formulated on an aqueous or aqueous-alcoholic basis.
  • alcoholic component while lower alkanols and polyols such as propylene glycol and glycerol are used. Ethanol and isopropanol are preferred alcohols.
  • Water and alcohol may be present in the aqueous alcoholic base in a weight ratio of 1:10 to 10: 1.
  • Water and aqueous-alcoholic mixtures containing up to 50% by weight, in particular up to 25% by weight, of alcohol, based on the mixture alcohol / water, may be preferred according to the invention basics.
  • the pH of these preparations can in principle be between 2 and 11. It is preferably between 2 and 7, with values of 3 to 5 being particularly preferred.
  • any acid or base that can be used for cosmetic purposes can be used.
  • acids are used as acids.
  • By-acids are understood to mean those acids which are absorbed as part of the usual food intake and have positive effects on the human organism.
  • Eat acids are, for example, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, ascorbic acid and gluconic acid.
  • citric acid and lactic acid is particularly preferred.
  • Preferred bases are ammonia, alkali hydroxides, triethanolamine and N, N, N ', N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine.
  • the agent can be made up as a single-chamber system or as a two-chamber system.
  • the agent can in principle contain all other components known to the person skilled in the art for such cosmetic compositions.
  • nonionic surfactants such as, for example, alkylphenol polyglycol ethers, fatty acid polyglycol esters, fatty acid amide polyglycol ethers, fatty amine polyglycol ethers, alkoxylated triglycerides, in particular ethoxylated castor oil, alk (en) yl oligoglucosides, fatty acid N-alkylglucamides, polyol fatty acid esters, sugar esters, sorbitan esters and polysorbates. If the nonionic surfactants contain polyglycol ether chains, they may have a conventional or narrow homolog distribution.
  • anionic surfactants in particular alkyl sulfates, alkyl polyglycol ether sulfates and ether carboxylic acids having 10 to 18 carbon atoms in the alkyl group and up to 12 glycol ether groups in the molecule, soaps and sulfosuccinic mono- and
  • dialkyl esters having 8 to 18 C atoms in the alkyl group and sulfosuccinic acid monoalkylpolyoxyethyl esters having 8 to 18 C atoms in the alkyl group and 1 to 6 oxyethyl groups,
  • zwitterionic surfactants in particular the so-called betaines such as the N-alkyl-N, N-dimethylammonium glycinates, for example the cocoalkyldimethylammonium glycinate, N-acylaminopropyl-N, N-dimethylammoniumglycinates, for example the cocoacylaminopropyldimethylammoniumglycinate, and 2-alkyl-3-carboxylmethyl-3-hydroxyethylimidazolines having in each case 8 to 18 C atoms in the alkyl or acyl group and the cocoacylaminoethylhydroxyethylcarboxymethylglycinate,
  • betaines such as the N-alkyl-N, N-dimethylammonium glycinates, for example the cocoalkyldimethylammonium glycinate, N-acylaminopropyl-N, N-dimethylammoniumglycinates, for example the
  • ampholytic surfactants for example N-alkylglycines, N-alkylpropionic acids, N-alkylaminobutyric acids, N-alkyliminodipropionic acids, N-hydroxyethyl-N-alkylamidopropylglycines, N-alkyl- taurines, N-alkylsarcosines, 2-alkylaminopropionic acids and alkylaminoacetic acids each having about 8 to 18 C atoms in the alkyl group,
  • nonionic polymers such as, for example, vinylpyrrolidone / vinyl acrylate copolymers, polyvinylpyrrolidone and vinylpyrrolidone / vinyl acetate copolymers and polysiloxanes,
  • Thickeners such as agar-agar, guar gum, alginates, xanthan gum, gum arabic, karaya gum, locust bean gum, linseed gums, dextrans, cellulose derivatives, e.g. For example, methylcellulose, hydroxyalkylcellulose and carboxymethylcellulose, starch fractions and derivatives such as amylose, amylopectin and dextrins, clays such. As bentonite or fully synthetic hydrocolloids such. For example, polyvinyl alcohol,
  • hair-conditioning compounds such as phospholipids, for example soya lecithin, egg lecithin and cephalins, and silicone oils,
  • Solvents and mediators such as ethanol, isopropanol, ethylene glycol, propylene glycol, glycerol and diethylene glycol,
  • dialkyl ethers having a total of from 12 to 36 carbon atoms, in particular 12 to 24 carbon atoms, such as di-n-octyl ether, di-n-decyl ether, di-n-nonyl ether, di-n -undecyl ether and di-n-dodecyl ether, n-hexyl n-octyl ether, n-octyl n-decyl ether, n-decyl n-undecyl ether, n-undecyl n-dodecyl ether and n-hexyl n-undecyl ether and di tert-butyl ether, di-iso-pentyl ether, di-3-ethyl decyl ether, tert-butyl n-octyl ether, is
  • Fatty alcohols in particular linear and / or saturated fatty alcohols containing 8 to 30 carbon atoms, and monoesters of the fatty acids with alcohols having 6 to 24 carbon atoms,
  • fiber-structure-improving active substances in particular mono-, di- and oligosaccharides, such as, for example, glucose, galactose, fructose, fructose and lactose,
  • paraffin oils such as paraffin oils, vegetable oils, eg. Sunflower oil, orange oil, almond oil, wheat germ oil and peach kernel oil, as well as phospholipids, for example soya lecithin, egg lecithin and cephalins,
  • quaternized amines such as methyl-1-alkylamidoethyl-2-alkylimidazolinium methosulfate,
  • Anti-dandruff agents such as Piroctone Olamine, Zinc Omadine and Climbazole,
  • - light stabilizers in particular derivatized benzophenones, cinnamic acid derivatives and triazines,
  • Bodying agents such as sugar esters, polyol esters or polyol alkyl ethers,
  • Fatty acid alkanolamides Complexing agents such as EDTA, NTA, ⁇ -alaninediacetic acid and phosphonic acids,
  • - swelling and penetrating substances such as glycerol, propylene glycol monoethyl ether, carbonates, bicarbonates, guanidines, ureas and primary, secondary and tertiary phosphates,
  • Opacifiers such as latex, styrene / PVP and styrene / acrylamide copolymers
  • Pearlescing agents such as ethylene glycol mono- and distearate and PEG-3-distearate,
  • Propellants such as propane-butane mixtures, N 2 O, dimethyl ether, CO 2 and air,
  • composition of the invention may also contain surfactants. These may be anionic, ampholytic, zwitterionic or nonionic surfactants as well as cationic surfactants.
  • a combination of anionic and nonionic surfactants or a combination of anionic and amphoteric surfactants is used.
  • anionic and nonionic surfactants or a combination of anionic and amphoteric surfactants is used.
  • the skilled person can also largely or completely dispense with the use of surfactants.
  • Suitable anionic surfactants in compositions according to the invention are all anionic surfactants suitable for use on the human body. These are characterized by a water-solubilizing, anionic group such as. Example, a carboxylate, sulfate, sulfonate or phosphate group and a lipophilic alkyl group having about 10 to 22 carbon atoms. In addition, glycol or polyglycol ether groups, ester, ether and amide groups and hydroxyl groups may be present in the molecule.
  • Nonionic surfactants contain as hydrophilic group z.
  • Such compounds are, for example
  • Alkylphenols having 8 to 15 C atoms in the alkyl group having 8 to 15 C atoms in the alkyl group
  • Preferred nonionic surfactants are alkyl polyglycosides of the general formula R 1 O- (Z) x . These connections are identified by the following parameters.
  • the alkyl radical R 1 contains 6 to 22 carbon atoms and may be both linear and branched. Preference is given to primary linear and methyl-branched in the 2-position aliphatic radicals.
  • Such alkyl radicals are, for example, 1-octyl, 1-decyl, 1-lauryl, 1-myristyl, 1-cetyl and 1-stearyl. Particularly preferred are 1-octyl, 1-decyl, 1-lauryl, 1-myristyl.
  • oxo-alcohols compounds with an odd number of carbon atoms in the alkyl chain predominate.
  • the alkyl polyglycosides which can be used according to the invention can contain, for example, only one particular alkyl radical R 1 .
  • these compounds are prepared starting from natural fats and oils or mineral oils.
  • the alkyl radicals R are mixtures corresponding to the starting compounds or corresponding to the particular work-up of these compounds.
  • R 1 consists essentially of C 8 and C 1 alkyl groups, substantially of C 2 - and C 4 -alkyl groups, essentially of C 8 - to C 16 -alkyl groups or essentially of C 12 - To C 16 alkyl groups.
  • sugar building block Z it is possible to use any desired mono- or oligosaccharides.
  • sugars with 5 or 6 carbon atoms and the corresponding oligosaccharides are used.
  • Such sugars are, for example, glucose, fructose, galactose, arabinose, ribose, xylose, lyxose, allose, altrose, mannose, gulose, idose, talose and sucrose.
  • Preferred sugar building blocks are glucose, fructose, galactose, arabinose and sucrose; Glucose is particularly preferred.
  • alkyl polyglycosides which can be used according to the invention contain on average from 1.1 to 5 sugar units. Alkyl polyglycosides having x values of 1.1 to 1.6 are preferred. Very particular preference is given to alkyl glycosides in which x is 1: 1 to 1, 4.
  • the alkyl glycosides can also serve to improve the fixation of fragrance components on the hair.
  • the expert will therefore in the event that over the duration of the hair treatment going beyond effect of the perfume oil on the hair is desired, preferably to use this class of substance as a further ingredient of the inventive preparations.
  • alkoxylated homologs of said alkyl polyglycosides can also be used according to the invention. These homologs may contain on average up to 10 ethylene oxide and / or propylene oxide units per alkyl glycoside unit.
  • zwitterionic surfactants can be used, in particular as cosurfactants.
  • Zwitterionic surfactants are those surface-active compounds which carry at least one quaternary ammonium group and at least one -COO () or -SO 3 - group in the molecule.
  • Particularly suitable zwitterionic surfactants are the so-called betaines, such as the N-alkyl-N, N-dimethylammonium glycinates, for example cocoalkyldimethylammonium glycinate, N-acylaminopropyl-N, N-dimethylammoniumglycinates, for example cocoacylaminopropyldimethylammonium glycinate, and Alkyl-3-carboxylmethyl-3-hydroxyethyl-imidazolines each having 8 to 18 carbon atoms in the alkyl or acyl group and Kokosacylaminoethylhydroxyethyl- carboxymethylglycinat.
