JP2001318096A - 毛成長促進作用を有する物質のスクリーニング方法 - Google Patents
毛成長促進作用を有する物質のスクリーニング方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 毛成長促進作用を有する物質のスクリーニン
グ方法を提供する。 【解決手段】 毛成長促進作用を有する物質のスクリー
ニング方法であって、休止期にある毛包を被検物質と接
触させる工程、及び休止期にある毛包が被検物質により
成長期に誘導された場合に被検物質が陽性であると判定
する工程を含み、該判定を毛包におけるHacl-1の発現を
検出することにより行うことを特徴とする方法。
グ方法を提供する。 【解決手段】 毛成長促進作用を有する物質のスクリー
ニング方法であって、休止期にある毛包を被検物質と接
触させる工程、及び休止期にある毛包が被検物質により
成長期に誘導された場合に被検物質が陽性であると判定
する工程を含み、該判定を毛包におけるHacl-1の発現を
検出することにより行うことを特徴とする方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、毛成長促進作用を
有する物質のスクリーニング方法に関するものである。
有する物質のスクリーニング方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】発毛剤や育毛剤の開発にあたり、被検物
質の毛成長促進作用を正確かつ簡便に判定する方法が必
要である。従来、被検物質の存在下で培養した皮膚を用
い、毛の伸長をDNA合成などを指標として調べる方法が
知られている。しかしながら、この方法は細胞の培養が
技術的に難しく、再現性に問題があった。また、実験動
物を用いて、成長期に入った皮膚の面積や毛の伸長を一
匹ずつ調べる方法もあるが、この方法は大変煩雑であ
る。このため、毛成長促進作用を有する物質のスクリー
ニングを正確かつ簡便に行うことができる方法の開発が
求められていた。
質の毛成長促進作用を正確かつ簡便に判定する方法が必
要である。従来、被検物質の存在下で培養した皮膚を用
い、毛の伸長をDNA合成などを指標として調べる方法が
知られている。しかしながら、この方法は細胞の培養が
技術的に難しく、再現性に問題があった。また、実験動
物を用いて、成長期に入った皮膚の面積や毛の伸長を一
匹ずつ調べる方法もあるが、この方法は大変煩雑であ
る。このため、毛成長促進作用を有する物質のスクリー
ニングを正確かつ簡便に行うことができる方法の開発が
求められていた。
【０００３】一方、毛母から毛へと分化する際に発現す
るタンパク質が知られている(Hacl-1:Huh, N. et al.,
The Journal of Investigative Dermatology, 102(5),
pp.716-720, 1994)。上記刊行物には、このタンパク質
のmRNAレベルが毛の分化と再生のプロセスにおける毛包
の活性化状態と相関していることが示唆されており、上
記刊行物のFig.5Aにはこのタンパク質がある時期にのみ
発現することが報告されている。しかしながら、上記刊
行物には、このタンパク質が毛包の成長期又は休止期の
いずれの時期に発現しているのかについて示唆ないし教
示はない。
るタンパク質が知られている(Hacl-1:Huh, N. et al.,
The Journal of Investigative Dermatology, 102(5),
pp.716-720, 1994)。上記刊行物には、このタンパク質
のmRNAレベルが毛の分化と再生のプロセスにおける毛包
の活性化状態と相関していることが示唆されており、上
記刊行物のFig.5Aにはこのタンパク質がある時期にのみ
発現することが報告されている。しかしながら、上記刊
行物には、このタンパク質が毛包の成長期又は休止期の
いずれの時期に発現しているのかについて示唆ないし教
示はない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】本発明の課題は、毛成長促進作用を有する被検
物質を正確かつ簡便にスクリーニングすることができる
方法を提供することにある。また、本発明の課題は、毛
包が成長期又は休止期のいずれにあるかを正確に判定で
きる方法を提供することにある。本発明者らは上記の課
題を解決すべく鋭意研究を行った結果、Hacl-1が毛包の
成長期にのみ特異的に発現していること、及びHacl-1に
特異的な抗体を用いてHacl-1を測定することによって、
毛包が成長期又は休止期のいずれの状態にあるかを正確
に判定できることを見出した。また、被検薬物の存在下
で毛包が休止期から成長期へと誘導されるか否かを観測
することによって、被検薬物の毛成長促進作用を正確に
判定できることを見出した。本発明は上記の知見を基に
して完成されたものである。
の手段】本発明の課題は、毛成長促進作用を有する被検
物質を正確かつ簡便にスクリーニングすることができる
方法を提供することにある。また、本発明の課題は、毛
包が成長期又は休止期のいずれにあるかを正確に判定で
きる方法を提供することにある。本発明者らは上記の課
題を解決すべく鋭意研究を行った結果、Hacl-1が毛包の
成長期にのみ特異的に発現していること、及びHacl-1に
特異的な抗体を用いてHacl-1を測定することによって、
毛包が成長期又は休止期のいずれの状態にあるかを正確
