JP2003517816A - 新脈管形成の診断の新規方法、新脈管形成調節因子についてのスクリーニングの組成物および方法 - Google Patents

新脈管形成の診断の新規方法、新脈管形成調節因子についてのスクリーニングの組成物および方法

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Abstract

(57)【要約】 新脈管形成および脈管形成表現型の診断のために使用され得る方法が、本明細書中に記載される。新脈管形成を調節する能力について、候補生物活性薬剤をスクリーニングするために使用され得る方法もまた、本明細書中に記載される。さらに、新脈管形成に関連する障害への治療的介入のための方法および分子標的（例えば、遺伝子およびこれらの産物）が、記載される。治療部分を脈管形成組織に局在化するための方法もまた、記載される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、新脈管形成に関与する発現プロフィールおよび核酸の同定、ならび
にこのような発現プロフィールおよび核酸の、新脈管形成の診断における使用に
関する。本発明は、さらに、新脈管形成を調節する候補薬剤および／または標的
を同定するための方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） 新たな血管の発達は、静脈の形成（脈管形成）および動脈の形成（新脈管形成
）を包含する。新脈管形成は、胚の発達、ならびに月経（ｍｅｎｓｔｒａｔｉｏ
ｎ）、創傷治癒において、通常の役割を果たす。新脈管形成はまた、種々の疾患
状態（癌、増殖性糖尿病性網膜症、および慢性的な炎症部位への血流の維持が挙
げられる）において、重大な病原性の役割を果たす。
【０００３】 新脈管形成は、多数の段階を有する。新脈管形成の初期の段階としては、内皮
細胞プロテアーゼ産生、細胞の移動および増殖が挙げられる。初期の段階はまた
、いくらかの増殖因子（ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏ
ｓｔａｔｉｎ）、および選択されたケモカイン（全て、推定上は役割を果たす）
）を必要とするようである。新脈管形成の後期段階としては、壁細胞（周皮細胞
または平滑筋細胞）との血管の集団化（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）、基底膜生成お
よび血管床の分化の誘導が挙げられる。血管形成の最終段階としては、「最造形
」として公知である段階が挙げられ、ここで、血管系の形成が、安定な成熟血管
床となる。
【０００４】 従って、遺伝子、タンパク質および新脈管形成の間に起こる調節機構を理解す
ることが望ましい。従って、本発明の目的は、新脈管形成を調節する能力につい
て、候補生物活性薬剤をスクリーニングするために使用され得る方法を、提供す
ることである。さらに、新脈管形成が所望でなく過剰であるか、または欠乏して
いるかのいずれかである、疾患状態への治療的介入のための、分子標的を提供す
ることが、目的である。
【０００５】 （発明の要旨） 本発明は、新脈管形成の診断および予後の推定のための、新規な方法、ならび
に新脈管形成を調節する組成物についてスクリーニングするための方法を、提供
する。新脈管形成に関連する障害を処置する方法および組成物もまた、本明細書
中において提供される。
【０００６】 １つの局面において、薬物候補をスクリーニングする方法は、発現プロフィー
ル遺伝子またはそのフラグメントを発現する細胞を提供する工程を包含する。発
現プロフィール遺伝子の好ましい実施形態は、他の細胞と比較して新脈管形成細
胞において差示的に発現する、遺伝子である。本明細書中の方法において使用さ
れる発現プロフィール遺伝子の好ましい実施形態としては、ＡＡＡ４、ＡＡＡ１
、Ｅｄｇ−１、α５β１インテグリン、エンドムチン、およびマトリックスメタ
ロプロテイナーゼ１０からなる群が挙げられるが、これらに限定されない；この
群のタンパク質のフラグメントもまた、好ましい。本発明における使用のための
分子は、列挙された分子の任意の形態または任意のサブセットの形態であり得る
ことが、理解される。従って、例えば、上に列挙された遺伝子のいずれか１つ以
上が、本明細書中の方法において使用され得る。別の実施形態においては、核酸
は、表１、２、３、４または５から選択される。好ましい核酸は、表４に示され
るものであり、そして最も好ましくは、表５のものである。この方法は、薬物候
補を細胞に添加する工程、および発現プロフィール遺伝子の発現に対するこの薬
物候補の効果を決定する工程を、さらに包含する。
【０００７】 １つの実施形態において、薬物候補をスクリーニングする方法は、薬物候補の
非存在下での発現レベルを、薬物候補の存在下での発現レベルとを比較する工程
を包含し、ここで、この薬物候補が存在する場合には、この薬物候補の濃度は、
変化し得、そしてここで、この比較は、薬物候補の添加または除去の後に、起こ
り得る。好ましい実施形態においては、細胞は、少なくとも２つの発現プロフィ
ール遺伝子を発現する。これらのプロフィール遺伝子は、増加または減少を示し
得る。
【０００８】 本明細書中にはまた、新脈管形成調節因子タンパク質（ＡＭＰ）に結合し得る
生物活性薬剤についてスクリーニングする方法が提供され、この方法は、このＡ
ＭＰと候補生物活性薬剤とを合わせる工程、およびＡＭＰに対するこの候補薬剤
の結合を決定する工程を包含する。好ましくは、ＡＭＰは、ＡＡＡ４、ＡＡＡ１
、Ｅｄｇ−１、α５β１インテグリン、エンドムチンおよびマトリックスメタロ
プロテイナーゼ１０からなる群より選択される、タンパク質またはそのフラグメ
ントである。別の実施形態においては、このタンパク質は、表１、２、３、４ま
たは５から選択される核酸によって、コードされている。好ましい核酸は、表４
に示されており、そして最も好ましくは、表５のものである。
【０００９】 本明細書中にはさらに、ＡＭＰの活性を調節し得る生物活性薬剤についてスク
リーニングするための方法が提供される。１つの実施形態においては、この方法
は、ＡＭＰと候補生物活性薬物とを合わせる工程、およびＡＭＰの生物活性に対
するこの候補薬剤の効果を決定する工程を、包含する。好ましくは、ＡＭＰは、
ＡＡＡ４、ＡＡＡ１、Ｅｄｇ−１、α５β１インテグリン、エンドムチンおよび
マトリックスメタロプロテイナーゼ１０からなる群より選択される、タンパク質
またはそのフラグメントである。別の実施形態においては、このタンパク質は、
表１、２、３、４または５から選択される核酸によって、コードされている。好
ましい核酸は、表４に示されており、そして最も好ましくは、表５のものである
。
【００１０】 候補新脈管形成薬物の効果を評価する方法もまた提供され、この方法は、ＡＭ
Ｐを発現または過剰発現するトランスジェニック動物、あるいはＡＭＰが欠乏し
ている動物（例えば、遺伝子ノックアウトの結果として）に、この薬物を投与す
る工程を包含する。
【００１１】 さらに、本明細書中には、候補新脈管形成薬物の効果を評価する方法が提供さ
れ、この方法は、患者にこの薬物を投与する工程、およびこの患者から細胞サン
プルを取り出す工程を包含する。次いで、細胞の発現プロフィールが決定される
。この方法は、この発現プロフィールを、健全な個体の発現プロフィールと比較
する工程を、さらに包含し得る。好ましい実施形態においては、発現プロフィー
ルは、表１、表２、表３、表４または表５の遺伝子を含む。
【００１２】 さらに、本明細書中には、新脈管形成タンパク質をコードする１つ以上の核酸
セグメントを含むバイオチップが提供され、このタンパク質は、好ましくは、Ａ
ＡＡ４、ＡＡＡ１、Ｅｄｇ−１、α５β１インテグリン、エンドムチンおよびマ
トリックスメタロプロテイナーゼまたはそのフラグメントからなる群より選択さ
れ、ここで、このバイオチップは、１０００未満の核酸プローブを含む。好まし
くは、少なくとも２つの核酸セグメントが、含まれる。別の実施形態においては
、表１、２、３、４または５から選択される核酸である。好ましい核酸は、表４
に示され、そして最も好ましくは、表５に示されるものである。
【００１３】 さらに、新脈管形成に関連する障害を診断する方法が、提供される。この方法
は、ＡＡＡ４、ＡＡＡ１、Ｅｄｇ−１、α５β１インテグリン、エンドムチンお
よびマトリックスメタロプロテイナーゼ１０からなる群より好ましくは選択され
る、新脈管形成タンパク質またはそのフラグメントをコードする遺伝子の、第一
の個体の第一の組織型における発現を決定する工程、および第一の個体または第
二の罹患していない個体に由来の第二の正常組織型からの遺伝子の発現への分布
を比較する工程を包含する。別の実施形態においては、このタンパク質は、表１
、２、３、４または５から選択される核酸によって、コードされる。好ましい核
酸は、表４に示されるものであり、そして最も好ましくは、表５に示されるもの
である。発現における差異は、第一の個体が、新脈管形成に関連する障害を有す
ることを示す。
【００１４】 別の局面において、本発明は、新脈管形成に特異的に結合する抗体を提供し、
これは、好ましくは、ＡＡＡ４、ＡＡＡ１、Ｅｄｇ−１、α５β１インテグリン
、エンドムチンおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ１０、またはそのフラ
グメントからなる群より選択される。別の実施形態においては、このタンパク質
は、表１、２、３、４または５から選択される核酸によって、コードされる。好
ましい核酸は、表４に示されるものであり、そして最も好ましくは、表５に示さ
れるものである。好ましい実施形態においては、ＡＡＡ１のフラグメントが、Ａ
ＡＡ１ｐ１またはＡＡＡ１ｐ２から選択される。新脈管形成タンパク質のための
他の好ましいフラグメントを、図に示す。
【００１５】 １つの実施形態においては、新脈管形成調節タンパク質（ＡＭＰ）またはその
フラグメントと、ＡＭＰまたはそのフラグメントに結合する抗体との結合を、妨
害し得る生物活性薬剤について、スクリーニングするための方法である。好まし
い実施形態においては、この方法は、ＡＭＰまたはそのフラグメント、候補生物
活性薬剤、およびＡＭＰまたはそのフラグメントに結合する抗体を合わせる工程
を、包含する。この方法は、ＡＭＰまたはそのフラグメントと、この抗体との結
合を決定する工程を、さらに包含する。結合に変化がある場合には、薬剤は、妨
害薬剤と同定される。この妨害薬剤は、アゴニストまたはアンタゴニストであり
得る。好ましくは、この薬剤は、新脈管形成を阻害する。
【００１６】 さらなる局面において、新脈管形成を阻害するための方法が提供される。１つ
の実施形態において、この方法は、新脈管形成調節タンパク質（好ましくは、Ａ
ＡＡ４、ＡＡＡ１、Ｅｄｇ−１、α５β１インテグリン、エンドムチンおよびマ
トリックスメタロプロテイナーゼ１０、またはそのフラグメントからなる群より
選択される）に対する抗体を含有する組成物を、細胞に投与する工程を包含する
。別の実施形態においては、このタンパク質は、表１、２、３、４または５から
選択される核酸によって、コードされる。好ましい核酸は、表４に示されるもの
であり、そして最も好ましくは、表５に示されるものである。この方法は、イン
ビトロまたはインビボで実施され得、好ましくは、個体に対するインビボでであ
る。好ましい実施形態意においては、新脈管形成を阻害する方法は、癌のような
新脈管形成に関連する障害を有する個体に対して、提供される。本明細書中に記