  • a preferred zwitterionic surfactant is the fatty acid amide derivative known under the INCI name Cocamidopropyl Betaine.
  • ampholytic surfactants are understood as meaning those surface-active compounds which contain, in addition to a C 8 -C -alkyl or acyl group in the molecule, at least one free amino group and at least one -COOH or -SO 3 H group and for the formation of internal salts are capable.
  • ampholytic surfactants are N-alkylglycines, N-alkylpropionic acids, N-alkylaminobutyric acids, N-alkyliminodipropionic acids, N-hydroxyethyl-N-alkylamidopropylglycines, N-alkyltaurines, N-alkylsarcosines, 2-alkylaminopropionic acids and alkylaminoacetic acids each having about 8 to 18 C atoms in the alkyl group.
  • Particularly preferred ampholytic surfactants are N-cocoalkylaminopropionate, cocoacylaminoethylaminopropionate and C-1 2 - 18 acylsarcosine.
  • the cationic surfactants used are, in particular, those of the quaternary ammonium compound type, the esterquats and the amidoamines.
  • Preferred quaternary ammonium compounds are ammonium halides, especially chlorides and bromides, such as alkyltrimethylammonium chlorides, dialkyldimethylammonium chlorides and trialkylmethylammonium chlorides, e.g.
  • alkyltrimethylammonium chlorides dialkyldimethylammonium chlorides and trialkylmethylammonium chlorides, e.g.
  • cetyltrimethylammonium chloride, stearyltrimethylammonium chloride, distearyldimethylammonium chloride, lauryldimethylammonium chloride, lauryldimethylbenzylammonium chloride and tricetylmethylammonium chloride as well as the imidazolium compounds known under the INCI names Quaternium-27 and Quaternium-83.
  • esterquats are known substances which contain both at least one ester function and at least one quaternary ammonium group as a structural element.
  • Preferred ester quats are quaternized ester salts of fatty acids with triethanolamine, quaternized ester salts of fatty acids with diethanolalkylamines and quaternized ester salts of fatty acids with 1,2-dihydroxypropyldialkylamines.
  • Such products are marketed under the trade names Stepantex® ®, ® and Dehyquart® Armocare® ®.
  • the alkylamidoamines are usually prepared by amidation of natural or synthetic fatty acids and fatty acid cuts with dialkylaminoamines.
  • An inventively particularly suitable compound from this group of substances under the name Tegoamid ® S 18 commercial stearamidopropyl dimethylamine is.
  • the compounds used as surfactant with alkyl groups may each be uniform substances. However, it is usually preferred to start from the production of these substances from native plant or animal raw materials, so as to obtain substance mixtures with different, depending on the particular raw material alkyl chain lengths.
  • both products with a "normal” homolog distribution and those with a narrow homolog distribution can be used.
  • "normal” homolog distribution are meant mixtures of homologs obtained in the reaction of fatty alcohol and alkylene oxide using alkali metals, alkali metal hydroxides or alkali metal alcoholates as catalysts. Narrowed homolog distributions are obtained when, for example, hydrotalcites, alkaline earth metal salts of ether carboxylic acids, alkaline earth metal oxides, hydroxides or alkoxides are used as catalysts. The use of products with narrow homolog distribution may be preferred.
  • Another object of the invention is the use of at least one of the genes that are expressed differently in gray and in pigmented human hair follicles, for the identification of cosmetic or pharmaceutical agents against Hair graying or to prove the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical agents against hair graying. Particularly preferred is the cosmetic application.
  • the genes that are expressed differently in gray and in pigmented human hair follicles, one of the methods of the invention can be found.
  • Figures 1 and 2 Detection of SCF by immunohistological staining in plucked pigmented
  • Figures 3 and 4 Detection of ⁇ -MSH by immunohistological staining in plucked pigmented ( Figure 3) and plucked gray hairs ( Figure 4). The results make it clear that ⁇ -MSH is probably not affected by hair graying.
  • Figures 5 and 6 Detection of MITF by immunohistological staining in pigmented ( Figure 5) and gray ( Figure 6) follicles. The results show that MITF is involved in the graying process.
  • Figures 7 and 8 Detection of TRP1 by immunohistological staining in pigmented ( Figure 7) and gray ( Figure 8) follicles.
  • Figures 9 and 10 Detection of gp100 by immunohistological staining in pigmented ( Figure 9) and gray ( Figure 10) follicles.
  • Fig. 13 Network of parameters, whereby the black-framed parameters are repremed in gray follicles, whereas the unframed ones are not regulated.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur molekularen Charakterisierung von ergrautem und pigmentiertem menschlichen Haar in vitro, ein Haarbehandlungsmittel, enthaltend mindestens eine Verbindung, die die Expression mindestens eines der in ergrauten menschlichen Haarfollikeln und in pigmentierten menschlichen Haarfollikeln differentiell exprimierten Gene positiv oder negativ zu beeinflussen vermag, sowie die Verwendung von Genen, die in ergrauten und in pigmentierten menschlichen Haarfollikeln unterschiedlich stark exprimiert werden, zum Nachweis der Wirksamkeit oder der Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen.

Description

Verfahren zur molekularen Charakterisierung von ergrautem und pigmentiertem Haar
Beschreibung:
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur molekularen Charakterisierung von ergrautem und pigmentiertem Haar bei Menschen sowie ein Haarbehandlungsmittel, enthaltend mindestens eine Verbindung, die die Expression mindestens eines der in ergrauten Haarfollikeln und in pigmentierten Haarfollikeln differentiell exprimierten Gene positiv oder negativ zu beeinflussen vermag.
Die Ursachen für Haarergrauung sind bislang nur unzureichend untersucht. Es gibt verschiedene theoretische Ansätze, deren Zusammenhänge bisher aber weitestgehend unklar bleiben. Als Gründe für die Haarergrauung werden beispielsweise fehlende Tyrosinaseaktivität, suboptimale Melanozyten-Keratinozyten-Interaktion oder oxidativer Stress diskutiert. Einige Theorien gehen zudem von einer unzureichenden Nachlieferung aktiver Melanozyten aus dem Stammzellreservoir aus, die zu fehlender Pigmentierung führen soll.
Der Stand der Technik beschreibt dabei vor allem isolierte Einzeluntersuchungen, die dem gesamten Kontext der komplexen Vorgänge während der Haarergrauung nicht gerecht werden. Zum anderen handelt es sich in der Regel um Untersuchungen an der Maus. Da sich der Haarzyklus der Maus jedoch stark von dem des Menschen unterscheidet, die Haarpigmentierung aber fest an den Haarzyklus gekoppelt zu sein scheint, kann auch davon ausgegangen werden, dass es signifikante Unterschiede in den Ergrauungsmechanismen gibt. Darüber hinaus sind verschiedene Proteine an der Farbgebung des Mausfells beteiligt, die kein funktionales menschliches Homolog haben. Die umfassende Untersuchung der molekularen und zellphysiologischen Gründe für die phänotypischen Veränderungen während des Ergrauungsprozesses beim Menschen sowie die Analyse von geschlechtsspezifischen Unterschieden fehlen daher weitestgehend.
Die Pigmentierung im Haarfollikel wird durch ein definiertes komplexes Set molekularer Signale gesteuert. Da die Melanogenese in ergrauten Follikeln offensichtlich beeinflusst ist, kann davon ausgegangen werden, dass im ergrauten Follikel Teile dieses Netzwerkes in ihrer Funktion modifiziert sind. Welche Komponenten wie reguliert sind ist für den humanen Follikel jedoch noch weitestgehend unbekannt.
Die Regulation der Melanogenese und damit der Pigmentierung im Haarfollikel unterliegt einem komplizierten Zusammenspiel unterschiedlicher Liganden, Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren und Effektorgenen. Soll durch die Anwendung einer kosmetischen oder pharmakologischen Formulierung die Pigmentierung moduliert werden, so ist es zunächst von Bedeutung, die globalen Zusammenhänge zwischen den Signalen und ihre Regulation zu begreifen, damit später gezielt auf die entsprechenden molekularen Steuermoleküle eingewirkt werden kann.
Bisher sind die Veränderungen, die zum Ergrauen des Haares führen, nur teilweise und bruchstückhaft untersucht. Die umfassende Untersuchung der globalen molekularen und zellphysiologischen Zusammenhänge für die phänotypischen Veränderungen während des Ergrauungsprozesses beim Menschen fehlt. Statt dessen werden oft einfache in vitro Zellkulturen eingesetzt, die die tatsächliche in vivo Situation nur eingeschränkt widerspiegeln.
Da es bisher keine hochentwickelten dreidimensionalen Zellkulturmodelle gibt, kann in diesen Einzelzellkulturen der Komplexität des menschlichen Haarfollikels kaum Rechnung getragen und globale Zusammenhänge können nur unzureichend beschrieben werden. Die meisten Studien zur Untersuchung molekularer Mechanismen der Haarergrauung in vivo lassen sich derzeit nur mit Hilfe von Versuchtieren, z.B. Mäusen durchführen. D.h. die bisherigen Erkenntnisse hinsichtlich der Ursachen der Haarergrauung beruhen auf murinen Daten. Dass solche Daten nicht uneingeschränkt auf humane Haarfollikel übertragen werden können, zeigt sich bereits durch die unterschiedliche Expression einiger, bei der Maus an der Pigmentierung beteiligten Proteine. Agouti Protein beispielsweise ist im tierischen Organismus einer der wichtigsten Modulatoren und Inhibitoren der Melaninsythese im Haarfollikel, dies gilt jedoch nicht für den Menschen (Slominski et al (2005) J Investig Dermatol 124:13-21 ). Agouti Protein ist sowohl für die Intensität der Pigmentierung als auch für den Typus Melanin, der gebildet wird verantwortlich. Seine Expression in der Maus führt zu einem spezifischen Fellmuster aus gelben Bändern im ansonsten schwarzen Haar. Die Expression von humanen Agouti Protein in transgenen Mäusen führt zu einer kompletten Gelbfärbung des Fells, obwohl kein Fall von einer solchen Färbung beim Menschen bekannt ist (Slominski et al. (2004) Physiol Rev. 84:1 155-228). Dies zeigt die Bedeutung der Verwendung humaner Follikel bei der Ursachenforschung der Haarergrauung.