に判定できることを見出した。また、被検薬物の存在下
で毛包が休止期から成長期へと誘導されるか否かを観測
することによって、被検薬物の毛成長促進作用を正確に
判定できることを見出した。本発明は上記の知見を基に
して完成されたものである。
【０００５】すなわち本発明は、毛包が成長期にあるか
否かを判定する方法であって、毛包におけるHacl-1の発
現の有無を検出する工程を含む方法を提供するものであ
る。この方法の好ましい態様によれば、毛包におけるHa
cl-1の発現をHacl-1に対する抗体を用いて行うことがで
きる。
否かを判定する方法であって、毛包におけるHacl-1の発
現の有無を検出する工程を含む方法を提供するものであ
る。この方法の好ましい態様によれば、毛包におけるHa
cl-1の発現をHacl-1に対する抗体を用いて行うことがで
きる。
【０００６】上記の判定方法は、毛成長促進作用を有す
る物質のスクリーニングに用いることができる。すなわ
ち、本発明により、毛成長促進作用を有する物質のスク
リーニング方法であって、休止期にある毛包を被検物質
と接触させる工程、及び休止期にある毛包が被検物質に
より成長期に誘導された場合に被検物質が陽性であると
判定する工程を含み、該判定を毛包におけるHacl-1の発
現を検出することにより行うことを特徴とする方法が提
供される。この方法において、毛包におけるHacl-1の発
現は、好ましくはHacl-1に対する抗体を用いて検出する
ことができる。さらに本発明により、上記スクリーニン
グ方法により得られた毛成長促進作用を有する物質が提
供される。
る物質のスクリーニングに用いることができる。すなわ
ち、本発明により、毛成長促進作用を有する物質のスク
リーニング方法であって、休止期にある毛包を被検物質
と接触させる工程、及び休止期にある毛包が被検物質に
より成長期に誘導された場合に被検物質が陽性であると
判定する工程を含み、該判定を毛包におけるHacl-1の発
現を検出することにより行うことを特徴とする方法が提
供される。この方法において、毛包におけるHacl-1の発
現は、好ましくはHacl-1に対する抗体を用いて検出する
ことができる。さらに本発明により、上記スクリーニン
グ方法により得られた毛成長促進作用を有する物質が提
供される。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明の方法は、毛包が成長期に
あるか否かを判定する方法であって、毛包におけるHacl
-1の発現の有無を検出する工程を含むことを特徴として
いる。本発明者らの知見によれば、毛包において、Hacl
-1は成長期にのみ発現されており、休止期にはその発現
は認められない。従って、毛包におけるHacl-1の発現の
有無を検出することにより、その毛包が休止期にある
か、又は成長期にあるかを極めて正確かつ簡便に判定で
きる。すなわち、Hacl-1の発現が認められた毛包は成長
期にある毛包であると判定され、Hacl-1の発現が認めら
れない毛包は休止期にある毛包であると判定される。毛
周期において、成長期が止まり休止期が開始する短い期
間を退行期と呼ぶ場合があるが、本明細書においては初
期退行期を含めて成長期と呼び、後期退行期を含めて休
止期と呼ぶ場合がある。
あるか否かを判定する方法であって、毛包におけるHacl
-1の発現の有無を検出する工程を含むことを特徴として
いる。本発明者らの知見によれば、毛包において、Hacl
-1は成長期にのみ発現されており、休止期にはその発現
は認められない。従って、毛包におけるHacl-1の発現の
有無を検出することにより、その毛包が休止期にある
か、又は成長期にあるかを極めて正確かつ簡便に判定で
きる。すなわち、Hacl-1の発現が認められた毛包は成長
期にある毛包であると判定され、Hacl-1の発現が認めら
れない毛包は休止期にある毛包であると判定される。毛
周期において、成長期が止まり休止期が開始する短い期
間を退行期と呼ぶ場合があるが、本明細書においては初
期退行期を含めて成長期と呼び、後期退行期を含めて休
止期と呼ぶ場合がある。
【０００８】Hacl-1については、Huh, N. et al., The
Journal of Investigative Dermatology, 102(5), pp.7
16-720, 1994に詳細かつ具体的に開示があり、このタン
パク質の検出は当業者が容易に行うことができる。例え
ば、上記刊行物に開示されたHacl-1をコードする遺伝子
を用いて遺伝子工学の手法によりHacl-1を組換えタンパ
ク質として微生物で発現させることができ、得られた組
換えタンパク質を用いて常法によりラットなどの動物を
免疫することにより、抗血清を得ることができる。この
ようにして得られた抗血清を用いて、周知の方法でHacl
-1の発現を検出することができる。
Journal of Investigative Dermatology, 102(5), pp.7
16-720, 1994に詳細かつ具体的に開示があり、このタン
パク質の検出は当業者が容易に行うことができる。例え
ば、上記刊行物に開示されたHacl-1をコードする遺伝子
を用いて遺伝子工学の手法によりHacl-1を組換えタンパ
ク質として微生物で発現させることができ、得られた組
換えタンパク質を用いて常法によりラットなどの動物を
免疫することにより、抗血清を得ることができる。この
ようにして得られた抗血清を用いて、周知の方法でHacl