載されるように、新脈管形成を阻害する方法は、新脈管形成タンパク質（この遺
伝子に対するアンチセンス分子またはその遺伝子産物、および好ましい低分子を
含む）の活性のインヒビターを投与することによって、実施され得る。
【００１７】 本明細書中にはまた、個体において免疫応答を惹起する方法が提供される。１
つの実施形態において、本明細書中に提供される方法は、個体に、新脈管形成調
節タンパク質（好ましくは、ＡＡＡ４、ＡＡＡ１、Ｅｄｇ−１、α５β１インテ
グリン、エンドムチンおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ１０、またはそ
のフラグメントからなる群より選択される）を含有する組成物を投与する工程を
包含する。別の実施形態においては、このタンパク質は、表１、２、３、４また
は５から選択される核酸によって、コードされる。好ましい核酸は、表４に示さ
れるものであり、そして最も好ましくは、表５に示されるものである。別の局面
においては、この組成物は、新脈管形成調節タンパク質（好ましくは、ＡＡＡ４
、ＡＡＡ１、Ｅｄｇ−１、α５β１インテグリン、エンドムチンおよびマトリッ
クスメタロプロテイナーゼ１０、またはそのフラグメントからなる群より選択さ
れる）をコードする配列を含む核酸を含有する。別の実施形態においては、この
タンパク質は、表１、２、３、４または５から選択される核酸によって、コード
される。好ましい核酸は、表４に示されるものであり、そして最も好ましくは、
表５に示されるものである。
【００１８】 本明細書中には、さらに、個体において免疫応答を惹起し得る組成物が提供さ
れる。１つの実施形態においては、本明細書中に提供される組成物は、新脈管形
成調節タンパク質（好ましくは、ＡＡＡ４、ＡＡＡ１、Ｅｄｇ−１、α５β１イ
ンテグリン、エンドムチンおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ１０、また
はそのフラグメントからなる群より選択される）を含有する。別の実施形態にお
いては、このタンパク質は、表１、２、３、４または５から選択される核酸によ
って、コードされる。好ましい核酸は、表４に示されるものであり、そして最も
好ましくは、表５に示されるものである。別の実施形態においては、この組成物
は、新脈管形成調節タンパク質（好ましくは、ＡＡＡ４、ＡＡＡ１、Ｅｄｇ−１
、α５β１インテグリン、エンドムチンおよびマトリックスメタロプロテイナー
ゼ１０、またはそのフラグメントからなる群より選択される）をコードする配列
を含む核酸、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する。
【００１９】 別の実施形態においては、表１、２、３、４または５から選択される核酸であ
る。好ましい核酸は、表４に示されるものであり、そして最も好ましくは、表５
に示されるものである。
【００２０】 新脈管形成調節タンパク質（好ましくは、ＡＡＡ４、ＡＡＡ１、Ｅｄｇ−１、
α５β１インテグリン、エンドムチンおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ
１０、またはそのフラグメントからなる群より選択される）の効果を中和する方
法は、このタンパク質に対して特異的な薬剤を、このタンパク質に、中和を生じ
るに十分な量で接触させる工程を包含する。別の実施形態においては、このタン
パク質は、表１、２、３、４または５から選択される核酸によってコードされる
。好ましい核酸は、表４に示されるものであり、そして最も好ましくは、表５に
示されるものである。
【００２１】 本発明の別の局面においては、新脈管形成に関連する疾患に対して個体を処置
する方法が、提供される。１つの実施形態においては、この方法は、この個体に
、Ｅｄｇ−１のインヒビターを投与する工程を包含する。別の実施形態において
は、この方法は、新脈管形成を有する障害を有する患者に、治療部分が結合体化
したＥｄｇ−１に対する抗体を投与する工程を包含する。このような治療部分は
、細胞傷害性因子または放射性同位体であり得る。
【００２２】 新規な配列が、本明細書中に提供される。化合物および組成物もまた、提供さ
れる。本発明の他の局面は、以下の発明の説明によって、当業者に明らかとなる
。
【００２３】 （表および図の詳細な説明） 表１は、その発現レベルが新脈管形成を起こしていない組織と比較して新脈管
形成を起こしている組織において時間の関数として変化する、発現配列タグを含
む１７７４の遺伝子についての登録番号（登録番号が提供される場合には、その
全体が、本明細書中および本出願全体にわたって組み込まれる）を提供する。
【００２４】 表２は、その発現レベルが新脈管形成を起こしていない組織と比較して新脈管
形成を起こしている組織において時間の関数として変化する、発現配列タグを含
む５５９の遺伝子の好ましいサブセットについての登録番号を（登録番号が提供
される場合には、その全体が、本明細書中および本出願全体にわたって組み込ま
れる）提供する。これらの配列は、分泌タンパク質（ＳＳ）または膜貫通（ＴＭ
）タンパク質をコードすると予測されると特徴付けられる。
【００２５】 表３は、その発現レベルが新脈管形成を起こしていない組織と比較して新脈管
形成を起こしている組織において時間の関数として変化する、発現配列タグを含
む１９１６の遺伝子についての登録番号（登録番号が提供される場合には、その
全体が、本明細書中および本出願全体にわたって組み込まれる）を提供する。
【００２６】 表４は、その発現レベルが新脈管形成を起こしていない組織と比較して新脈管
形成を起こしている組織において時間の関数として変化する、図４に示す５５８
の登録番号の好ましいサブセットを提供する。
【００２７】 表５は、その発現レベルが新脈管形成を起こしていない組織と比較して新脈管
形成を起こしている組織において時間の関数として変化する、図４に示す２０の
登録番号の好ましいサブセットを提供する。
【００２８】 （発明の詳細な説明） 上記の目的に従って、本発明は、新脈管形成（ときどき、本明細書中で、新脈
管形成障害またはＡＤといわれる）に関連する障害の診断についての新規の方法
、ならびに、新脈管形成を調節する組成物のスクリーニングについての方法を提
供する。本明細書中における「新脈管形成に関連する障害」または「新脈管形成
に関連する疾患」は、血管の発生の過度または不足のどちらかによって特徴付け
られる疾患状態を意味する。新脈管形成障害は、癌および増殖性糖尿病網膜症を
含むが、それに限定されない。ＡＤを処置する方法もまた提供される。
【００２９】 １つの局面では、遺伝子の発現レベルは、発現プロフィールを提供するために
、診断情報が所望である異なった患者のサンプルにおいて決定される。特定のサ
ンプルの発現プロフィールは、基本的に、このサンプルの状態の「フィンガープ
リント」である；２つの状態は、任意の特定の遺伝子を類似して発現し得るが、
多数の遺伝子の評価は、同時に、細胞の状態における独特の遺伝子発現プロフィ
ールの作製を可能にする。すなわち、正常組織は、ＡＤ組織から区別され得る。
既知の異なった新脈管形成状態における組織の発現プロフィールを比較すること
によって、これらの状態の各々で、どの遺伝子が重要であるか（遺伝子のアップ
レギュレーションおよびダウンレギュレーションの両方を含む）に関する情報が
獲得される。非脈管形成組織に比較して脈管形成において差示的に発現される配
列の同定は、多数の方法で、この情報の使用を可能にする。例えば、特定の処置
レジームの評価は評価され得る：化学療法薬物は、新脈管形成をダウンレギュレ
ーションするために作用し、従って、特定の患者における腫瘍増殖または再発を
ダウンレギュレーションする。同様に、患者サンプルを既知の発現プロフィール
と比較することによって、診断は、行なわれ得るかまたは確かめられ得る。さら
に、これらの遺伝子発現プロフィール（または個々の遺伝子）は、特定の発現プ
ロフィールを模倣または変化するために、目を使用して、候補薬物のスクリーニ
ングを可能にする：例えば、スクリーニングは、脈管形成発現プロフィールを抑
制する薬物について行なわれ得る。このことは、重要な新脈管形成遺伝子のセッ
トを含むバイオチップを作製することによって行なわれ得、次いで、この遺伝子
は、これらのスクリーニングで使用され得る。これらの方法はまた、タンパク質
ベースで行なわれ得る；すなわち、脈管形成タンパク質のタンパク質発現レベル
は、診断目的のために評価され得るかまたは候補薬剤をスクリーニングするため
に評価され得る。さらに、脈管形成核酸配列は、遺伝子治療目的のために投与さ
れ得、これは、アンチセンス核酸の投与、または、治療薬物として投与される脈
管形成タンパク質（抗体および他のそのモジュレーターを含む）を含む。
【００３０】 従って、本発明は、新脈管形成において差示的に発現される核酸およびタンパ
ク質配列（本明細書中で「新脈管形成配列」といわれる）を提供する。以下に要
約するように、新脈管形成配列は、新脈管形成に関連した障害においてアップレ
ギュレーションされる（すなわち、より高いレベルで発現される）配列、および
ダウンレギュレーションされる（すなわち、より低いレベルで発現される）配列
を含む。好ましい実施形態では、新脈管形成配列は、ヒト由来である；しかし、
当業者によって理解されるように、他の生物由来の新脈管形成配列は、疾患およ
び薬物評価の動物モデルにおいて有用であり得る；従って、脊椎動物（哺乳動物
（げっ歯類（ラット、マウス、ハムスター、モルモットなど）、霊長類、農業動
物（ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマなどを含む）を含む）を含む）から、他の
新脈管形成配列が提供される。他の生物由来の新脈管形成配列は、以下に要約さ
れる技術を使用して、獲得され得る。
【００３１】 新脈管形成配列は、核酸およびアミノ酸配列の両方を含み得る。好ましい実施
形態では、この新脈管形成配列は、組換え核酸である。本明細書中において、用
語「組換え核酸」は、一般的に、ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼによる
核酸操作によって、元来インビトロで形成される、天然に通常見出されない形態
の核酸を意味する。従って、単離された核酸（直鎖状形態の）または通常加えら
れないＤＮＡ分子をインビトロで連結することにより形成される発現ベクターは
共に、本発明の目的のための組換え体として考えられる。一旦、組換え核酸が、
作製され、そして、宿主細胞または生物に再導入されると、組換え核酸は、非組
換え的に（すなわち、インビトロ操作ではなく宿主細胞のインビボの細胞の仕組
みを使用して）複製することが理解される；しかし、このような核酸は、一旦組
換え的に生成されると、続いて非組換え的に複製されるが、本発明の目的につい
て、なお組換え体と考えられる。
【００３２】 同様に、「組換えタンパク質」とは、組換え技術を使用して（すなわち、上記
のように組換え核酸の発現を介して）作製されたタンパク質である。組換えタン
パク質は、少なくとも１つ以上の特徴によって、天然に存在するタンパク質と区
別される。例えば、このタンパク質は、その野生型宿主において通常関連するタ
ンパク質および化合物のいくつかまたは全てから単離または精製され得、従って
、実質的に純粋であり得る。例えば、単離されたタンパク質は、その天然の状態
において通常関連する物質の少なくともいくつかを伴わず、所定のサンプル中の
総タンパク質の重量の、好ましくは、少なくとも約０．５％、さらに好ましくは