Eine umfassende Charakterisierung von ergrautem und pigmentiertem Haar ist bislang aus dem Stand der Technik nicht bekannt.
Das bruchstückhafte Verständnis der molekularen Mechanismen, die bei der Haarergrauung bedeutsam sind, führt zu einer unzureichenden Anzahl von Targets, die für eine biologische Einflussnahme auf den Haarfollikel zur Verfügung stehen. Daher werden bisher nicht die Ursachen der Haarergrauung bekämpft, sondern die Haare zur Grauabdeckung mit Hilfe von chemischen, oft aggressiven und damit das Haar schädigenden Colorationen behandelt. Die Wirksamkeit der zur Zeit vereinzelt auf dem Markt befindlichen biologischen Produkte ist wissenschaftlich nicht erwiesen und oft zweifelhaft. Signifikant wirksame, biologisch aktive Wirkstoffe, die den Ergrauungssprozess direkt an der Wurzel beeinflussen, kommen aufgrund fehlender Targets nicht zum Einsatz. Durch geeignete Wirkstoffformulierungen die Pigmentierung und damit Jugendlichkeit der Haare zu erhalten ist somit eine Herausforderung für die kosmetische Forschung und Entwicklung.
Es besteht daher ein Bedarf an der Identifikation möglichst vieler, vorzugsweise aller, für Ergrauungsprozess im menschlichen Haarfollikel wichtigen Gene.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen möglichst großen Teil der für die Ergrauung der menschlichen Haarfollikel bedeutsamen Gene zu identifizieren.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur molekularen Charakterisierung von menschlichem ergrautem und pigmentiertem Haar, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man a) ein erstes Gemisch von in ergrauten menschlichen Haarfollikeln exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus ergrauten menschlichen Haarfollikeln gewinnt, b) ein zweites Gemisch von in pigmentierten menschlichen Haarfollikeln exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus pigmentierten menschlichen Haarfollikeln gewinnt und c) die in a) und b) gewonnenen Gemische einer differentiellen Analyse der Genexpression unterwirft, und dadurch die Gene identifiziert, die in ergrauten bzw. pigmentierten Haarfollikeln unterschiedlich stark (differentiell) exprimiert werden.
Einzelnen gezupften humanen Haarfollikeln haftet ausreichend biologisches Material an, um relevante Parameter, die gegebenenfalls bei der Haarergrauung eine Rolle spielen, auf zellulärer Ebene zu erfassen. Das anhaftende biologische Material besteht aus Zellen der äußeren Bindegewebsscheide (CTS-Fibroblasten), Keratinozyten der äußeren und inneren Wurzelscheide (ORS- und IRS-Keratinozyten), Matrix- und Wurzelscheidenmelanozyten sowie Matrixkeratinozyten. Makroskopische Veränderungen der Pigmentierung des Haares sind unmittelbare Folgen einer Modulation von Genen, Proteinen und Stoffwechselprodukten in den Haarfollikelzellen. Durch die molekulare Analyse von ergrauten Haarfollikeln gegenüber pigmentierten Haarfollikeln kann eine umfassende Charakterisierung der ergrauungsbedingten Veränderungen im Haarfollikel durchgeführt und neue Targets und Signalwege können so identifiziert werden, die die Depigmentierung entscheidend beeinflussen. Durch die Analyse und Quantifizierung der bei der Haarergrauung auftretenden zellulären Effekte können somit Rückschlüsse auf die zu erwartenden makroskopischen Veränderungen des Haares gezogen werden, bevor sich diese im sichtbaren Haarschaft manifestieren. Die globalen Steuerungsmechanismen auf Genebene unter Berücksichtigung des zellulären Zusammenspiels der verschiedenen Zelltypen lassen sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren direkt bestimmen. Mittels verschiedener proteinanalytischer Methoden wie beispielsweise Westernblot oder Proteinarray können die pigmentierungsrelevanten Marker Marker auch auf Proteinebene bestimmt und ergrauungsabhängige Effekte auf das Proteinexpressionsmuster untersucht werden.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es vorteilhafterweise möglich, den komplexen Prozess der Haarergrauung und die kausalen Zusammenhänge der Veränderungen am ergrauten Haar zu begreifen. Nur mit diesem Wissen können neue Konzepte für kosmetische Haar-Produkte entwickelt werden, die ihre Wirkung auf das breite Spektrum der Genexpression im ergrauten Haarfollikel ausüben. Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführte differentielle Analyse zeigt erstmals in umfassender Weise, welche Gene in ergrautem und pigmentiertem Haar exprimiert werden, und welche Gene in ergrautem Har anders exprimiert werden als in pigmentiertem Haar.
Erst durch die systematische und umfassende Identifizierung der während der Haarergrauung modifizierten zellulären Prozesse wird die gezielte Entwicklung biologisch aktiver Haarpflegeprodukte, die die Haarergrauung wirksam bekämpfen, ermöglicht.
Vorteilhafterweise ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren somit erstmals eine umfassende systematische Identifikation der pigemtierungsrelevanten Veränderungen im Haarfollikel sowie eine Beschreibung des Gen- und Proteinexpressionsstatus humaner ergrauter versus pigmentierter Haarfollikel durch Quantifizierung relevanter Proteine und mRNA mit erfindungsgemäß geeigneten Kits oder Methoden.
Die vorliegende Erfindung leistet auch einen Beitrag zur Aufklärung der mechanistischen Zusammenhänge der Pigmentierung und Haarergrauung in vivo im komplexen Zellverband des humanen Haarfollikels und zur Identifikation von Zielparametern zur effektiven biologischen Verhinderung der Haarergrauung und zur Re-Pigmentierung
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt in der Möglichkeit zur Entwicklung bzw. Evaluierung von Wirkstoffen und deren Effekte auf eine Vielzahl von Markern im Haarfollikel, die für ergrauungsbedingten Veränderungen im Haarfollikel charakteristisch sind, durch Quantifizierung der Expression von Markergenen und -proteinen mit erfindungsgemäß geeigneten Kits oder Methoden.
Vorzugsweise erhält man die in den Schritten a) und b) zu gewinnenden Gemische aus Haarfollikeln behaarter Kopfhaut.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die Untersuchung in Schritt c) mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter i. Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese ii. Affinitätschromatographie iii. Protein-Protein-Komplexierung in Lösung iv. ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) v. enzymgekoppelte Stoffwechselassays vi. Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI), vii. Einsatz von Proteinchips, Northern Blots, viii. Real Time Quantitative Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), ix. Multiplex-PCR, x. RNase-Schutzexperimente, xi. Dot-Blots, xii. CDNA-Sequenzierung, xiii. Klon-Hybridisierung, xiv. Differential Display, xv. Subtraktive Hybridisierung, xvi. cDNA-Fragment-Fingerprinting, xvii. Durchflusszytometrieanalysen, xviii. Serielle Analyse der Genexpression (SAGE) und insbesondere xix. Einsatz von Nukleinsäurechips, • oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
Besonders bevorzugt ist im Sinne der vorliegenden Erfindung die Quantitative Real Time Polymerasekettenreaktion (RT-PCR). Die RT-PCR ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) beruht, und zusätzlich die Möglichkeit der Quantifizierung bietet. Die Quantifizierung wird mit Hilfe von Fluoreszenz-Messungen am Ende bzw. während eines PCR-Zykluses durchgeführt und unterscheidet sich somit von anderen quantitativen PCR-Methoden (qPCR), die erst nach Ablauf der PCR quantitativ ausgewertet werden (z.B. Kompetitive PCR). Die Fluoreszenz nimmt proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu, was eine Quantifizierung möglich macht. Eine Gelelektrophoretische Auftrennung der Fragmente ist nicht nötig, die Daten sind sofort verfügbar und das Kontaminationsrisiko ist vorteilhafterweise gering („A-Z of Quantitative PCR" IUL Biotechnology Series, ed. by Stephen A. Bustin).
Zur Erfassung der differentiellen Genexpression ergrauter bzw. pigmentierter Haarfollikel können aber auch andere dem Fachmann bekannten Methoden eingesetzt werden, beispielsweise die Technik der „Seriellen Analyse der Genexpression" (SAGE™). Diese Technik erlaubt gleichzeitig die Identifikation und Quantifizierung aller in ergrauten bzw. pigmentierten Haarfollikeln exprimierten Gene. Die Analyse der Genexpression ist auch mit der Quantifizierung spezifischer mRNA-Moleküle möglich (z.B. Northern-Blot, RNase-Schutzexperimente). Außerdem können die Techniken MPSS (Massive Parallel Signiture Sequencing) oder Techniken, die auf Differential display beruhen, erfindungsgemäß eingesetzt werden.
Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Methoden sind in den Übersichtsartikeln von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837 - 846 (2000), und „Genomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788, 827 - 836 (2000), und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Zur Erfassung der differentiellen Genexpression ergrauter bzw. pigmentierter Haarfollikel kann erfindungsgemäß auch die Analyse mittels Ganzgenom-Microarray eingesetzt werden, beispielsweise der Whole Human Genome Microarray der Firma Agilent eingesetzt. Dieser umfasst ca. 34.000 Gene.
Die 2D-Gelelektrophorese wird beispielsweise in L. D. Adams, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the Isodalt System oder in L. D. Adams & S. R. Gallagher, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell System; beide in Current Protocols in Molecular Biology (1997, Eds. F. M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1 - 10.4.13; oder in 2-D Electrophoresis-Manual; T. Berkelman, T. Senstedt; Amersham Pharmacia Biotech, 1998 (Bestell-Nr. 80-6429-60), beschrieben.
Die massenspektrometrische Charakterisierung der Proteine oder Proteinfragmente erfolgt in der Fachwelt bekannter Weise, beispielsweise wie in den folgenden Literaturstellen beschrieben:
Methods in Molecular Biology, 1999; VoI 112; 2-D Proteome Analysis Protocols; Editor: A. J. Link; Humana Press; Totowa; New Jersey. Darin insbesondere: Courchesne, P. L. und Patterson, S. D.; S. 487-512.
Carr, S. A. und Annan, R. S.; 1997; in: Current Protocols in Molecular Biology; Editor: Ausubel, F. M. et al.; John Wiley and Sons, Inc. 10.2.1-10.21.27.