-1の発現を検出することができる。
【０００９】また、免疫した動物から免疫細胞を取得し
て、常法によりモノクローナル抗体を製造することも可
能である。モノクローナル抗体を蛍光色素又はビオチン
などで標識することにより、Hacl-1の検出を極めて高精
度かつ簡便に行うことができる。モノクローナル抗体の
製造及びモノクローナル抗体の標識化の手法は当業者に
周知されている。Hacl-1の検出には、キメラ抗体を用い
ることも可能である。もっとも、Hacl-1の発現を検出す
る方法は抗体を用いた方法に限定されることはなく、当
業者が検出手段を適宜選択可能であることは言うまでも
ない。毛包はヒト又はヒト以外の哺乳類動物のいずれの
ものでもよく、Hacl-1の発現の検出には頭皮や皮膚など
の細胞、ヒゲなどを用いることができる。
て、常法によりモノクローナル抗体を製造することも可
能である。モノクローナル抗体を蛍光色素又はビオチン
などで標識することにより、Hacl-1の検出を極めて高精
度かつ簡便に行うことができる。モノクローナル抗体の
製造及びモノクローナル抗体の標識化の手法は当業者に
周知されている。Hacl-1の検出には、キメラ抗体を用い
ることも可能である。もっとも、Hacl-1の発現を検出す
る方法は抗体を用いた方法に限定されることはなく、当
業者が検出手段を適宜選択可能であることは言うまでも
ない。毛包はヒト又はヒト以外の哺乳類動物のいずれの
ものでもよく、Hacl-1の発現の検出には頭皮や皮膚など
の細胞、ヒゲなどを用いることができる。
【００１０】本発明により提供される毛成長促進作用を
有する物質のスクリーニング方法は、休止期にある毛包
を被検物質と接触させる工程、及び休止期にある毛包が
被検物質により成長期に誘導された場合に被検物質が陽
性であると判定する工程を含み、該判定を毛包における
Hacl-1の発現を検出することにより行うを特徴としてい
る。被検物質を接触させる毛包が休止期にあるか成長期
にあるかは、通常は組織切片を顕微鏡観察することによ
り行うことが可能である。また、例えばC57BLマウスで
は生まれてからの日齢と毛周期との関係が詳細に調べら
れているので、日齢を基にして毛包が休止期にあるか成
長期にあるかを判断してもよい。
有する物質のスクリーニング方法は、休止期にある毛包
を被検物質と接触させる工程、及び休止期にある毛包が
被検物質により成長期に誘導された場合に被検物質が陽
性であると判定する工程を含み、該判定を毛包における
Hacl-1の発現を検出することにより行うを特徴としてい
る。被検物質を接触させる毛包が休止期にあるか成長期
にあるかは、通常は組織切片を顕微鏡観察することによ
り行うことが可能である。また、例えばC57BLマウスで
は生まれてからの日齢と毛周期との関係が詳細に調べら
れているので、日齢を基にして毛包が休止期にあるか成
長期にあるかを判断してもよい。
【００１１】毛包と被検物質との接触はいかなる方法で
行ってもよい。例えば、毛包を含む皮膚に対して被検物
質を溶解した溶液を塗布又は注射する方法などを挙げる
ことができるが、これらに限定されることはない。被検
物質を溶解した溶液は水溶液として調製してもよいが、
グリセリンやエタノールなどの水性有機溶媒と水とを含
む溶液として調製することもできる。被検物質をヒト又
は動物に経口的又は非経口的に投与して、血流を介して
被検物質を毛包に接触させてもよい。非経口的な投与の
例として、静脈内、筋肉内、若しくは皮下への注射、静
脈内への点滴剤の投与、クリーム剤や軟膏剤などの外用
剤による局所投与、経皮吸収剤や経粘膜吸収剤による全
身投与、坐剤による直腸内投与などを挙げることができ
るが、これらに限定されることはない。
行ってもよい。例えば、毛包を含む皮膚に対して被検物
質を溶解した溶液を塗布又は注射する方法などを挙げる
ことができるが、これらに限定されることはない。被検
物質を溶解した溶液は水溶液として調製してもよいが、
グリセリンやエタノールなどの水性有機溶媒と水とを含
む溶液として調製することもできる。被検物質をヒト又
は動物に経口的又は非経口的に投与して、血流を介して
被検物質を毛包に接触させてもよい。非経口的な投与の
例として、静脈内、筋肉内、若しくは皮下への注射、静
脈内への点滴剤の投与、クリーム剤や軟膏剤などの外用
剤による局所投与、経皮吸収剤や経粘膜吸収剤による全
身投与、坐剤による直腸内投与などを挙げることができ
るが、これらに限定されることはない。
【００１２】本発明のスクリーニング方法において、Ha
cl-1の検出は上記の方法により行うことができる。休止
期にある毛包に被検物質を接触させることにより、その
毛包が成長期に誘導された場合（すなわちHacl-1の発現
が検出された場合）には、その被検物質が毛成長促進作
用を有すると判定できる。通常は、コントロールの試験
群を用意し、休止期にある毛包がHacl-1を発現するに至
るまでの期間を測定し、被検物質の存在下で同一の条件
下に測定を行って、休止期にある毛包がHacl-1を発現す
るに至るまでの期間が実質的に短縮された場合には、そ
の被検物質が毛成長促進作用を有すると判定できる。も
っとも、判定方法は上記の方法に限定されることはな
い。
cl-1の検出は上記の方法により行うことができる。休止
期にある毛包に被検物質を接触させることにより、その
毛包が成長期に誘導された場合（すなわちHacl-1の発現
が検出された場合）には、その被検物質が毛成長促進作