、少なくとも約５％を構成する。実質的に純粋なタンパク質は、総タンパク質の
重量の少なくとも約７５％、好ましくは、少なくとも約８０％、そして、特に好
ましくは、少なくとも約９０％を含む。この定義は、ある生物体由来の新脈管形
成タンパク質の異なった生物体または宿主細胞における産生を含む。あるいは、
このタンパク質は、誘導性プロモーターまたは高発現プロモーターの使用を介し
て、通常みられるよりも有意に高い濃度で作製され得、その結果、このタンパク
質は、増加した濃度レベルで作製される。あるいは、このタンパク質は、以下に
考察されるように、エピトープタグの付加またはアミノ酸置換、挿入および欠失
にみられるように、通常天然に見出されない形態で存在し得る。
【００３３】 好ましい実施形態では、新脈管形成配列は核酸である。当業者によって理解さ
れ、そして、以下に十分に要約されるように、新脈管形成配列は、診断適用（こ
れは、天然に存在する核酸を検出する）およびスクリーニング適用を含む種々の
適用において有用である；例えば、新脈管形成配列に対する核酸プローブを含む
バイオチップが作製され得る。次いで、最も幅広い意味では、本明細書中におい
て「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または文法的等価物は、共に共有結合
的に連結された少なくとも２つの核酸を意味する。本発明の核酸は、一般的に、
ホスホジエステル結合を含むが、以下に要約されるように、いくつかの場合にお
いて、他の骨格（例えば、以下を含む）を有し得る核酸アナログが含まれる：ホ
スホルミデート（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９（１０）
：１９２５（１９９３）およびその中の参考文献）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．
Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００（１９７０）；Ｓｐｒｉｚｌら、Ｅｕｒ．Ｊ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９（１９７７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：３４８７（１９８６）；Ｓａｗａｉら、Ｃｈｅ
ｍ．Ｌｅｔｔ．８０５（１９８４），Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；およびＰａｕｗｅｌｓら、Ｃｈｅ
ｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ ２６：１４１ ９１９８６））、ホスホロチオエー
ト（Ｍａｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：１４３７（１９９
１）；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒ
ｉｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１（１９８９））、Ｏ−
メチルホスホロアミダイト連結（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）、お
よびペプチド核酸骨格および連結（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ
．１１４：１８９５（１９９２）；Ｍｅｉｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅ
ｎｇｌ．３１：１００８（１９９２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３６５
：５６６（１９９３）；Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：２０７（
１９９６）を参照のこと）（これら全てが参考として援用される）。他のアナロ
グ核酸としては、以下を有するものが挙げられる：陽性骨格（Ｄｅｎｐｃｙら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：６０９７（１９９５）；
非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号
、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号、同第４，４６９，８
６３号；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅ
ｎｇｌｉｓｈ ３０：４２３（１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎ
ｕｃｌｅｏｓｉｄｅ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ １３：１５９７（１９９４）；Ａ
ＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０、第２章および第３章、「Ｃ
ａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎ
ｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ
編；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈ
ｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５（１９９４）；Ｊｅｆｆｓら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ＮＭＲ ３４：１７（１９９４）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅ
ｔｔ．３７：７４３（１９９６））ならびに非リボース骨格（米国特許第５，２
３５，０３３号および第５，０３４，５０６号およびＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕ
ｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０、第６章および第７章、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ
Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
」Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編において記載される骨
格を含む）。１つ以上の炭素環式の糖を含む核酸もまた、核酸の１つの定義内に
含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（１９９５）１６９
〜１７６頁を参照のこと）。いくつかの核酸アナログが、Ｒａｗｌｓ，Ｃ＆Ｅ
Ｎｅｗｓ Ｊｕｎｅ２，１９９７ ３５頁に記載されている。これらの参考文献
の全ては、本明細書中に参考として明確に援用される。これらのリボース−リン
酸骨格は、種々の理由のため、例えば、生理学的環境におけるこのような分子の
安定性および半減期を増加するためにまたはバイオチップ上のプローブとして、
行なわれ得る。
【００３４】 当業者によって理解されるように、これらの核酸アナログの全ては、本発明に
おける用途を見出し得る。さらに、天然に存在する核酸およびアナログの混合物
は、作製され得る；あるいは、異なった核酸アナログの混合物ならびに天然に存
在する核酸およびアナログの混合物が、作製され得る。
【００３５】 特に好ましいのは、ペプチド核酸アナログを含むペプチド核酸（ＰＮＡ）であ
る。これらの骨格は、天然に存在する核酸の高く荷電したリン酸ジエステル骨格
とは対照的に、中性条件下で、実質的に非イオン性である。これは、２つの利点
を生じる。第１に、このＰＮＡ骨格は、改善したハイブリダイゼーション動態を
示す。ＰＮＡは、完全にマッチした塩基対と比較してミスマッチ塩基対について
の融解温度（Ｔｍ）におけるより大きい変化を有する。ＤＮＡおよびＲＮＡは、
代表的には、内部ミスマッチについてＴｍにおける２〜４℃の低下を示す。非イ
オン性ＰＮＡ骨格の場合は、この低下は、７〜９℃に近い。同様に、これらの非
イオン性性質に起因して、これらの骨格に付着した塩基のハイブリダイゼーショ
ンは、塩濃度に対して比較的非感受性である。さらに、ＰＮＡは、細胞内酵素に
よって分解されず、従って、より安定であり得る。
【００３６】 核酸は、具体的には、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または、二本鎖も
しくは一本鎖配列の両方の部分を含み得る。当業者に理解されるように、一本鎖
（「Ｗａｔｓｏｎ」）の描写はまた、他方の鎖（「Ｃｒｉｃｋ」）の配列を定義
する；従って、本明細書中に記載される配列はまた、この配列の相補体を含む。
この核酸は、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡまたはハイ
ブリッドであり得、ここで、この核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボ
ヌクレオチドの任意の組み合わせ、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グ
アニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン
などを含む塩基の任意の組み合わせを含む。本明細書中で使用される場合、用語
「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドおよびヌクレオシドおよびヌクレオチドアナ
ログおよびアミノ改変ヌクレオシドなどの改変ヌクレオシドを含む。さらに、「
ヌクレオシド」は、天然に存在しないアナログ構造を含む。従って、例えば、ペ
プチド核酸（それぞれが塩基を含む）の個々のユニットは、本明細書中では、ヌ
クレオシドといわれる。
【００３７】 新脈管形成配列は、本明細書中に要約される新脈管形成配列に対する有意な核
酸および／またはアミノ酸配列相同性によって最初に同定され得る。このような
相同性は、核酸またはアミノ酸配列全体に基づき得、そして、一般的に以下に要
約されるように、相同性プログラムまたはハイブリダイゼーション条件のどちら
かを使用して決定される。
【００３８】 新脈管形成スクリーニングは、Ｈｉｒａｏｋａ，Ｃｅｌｌ ９５：３６５（１
９９８）（これは、参考として明確に援用される）に記載されるように新脈管形
成のインビトロモデル中で同定される遺伝子を、コントロール中で同定される遺
伝子と比較する工程を包含する。正常組織および新脈管形成を起こす組織のサン
プルを、核酸プローブを含むバイオチップに適用する。このサンプルを、最初に
、適用可能であれば、顕微解剖し、ｍＲＮＡの調製のために当該分野で公知のよ
うに処理する。適切なバイオチップは、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘから市販
されている。本明細書中に記載される遺伝子発現プロフィールを作製し、そして
、データを分析した。