Es können jedoch erfindungsgemäß auch andere dem Fachmann bekannte Methoden zur Erfassung der differentiellen Genexpression ergrauter bzw. pigmentierter Haarfollikel eingesetzt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken.
Beispiele:
Beispiel 1 : An der Melanogenese beteiligte Liganden Die Regulation der Melanogenese und damit der Pigmentierung im Haarfollikel unterliegt einem komplizierten Zusammenspiel unterschiedlicher Liganden, Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren und Effektorgene. Da die Melanogenese in ergrauten Follikeln offensichtlich beeinflusst ist, kann davon ausgegangen werden, dass im ergrauten Follikel Teile dieses Netzwerkes in ihrer Funktion modifiziert sind. Welche Komponenten wie reguliert sind ist für den Menschen jedoch noch weitestgehend unbekannt. Am Anfang der Signalkette stehen die Liganden. Daher wurde die Expression von SCF (Stern cell Factor), dem Liganden des Rezeptors c-kit, in gezupften ergrauten und pigmentierten Haarfollikel mit Hilfe eines quantitativen Real-Time-PCR-Verfahrens untersucht. Aus der Literatur ist bekannt, dass SCF eine Rolle bei der Melanogenese in murinen Haarfollikeln spielt. Die Bedeutung von SCF für den humanen Follikel und seine Regulation im ergrauten Haar ist bisher jedoch unbekannt.
Jeweils 15 graue und 15 pigmentierte Haarfollikel wurden von jeweils einem Probanden entnommen und die RNA mit Hilfe des RNeasy Mini Kits der Fa. Qiagen jeweils getrennt isoliert. Zur Durchführung der PCR wurde die RNA anschließend mittels reverser Transkription in cDNA umgeschrieben. Bei der anschließenden PCR Reaktion, die mit Hilfe genspezifischer Primer für die jeweiligen Haarkeratine durchgeführt wird und die der Amplifikation der gesuchten Genabschnitte dient, wird die Bildung der PCR-Produkte online über ein Fluoreszenzsignal detektiert. Das Fluoreszenzsignal ist dabei proportional zur Menge des gebildeten PCR-Produktes. Je stärker die Expression eines bestimmten Gens ist, desto größer ist die Menge an gebildetem PCR-Produkt und um so höher ist das Fluoreszenzsignal. Üblicherweise kann bei einer Expressionsänderung um den Faktor 1 ,8 der Kontrolle von einer echten Regulation ausgegangen werden. Sowohl die RNA aus den grauen als auch aus den pigmentierten Follikeln wurde in Pools aus jeweils 2-4 Probanden unterteilt (insgesamt 23 Probanden in 8 Pools), wobei die Expressionsänderung im ergrauten Follikel durch Normierung auf die entsprechende pigmentierte Kontrollgruppe berechnet wurde.
Gezeigt ist in Tabelle 1 die differentielle Genexpression der Probandenpools (Expression in grauen Follikeln bezogen auf die entsprechenden pigmentierten Follikel) .
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
SCF 1 ,64 1 ,02 1 ,22 1 ,84 -1 ,14 -1 ,66 -2,11 3,02
(Tabelle 1 )
Darüber hinaus wurden die Ergebnisse auf Proteinebene mit Hilfe immunhistologischer Färbungen in grauen und pigmentierten Haaren bestätigt (Fig. 1 und 2). Die Ergebnisse verdeutlichen, dass SCF durch die Haarergrauung vermutlich nicht beeinflusst wird.
Ein weiterer wichtiger melanogenese-assoziierter Ligand ist α-MSH (alpha melanocyte stimulating hormone). Da α-MSH als ein Spaltprodukt eines größeren Proteinkomplexes in den Zellen vorliegt, kann sein Gehalt nicht mit Hilfe der RT-PCR bestimmt werden. α-MSH wurde daher auf Proteinebene mittels immunhistologischer Färbungen in grauen und pigmentierten Follikeln nachgewiesen (Fig. 3 und 4). Die Ergebnisse zeigen, dass α-MSH durch die Haarergrauung vermutlich nicht beeinflusst wird.
Beispiel 2: Rezeptoren
Die an der Melanogenese beteiligten Liganden wie SCF oder α-MSH (Melanocyte Stimulating Hormone alpha) binden an verschiedene Rezeptoren, durch die das entsprechende Signal ins Zellinnere weitergeleitet wird. Der Rezeptor für SCF ist c-kit, der Rezeptor für α-MSH ist MCR-1 (Melanocortin Receptor 1 ). Die Expression von c-kit und MCR-1 wurde mittels des in Beispiel 1 beschriebenen Real Time PCR-Verfahrens untersucht. Die Proteinexpression von c-kit wurde mittels Western Blot analysiert. Die Expressionsänderung im ergrauten Follikel wurden durch Normierung auf die entsprechende pigmentierte Kontrollgruppe berechnet.
Gezeigt ist in Tabelle 2 die differentielle Genexpression der Probandenpools (Expression in grauen Follikeln bezogen auf die entsprechenden pigmentierten Follikel).
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 c-kit -2,23 -18,28 -10,34 -11 ,13 -10,56 -6,26 -22,73 -22,06
MCR1 1 ,17 -3,71 -1 ,91 -1 ,85 -3,83 -3,29 -3,46 -1 ,74
(Tabelle 2)
Tabelle 3 zeigt die differentielle Proteinexpression der Probandenpools (Expression in grauen Follikeln bezogen auf die entsprechenden pigmentierten Follikel)
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 c-kit - -3,53 -3,38 -2,88 4,47 -16,71 -3,83 -1 ,29
(Tabelle 3)
Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl auf Gen- als auch auf Proteinebene die Expression von c-kit in depigmentierten Haarfollikeln signifikant gegenüber den pigmentierten Follikeln verringert ist. Für MCR-1 konnte ebenfalls eine signifikante Repression in ergrauten gegenüber pigmentierten Follikeln nachgewiesen werden, c-kit und MCR-1 sind damit wichtige potentielle Parameter zur Beeinflussung der Haarergrauung.
Beispiel 3: Transkriptionsfaktoren
Transkriptionsfaktoren sind Proteine, die für die Initiation der RNA-Polymerase bei der Transkription von Bedeutung ist. Außerdem sind sie bei der Regulation der Elongation und Termination beteiligt. Dabei binden Transkriptionsfaktoren die DNA und aktivieren bzw repremieren so den entsprechenden Promotor. Daneben gibt es weitere Transkriptionsfaktoren, die nicht direkt an die DNA, sondern zum Beispiel an andere DNA-bindende Proteine binden. Ein in Mäusen beschriebener melanogenese-assoziierter Transkriptionsfaktor ist MITF (Microphthalmia transcription factor). Darüber hinaus spielen die Transkriptionsfaktoren Pax3, Sox10 und ß-catenin in murinen Systemen eine Rolle. Die Expression von MITF, Pax3 und Sox10 wurde mittels des in Beispiel 1 beschriebenen Real Time PCR-Verfahrens untersucht. Die Expressionsänderung im ergrauten Follikel wurden durch Normierung auf die entsprechende pigmentierte Kontrollgruppe berechnet. Die Proteinexpression von MITF wurde mittels immunhistochemischer Färbungen an grauen und pigmentierten Follikeln untersucht. Die Proteinexpression von ß-catenin wurde mittels Western Blot analysiert.
Gezeigt ist in Tabelle 4 die differentielle Genexpression der Probandenpools (Expression in grauen Follikeln bezogen auf die entsprechenden pigmentierten Follikel).
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
MITF -1 ,2 -1 ,1 -1 ,2 1 ,23 -1 ,1 -1 ,0 -1 ,2 -1 ,1
Pax3 -22,0 -30, 9 -36,6 -13,0 -24,4 -42,2 -6,37 -39
Sox10 -5,4 -32, 7 -22,5 -12,3 -5,9 ß-catenin -1 ,0 1 ,0 -1 ,1 1 ,3 -1 ,8 -1 ,2 -1 ,0 -1 ,C
(Tabelle 4)
Die Fig. 5 und 6 zeigen MITF als immunhistologische Färbung an pigmentierten und grauen Follikeln.
Gezeigt ist in Tabelle 5 die Proteinexpression der Probandenpools (Expression in grauen Follikeln bezogen auf die entsprechenden pigmentierten Follikel).
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 ß-catenin -1 ,1 1 ,0 -1 ,0 -1 ,2 -1 ,2 -1 ,1 -1 ,3 1 ,2
(Tabelle 5)
Die Ergebnisse zeigen, dass die Transkriptionsfaktoren MITF, Sox10 sowie Pax3 am Ergrauungsprozess beteiligt sind. Dabei ist zu berücksichtigen, dass die Regulation von MITF nicht auf Genexpressionsebene erfolgt, sondern entweder posttranslational z.B. durch Beeinflussung der Stabilität von MITF oder durch direkte Effekte auf die Translation, ß-catenin ist nicht vom Ergrauungsprozess betroffen.
Beispiel 4: Effektorgene
Durch die vorausgeschaltete Kaskade von Liganden, Rezeptoren und Transkriptionsfaktoren wird die Expression der Effektorgene beeinflusst. Im Fall der Melanogenese sind dies beispielsweise TRP1 (Tyrosinase related protein 1 ) und TRP2, beides Enzyme, die an der Verstoffwechselung von Tyrosin zu Melanin beteiligt sind, gp100, ein in der Membran von Melanosomen lokalisiertes Protein oder MART1 (Melanoma Antigen Recognized by T cells 1 ), welches eine wichtige Rolle für die Funktionalität (z.B. Stabilität) von gp100 spielt.
Die Expression von TRP1 , TRP2, gp100 und MART1 wurde mittels des in Beispiel 1 beschriebenen Real Time PCR-Verfahrens untersucht. TRP2 wurde in den Haarfollikeln darüber hinaus auch auf Proteinebene mittels Western Blot analysiert. TRP1 , gp100 und MART1 wurden immunhistologisch an grauen und pigmentierten Follikeln untersucht.
Gezeigt ist in Tabelle 6 die differentielle Genexpression der Probandenpools (Expression in grauen Follikeln bezogen auf die entsprechenden pigmentierten Follikel).