用を有すると判定できる。通常は、コントロールの試験
群を用意し、休止期にある毛包がHacl-1を発現するに至
るまでの期間を測定し、被検物質の存在下で同一の条件
下に測定を行って、休止期にある毛包がHacl-1を発現す
るに至るまでの期間が実質的に短縮された場合には、そ
の被検物質が毛成長促進作用を有すると判定できる。も
っとも、判定方法は上記の方法に限定されることはな
い。
【００１３】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定される
ことはない。 例１ Hacl-1 (Huh, N. et al., The Journal of Investigati
ve Dermatology, 102(5), pp.716-720, 1994)をコード
する遺伝子を含むDNAをPCR法により増幅し、この増幅産
物を用いてHacl-1を組換えタンパク質として常法により
大腸菌で発現させた。この組換えHacl-1を用いて常法に
よりラットを免疫し、Hacl-1に対する抗血清を調製し
た。
説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定される
ことはない。 例１ Hacl-1 (Huh, N. et al., The Journal of Investigati
ve Dermatology, 102(5), pp.716-720, 1994)をコード
する遺伝子を含むDNAをPCR法により増幅し、この増幅産
物を用いてHacl-1を組換えタンパク質として常法により
大腸菌で発現させた。この組換えHacl-1を用いて常法に
よりラットを免疫し、Hacl-1に対する抗血清を調製し
た。
【００１４】抗血清の調製は以下のようにして行った。
C3Hマウスのアゴヒゲ組織から調製したcDNAライブラリ
ーをテンプレートとしてPCR法によりHaCl-1の全翻訳領
域cDNA(Huh, N. et al., J. Invest. Dermatol., 102,
pp.716-720, 1994)を単離した。単離したHaCl-1遺伝子
をテンプレートとして、N-末端に6個のヒスチジンを付
加したHaCl-1遺伝子を単離した。N-末端に6個のヒスチ
ジンを付加したHaCl-1遺伝子を大腸菌発現ベクターPet3
c(Novogen)に組み込み、大腸菌BL-21中に導入し、32℃
で十分増殖させたものに最終濃度1 mMのIPTG添加により
HaCl-1蛋白を発現させた。
C3Hマウスのアゴヒゲ組織から調製したcDNAライブラリ
ーをテンプレートとしてPCR法によりHaCl-1の全翻訳領
域cDNA(Huh, N. et al., J. Invest. Dermatol., 102,
pp.716-720, 1994)を単離した。単離したHaCl-1遺伝子
をテンプレートとして、N-末端に6個のヒスチジンを付
加したHaCl-1遺伝子を単離した。N-末端に6個のヒスチ
ジンを付加したHaCl-1遺伝子を大腸菌発現ベクターPet3
c(Novogen)に組み込み、大腸菌BL-21中に導入し、32℃
で十分増殖させたものに最終濃度1 mMのIPTG添加により
HaCl-1蛋白を発現させた。
【００１５】大腸菌を粉砕してDNAse処理を行った後、2
Mウレア(pH8.0)溶液で3回洗浄した。得られた分画を8M
ウレア(pH8.0)に溶解し、N1 +-アガロースゲル（Quage
n）にアフィニティー吸着させた後、8Mウレア(pH3.0)に
てHaCl-1を溶出させた。さらに精製したHaCl-1/8Mウレ
ア(pH3.0)をPBSに対して透析した。アジュバントと十分
に混合したHaCl-1蛋白を用いてウイスター系ラット（雄
性、8週齢）を免疫し（1ヵ月毎、3回）、免疫ラットの
心臓から血液を採取してプロテインGカラムでIgG分画を
回収して抗血清とした。
Mウレア(pH8.0)溶液で3回洗浄した。得られた分画を8M
ウレア(pH8.0)に溶解し、N1 +-アガロースゲル（Quage
n）にアフィニティー吸着させた後、8Mウレア(pH3.0)に
てHaCl-1を溶出させた。さらに精製したHaCl-1/8Mウレ
ア(pH3.0)をPBSに対して透析した。アジュバントと十分
に混合したHaCl-1蛋白を用いてウイスター系ラット（雄
性、8週齢）を免疫し（1ヵ月毎、3回）、免疫ラットの
心臓から血液を採取してプロテインGカラムでIgG分画を
回収して抗血清とした。
【００１６】C57BLマウス（14週齢）の背中皮膚をバリ
カンで剃毛し、皮膚色から毛周期が成長期又は休止期の
皮膚領域を併せ持つことを確認した。このマウスから毛
周期が成長期及び休止期の皮膚領域を各200 mg採取し
て、２分間氷上にてホモジナイズし、バッファー(PBS)
を加えて懸濁させた。上清を採取してSDS-ポリアクリル
アミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)に付した。毛包の休止期
及び成長期の区別は組織切片を顕微鏡観察することによ
り行い、判定基準として図１に示す基準を採用した。図
２にSDS-PAGEの結果を示す。(A)はマウスのアゴヒゲの
結果を示し、(B)は背中の皮膚の結果を示す。図中、「c
oomassie」は電気泳動後のゲルをクマジーブリリアント
ブルーで染色した結果を示し、「Hacl-1」は電気泳動後
のゲルについてHacl-1に対する抗血清を用いてEur. J.