【００３９】 好ましい実施形態では、正常状態と疾患状態との間のような発現における変化
を示す遺伝子は、他の正常な組織（肺、心臓、脳、肝臓、乳房、腎臓、筋肉、前
立腺、小腸、大腸、脾臓、骨および胎盤を含むがそれに限定されない）において
発現される遺伝子と比較される。好ましい実施形態では、他の組織において任意
の有意な量で発現される、新脈管形成スクリーニングの間に同定される遺伝子は
、いくつかの実施形態においてはこのことは必ずしも必要ではないが、プロフィ
ールから取り出される。すなわち、薬物についてのスクリーニングの場合では、
ありうる副作用を最小限にするために、標的は疾患特異的であることが好ましい
。
【００４０】 好ましい実施形態では、新脈管形成配列は、新脈管形成障害においてアップレ
ギュレーションされる配列である；すなわち、これらの遺伝子の発現は、正常組
織と比較して疾患組織でより高い。本明細書中で使用される場合、「アップレギ
ュレーション」は、少なくとも約２倍の変化、好ましくは、少なくとも約３倍の
変化を意味し、少なくとも、約５倍またはより高い変化が好ましい。本明細書中
の全ての登録番号は、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベースの番号であり、そして、
登録番号の配列は、本明細書中に参考として明確に援用される。ＧｅｎｅＢａｎ
ｋは、当該分野で公知であり、例えば、Ｂｅｎｓｏｎ．ＤＡら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６：１−７（１９９８）およびｈｔｔｐ：
／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照のこと。さらに、これ
らの遺伝子は、心臓、脳、肺、肝臓、乳房、腎臓、前立腺、小腸および脾臓にお
いて、限られた量で発現されるかまたは全く発現されないことが見出された。
【００４１】 好ましい実施形態では、新脈管形成配列は、新脈管形成障害においてダウンレ
ギュレーションされる配列である；すなわち、これらの遺伝子の発現は、正常組
織と比較して、脈管形成組織でより低い。本明細書中で使用される場合、「ダウ
ンレギュレーション」とは、少なくとも約２倍の変化、好ましくは、少なくとも
約３倍の変化を意味し、少なくとも約５倍またはより高い変化が好ましい。
【００４２】 本発明による新脈管形成配列は、この配列の共通の発現プロフィールに基づい
て個々の配列クラスターに分類され得る。新脈管形成配列の発現レベルは、新脈
管形成の誘導と相関する様式で、時間の関数として、増加または減少し得る。あ
るいは、新脈管形成配列の発現レベルは、時間の関数として、増加および減少の
両方をし得る。例えば、いくつかの新脈管形成配列の発現レベルは、新脈管形成
表現型に変わる間に、一次的に誘導されるかまたは減少され、続いて、発現レベ
ルのベースラインへと戻る。表１は、１７７４の遺伝子を示し、この発現は、正
常組織と比較する場合、新脈管形成組織における時間の関数として変化する。図
１は、表１に同定される新脈管形成遺伝子の個々の発現プロフィールを示す。
【００４３】 特に好ましい実施形態は、５５９の新脈管形成配列（この発現は、正常組織と
比較される場合、新脈管形成において変化する）の好ましいサブセットを示す表
２に記載されるような配列を含む。
【００４４】 さらなる実施形態は、発現配列タグを含む１９１６の遺伝子（これらの発現レ
ベルは、新脈管形成でない組織と比較して、新脈管形成を起こす組織における時
間の関数として変化する）を示す表３に記載される配列を含む（登録番号が提供
される場合、その全体が本明細書中および出願全体に援用される）。
【００４５】 好ましい実施形態は、表３に同定される５５８の遺伝子の好ましいサブセット
を示す表４に記載される配列（これらの発現レベルは、新脈管形成でない組織と
比較して、新脈管形成を起こす組織における時間の関数として変化する）を含む
。
【００４６】 特に好ましい実施形態は、表３に同定される２０の登録番号の好ましいサブセ
ットを提供する表５に記載される配列（これらの発現レベルは、新脈管形成でな
い組織と比較して、新脈管形成を起こす組織における時間の関数として変化する
）を含む。
【００４７】 特に好ましい実施形態では、新脈管形成配列は、一定の期間誘導され、続いて
ベースラインレベルに戻る配列である。一過的に誘導される配列は、新脈管形成
組織（例えば、新生血管形成腫瘍）を標的化するが、永続的な血管新生を必要と
する急速に増殖する組織を避ける方法を提供する。このような陽性脈管形成因子
としては、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、アンギオゲニンなどが挙げられる。
【００４８】 誘導された新脈管形成配列はまた、誘導の時間に関してさらに分類される。例
えば、いくつかの新脈管形成遺伝子は、初期の時間帯（例えば、新脈管形成の誘
導の１０分後）で誘導され得る。他の遺伝子は、後に（例えば、５分と６０分と
の間）誘導され得るが、さらに他の遺伝子は、約２時間以上の期間で誘導され得
、続いてベースライン発現レベルへと戻る。
【００４９】 別の好ましい実施形態では、新脈管形成配列が、時間の関数として阻害される
かまたは減少され、続いて「正常な」発現レベルへと戻る。新脈管形成のインヒ
ビターは、この発現プロフィールを有する分子の例である。これらの配列はまた
、消失した発現の時間に依存して群にさらに分けられ得る。例えば、いくつかの
分子は、新脈管形成の誘導後１０分で、減少した発現を示し得る。他の分子は、
より遅く（例えば、５分と６０分との間）消失し得るが、さらに他の分子は、約
２時間以上の期間で消失し得、続いてベースラインに戻る。このような陰性脈管
形成因子の例としては、いくつか名前を挙げると、トロンボスポンジンおよびエ
ンドスタチンが挙げられる。
【００５０】 さらに別の好ましい実施形態では、新脈管形成配列は、延長した期間誘導され
る。これらの配列は、代表的には、新脈管形成の誘導に関連しており、そして、
新脈管形成表現型の誘導および／または維持に関与し得る。
【００５１】 別の好ましい実施形態では、新脈管形成配列は、その発現が、脈管形成組織に
おいて、延長した期間、減少するかまたは消失する。これらの配列は、代表的に
は、新脈管形成インヒビターであり、そして、これらの消失は、新脈管形成にお
ける増加と相関する。
【００５２】 本発明の新脈管形成タンパク質は、分泌タンパク質、膜貫通タンパク質または
細胞内タンパク質として分類され得る。好ましい実施形態では、この新脈管形成
タンパク質は、細胞内タンパク質である。細胞内タンパク質は、細胞質および／
または核で検出され得る。細胞内タンパク質は、細胞機能および複製（例えば、
シグナル伝達経路を含む）の全ての局面に関与する；このようなタンパク質の異
常な発現は、未制御または誤制御の細胞プロセスを生じる。例えば、多数の細胞
内タンパク質は、プロテインキナーゼ活性、プロテインホスファターゼ活性、プ
ロテアーゼ活性、ヌクレオチドシクラーゼ活性、ポリメラーゼ活性などの酵素活
性を有する。細胞内タンパク質はまた、タンパク質の複合体を組織化すること、
または種々の亜細胞内局在化へタンパク質を標的化することに関与し、そして、
細胞小器官の構造的統合性を維持することに関与するドッキングタンパク質とし
て機能する。
【００５３】 細胞内タンパク質を特徴付ける際のますます理解される概念は、所定の機能が
寄与する１つ以上のモチーフの、タンパク質における存在である。タンパク質の
酵素学的ドメインに見出される高度に保存された配列に加えて、高度に保存され
た配列が、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質で、同定され
てきた。例えば、Ｓｒｃ−ホモロジー−２（ＳＨ２）ドメインは、配列に依存し
た様式で、チロシンリン酸化標的に結合する。ＰＴＢドメイン（ＳＨ２ドメイン
とは区別される）もまた、チロシンリン酸化標的に結合する。ＳＨ３ドメインは
、プロリンリッチな標的に結合する。さらに、いくつかのみ名前を挙げると、Ｐ
Ｈドメイン、テトラトリコペプチド反復およびＷＤドメインは、タンパク質−タ
ンパク質相互作用を媒介することが示されてきた。これらのいくつかはまた、リ
ン脂質または他の第２メッセンジャーへの結合に関与し得る。当業者によって理
解されるように、これらのモチーフは、一次配列に基づいて同定され得る；従っ
て、タンパク質の配列の分析は、このタンパク質が会合し得る分子（単数）およ
び／または分子（複数）の両方の酵素学的潜在能力に洞察を提供し得る。
【００５４】 好ましい実施形態では、新脈管形成配列は、膜貫通タンパク質である。膜貫通
タンパク質は、細胞のリン脂質二重層に広がる分子である。これらは、細胞内ド
メイン、細胞外ドメイン、または両方を有し得る。このようなタンパク質の細胞
内ドメインは、細胞内タンパク質についてすでに記載された機能を含む多数の機
能を有し得る。例えば、細胞内ドメインは、酵素学的活性を有し得、そして／ま
たは、さらなるタンパク質についての結合部位として機能し得る。しばしば、膜
貫通タンパク質の細胞内ドメインは、両方の役割を果たす。例えば、特定のレセ
プターチロシンキナーゼは、プロテインキナーゼ活性およびＳＨ２ドメインの両
方を有する。さらに、レセプター分子それ自身上でのチロシンの自己リン酸化は
、さらなるＳＨ２ドメイン含有タンパク質についての結合部位を作製する。
【００５５】 膜貫通タンパク質は、１から多数の膜貫通ドメインを含み得る。例えば、レセ
プターチロシンキナーゼ、特定のサイトカインレセプター、レセプターグアニリ
ルシクラーゼおよびレセプターセリン／トレオニンプロテインキナーゼは、単一
の膜貫通ドメインを含む。しかし、チャネルおよびアデニリルシクラーゼを含む
種々の他のタンパク質は、多数の膜貫通ドメインを含む。多数の重要な細胞表面
レセプターは、これらが７つの膜スパニング（ｓｐａｎｎｉｎｇ）領域を含むの
で、「７回膜貫通ドメイン」タンパク質として分類される。重要な膜貫通タンパ
ク質レセプターとしては、インスリンレセプター、インスリン様増殖因子レセプ
ター、ヒト増殖ホルモンレセプター、グルコース輸送体、トランスフェリンレセ
プター、上皮増殖因子レセプター、低密度リポタンパク質レセプター、上皮増殖
因子レセプター、レプチンレセプター、インターロイキンレセプター（例えば、
ＩＬ−１レセプター、ＩＬ−２レセプターなど）が挙げられるが、これらに限定
されない。
【００５６】 膜貫通ドメインの特徴は、荷電アミノ酸が後に続き得る、約２０の継続的な疎
水性アミノ酸を含む。従って、特定のタンパク質のアミノ酸配列の分析の際、タ
ンパク質内の膜貫通ドメインの局在化および数が、予想され得る。
【００５７】 膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、多様である；しかし、保存されたモチ
ーフが、種々の細胞外ドメイン内で反復して見出される。保存された構造および
／または機能は、異なった細胞外モチーフに起因すると考えられてきた。例えば
、サイトカインレセプターは、システインおよびＷＳＸＷＳ（Ｗ＝トリプトファ
ン、Ｓ＝セリン、Ｘ＝任意のアミノ酸）モチーフのクラスターによって特徴付け
られる。免疫グロブリン様ドメインは、高度に保存されている。ムチン様ドメイ
ンは、細胞付着に関与し得、そして、ロイシンリッチリピートは、タンパク質−
タンパク質相互作用に関与する。
【００５８】 多数の細胞外ドメインは、他の分子への結合に関与する。１つの局面では、細