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
TRP1 -2,1 -52,1 -15,2 -291 ,3 -15,7 -22,5 -97,7 -103,7
TRP2 -1 ,2 -3,5 1 ,1 -1 ,2 1 ,1 -1 ,8 -1 ,7 2,2 gp100 -2,9 -33,9 -12,0 -30,6 -23,5 -18,4 -39,1 -23,9
MART 1 -44,2 -144,7 -90,1 -159,2 -248,8 -117,4 -172,4 -66,7
(Tabelle 6)
Tabelle 7 zeigt die differentielle Proteinexpression der Probandenpools (Expression in grauen Follikeln bezogen auf die entsprechenden pigmentierten Follikel)
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
TRP2 -6,13 -32,00 1 ,18 -2,33 -1 ,11 -1 ,44 -1 ,66 -24,63
(Tabelle 7)
Die Figuren 7-12 zeigen TRP1 , gp100 sowie MART1 in einer immunhistologischen Färbung in pigmentierten und grauen Follikeln.
Beispiel 5: cDNA Microarray Daten
Um die molekularen Veränderungen im ergrauten Haarfollikel umfassend zu charakterisieren, sowie zusammenhängende Pathways und mögliche Targets zu identifizieren, wurde die Genexpression mit Hilfe eines cDNA Microarrays untersucht.
Die Ganzgenomanalyse ergab ein Set an Regulationen im ergrauten Follikelwobei Tabelle 8 die 30 am stärksten differentiell expremierten Gene zeigt. Sequence Log2
Name(s) Ratio P-value Accession # Sequence Description
TYRP 1 -5 ,90 0 NM_000550 tyrosinase-related protein 1 (TYRP1 )
MLANA -4 ,95 0 NM_005511 melan-A (MLANA)
THC2100046 -4 ,75 4,25E-42 THC2100046 Myelin gene expression factor 2, partial (10%)
TYR -4 ,72 0 NM_000372 tyrosinase (oculocutaneous albinism IA) (TYR)
KRTHA7 3, 68 6,43E-20 NM_003770 keratin, hair, acidic, 7 (KRTHA7) v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral
KIT -3 ,30 0 NM_000222 oncogene homolog (KIT)
SILV -2 ,97 0 NM_006928 silver homolog (mouse) (SILV)
CSAG2 2, 34 0,00002 NM_004909 taxol resistance associated gene 3 (TRAG3)
RNF28 -2 ,20 7,60E-38 NM_032588 ring finger protein 28 (RNF28)
C16orf30 -2 ,18 0 NM_024600 hypothetical protein FLJ20898 (FLJ20898)
GJB1 -2 ,11 0,00016 NM_000166 gap junction protein, beta 1 , 32kDa
AV656516 AV656516 GLC cDNA clone
THC2230388 1 , 77 0,00031 THC2230388 GLCESB07 3'
THC2058421 1 , 74 3,62E-08 THC2058421 Unknown transient receptor potential cation Channel,
TRPM1 -1 ,71 6,71 E-19 NM_002420 subfamily M, member 1 (TRPM1 )
GPR143 -1 ,64 2,80E-45 NM_000273 G protein-coupled receptor 143 (GPR143)
AGENCOURT_6414428 NIH_MGC_72 cDNA
BM459062 -1 ,64 9,15E-18 BM459062 clone IMAGE:5557378 5' melanocortin 1 receptor (alpha melanocyte
MC1 R -1 ,64 0,00067 NM_002386 stimulating hormone receptor) (MC1 R) endothelin receptor type B (EDNRB), transcript
EDNRB -1 ,56 0 NM_003991 variant 2
C17 -1 ,51 1 ,55E-06 NM_018659 cytokine-like protein C17 (C17)
A_24_P843335 1 , 51 0,00004 A_24_P843335 Unknown paired box gene 3 (PAX3), transcript variant
PAX3 -1 ,49 3,69E-38 NM_181458 PAX3D
RUNX3 -1 ,48 1 ,38E-09 NM_004350 runt-related transcription factor 3 (RUNX3
PLP1 -1 ,47 1 ,03E-11 M54927 Human myelin proteolipid protein mRNA
S100 calcium binding protein, beta (neural)
S100B -1 ,41 9,75E-09 NM 006272 (S100B)
ZNF258 -1 ,36 0,00012 NM_007167 zinc finger protein 258 (ZNF258)
RGS1 -1 ,33 1 ,09E-09 NM_002922 regulator of G-protein signalling 1 (RGS1 )
LPPR4 -1 ,31 1 ,45E-21 NM_014839 plasticity related gene 1 (LPPR4)
A_32_P22245 1 , 30 0,00004 A_32_P22245 Unknown
THC2113405 1 , 30 0,00002 THC2113405 ALU2_HUMAN (P39189)
0LFM1 -1 ,27 9,29E-10 NM 006334 olfactomedin 1 (OLFM 1 ), transcript variant 2
(Tabelle 8)
Davon werden folgende Parameter als hochrelevant eingestuft:
Sequence Log2
Name(s) Ratio Accession # Sequence Description
Melanogenese
TYRP 1 -5,9 NM_000550 tyrosinase-related protein 1 (TYRP1 )
MLANA -4,95 NM_005511 melan-A (MLANA)
TYR -4,72 NM_000372 tyrosinase (oculocutaneous albinism IA) (TYR)
KIT -3,3 NM 000222 v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog (KIT)
SILV -2,97 NM_006928 silver homolog (mouse) (SILV)
RNF28 -2,2 NM_032588 ring finger protein 28 (RNF28)
GJB1 -2,11 NM_000166 gap junction protein, beta 1 , 32kDa transient receptor potential cation Channel, subfamily
TRPM1 -1 ,71 NM_002420 M, member 1 (TRPM1 )
GPR143 -1 ,64 NM_000273 G protein-coupled receptor 143 (GPR143) melanocortin 1 receptor (alpha melanocyte
MC1 R -1 ,64 NM_002386 stimulating hormone receptor) (MC1 R) endothelin receptor type B (EDNRB), transcript
EDNRB -1 ,56 NM_003991 variant 2
PAX3 -1 ,49 NM_181458 paired box gene 3 (PAX3), transcript variant PAX3D
S100B -1 ,41 NM_006272 S100 calcium binding protein, beta (neural) (S100B)
Signaltransduktion
RGS1 -1 ,33 NM_002922 regulator of G-protein signalling 1 (RGS1 )
C17 -1 ,51 NM_018659 cytokine-like protein C17 (C17)
Transkription
RUNX3 -1 ,48 NM_004350 runt-related transcription factor 3 (RU NX3
Cytoskelett
KRTHA7 3,68 NM_003770 keratin, hair, acidic, 7 (KRTHA7)
Unbekannte Gene
THC2058421 1 ,74 THC2058421 Unknown
A_24_P843335 1 ,51 A_24_P843335 Unknown
A 32 P22245 1 ,3 A 32 P22245 Unknown
(Tabelle 9)
Aus diesen Daten lässt sich unter anderem das in Fig. 13 dargestellte Netzwerk ableiten, wobei die schwarz umrahmten Parameter in ergrauten Follikeln repremiert sind, die nicht umrahmten nicht reguliert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Haarbehandlungsmittel, enthaltend mindestens einen Wirkstoff, der die Expression mindestens eines der in ergrauten Haarfollikeln und in pigmentierten Haarfollikeln differentiell exprimierten Gene positiv oder negativ zu beeinflussen vermag.
Erfindungsgemäß bevorzugte Gene sind ausgewählt unter Tyrosinase, Tyrosinase related Protein 1 , Tyrosinase related Protein 2, Melanocortin Receptor 1 , c-kit, MITF (microphthalmia-associated transcription factor), Pax3, Sox10, MART1 und gp100 sowie unter den in den Tabellen 8 und 9 aufgelisteten Genen. Besonders bevorzugte Gene sind die als hochrelevant in Tabelle 9 aufgelisteten Gene.
In den Tabellen 1 bis 9 ist die Stärke der differentiellen Expression angegeben, d. h., um welchen Faktor das jeweilige Gen in pigmentierten Haarfollikeln stärker exprimiert wird, als in ergrauten Haarfollikeln, oder umgekehrt. Unter ihrer UniGene-Accession-Number oder unter ihrem Namen sind die jeweiligen Gene bzw. Genprodukte in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) offenbart. Diese Datenbank ist im Internet unter folgender Adresse zugänglich: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Die Gene bzw. Genprodukte sind außerdem unter den Internet-Adressen http://www.ncbi.nlm.nih.qov/UniGene/Hs.Home.html oder http://www.ncbi.nlm.nih.gov/qenome/quide direkt zugänglich.