Biochem., 225, pp.1133-1139, 1994に記載されている
方法でウェスタンブロッティングを行った結果を示す。
カンで剃毛し、皮膚色から毛周期が成長期又は休止期の
皮膚領域を併せ持つことを確認した。このマウスから毛
周期が成長期及び休止期の皮膚領域を各200 mg採取し
て、２分間氷上にてホモジナイズし、バッファー(PBS)
を加えて懸濁させた。上清を採取してSDS-ポリアクリル
アミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)に付した。毛包の休止期
及び成長期の区別は組織切片を顕微鏡観察することによ
り行い、判定基準として図１に示す基準を採用した。図
２にSDS-PAGEの結果を示す。(A)はマウスのアゴヒゲの
結果を示し、(B)は背中の皮膚の結果を示す。図中、「c
oomassie」は電気泳動後のゲルをクマジーブリリアント
ブルーで染色した結果を示し、「Hacl-1」は電気泳動後
のゲルについてHacl-1に対する抗血清を用いてEur. J.
Biochem., 225, pp.1133-1139, 1994に記載されている
方法でウェスタンブロッティングを行った結果を示す。
【００１７】クマジーブリリアントブルーで染色を行っ
たバンドの濃度から、休止期及び成長期の毛包に含まれ
るタンパク質量がほぼ同じであることを確認した。Hacl
-1に対する抗血清を用いてウェスタンブロッティングを
行った結果、成長期の毛包から得たサンプルにはHacl-1
の明確なバンドが確認でき、Hacl-1が発現されているこ
とが確認できた。一方、休止期の毛包ではHacl-1のバン
ドは全く検出されず、休止期の毛包においてはHacl-1が
発現されていないことが明らかになった。
たバンドの濃度から、休止期及び成長期の毛包に含まれ
るタンパク質量がほぼ同じであることを確認した。Hacl
-1に対する抗血清を用いてウェスタンブロッティングを
行った結果、成長期の毛包から得たサンプルにはHacl-1
の明確なバンドが確認でき、Hacl-1が発現されているこ
とが確認できた。一方、休止期の毛包ではHacl-1のバン
ドは全く検出されず、休止期の毛包においてはHacl-1が
発現されていないことが明らかになった。
【００１８】例２ 国際公開WO98/22505号に記載された上皮細胞に対する形
態形成促進作用を有するポリペプチドH1(上記国際公開
中に示されたアミノ酸配列(II)で表される104個のアミ
ノ酸からなるポリペプチド)を国際公開WO98/22505号に
記載された方法に従って大腸菌で発現させた。コントロ
ールとして、上記ポリペプチドをコードする組換えベク
ターを導入しない大腸菌を溶菌した上清を用いた。
態形成促進作用を有するポリペプチドH1(上記国際公開
中に示されたアミノ酸配列(II)で表される104個のアミ
ノ酸からなるポリペプチド)を国際公開WO98/22505号に
記載された方法に従って大腸菌で発現させた。コントロ
ールとして、上記ポリペプチドをコードする組換えベク
ターを導入しない大腸菌を溶菌した上清を用いた。
【００１９】別途、アミノ酸配列(I)：Ser-Ile-Glu-Gln
-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu で表されるオリゴペプチド
をFmocを用いた固相法により合成した(実施例において
「pep7」と呼ぶ場合がある。)。合成した各オリゴペプ
チドは高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により精製
し、HPLC及びMassによって純度が90%以上であることを
確認した。HPLCの条件及びリテンションタイムは以下の
とおりである。 カラム：ODS-UG3（モノメリックODS、野村化学製）内径
1.0 mm、全長100 mm 測定：室温(25℃) 検出：UV 214 nm、280 nm 溶出溶媒：溶媒Ａ及び溶媒Ｂのグラジエント（溶媒A：
0.1% トリフルオロ酢酸；溶媒B：90%アセトニトリル/0.