胞外ドメインは、レセプターである。レセプタードメインに結合する因子として
は、循環リガンド（これは、ペプチド、タンパク質、またはアデノシンのような
小分子などであり得る）が挙げられる。例えば、ＥＧＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦ
などの増殖因子は、種々の細胞内応答を開始するために同族のレセプターに結合
する循環増殖因子である。他の因子としては、サイトカイン、マイトジェン因子
、神経栄養性因子などが挙げられる。細胞外ドメインはまた、細胞関連分子に結
合する。この局面において、これらは、細胞−細胞相互作用を媒介する。細胞関
連リガンドは、例えば、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アン
カーを介して、細胞につながれ得るか、または、それ自体が膜貫通タンパク質で
あり得る。細胞外ドメインはまた、細胞外マトリックスに関連し、そして、細胞
構造の維持に貢献する。
【００５９】 推定の膜貫通新脈管形成タンパク質は、表２に示されるＴＭ欄に「Ｙ」で標識
された配列によってコードされるタンパク質を含む。
【００６０】 膜貫通である新脈管形成タンパク質は、本明細書中に記載されるように、これ
らは免疫治療についての優れた標的であるため、本発明において特に好ましい。
さらに、以下に要約されるように、膜貫通タンパク質はまた、画像化様式におい
て有用であり得る。
【００６１】 膜貫通タンパク質は、例えば、組換え方法を介して、膜貫通配列を除去するこ
とによって可溶性となり得ることが、当業者により理解される。さらに、可溶性
となった膜貫通タンパク質は、適切なシグナル配列を付加することによる組換え
方法を介して、分泌されるようになされ得る。
【００６２】 好ましい実施形態では、新脈管形成タンパク質は、分泌タンパク質である；こ
の分泌は、構成的であるかまたは調節されるかのいずれかであり得る。これらの
タンパク質は、分子を分泌経路へと標的化するシグナルペプチドまたはシグナル
配列を有する。分泌タンパク質は、多数の生理学的事象に関与する；これらの循
環性質のために、これらは、シグナルを種々の他の細胞型へ伝達するために役立
つ。この分泌タンパク質は、オートクライン様式（因子を分泌する細胞に作用す
る）で、パラクリン様式（因子を分泌する細胞に近接した細胞に作用する）で、
または、内分泌様式（離れた細胞に作用する）で、機能し得る。従って、分泌さ
れた分子は、生理学の多数の局面を調節および変化する際の用途を見出する。分
泌タンパク質である新脈管形成タンパク質は、例えば、血液試験について、これ
らは診断マーカーとして優れた標的として役立つので、本発明において特に好ま
しい。
【００６３】 推定の分泌された新脈管形成タンパク質は、表２に示されるＳＳ欄に「Ｙ」で
標識された配列（しかし、ＴＭ欄では「Ｎ」）によってコードされるタンパク質
を含む。
【００６４】 新脈管形成配列は、本明細書中に要約される新脈管形成配列に対する有意な核
酸および／またはアミノ酸配列相同性によって最初に同定される。このような相
同性は、核酸またはアミノ酸配列全体に基づき得、そして、一般的に以下に要約
されるように、相同性プログラムまたはハイブリダイゼーション条件のどちらか
を使用して決定される。
【００６５】 本明細書中で使用される場合、表１、表２、表３、表４または表５の核酸の１
つに対する核酸配列の全体の相同性が、好ましくは、約７５％より高く、さらに
好ましくは、約８０％より高く、なおさらに好ましくは、約８５％より高く、最
も好ましくは、９０％より高い場合、核酸は「新脈管形成核酸」である。いくつ
かの実施形態では、相同性は、約９３〜９５または９８％ほども高い。この文脈
での相同性は、配列類似性または同一性を意味し、同一性が好まれる。相同性目
的についての好ましい比較は、正確な配列に対して配列決定のエラーを含む配列
を比較することである。この相同性は、当該分野で公知の標準技術を使用して決
定され、この技術は、以下を含むが、これらに限定されない：Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａ
ｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的
な相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ
＆Ｌｉｐｍａｎ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性方法の
検索、３つのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔ
ｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ
，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ
、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された
実施、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９
５（１９８４）によって記載されるＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム、好ましく
はデフォルト設定の使用または検査。
【００６６】 好ましい実施形態では、配列同一性または類似性を決定するために使用される
配列は、表および図において示される配列、好ましくは、表４において示される
配列、より好ましくは、表５に示される配列、さらにより好ましくは、図２、３
、７、１１、１２、１７、２１、２３およびそのフラグメントの配列、から選択
される。１つの好ましい実施形態では、本明細書中で利用される配列は、表およ
び図で示される配列である。別の実施形態では、この配列は、表および図で示さ
れる配列の天然に存在する対立遺伝子の変形である。別の実施形態では、この配
列は、本明細書中にさらに説明されるような配列の変形である。
【００６７】 有用なアルゴリズムの１つの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、進
行性の対を成す整列を使用して、関連した配列の群より多数の配列整列を作製す
る。ＰＩＬＥＵＰはまた、この整列を作製するために使用されるクラスター化関
係を示す樹形図をプロットし得る。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔ
ｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７）の進行性整列
方法の単純化した方法を使用する；この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ
ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）によって記載される方法に類似
している。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターとしては、３．００のデフォルト間
隔重み、０．１０のデフォルト間隔長重み、および重み付けされた末端間隔が挙
げられる。
【００６８】 有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．２１５，４０３−４１０（１９９０）およびＫａｒｌｉｎら、ＰＮＡＳ ＵＳ
Ａ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズ
ムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）か
ら得られるＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ
．ｗｕｓｔｌ。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメーターを使用し、
その大部分は、デフォルト値に対して設定される。この調整可能なパラメーター
は、以下の値を使用して設定される：重複範囲＝１、重複部分＝０．１２５、単
語許容限界（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ ＳおよびＨＳＰ Ｓ２パラメーターは、動的
値であり、そして、特定の配列の組成および目的の配列が検索される特定のデー
タベースの組成に依存して、プログラム自身によって確立される；しかし、この
値は、感度を増加するために調整され得る。アミノ酸配列同一性値の％は、マッ
チングした同一の残基の数を、整列された領域における「より長い」配列の残基
の総数によって割ることによって決定される。「より長い」配列は、整列領域に
おいて最も多くの実際の残基を有する配列である（整列スコアを最大化するため
に、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって導入された間隙は無視される）。
【００６９】 従って、「パーセント（％）核酸配列同一性」は、図の核酸のヌクレオチド残
基と同一である候補配列におけるヌクレオチド残基の割合として、定義される。
好ましい方法は、重複範囲および重複部分をそれぞれ１および０．１２５に設定
して、デフォルトパラメーターに対して設定されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬ
ＡＳＴＮモジュールを利用する。
【００７０】 この整列は、整列される配列における間隙の導入を含み得る。さらに、図の核
酸の整列よりもより多いまたはより少ないヌクレオチドのどちらかを含む配列に
ついて、相同性の割合は、ヌクレオシドの総数に関する相同なヌクレオシドの数
に基づいて決定されることが理解される。従って、例えば、本明細書中で同定さ
れそして以下で考察される配列の整列より短い配列の相同性は、より短い配列の
ヌクレオシドの数を用いて、決定される。
【００７１】 １つの実施形態では、核酸相同性は、ハイブリダイゼーション研究を介して決
定される。従って、例えば、図に同定される核酸またはその相補体にハイストリ
ンジェンシー下で、ハイブリダイズする核酸は、新脈管形成配列として考えられ
る。ハイストリンジェンシー条件は、当該分野で公知である；例えば、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９、およびＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、を参照のこ
と、これらの両方が本明細書中に参考として援用される。ストリンジェント条件
は、配列依存であり、そして、異なった状況で異なる。より長い配列は、より高
い温度で、特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対す
る広範な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄ
ｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，「Ｏｖ
ｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａ
ｓｓａｙｓ」（１９９３）において見出される。一般的に、ストリンジェント条