Das erfindungsgemäße Mittel kann zusätzlich Proteinhydrolysate umfassen, vorzugsweise kationisierte Proteinhydrolysate, wobei das zugrunde liegende Proteinhydrolysat vom Tier, beispielsweise aus Collagen, Milch oder Keratin, von der Pflanze, beispielsweise aus Weizen, Mais, Reis, Kartoffeln, Soja oder Mandeln, von marinen Lebensformen, beispielsweise aus Fischcollagen oder Algen, oder biotechnologisch gewonnenen Proteinhydrolysaten, stammen kann. Die den kationischen Derivaten zugrunde liegenden Proteinhydrolysate können aus den entsprechenden Proteinen durch eine chemische, insbesondere alkalische oder saure Hydrolyse, durch eine enzymatische Hydrolyse und/oder einer Kombination aus beiden Hydrolysearten gewonnen werden. Die Hydrolyse von Proteinen ergibt in der Regel ein Proteinhydrolysat mit einer Molekulargewichtsverteilung von etwa 100 Dalton bis hin zu mehreren tausend Dalton. Bevorzugt sind solche kationischen Proteinhydrolysate, deren zugrunde liegender Proteinanteil ein Molekulargewicht von 100 bis zu 25000 Dalton, bevorzugt 250 bis 5000 Dalton aufweist. Weiterhin sind unter kationischen Proteinhydrolysaten quaternierte Aminosäuren und deren Gemische zu verstehen. Die Quaternisierung der Proteinhydrolysate oder der Aminosäuren wird häufig mittels quarternären Ammoniumsalzen wie beispielsweise N,N-Dimethyl-N-(n-Alkyl)-N-(2-hydroxy-3- chloro-n-propyl)-ammoniumhalogeniden durchgeführt. Weiterhin können die kationischen Proteinhydrolysate auch noch weiter derivatisiert sein. Als typische Beispiele für die kationischen Proteinhydrolysate und -derivate seien die unter den INCI - Bezeichnungen im "International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook", (seventh edition 1997, The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association 1101 17th Street, N.W., Suite 300, Washington, DC 20036-4702) genannten und im Handel erhältlichen Produkte genannt: Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Collagen, Cocodimopnium Hydroxypropyl Hydrolyzed Casein, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Collagen, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Hair Keratin, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Keratin, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Rice Protein, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed SiIk, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Soy Protein, Cocodimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Wheat Protein, Cocodimonium Hydroxypropyl SiIk Amino Acids, Hydroxypropyl Arginine Lauryl/Myristyl Ether HCl, Hydroxypropyltrimonium Gelatin, Hydroxypropyltrimonium Hydrolyzed Casein, Hydroxypropyltrimonium Hydrolyzed Collagen, Hydroxypropyltrimonium Hydrolyzed Conchiolin Protein, Hydroxypropyltrimonium Hydrolyzed keratin, Hydroxypropyltrimonium Hydrolyzed Rice Bran Protein, Hydroxyproypltrimonium Hydrolyzed SiIk, Hydroxypropyltrimonium Hydrolyzed Soy Protein, Hydroxypropyl Hydrolyzed Vegetable Protein, Hydroxypropyltrimonium Hydrolyzed Wheat Protein, Hydroxypropyltrimonium Hydrolyzed Wheat Protein/Siloxysilicate, Laurdimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Soy Protein, Laurdimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Wheat Protein, Laurdimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Wheat Protein/Siloxysilicate, Lauryldimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Casein, Lauryldimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Collagen, Lauryldimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Keratin, Lauryldimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed SiIk, Lauryldimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Soy Protein, Steardimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Casein, Steardimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Collagen, Steardimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Keratin, Steardimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Rice Protein, Steardimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed SiIk, Steardimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Soy Protein, Steardimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Vegetable Protein, Steardimonium Hydroxypropyl Hydrolyzed Wheat Protein, Steartrimonium Hydroxyethyl Hydrolyzed Collagen, Quaternium-76 Hydrolyzed Collagen, Quaternium-79 Hydrolyzed Collagen, Quaternium-79 Hydrolyzed Keratin, Quaternium-79 Hydrolyzed Milk Protein, Quaternium-79 Hydrolyzed SiIk, Quaternium-79 Hydrolyzed Soy Protein, Quaternium-79 Hydrolyzed Wheat Protein.
Obwohl das erfindungsgemäße Mittel prinzipiell auf dem Haar verbleiben kann, wird das Mittel vorzugsweise nach einer Einwirkzeit von 10 Sekunden bis 60 Stunden ausgespült. Dieses Ausspülen kann mit reinem Wasser oder einem marktüblichen Shampoo erfolgen. Einwirkzeiten von 1 bis 15 Minuten haben sich in den meisten Fällen als ausreichend erwiesen.
Unabhängig von dem genauen Ablauf der Behandlung hat es sich als vorteilhaft erwiesen, das erfindungsgemäße Mittel bei einer Temperatur von 20 bis 55 0C, insbesondere von 35 bis 4O0C, anzuwenden.
Hinsichtlich der Art, gemäß das erfindungsgemäße Mittel auf das Haar, aufgebracht wird, bestehen keine prinzipiellen Einschränkungen.
Erfindungsgemäß von besonderem Interesse sind Haartonics, insbesondere als leave on Formulierung. Diese werden vorzugsweise bei Raumtemperatur angewendet, der alkoholische Gehalt liegt bevorzugtermaßen im Bereich von etwa 30 % bis etwa 35 % und der pH-Wert sollte etwa bei pH 7 liegen.
Als Konfektionierung der das erfindungsgemäße Mittel enthaltenden Zubereitungen sind beispielsweise Cremes, Lotionen, Lösungen, Wässer, Emulsionen wie W/O-, O/W-, PIT- Emulsionen (Emulsionen nach der Lehre der Phaseninversion, PIT genannt), Mikroemulsionen und multiple Emulsionen, Gele, Sprays, Aerosole und Schaumaerosole geeignet. Diese werden in der Regel auf wäßriger oder wäßrig-alkoholischer Basis formuliert. Als alkoholische Komponente kommen dabei niedere Alkanole sowie Polyole wie Propylenglykol und Glycerin zum Einsatz. Ethanol und Isopropanol sind bevorzugte Alkohole. Wasser und Alkohol können in der wäßrig alkoholischen Basis in einem Gewichtsverhältnis von 1 : 10 bis 10 : 1 vorliegen. Wasser sowie wäßrig-alkoholische Mischungen, die bis zu 50 Gew.-%, insbesondere bis zu 25 Gew.-%, Alkohol, bezogen auf das Gemisch Alkohol/Wasser, enthalten, können erfindungsgemäß bevorzugte Grundlagen sein. Der pH-Wert dieser Zubereitungen kann prinzipiell bei Werten von 2 - 11 liegen. Er liegt bevorzugt zwischen 2 und 7, wobei Werte von 3 bis 5 besonders bevorzugt sind. Zur Einstellung dieses pH-Wertes kann praktisch jede für kosmetische Zwecke verwendbare Säure oder Base verwendet werden. Üblicherweise werden als Säuren Genußsäuren verwendet. Unter Genußsäuren werden solche Säuren verstanden, die im Rahmen der üblichen Nahrungsaufnahme aufgenommen werden und positive Auswirkungen auf den menschlichen Organismus haben. Genußsäuren sind beispielsweise Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Äpfelsäure, Ascorbinsäure und Gluconsäure. Im Rahmen der Erfindung ist die Verwendung von Zitronensäure und Milchsäure besonders bevorzugt. Bevorzugte Basen sind Ammoniak, Alkalihydroxide, Triethanolamin sowie N,N,N',N'-Tetrakis-(2-hydroxypropyl)-ethylendiamin.
Das Mittel kann als Einkammersystem oder als Zweikammersystem konfektioniert werden.
Neben der erfindungsgemäß zwingend erforderlichen Verbindung, die die Expression mindestens eines der in älteren Haarfollikeln und in jungen Haarfollikeln differentiell exprimierten Gene positiv oder negativ zu beeinflussen vermag, kann das Mittel prinzipiell alle weiteren, dem Fachmann für solche kosmetischen Mittel bekannten Komponenten enthalten.
Weitere Wirk-, Hilfs- und Zusatzstoffe sind beispielsweise
- nichtionogene Tenside wie beispielsweise Alkylphenolpolyglycolether, Fettsäurepolyglycolester, Fettsäureamidpolyglycolether, Fettaminpolyglycolether, alkoxylierte Triglyceride, wie insbesondere ethoxyliertes Rizinusöl, Alk(en)yloligoglucoside, Fettsäure-N-alkylglucamide, Polyolfettsäureester, Zuckerester, Sorbitanester und Polysorbate. Sofern die nichtionischen Tenside Polyglycoletherketten enthalten, können sie eine konventionelle oder eingeengte Homologenverteilung aufweisen.
- anionische Tenside, insbesondere Alkylsulfate, Alkylpolyglykolethersulfate und Ether- carbonsäuren mit 10 bis 18 C-Atomen in der Alkylgruppe und bis zu 12 Glykolethergruppen im Molekül, Seifen sowie Sulfobernsteinsäuremono- und
- dialkylester mit 8 bis 18 C-Atomen in der Alkylgruppe und Sulfobernsteinsäuremono-alkylpolyoxy- ethyl-ester mit 8 bis 18 C-Atomen in der Alkylgruppe und 1 bis 6 Oxyethylgruppen,
- zwitterionische Tenside, insbesondere die sogenannten Betaine wie die N-Alkyl-N,N-dime- thylammonium-glycinate, beispielsweise das Kokosalkyl-dimethylammonium-glycinat, N-Acyl- aminopropyl-N,N-dimethylammoniumglycinate, beispielsweise das Kokosacylaminopropyl- dimethylammoniumglycinat, und 2-Alkyl-3-carboxylmethyl-3-hydroxyethyl-imidazoline mit jeweils 8 bis 18 C-Atomen in der Alkyl- oder Acylgruppe sowie das Kokosacylaminoethylhydroxyethyl- carboxymethylglycinat,
- ampholytische Tenside wie beispielsweise N-Alkylglycine, N-Alkylpropionsäuren, N-Alkylamino- buttersäuren, N-Alkyliminodipropionsäuren, N-Hydroxyethyl-N-alkylamidopropylglycine, N-Alkyl- taurine, N-Alkylsarcosine, 2-Alkylaminopropionsäuren und Alkyl-aminoessigsäuren mit jeweils etwa 8 bis 18 C-Atomen in der Alkylgruppe,
- nichtionische Polymere wie beispielsweise Vinylpyrrolidon/Vinylacrylat-Copoly mere, Polyvinylpyrrolidon und Vinylpyrrolidon/Vinylacetat-Copolymere und Polysiloxane,
- Verdickungsmittel wie Agar-Agar, Guar-Gum, Alginate, Xanthan-Gum, Gummi arabicum, Karaya- Gummi, Johannisbrotkernmehl, Leinsamengummen, Dextrane, Cellulose-Derivate, z. B. Methylcellulose, Hydroxyalkylcellulose und Carboxymethylcellulose, Stärke-Fraktionen und Derivate wie Amylose, Amylopektin und Dextrine, Tone wie z. B. Bentonit oder vollsynthetische Hydrokolloide wie z. B. Polyvinylalkohol,
- Strukturanten wie Maleinsäure und Milchsäure,
- haarkonditionierende Verbindungen wie Phospholipide, beispielsweise Sojalecithin, Ei-Lecitin und Kephaline, sowie Silikonöle,
- Parfümöle, Dimethylisosorbid und Cyclodextrine,
- Lösungsmittel und -vermittler wie Ethanol, Isopropanol, Ethylenglykol, Propylenglykol, Glycerin und Diethylenglykol,
- symmetrische und unsymmetrische, lineare und verzweigte Dialkylether mit insgesamt zwischen 12 bis 36 C-Atomen, insbesondere 12 bis 24 C-Atomen, wie beispielsweise Di-n-octylether, Di-n- decylether, Di-n-nonylether, Di-n-undecylether und Di-n-dodecylether, n-Hexyl-n-octylether, n- Octyl-n-decylether, n-Decyl-n-undecylether, n-Undecyl-n-dodecylether und n-Hexyl-n- Undecylether sowie Di-tert-butylether, Di-iso-pentylether, Di-3-ethyldecylether, tert.-Butyl-n- octylether, iso-Pentyl-n-octylether und 2-Methyl-pentyl-n-octylether,
- Fettalkohole, insbesondere lineare und/oder gesättigte Fettalkohole mit 8 bis 30 C-Atomen, und Monoester der Fettsäuren mit Alkoholen mit 6 bis 24 C-Atomen,
- faserstrukturverbessernde Wirkstoffe, insbesondere Mono-, Di- und Oligosaccharide, wie beispielsweise Glucose, Galactose, Fructose, Fruchtzucker und Lactose,
- konditionierende Wirkstoffe wie Paraffinöle, pflanzliche Öle, z. B. Sonnenblumenöl, Orangenöl, Mandelöl, Weizenkeimöl und Pfirsichkernöl sowie Phospholipide, beispielsweise Sojalecithin, Ei- Lecithin und Kephaline,
- quaternierte Amine wie Methyl-1-alkylamidoethyl-2-alkylimidazolinium-methosulfat,
- Entschäumer wie Silikone,
- Farbstoffe zum Anfärben des Mittels,
- Antischuppenwirkstoffe wie Piroctone Olamine, Zink Omadine und Climbazol,
- Lichtschutzmittel, insbesondere derivatisierte Benzophenone, Zimtsäure-Derivate und Triazine,
- weitere Substanzen zur Einstellung des pH-Wertes, wie beispielsweise α- und ß- Hydroxycarbonsäuren
- Wirkstoffe wie Allantoin und Bisabolol,
- Cholesterin,
- Konsistenzgeber wie Zuckerester, Polyolester oder Polyolalkylether,
- Fette und Wachse wie Walrat, Bienenwachs, Montanwachs und Paraffine,
- Fettsäurealkanolamide, - Komplexbildner wie EDTA, NTA, ß-Alanindiessigsäure und Phosphonsäuren,
- Quell- und Penetrationsstoffe wie Glycerin, Propylenglykolmonoethylether, Carbonate, Hydrogencarbonate, Guanidine, Harnstoffe sowie primäre, sekundäre und tertiäre Phosphate,
- Trübungsmittel wie Latex, Styrol/PVP- und Styrol/Acrylamid-Copolymere
- Perlglanzmittel wie Ethylenglykolmono- und -distearat sowie PEG-3-distearat,
- Pigmente,
- Reduktionsmittel wie z. B. Thioglykolsäure und deren Derivate, Thiomilchsäure, Cysteamin, Thioäpfelsäure und α-Mercaptoethansulfonsäure,
- Treibmittel wie Propan-Butan-Gemische, N2O, Dimethylether, CO2 und Luft,
- Antioxidantien.