1% トリフルオロ酢酸、5分後（溶媒B：0%）から55分
（溶媒B：55%）の直線濃度勾配） 流速：75 ml/ml リテンションタイム: 21.52分(dimer), 20.59分(mono
mer)
-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu で表されるオリゴペプチド
をFmocを用いた固相法により合成した(実施例において
「pep7」と呼ぶ場合がある。)。合成した各オリゴペプ
チドは高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により精製
し、HPLC及びMassによって純度が90%以上であることを
確認した。HPLCの条件及びリテンションタイムは以下の
とおりである。 カラム：ODS-UG3（モノメリックODS、野村化学製）内径
1.0 mm、全長100 mm 測定：室温(25℃) 検出：UV 214 nm、280 nm 溶出溶媒：溶媒Ａ及び溶媒Ｂのグラジエント（溶媒A：
0.1% トリフルオロ酢酸；溶媒B：90%アセトニトリル/0.
1% トリフルオロ酢酸、5分後（溶媒B：0%）から55分
（溶媒B：55%）の直線濃度勾配） 流速：75 ml/ml リテンションタイム: 21.52分(dimer), 20.59分(mono
mer)
【００２０】オリゴペプチドの架橋は以下のように行っ
た。PBSに溶解した1 mg/mlのオリゴペプチドpep7溶液(5
ml)に対して33μg/μlとなるようにジメチルスルホキ
シドに溶解したBMH(65μl)を攪拌しながら徐々に加え、
一晩4℃で反応させた。この溶液に、さらに6.6 mlのPBS
と5 mg/mlとなるようにPBSに溶解した塩酸システイン溶
液(5 ml)を加えて混合することにより、終濃度0.3 mg/m
lのSS架橋したオリゴペプチド溶液を調製した（実施例
において「ssb7」と呼ぶ場合がある。上記の条件下にお
いてHPLCのリテンションタイムは33.01分であっ
た。）。コントロール溶液として、オリゴペプチド溶液
の替わりにPBSを用いて同様に試薬を加えて反応を行っ
たものを調製した。架橋したオリゴペプチドssb7の溶液
に等量のエタノールを加えて、終濃度0.15 mg/mlの50%
エタノール・PBS溶液を調製した。
た。PBSに溶解した1 mg/mlのオリゴペプチドpep7溶液(5
ml)に対して33μg/μlとなるようにジメチルスルホキ
シドに溶解したBMH(65μl)を攪拌しながら徐々に加え、
一晩4℃で反応させた。この溶液に、さらに6.6 mlのPBS
と5 mg/mlとなるようにPBSに溶解した塩酸システイン溶
液(5 ml)を加えて混合することにより、終濃度0.3 mg/m
lのSS架橋したオリゴペプチド溶液を調製した（実施例
において「ssb7」と呼ぶ場合がある。上記の条件下にお
いてHPLCのリテンションタイムは33.01分であっ
た。）。コントロール溶液として、オリゴペプチド溶液
の替わりにPBSを用いて同様に試薬を加えて反応を行っ
たものを調製した。架橋したオリゴペプチドssb7の溶液
に等量のエタノールを加えて、終濃度0.15 mg/mlの50%
エタノール・PBS溶液を調製した。
【００２１】上記のポリペプチドH1及びオリゴペプチド
ssb7の毛成長促進作用を評価した。C57BL/6マウスは生
後45日から95日前後まで約50日間休止期が続くことが知
られている。また、休止期ではピンク、成長期ではグレ
ー又はクロと皮膚の色が変化するため、毛周期の判定が
容易である。毛周期が休止期に入った直後のC57BL/6マ
ウスの背中(約3×2.5 cm2)を動物用電気バリカンで傷が
付かないように注意深く刈毛し、皮膚の色及び皮膚の厚
みから毛周期が休止期であることを確認した。上記で調
製したポリペプチドH1溶液(0.8 mg/ml)又はオリゴペプ
チドssb7溶液(0.8mg/ml)を0.1 mlずつ24時間毎の頻度で
５回皮下注射して、経時的に毛包のHacl-1を例１の方法
に従って測定した。
ssb7の毛成長促進作用を評価した。C57BL/6マウスは生
後45日から95日前後まで約50日間休止期が続くことが知
られている。また、休止期ではピンク、成長期ではグレ
ー又はクロと皮膚の色が変化するため、毛周期の判定が
容易である。毛周期が休止期に入った直後のC57BL/6マ
ウスの背中(約3×2.5 cm2)を動物用電気バリカンで傷が
付かないように注意深く刈毛し、皮膚の色及び皮膚の厚
みから毛周期が休止期であることを確認した。上記で調
製したポリペプチドH1溶液(0.8 mg/ml)又はオリゴペプ
チドssb7溶液(0.8mg/ml)を0.1 mlずつ24時間毎の頻度で
５回皮下注射して、経時的に毛包のHacl-1を例１の方法
に従って測定した。
【００２２】この結果、上記のポリペプチドH1及びオリ
ゴペプチドssb7の注射を行った群では20日目のサンプル
でHacl-1の明確なバンドが確認でき、成長期が誘導され
ていることが確認できた。同時期にサンプリングを行っ
たコントロール群の毛包は休止期にありHacl-1が発現さ
れていないか、発現されていてもごくわずかな量であっ
た。結果を図３に示す。
ゴペプチドssb7の注射を行った群では20日目のサンプル
でHacl-1の明確なバンドが確認でき、成長期が誘導され
ていることが確認できた。同時期にサンプリングを行っ
たコントロール群の毛包は休止期にありHacl-1が発現さ
れていないか、発現されていてもごくわずかな量であっ
た。結果を図３に示す。
【００２３】例３ 例２で用いたマウスの左右のアゴヒゲを採取し、Develo
pment, 105, pp.271-277, 1989に記載された方法で培養
した。左右のアゴヒゲの一方をコントロールとして、も
う一方を上記オリゴペプチドss7b(50μg/ml)で処理し、
５日間培養後に例１の方法に従って培養液中のHacl-1を
測定した。この結果、オリゴペプチドss7bで処理したア
ゴヒゲではHacl-1の発現が認められ、コントロール群で
はごくわずかなHacl-1の発現が認められたにすぎなかっ
た。結果を図４に示す。
pment, 105, pp.271-277, 1989に記載された方法で培養
した。左右のアゴヒゲの一方をコントロールとして、も
う一方を上記オリゴペプチドss7b(50μg/ml)で処理し、
５日間培養後に例１の方法に従って培養液中のHacl-1を
測定した。この結果、オリゴペプチドss7bで処理したア