件は、規定のイオン強度ｐＨにおいて、特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よ
りも約５〜１０℃低く選択される。このＴｍは、平衡状態で、標的に対して相補
的なプローブの５０％が標的配列にハイブリダイズする温度（規定のイオン強度
、ｐＨおよび核酸濃度下で）である（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍにお
いて、プローブの５０％が、平衡状態において有される）。ストリンジェント条
件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン濃度未満、
代表的には、約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であ
り、そして、温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）につい
て少なくとも約３０℃、そして、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより
大きい）について少なくとも６０℃である条件である。ストリンジェント条件は
また、ホルムアミドのような不安定化剤の添加で達成され得る。
【００７２】 別の実施形態では、よりストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件
が使用される；例えば、中間または低いストリンジェンシー条件が、当該分野で
公知のように、使用され得る；ＭａｎｉａｔｉｓおよびＡｕｓｕｂｅｌ、前出、
およびＴｉｊｓｓｅｎ、前出、を参照のこと。
【００７３】 さらに、本発明の新脈管形成核酸配列は、より大きい遺伝子のフラグメントで
ある（すなわち、これらは、核酸セグメントである）。この文脈における「遺伝
子」は、コード領域、非コード領域、ならびにコード領域および非コード領域の
混合物を含む。従って、本明細書中で提供される配列を用いて、当業者によって
理解されるように、より長い配列または全長配列のどちらかをクローニングする
ための当該分野で周知の方法を用いて、新脈管形成遺伝子のさらなる配列が獲得
され得る；ＭａｎｉａｔｉｓらおよびＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと、こ
れは、本明細書中に参考文献として援用される。
【００７４】 一旦、新脈管形成核酸が同定されると、これはクローニングされ、必要であれ
ば、この構成成分部分は組換えられ、全体の新脈管形成核酸を形成し得る。一旦
、その天然供給源（例えば、プラスミドまたは他のベクターに含まれるかまたは
直鎖状核酸セグメントとしてそれらから切断される）から単離されると、この組
換え新脈管形成核酸は、他の新脈管形成核酸（例えば、さらなるコード領域）を
同定および単離するためのプローブとしてさらに使用され得る。これはまた、改
変されたまたは改変体新脈管形成核酸およびタンパク質を作製するために、「前
駆体」核酸として使用され得る。
【００７５】 本発明の新脈管形成核酸は、いくつかの方法において使用される。第１の実施
形態では、新脈管形成核酸に対する核酸プローブが、以下に要約されるように、
スクリーニングおよび診断方法において使用されるために、または投与のために
（例えば、遺伝子治療および／またはアンチセンス適用のために）作製されて、
そしてバイオチップに付着される。あるいは、新脈管形成タンパク質のコード領
域を含む新脈管形成核酸は、再びスクリーニング目的のためにかまたは患者に対
して投与するためのどちらかのために、新脈管形成タンパク質の発現のための発
現ベクターに組み込まれ得る。
【００７６】 好ましい実施形態では、新脈管形成核酸に対する核酸プローブ（図に概説され
た核酸配列および／またはその相補体の両方）が作製される。バイオチップに付
着された核酸プローブを、新脈管形成核酸（すなわち、標的配列（サンプルの標
的配列か、または例えば、サンドウィッチアッセイにおける他のプローブ配列に
対するものかのいずれか））に対して、実質的に相補的であるように設計する。
その結果、標的配列と本発明のプローブとのハイブリダイゼーションが生じる。
以下に概説するように、この相補性は、完全である必要はない；標的配列と本発
明の一本鎖核酸との間でのハイブリダイゼーションを阻害する、かなり多数の塩
基対ミスマッチが存在し得る。しかし、変異の数が、最も低いストリンジェント
のハイブリダイゼーション条件においてさえハイブリダイゼーションが全く生じ
得ないほど多い場合に、この配列は、相補的標的配列ではない。従って、「実質
的に相補的」とは、本明細書中では、プローブが、本明細書中に概説されるよう
な、通常の反応条件、特に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするに
十分に標的配列に対して相補的であることを意味する。
【００７７】 核酸プローブは、一般的に一本鎖であるが、部分的に一本鎖および部分的に二
本鎖になり得る。プローブの鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）は、標的配列の
構造、組成、および特性によって指示される。一般的に、核酸プローブは、約８
〜約１００塩基長の範囲であり、約１０〜約８０塩基が好ましく、そして約３０
〜約５０塩基が特に好ましい。すなわち、一般的には、遺伝子全体は使用されな
い。いくつかの実施形態では、より長い核酸（数百塩基まで）が使用され得る。
【００７８】 好ましい実施形態では、１配列あたり１つより多いプローブが使用され、重複
するプローブまたは標的の異なる区画に対するプローブのいずれかが用いられる
。すなわち、２個、３個、４個、またはそれより多いプローブ（３個が好ましい
）が使用されて、特定の標的についての重複性に組み込まれる。プローブは、重
複しても（すなわち、共通のいくつかの配列を有する）、別々でもよい。
【００７９】 当業者に理解されるように、核酸は、広範な種々の方法で、固体支持体に付着
または固定され得る。本明細書中では、「固定される」および文法上等価な語に
よって、核酸プローブと固体支持体との間の関係または結合が、以下に概説され
るような結合条件、洗浄条件、分析条件、および除去条件下で安定であるに十分
であることを意味する。結合は、共有結合的または非共有結合的であり得る。本
明細書中では、「非共有結合」および文法上等価な語によって、静電気的相互作
用、親水性相互作用、および疎水性相互作用のいずれか１つ以上を意味する。非
共有結合に含まれるのは、支持体へのストレプトアビジンのような分子の共有結
合的付着、およびストレプトアビジンへのビオチン化プローブの非共有結合であ
る。本明細書中では、「共有結合」および文法上等価な語によって、２つの部分
（固体支持体およびプローブ）が、σ結合、π結合、および配位結合を含む少な
くとも１つの結合によって結合されることを意味する。共有結合は、プローブと
固体支持体との間で直接的に形成され得るか、あるいは架橋によって形成され得
るか、あるいは固体支持体もしくはプローブまたはその両方の分子のいずれかに
おける特定の反応基を含ませることによって形成され得る。固定はまた、共有結
合的相互作用および非共有結合的相互作用の組み合わせを包含し得る。
【００８０】 一般的に、当業者によって理解されるように、プローブは広範な種々の方法で
バイオチップに付着される。本明細書中に記載したように、核酸は、最初に合成
されて、引き続きバイオチップに付着され得るか、またはバイオチップ上で直接
的に合成され得るかのいずれかである。
【００８１】 バイオチップは、適切な固体基板を含む。本明細書中では、「基板」もしくは
「固体支持体」または他の文法上等価な語によって、核酸プローブの付着もしく
は結合に適切な別個の部位を含むように改変され得る任意の物質、および少なく
とも１つの検出方法に対して許容性である任意の物質を意味する。当業者に理解
されるように、可能な基板の数は非常に多く、そしてこれには、ガラス、改変も
しくは官能化されたガラス、プラスチック（スチレンおよび他の物質のアクリリ
ックス、ポリスチレン、およびコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポ
リブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）Ｊなどを含む）、ポリサッカ
リド、ナイロン、またはニトロセルロース、樹脂、シリカ、もしくはシリカに基
づく物質（シリコーンおよび改変されたシリコーンを含む）、カーボン、金属、
無機ガラス、プラスチックなどが挙げられるが、これらに限定されない。一般的
に、基板は、光学的検出を可能にし、そしてさほど蛍光性ではない。好ましい基
板は、１９９９年３月１５日付けで出願され、Ｒｅｕｓａｂｌｅ Ｌｏｗ Ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｂｉｏｃｈｉｐと表題付けられた同時係
属中の出願である米国特許出願番号０９／２７０，２１４（その全体において、
本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【００８２】 一般的に、基板は平面であるが、当業者によって理解されるように、他の外形
の基板も同様に使用され得る。例えば、プローブは、貫流サンプル分析のために
、管の内側表面に配置されて、サンプル容量を最少化し得る。同様に、基板は可
撓性、例えば、可撓性フォーム（特定のプラスチック製の独立気泡フォームを含
む）であり得る。
【００８３】 好ましい実施形態では、バイオチップの表面およびプローブは、この２つの引
き続く付着のために、化学的官能基で誘導体化され得る。従って、例えば、バイ
オチップは、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基、およびチオール基（アミノ基
が特に好ましい）が含むが、これらに限定されない化学的官能基で誘導体化され
る。これらの官能基を使用し、プローブ上の官能基を使用して、このプローブを
付着させ得る。例えば、アミノ基を含む核酸は、例えば、当該分野において公知
のリンカー（例えば、周知のようなホモまたはヘテロの二官能性リンカー（１９
９４ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙカタログ，ｃｒｏｓｓ
−ｌｉｎｋｅｒｓのｔｅｃｈｎｉｃａｌ節，１５５−２００頁（本明細書中で参
考として援用される）を参照のこと））を使用して、アミノ基を含む表面に付着
され得る。さらに、いくつかの場合には、さらなるリンカー（例えば、アルキル
基（置換およびヘテロアルキル基を含む））を使用し得る。
【００８４】 この実施形態では、オリゴヌクレオチドを、当該分野において公知のように合
成し、次いで、固体支持体の表面に付着させる。当業者に理解されるように、５
’末端もしくは３’末端のいずれかが固体支持体に付着されても、または付着が
、内部ヌクレオシドを介してでも良い。
【００８５】 さらなる実施形態では、固体支持体への固定は、非共有結合性であるが、非常
に強力であり得る。例えば、ビオチン化オリゴヌクレオチドが作製され得、これ
は、ストレプトアビジンで共有結合的にコーティングされた表面に結合して付着
を生じる。
【００８６】 あるいは、オリゴヌクレオチドを、当該分野において公知のように、表面上で
合成し得る。例えば、光重合化合物および技術を利用する光活性化技術を使用す