Das erfindungsgemäße Mittel kann außerdem Tenside enthalten. Bei diesen kann es sich sowohl um anionische, ampholytische, zwitterionische oder nichtionogene Tenside als auch um kationische Tenside handeln.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird, beispielsweise in einem Shampoo, eine Kombination aus anionischen und nichtionischen Tensiden oder eine Kombination aus anionischen und amphoteren Tensiden eingesetzt. In einem Haartonic kann der Fachmann jedoch auch weitgehend oder vollständig auf den Einsatz von Tensiden verzichten.
Es hat sich in Einzelfällen als vorteilhaft erwiesen, die Tenside aus amphoteren oder nichtionischen Tensiden auszuwählen.
Als anionische Tenside eignen sich in erfindungsgemäßen Mitteln alle für die Verwendung am menschlichen Körper geeigneten anionischen oberflächenaktiven Stoffe. Diese sind gekennzeichnet durch eine wasserlöslich machende, anionische Gruppe wie z. B. eine Carboxylat-, Sulfat-, Sulfonat- oder Phosphat-Gruppe und eine lipophile Alkylgruppe mit etwa 10 bis 22 C- Atomen. Zusätzlich können im Molekül Glykol- oder Polyglykolether-Gruppen, Ester-, Ether- und Amidgruppen sowie Hydroxylgruppen enthalten sein.
Nichtionogene Tenside enthalten als hydrophile Gruppe z. B. eine Polyolgruppe, eine Po- lyalkylenglykolethergruppe oder eine Kombination aus Polyol- und Polyglykolethergruppe. Solche Verbindungen sind beispielsweise
Anlagerungsprodukte von 2 bis 30 Mol Ethylenoxid und/oder 0 bis 5 Mol Propylenoxid an lineare Fettalkohole mit 8 bis 22 C-Atomen, an Fettsäuren mit 12 bis 22 C-Atomen und an
Alkylphenole mit 8 bis 15 C-Atomen in der Alkylgruppe,
Ci2-C22-Fettsäuremono- und -diester von Anlagerungsprodukten von 1 bis 30 Mol Ethylenoxid an Glycerin,
C8-C22-Alkylmono- und -oligoglycoside und deren ethoxylierte Analoga sowie Anlagerungsprodukte von 5 bis 60 Mol Ethylenoxid an Rizinusöl und gehärtetes Rizinusöl.
Bevorzugte nichtionische Tenside sind Alkylpolyglykoside der allgemeinen Formel R1O-(Z)x. Diese Verbindungen sind durch die folgenden Parameter gekennzeichnet.
Der Alkylrest R1 enthält 6 bis 22 Kohlenstoffatome und kann sowohl linear als auch verzweigt sein. Bevorzugt sind primäre lineare und in 2-Stellung methylverzweigte aliphatische Reste. Solche Alkylreste sind beispielsweise 1-Octyl, 1-Decyl, 1-Lauryl, 1-Myristyl, 1-Cetyl und 1-Stearyl. Besonders bevorzugt sind 1-Octyl, 1-Decyl, 1-Lauryl, 1-Myristyl. Bei Verwendung sogenannter "Oxo-Alkohole" als Ausgangsstoffe überwiegen Verbindungen mit einer ungeraden Anzahl von Kohlenstoffatomen in der Alkylkette.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Alkylpolyglykoside können beispielsweise nur einen bestimmten Alkylrest R1 enthalten. Üblicherweise werden diese Verbindungen aber ausgehend von natürlichen Fetten und Ölen oder Mineralölen hergestellt. In diesem Fall liegen als Alkylreste R Mischungen entsprechend den Ausgangsverbindungen bzw. entsprechend der jeweiligen Aufarbeitung dieser Verbindungen vor.
Besonders bevorzugt sind solche Alkylpolyglykoside, bei denen R1 im wesentlichen aus C8- und do-Alkylgruppen, im wesentlichen aus Ci2- und d4-Alkylgruppen, im wesentlichen aus C8- bis C16-Alkylgruppen oder im wesentlichen aus C12- bis C16-Alkylgruppen besteht.
Als Zuckerbaustein Z können beliebige Mono- oder Oligosaccharide eingesetzt werden. Üblicherweise werden Zucker mit 5 bzw. 6 Kohlenstoffatomen sowie die entsprechenden Oligosaccharide eingesetzt. Solche Zucker sind beispielsweise Glucose, Fructose, Galactose, Arabinose, Ribose, Xylose, Lyxose, Allose, Altrose, Mannose, Gulose, Idose, Talose und Sucrose. Bevorzugte Zuckerbausteine sind Glucose, Fructose, Galactose, Arabinose und Sucrose; Glucose ist besonders bevorzugt.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Alkylpolyglykoside enthalten im Schnitt 1 ,1 bis 5 Zuckereinheiten. Alkylpolyglykoside mit x-Werten von 1 ,1 bis 1 ,6 sind bevorzugt. Ganz besonders bevorzugt sind Alkylglykoside, bei denen x 1 ,1 bis 1 ,4 beträgt.
Die Alkylglykoside können neben ihrer Tensidwirkung auch dazu dienen, die Fixierung von Duftkomponenten auf dem Haar zu verbessern. Der Fachmann wird also für den Fall, daß eine über die Dauer der Haarbehandlung hinausgehende Wirkung des Parfümöles auf dem Haar gewünscht wird, bevorzugt zu dieser Substanzklasse als weiterem Inhaltsstoff der er- findungsgemäßen Zubereitungen zurückgreifen.
Auch die alkoxylierten Homologen der genannten Alkylpolyglykoside können erfindungsgemäß eingesetzt werden. Diese Homologen können durchschnittlich bis zu 10 Ethylenoxid- und/oder Propylenoxideinheiten pro Alkylglykosideinheit enthalten.
Weiterhin können, insbesondere als Co-Tenside, zwitterionische Tenside verwendet werden. Als zwitterionische Tenside werden solche oberflächenaktive Verbindungen bezeichnet, die im Molekül mindestens eine quartäre Ammoniumgruppe und mindestens eine -COO( )- oder -SO3^-G ruppe tragen. Besonders geeignete zwitterionische Tenside sind die sogenannten Betaine wie die N-Alkyl- N,N-dimethylammonium-glycinate, beispielsweise das Kokosalkyl-dimethylammonium-glycinat, N- Acyl-aminopropyl-N,N-dimethylammoniumglycinate, beispielsweise das Kokosacylaminopropyl- dimethylammoniumglycinat, und 2-Alkyl-3-carboxylmethyl-3-hydroxyethyl-imidazoline mit jeweils 8 bis 18 C-Atomen in der Alkyl- oder Acylgruppe sowie das Kokosacylaminoethylhydroxyethyl- carboxymethylglycinat. Ein bevorzugtes zwitterionisches Tensid ist das unter der INCI-Be- zeichnung Cocamidopropyl Betaine bekannte Fettsäureamid-Derivat.
Ebenfalls insbesondere als Co-Tenside geeignet sind ampholytische Tenside. Unter ampholyti- schen Tensiden werden solche oberflächenaktiven Verbindungen verstanden, die außer einer C8- C-is-Alkyl- oder Acylgruppe im Molekül mindestens eine freie Aminogruppe und mindestens eine - COOH- oder -SO3H-Gruppe enthalten und zur Ausbildung innerer Salze befähigt sind. Beispiele für geeignete ampholytische Tenside sind N-Alkylglycine, N-Alkylpropionsäuren, N-Alkylaminobutter- säuren, N-Alkyliminodipropionsäuren, N-Hydroxyethyl-N-alkylamidopropylglycine, N-Alkyltaurine, N-Alkylsarcosine, 2-Alkylaminopropionsäuren und Alkylaminoessigsäuren mit jeweils etwa 8 bis 18 C-Atomen in der Alkylgruppe. Besonders bevorzugte ampholytische Tenside sind das N-Kokos- alkylaminopropionat, das Kokosacylaminoethylaminopropionat und das C-|2-18-Acylsarcosin.