ゴヒゲではHacl-1の発現が認められ、コントロール群で
はごくわずかなHacl-1の発現が認められたにすぎなかっ
た。結果を図４に示す。
【００２４】
【発明の効果】本発明の方法によれば、毛成長促進作用
を有する物質のスクリーニングを極めて簡便かつ正確に
行うことができ、毛成長促進剤などの医薬の有効成分の
開発を効率よく行うことができる。
を有する物質のスクリーニングを極めて簡便かつ正確に
行うことができ、毛成長促進剤などの医薬の有効成分の
開発を効率よく行うことができる。
【００２５】
SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Electric Industries, Ltd. <120> Method for screening a substance having prom
oting activity on hairgrowth <130> 99437M <160> 1 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> human <400> 1 Ser Ile Glu Gln Ser Cys Asp Gln Asp Glu 10
oting activity on hairgrowth <130> 99437M <160> 1 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> human <400> 1 Ser Ile Glu Gln Ser Cys Asp Gln Asp Glu 10
【図１】 毛包の休止期及び成長期の区別を組織切片の
顕微鏡観察により行う場合の判定基準を示した図であ
る。図中、anagenは成長期、telogenは休止期を示し、
(A)はマウスのアゴヒゲ、(B)はマウスの背中皮膚の図を
示す。
顕微鏡観察により行う場合の判定基準を示した図であ
る。図中、anagenは成長期、telogenは休止期を示し、
(A)はマウスのアゴヒゲ、(B)はマウスの背中皮膚の図を
示す。
【図２】 毛包の上清をSDS-ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分析した結果を示した図である。(A)はマ
ウスのアゴヒゲの結果を示し、(B)は背中の皮膚の結果
を示す。図中、「coomassie」は電気泳動後のゲルをク
マジーブリリアントブルーで染色した結果を示し、「Ha
cl-1」は電気泳動後のゲルについてHacl-1に対する抗血
清を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示
す。また、anagenは成長期、catagenは退行期、telogen
は休止期を示し、Hacl-1の矢印はHacl-1の位置を示す。
気泳動により分析した結果を示した図である。(A)はマ
ウスのアゴヒゲの結果を示し、(B)は背中の皮膚の結果
を示す。図中、「coomassie」は電気泳動後のゲルをク
マジーブリリアントブルーで染色した結果を示し、「Ha
cl-1」は電気泳動後のゲルについてHacl-1に対する抗血
清を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示
す。また、anagenは成長期、catagenは退行期、telogen
は休止期を示し、Hacl-1の矢印はHacl-1の位置を示す。
【図３】 国際公開WO98/22505号に記載されたアミノ酸
配列(II)で表される104個のアミノ酸からなるポリペプ
チドH1及びオリゴペプチドssb7の存在下でマウス皮膚の
毛包におけるHacl-1の発現が誘導され、毛包が成長期に
誘導された結果を示した図である。
配列(II)で表される104個のアミノ酸からなるポリペプ
チドH1及びオリゴペプチドssb7の存在下でマウス皮膚の
毛包におけるHacl-1の発現が誘導され、毛包が成長期に
誘導された結果を示した図である。
【図４】 オリゴペプチドssb7の存在下でマウスのアゴ
ヒゲを培養することによりHacl-1の発現が誘導され、毛
包が成長期に誘導された結果を示した図である。
ヒゲを培養することによりHacl-1の発現が誘導され、毛
包が成長期に誘導された結果を示した図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB24 CB01 DA36 FA16 FA27 FA29 FB02 FB03 FB05 FB06 4B024 AA01 AA11 BA31 BA80 CA02 DA06 GA11 4B064 AG01 AG27 CA02 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4C084 AA02 BA01 BA07 BA17 BA23 CA59 DB52 MA63 NA14 ZA922 4H045 AA10 AA30 BA10 BA15 CA40 EA20 FA33 FA73 FA74 GA21 HA03
Claims (5)
- 【請求項１】 毛包が成長期にあるか否かを判定する方
法であって、毛包におけるHacl-1の発現の有無を検出す
る工程を含む方法。 - 【請求項２】 毛包におけるHacl-1の発現をHacl-1に対
する抗体を用いて行う請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 毛成長促進作用を有する物質のスクリー
ニング方法であって、休止期にある毛包を被検物質と接
触させる工程、及び休止期にある毛包が被検物質により
成長期に誘導された場合に被検物質が陽性であると判定
する工程を含み、該判定を毛包におけるHacl-1の発現を
検出することにより行うことを特徴とする方法。 - 【請求項４】 毛包におけるHacl-1の発現をHacl-1に対
する抗体を用いて検出する請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 請求項３又は４に記載のスクリーニング
方法により得られた毛成長促進作用を有する物質。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000137052A JP2001318096A (ja) | 2000-05-10 | 2000-05-10 | 毛成長促進作用を有する物質のスクリーニング方法 |