る。好ましい実施形態では、核酸を、以下に記載のような周知の写真平版技術を
使用して、インサイチュで合成し得る：ＷＯ９５／２５１１６；ＷＯ９５／３５
５０５；米国特許第５，７００，６３７号および同第５，４４５，９３４号；な
らびにこの中で引用された参考文献（このすべては、明らかに参考として援用さ
れる）；これらの付着方法は、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐTM技術
の基礎をなす。
【００８７】 好ましい実施形態では、新脈管形成タンパク質をコードする新脈管形成核酸を
使用して、新脈管形成タンパク質を発現するための種々の発現ベクターを作製し
、この発現ベクターが、次いで、以下に記載のようなスクリーニングアッセイに
おいて使用され得る。発現ベクターは、自律複製する染色体外ベクター、または
宿主ゲノム中に組み込むベクターのいずれであってもよい。一般的に、これらの
発現ベクターは、新脈管形成タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結され
た、転写調節核酸および翻訳調節核酸を含む。用語「制御配列」は、特定の宿主
生物体において、作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を
いう。原核生物に適切な制御配列としては、例えば、プロモーター、必要に応じ
てオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核生物細胞は
、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用すること
が公知である。
【００８８】 核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に核酸が配置された場合に、「作動可能
に連結される」。例えば、プレシークエンス（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）または
分泌リーダーについてのＤＮＡは、そのＤＮＡが、ポリペプチドの分泌に関与す
るプレタンパク質として発現される場合に、そのポリペプチドについてのＤＮＡ
に作動可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、そのプロモ
ーターまたはエンハンサーが、コード配列の転写に影響する場合に、そのコード
配列に作動可能に連結されており；または、リボソーム結合部位は、リボソーム
結合部位が翻訳を容易にするように位置づけられている場合に、コード配列に作
動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結される（た）」は、連結
されているＤＮＡ配列が連続性であり、そして分泌リーダーの場合には、連続性
でかつ読み取り相（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にある。しかし、エンハンサ
ーは、連続性である必要はない。連結は、都合の良い制限部位で連結することに
よって達成される。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオ
チドアダプターまたはリンカーを、従来の慣行に従って使用する。転写調節核酸
および翻訳調節核酸は、一般的に、新脈管形成タンパク質を発現するために使用
される宿主細胞に対して適切である；例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ由来の転写調節
核酸配列および翻訳調節核酸配列が、好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓにおいて新
脈管形成タンパク質を発現させるために使用される。多数の型の適切な発現ベク
ターおよび適切な調節配列が、種々の宿主細胞について当該分野において公知で
ある。
【００８９】 一般的に、転写調節配列および翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リ
ボソーム結合部位、転写開始配列および転写終止配列、翻訳開始配列および翻訳
終止配列、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列が挙げられ得る
が、これらに限定されない。好ましい実施形態では、調節配列は、プロモーター
ならびに転写開始配列および転写終止配列を含む。
【００９０】 プロモーター配列は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれ
かをコードする。プロモーターは、天然に存在するプロモーターまたはハイブリ
ッドプロモーターのいずれであっても良い。ハイブリッドプロモーター（これは
、１より多くのプロモーターのエレメントを組み合わせる）もまた当該分野にお
いて公知であり、そして本発明において有用である。
【００９１】 さらに、発現ベクターは、さらなるエレメントを含み得る。例えば、発現ベク
ターは、２つの複製系を有し得、これによって、２つの生物体中（例えば、発現
のための哺乳動物細胞または昆虫細胞中、ならびにクローニングおよび増幅のた
めの原核生物宿主中）において維持されることを可能にする。さらに、組み込み
型発現ベクターについて、この発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに対して相同な
少なくとも１つの配列、そして好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同な
配列を含む。組み込み型ベクターは、ベクターに含ませるために適切な相同性配
列を選択することによって、宿主細胞中の特定の遺伝子座に指向され得る。組み
込み型ベクターについての構築は、当該分野において周知である。
【００９２】 さらに、好ましい実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の
選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当該分野にお
いて周知であり、そして使用される宿主細胞に応じて変動する。
【００９３】 本発明の新脈管形成タンパク質は、新脈管形成タンパク質の発現を誘導するか
または引き起こすために適切な条件下で、新脈管形成タンパク質をコードする核
酸を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって生成さ
れる。新脈管形成タンパク質の発現に適切な条件は、発現ベクターおよび宿主細
胞の選択に応じて変動し、そして慣用的実験を通して、当業者に容易に確認され
る。例えば、発現ベクターにおいて構成性プロモーターを使用することは、宿主
細胞の成長および増殖を最適化することを必要とするが、誘導性プロモーターの
使用は、誘導のために適切な成長条件を必要とする。さらに、いくつかの実施形
態では、収集のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞発現において使用さ
れるバキュロウイルス系は、溶解性ウイルスである。従って、収集時期の選択は
、生成物収率に重要であり得る。
【００９４】 適切な宿主細胞としては、酵母細胞、細菌細胞、古細菌細胞、真菌細胞、なら
びに昆虫細胞および動物細胞（哺乳動物細胞を含む）が挙げられる。特に興味深
いのは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ細胞、Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび他の酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｆ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Ｎｅ
ｕｒｏｓｐｏｒａ、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ細胞、ＨＵＶＥＣ（ヒト
臍静脈内皮細胞）、ＴＨＰ１細胞（マクロファージ細胞株）ならびにヒト細胞お
よび株である。
【００９５】 好ましい実施形態では、新脈管形成タンパク質を、哺乳動物細胞において発現
させる。哺乳動物発現系もまた当該分野において公知であり、そしてレトロウイ
ルス系を含む。好ましい発現ベクター系は、以下に一般的に記載されるようなレ
トロウイルスベクター系である：ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９およびＰＣＴ／
ＵＳ９７／０１０４８（この両方は、明らかに、本明細書中で参考として援用さ
れる）。哺乳動物プロモーターとして特に有用なのは、哺乳動物ウイルス遺伝子
由来のプロモーターである。なぜなら、ウイルス遺伝子はしばしば高度に発現さ
れ、そして広範な宿主範囲を有するからである。例としては、ＳＶ４０初期プロ
モーター、マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期
プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、およびＣＭＶプロモーター
が挙げられる。代表的に、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列および
ポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンに対して３’側に位置づけられ、従って
、プロモーターエレメントと共にコード配列に隣接する、調節領域である。転写
ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０由来の転
写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルが挙げられる。
【００９６】 哺乳動物宿主ならびに他の宿主に外因性核酸を導入する方法は、当該分野にお
いて周知であり、そして使用される宿主細胞に応じて変動する。この技術として
は、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブ
レン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーショ
ン、ウイルス感染、リポソーム中へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核
へのＤＮＡの直接的微量注入が挙げられる。
【００９７】 好ましい実施形態では、新脈管形成タンパク質を、細菌系において発現させる
。細菌発現系は、当該分野において周知である。バクテリオファージ由来のプロ
モーターもまた使用され得、そして当該分野において公知である。さらに、合成
プロモーターおよびハイブリッドプロモーターもまた有用である；例えば、ｔａ
ｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列およびｌａｃプロモーター配列のハ
イブリッドである。さらに、細菌プロモーターとしては、細菌のＲＮＡポリメラ
ーゼに結合する能力を有し、かつ転写を開始する能力を有する、非細菌起源の天
然に存在するプロモーターが挙げられ得る。機能するプロモーター配列に加えて
、有効なリボソーム結合部位が所望され得る。発現ベクターはまた、細菌におい