Erfindungsgemäß werden als kationische Tenside insbesondere solche vom Typ der quartären Ammoniumverbindungen, der Esterquats und der Amidoamine eingesetzt.
Bevorzugte quaternäre Ammoniumverbindungen sind Ammoniumhalogenide, insbesondere Chloride und Bromide, wie Alkyltrimethylammoniumchloride, Dialkyldimethylammoniumchloride und Trialkylmethylammoniumchloride, z. B. Cetyltrimethylammoniumchlorid, Stearyltri- methylammoniumchlorid, Distearyldimethylammoniumchlorid, Lauryldimethylammoniumchlorid, Lauryldimethylbenzylammoniumchlorid und Tricetylmethylammoniumchlorid, sowie die unter den INCI-Bezeichnungen Quaternium-27 und Quaternium-83 bekannten Imidazolium-Verbindungen. Die langen Alkylketten der oben genannten Tenside weisen bevorzugt 10 bis 18 Kohlenstoffatome auf. Bei Esterquats handelt es sich um bekannte Stoffe, die sowohl mindestens eine Esterfunktion als auch mindestens eine quartäre Ammoniumgruppe als Strukturelement enthalten. Bevorzugte Esterquats sind quaternierte Estersalze von Fettsäuren mit Triethanolamin, quaternierte Estersalze von Fettsäuren mit Diethanolalkylaminen und quaternierten Estersalze von Fettsäuren mit 1 ,2- Dihydroxypropyldialkylaminen. Solche Produkte werden beispielsweise unter den Warenzeichen Stepantex®, Dehyquart® und Armocare® vertrieben. Die Produkte Armocare® VGH-70, ein N, N- Bis(2-Palmitoyloxyethyl)dimethylammoniumchlorid, sowie Dehyquart® F-75 und Dehyquart® AU-35 sind Beispiele für solche Esterquats.
Die Alkylamidoamine werden üblicherweise durch Amidierung natürlicher oder synthetischer Fettsäuren und Fettsäureschnitte mit Dialkylaminoaminen hergestellt. Eine erfindungsgemäß besonders geeignete Verbindung aus dieser Substanzgruppe stellt das unter der Bezeichnung Tegoamid® S 18 im Handel erhältliche Stearamidopropyl-dimethylamin dar.
Bei den als Tensid eingesetzten Verbindungen mit Alkylgruppen kann es sich jeweils um einheitliche Substanzen handeln. Es ist jedoch in der Regel bevorzugt, bei der Herstellung dieser Stoffe von nativen pflanzlichen oder tierischen Rohstoffen auszugehen, so daß man Substanzgemische mit unterschiedlichen, vom jeweiligen Rohstoff abhängigen Alkylkettenlängen erhält.
Bei den Tensiden, die Anlagerungsprodukte von Ethylen- und/oder Propylenoxid an Fettalkohole oder Derivate dieser Anlagerungsprodukte darstellen, können sowohl Produkte mit einer "normalen" Homologenverteilung als auch solche mit einer eingeengten Homologenverteilung verwendet werden. Unter "normaler" Homologenverteilung werden dabei Mischungen von Homologen verstanden, die man bei der Umsetzung von Fettalkohol und Alkylenoxid unter Verwendung von Alkalimetallen, Alkalimetallhydroxiden oder Alkalimetallalkoholaten als Katalysatoren erhält. Eingeengte Homologenverteilungen werden dagegen erhalten, wenn beispielsweise Hydrotalcite, Erdalkalimetallsalze von Ethercarbonsäuren, Erdalkalimetalloxide, -hydroxide oder - alkoholate als Katalysatoren verwendet werden. Die Verwendung von Produkten mit eingeengter Homologenverteilung kann bevorzugt sein.
Bezüglich weiterer fakultativer Komponenten sowie die eingesetzten Mengen dieser Komponenten wird ausdrücklich auf die dem Fachmann bekannten einschlägigen Handbücher, z. B. Kh. Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika, 2. Auflage, Hüthig Buch Verlag, Heidelberg, 1989, verwiesen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung mindestens eines der Gene, die die in ergrauten und in pigmentierten menschlichen Haarfollikeln unterschiedlich stark exprimiert werden, zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Haarergrauung oder zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Haarergrauung. Besonders bevorzugt ist die kosmetische Anwendung. Die Gene, die in ergrauten und in pigmentierten menschlichen Haarfollikeln unterschiedlich stark exprimiert werden, können eines der erfindungsgemäßen Verfahren aufgefunden werden. Bevorzugt sind die Gene, die ausgewählt aus der Gruppe gebildet aus Tyrosinase, Tyrosinase related Protein 1 , Tyrosinase related Protein 2, Melanocortin Receptor 1 , c-kit, MITF (microphthalmia-associated transcription factor), Pax3, Sox10, MART1 und gp100 sowie den in den Tabellen 8 und 9 aufgelisteten Genen. Besonders bevorzugt sind die Gene ausgewählt aus den in Tabelle 9 aufgelisteten Genen.
Abbildungen
Fig. 1 und 2: Nachweis von SCF durch immunhistologische Färbungen in gezupften pigmentierten
(Fig. 1 ) und gezupften grauen Haaren (Figur 2). Die Ergebnisse verdeutlichen, dass SCF durch die
Haarergrauung vermutlich nicht beeinflusst wird.
Fig. 3 und 4: Nachweis von α-MSH durch immunhistologische Färbungen in gezupften pigmentierten (Fig. 3) und gezupften grauen Haaren (Figur 4). Die Ergebnisse verdeutlichen, dass auch α-MSH durch die Haarergrauung vermutlich nicht beeinflusst wird.
Fig. 5 und 6: Nachweis von MITF durch immunhistologische Färbungen in pigmentierten (Fig. 5) und grauen (Fig. 6) Follikeln. Die Ergebnisse zeigen, dass MITF am Ergrauungsprozess beteiligt ist.
Fig. 7 und 8: Nachweis von TRP1 durch immunhistologische Färbung in pigmentierten (Fig. 7) und grauen (Fig. 8) Follikeln.
Fig. 9 und 10: Nachweis von gp100 durch immunhistologische Färbung in pigmentierten (Fig. 9) und grauen (Fig. 10) Follikeln.
Fig. 11 und 12: Nachweis von MART1 durch immunhistologische Färbung in pigmentierten (Fig.
11 ) und grauen (Fig. 12) Follikeln.
Fig. 13: Netzwerk von Paramtern, wobei die schwarz umrahmten Parameter in ergrauten Follikeln repremiert sind, die nicht umrahmten hingegen nicht reguliert.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur molekularen Charakterisierung von menschlichem ergrautem und pigmentiertem Haar, dadurch gekennzeichnet, daß man a. ein erstes Gemisch von in ergrauten menschlichen Haarfollikeln exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA- Molekülen aus ergrauten menschlichen Haarfollikeln gewinnt, b. ein zweites Gemisch von in pigmentierten menschlichen Haarfollikeln exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA- Molekülen aus pigmentierten menschlichen Haarfollikeln gewinnt und c. die in a) und b) gewonnenen Gemische einer differentiellen Analyse der Genexpression unterwirft, und dadurch die Gene identifiziert, die in ergrauten und in pigmentierten menschlichen Haarfollikeln unterschiedlich stark exprimiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man die Untersuchung in Schritt c) mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter a) Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese b) Affinitätschromatographie c) Protein-Protein-Komplexierung in Lösung d) ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) e) enzymgekoppelte Stoffwechselassays f) Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI), g) Einsatz von Proteinchips, Northern Blots, h) Real Time Quantitative Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), i) Multiplex-PCR, j) RNase-Schutzexperimente, k) Dot-Blots,
I) CDNA-Sequenzierung, m) Klon-Hybridisierung, n) Differential Display, o) Subtraktive Hybridisierung, p) cDNA-Fragment-Fingerprinting, q) Durchflusszytometrieanalysen, r) Serielle Analyse der Genexpression (SAGE) und insbesondere s) Einsatz von Nukleinsäurechips,
• wobei die Real Time Quantitative Polymerasekettenreaktion bevorzugt ist; oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
3. Haarbehandlungsmittel, enthaltend mindestens einen Wirkstoff, der die Expression mindestens eines der in ergrauten menschlichen Haarfollikeln und in pigmentierten menschlichen Haarfollikeln differentiell exprimierten Gene positiv oder negativ zu beeinflussen vermag.
4. Haarbehandlungsmittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die zu beeinflussenden Gene ausgewählt sind unter Tyrosinase, Tyrosinase related Protein 1 , Tyrosinase related Protein 2, Melanocortin Receptor 1 , c-kit, MITF (microphthalmia-associated transcription factor), Pax3, Sox10, MART1 und gp100 sowie unter den in den Tabellen 8 und 9 aufgelisteten Genen.
5. Haarbehandlungsmittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die zu beeinflussenden Gene ausgewählt sind unter den als hochrelevant in Tabelle 9 aufgelisteten Genen.
6. Verwendung mindestens eines der Gene, die in ergrauten und in pigmentierten menschlichen Haarfollikeln unterschiedlich stark exprimiert werden, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe gebildet aus Tyrosinase, Tyrosinase related Protein 1 , Tyrosinase related Protein 2, Melanocortin Receptor 1 , c-kit, MITF (microphthalmia-associated transcription factor), Pax3, Sox10, MART1 und gp100 sowie den in den Tabellen 8 und 9 aufgelisteten Genen, zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Haarerg rauung.
7. Verwendung mindestens eines der Gene, die in ergrauten und in pigmentierten menschlichen Haarfollikeln unterschiedlich stark exprimiert werden, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe gebildet aus Tyrosinase, Tyrosinase related Protein 1 , Tyrosinase related Protein 2, Melanocortin Receptor 1 , c-kit, MITF (microphthalmia-associated transcription factor), Pax3, Sox10, MART1 und gp100 sowie den in den Tabellen 8 und 9 aufgelisteten Genen, zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Haarerg rauung.
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