| CA002347151A CA2347151A1 (en) | 2000-05-10 | 2001-05-09 | Method for screening a substance having promoting activity on hair growth |
| US09/851,389 US20020051760A1 (en) | 2000-05-10 | 2001-05-09 | Method for screening a substance having promoting activity on hair growth |
| EP01304178A EP1156334A3 (en) | 2000-05-10 | 2001-05-09 | Method for screening a substance having promoting activity on hair growth |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000137052A JP2001318096A (ja) | 2000-05-10 | 2000-05-10 | 毛成長促進作用を有する物質のスクリーニング方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001318096A true JP2001318096A (ja) | 2001-11-16 |
Family
ID=18644895
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000137052A Pending JP2001318096A (ja) | 2000-05-10 | 2000-05-10 | 毛成長促進作用を有する物質のスクリーニング方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20020051760A1 (ja) |
| EP (1) | EP1156334A3 (ja) |
| JP (1) | JP2001318096A (ja) |
| CA (1) | CA2347151A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004063750A1 (ja) * | 2003-01-08 | 2004-07-29 | Sumitomo Electric Industries, Ltd. | 育毛活性評価方法 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100791442B1 (ko) * | 2000-06-05 | 2008-01-04 | 스미토모덴키고교가부시키가이샤 | 올리고펩티드 |
| US20050008602A1 (en) * | 2000-06-05 | 2005-01-13 | Sumitomo Electric Industries, Ltd. | Oligopeptides for promoting hair growth |
| US7241731B2 (en) | 2000-06-05 | 2007-07-10 | Sumitomo Electric Industries, Ltd. | Oligopeptides for promoting hair growth |
| CA2798517C (en) | 2010-05-17 | 2016-07-05 | The Procter & Gamble Company | Systems and methods of detecting and demonstrating hair damage via evaluation of protein fragments |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5616471A (en) * | 1987-05-06 | 1997-04-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Effects of growth factors on hair follicle cell proliferation and release of collagenolytic factors |
| GB8928634D0 (en) * | 1989-12-19 | 1990-02-21 | Unilever Plc | Method of testing |
| JPH07132083A (ja) * | 1993-11-12 | 1995-05-23 | Res Dev Corp Of Japan | 毛包組織に対するモノクローナル抗体と、この抗体を 産生するハイブリドーマ、およびこのハイブリドーマ の作成法 |
-
2000
- 2000-05-10 JP JP2000137052A patent/JP2001318096A/ja active Pending
-
2001
- 2001-05-09 EP EP01304178A patent/EP1156334A3/en not_active Withdrawn
- 2001-05-09 CA CA002347151A patent/CA2347151A1/en not_active Abandoned
- 2001-05-09 US US09/851,389 patent/US20020051760A1/en not_active Abandoned
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004063750A1 (ja) * | 2003-01-08 | 2004-07-29 | Sumitomo Electric Industries, Ltd. | 育毛活性評価方法 |
| CN100381820C (zh) * | 2003-01-08 | 2008-04-16 | 住友电气工业株式会社 | 评价受试物质的毛发生长促进活性的方法和试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1156334A2 (en) | 2001-11-21 |
| EP1156334A3 (en) | 2002-07-03 |
| US20020051760A1 (en) | 2002-05-02 |
| CA2347151A1 (en) | 2001-11-10 |
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