て新脈管形成タンパク質の分泌を与えるシグナルペプチド配列を含み得る。この
タンパク質は、増殖培地中に分泌される（グラム陽性細菌）か、または、細胞の
内膜と外膜との間に位置づけられるペリプラズム間隙中に分泌される（グラム陰
性細菌）かのいずれかである。細菌発現ベクターはまた、形質転換された細菌株
の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含み得る。適切な選択遺伝子と
しては、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシ
ン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンのような、細菌を薬物に対して耐性に
させる遺伝子が挙げられる。選択可能マーカーはまた、生合成遺伝子（例えば、
ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンの生合成経路における遺伝子）を
含み得る。これらの成分は、発現ベクターにアセンブルされる。細菌についての
発現ベクターは当該分野において周知であり、そしてこれには特に、Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒ
ｅｍｏｒｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓについて
のベクターが含まれる。細菌発現ベクターは、当該分野において周知の技術（例
えば、塩化カルシウム処理、エレクトロポレーションなど）を使用して細菌宿主
細胞中に形質転換される。
【００９８】 １つの実施形態では、新脈管形成タンパク質を、昆虫細胞において生成させる
。昆虫細胞の形質転換のための発現ベクター、そして特に、バキュロウイルスに
基づく発現ベクターは、当該分野において周知である。
【００９９】 好ましい実施形態では、新脈管形成タンパク質を、酵母細胞において生成させ
る。酵母発現系は当該分野において周知であり、そしてこれには、Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓお
よびＣ．ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕ
ｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉ
ａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏ
ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、ならびにＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａについての発現ベクターが含まれる。
【０１００】 新脈管形成タンパク質はまた、当該分野において周知の技術を使用して、融合
タンパク質として作製され得る。従って、例えば、モノクローナル抗体の作製に
ついて、所望されるエピトープが小さい場合には、新脈管形成タンパク質をキャ
リアタンパク質に融合して、免疫原を形成し得る。あるいは、発現を増加ささせ
るため、または他の理由のために、新脈管形成タンパク質を融合タンパク質とし
て作製し得る。例えば、新脈管形成タンパク質が新脈管形成ペプチドである場合
、このペプチドをコードする核酸を、発現の目的のために、他の核酸に連結し得
る。
【０１０１】 １つの実施形態では、本発明の新脈管形成核酸、タンパク質、および抗体を標
識する。本明細書中では、「標識される（た）」によって、化合物が、その化合
物の検出を可能にするために付着された少なくとも１つのエレメント、アイソト
ープ、または化合物を有することを意味する。一般的に、標識は以下の３つのク
ラスに分類される：ａ）アイソトープ標識（これは、放射性アイソトープまたは
重元素であり得る）；ｂ）免疫標識（これは、抗体または抗原であり得る）；お
よびｃ）着色色素または蛍光色素。標識は、新脈管形成核酸、タンパク質、およ
び抗体中の任意の部位に取り込まれ得る。例えば、標識は、検出可能なシグナル
を、直接的または間接的のいずれかで、生成し得るべきである。検出可能部分は
、ラジオアイソトープ（例えば、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、または125Ｉ）、蛍光
化合物もしくは化学発光化合物（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、
ローダミン、またはルシフェリン）、または酵素（例えば、アルカリホスファタ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼ）であり得る
。標識に抗体を結合体化させるための、当該分野において公知の任意の方法が使
用され得、これには、以下に記載の方法が含まれる：Ｈｕｎｔｅｒら，Ｎａｔｕ
ｒｅ，１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，１３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．
，４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．
ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７（１９８２）。
【０１０２】 従って、本発明はまた、新脈管形成タンパク質配列を提供する。本発明の新脈
管形成タンパク質は、いくつかの方法で同定され得る。この意味の「タンパク質
」は、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドが含まれる。当業者に理解さ
れるように、本発明の核酸配列を使用して、タンパク質配列を生成し得る。これ
を実施するための種々の方法が存在し、これには、遺伝子全体をクローニングす
ること、ならびにそのフレームおよびアミノ酸配列を確認すること、または新脈
管形成タンパク質が、使用されるデータベース中のいくつかのタンパク質に対し
て相同性を有すると仮定して、相同性について検索するために既知の配列に対し
てそれを比較し、フレームを提供することを包含する。一般的に、核酸配列を、
相同性について３つすべてのフレームで検索するプログラムに入力する。これは
、好ましい実施形態では、以下のＮＣＢＩ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＢＬＡＳＴパラ
メーターを使用して実施される。このプログラムは、ｂｌａｓｔｘまたはｂｌａ
ｓｔｎである。このデータベースはｎｒである。入力データは、「Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ ｉｎ ＦＡＳＴＡ ｆｏｒｍａｔ」としてである。生物体リストは、「ｎ
ｏｎｅ」である。「ｅｘｐｅｃｔ」は１０であり；フィルターはデフォルトであ
る。「ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ」は５００であり、「ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ」
は５００であり、そして「ａｌｉｇｎｍｎｅｎｔ ｖｉｅｗ」は対様式（ｐａｉ
ｒｗｉｓｅ）である。「Ｑｕｅｒｙ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅｓ」は、標準（
１）である。マトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２であり；ｇａｐ ｅｘｉｓｔｅｎ
ｃｅ ｃｏｓｔは１１であり、ｐｅｒ ｒｅｓｉｄｕｅ ｇａｐ ｃｏｓｔは１
であり；そしてｌａｍｂｄａ ｒａｔｉｏは０．８５デフォルトである。これは
、推定タンパク質配列の生成を生じる。
【０１０３】 また新脈管形成タンパク質の１つの実施形態に含まれるのは、本明細書中にお
いて決定されたような、天然に存在する配列のアミノ酸改変体である。好ましく
は、改変体は、野生型配列に対して、好ましくは、約７５％よりも高い相同性、
より好ましくは、約８０％よりも高い相同性、さらにより好ましくは、約８５％
よりも高い相同性、そして最も好ましくは、９０％よりも高い相同性である。い
くつかの実施形態では、相同性は約９３〜９５％または９８％と同じ程度に高い
。核酸に関して、この文脈での相同性は、配列類似性または配列同一性を意味す
る（同一性が好ましい）。この相同性は、核酸相同性について上記に概説したよ
うな当該分野において公知の標準的技術を使用して決定される。
【０１０４】 本発明の新脈管形成タンパク質は、野生型のアミノ酸配列より短くても、長く
ても良い。従って、好ましい実施形態では、新脈管形成タンパク質の定義に含ま
れるのは、本明細書中での野生型配列の部分またはフラグメントである。さらに
、上記に概説したように、本発明の新脈管形成核酸は、、当該分野において公知
の技術を使用して、さらなるコード領域を（従って、さらなるタンパク質配列）
得るために使用され得る。
【０１０５】 好ましい実施形態では、新脈管形成タンパク質は、野生型配列と比較した場合
の誘導体または改変体の新脈管形成タンパク質である。すなわち、以下でより完
全に概説するように、誘導体新脈管形成ペプチドの誘導体は、少なくとも１つの
アミノ酸の置換、欠失、または挿入（アミノ酸置換が特に好ましい）を含む。ア
ミノ酸の置換、挿入、または欠失は、新脈管形成ペプチド中の任意の残基で生じ
得る。
【０１０６】 また本発明の新脈管形成タンパク質の１つの実施形態に含まれるのは、アミノ
酸配列改変体である。これらの改変体は、以下の３つのクラスの１つ以上に分類
される：置換改変体、挿入改変体、または欠失改変体。これらの改変体は、通常
、新脈管形成タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的
変異誘発によって調製され、これは、改変体をコードするＤＮＡを生成するため
にカセットもしくはＰＣＲ変異誘発、または当該分野において周知の他の技術を
使用し、その後、上記に概説されたような組換え細胞培養物中で、このＤＮＡを
発現させる。しかし、約１００〜１５０個までの残基を有する改変体新脈管形成
タンパク質フラグメントは、確立された技術を使用して、インビトロ合成によっ
て調製され得る。アミノ酸配列改変体は、改変体の予め決定された性質、新脈管
形成タンパク質アミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体または種間改変
体からその改変体を分離する特徴によって、特徴付けられる。改変体は、代表的
に、天然に存在するアナログと同じ質的な生物学的活性を示すが、以下でより完
全に概説されるような改変された特徴を有する改変体がまた選択され得る。
【０１０７】 アミノ酸配列改変体を導入する部位または領域が予め決定されるが、変異自体
は、予め決定される必要はない。例えば、所定の部位での変異の実施を最適化す
るために、無作為な変異誘発を標的のコドンまたは領域で実施し得、そして発現
された新脈管形成改変体を、所望される活性の最適な組み合わせについてスクリ
ーニングし得る。既知の配列を有するＤＮＡ中の予め決定された部位で置換変異
体を作製する技術は周知である（例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣ
Ｒ変異誘発）。変異体のスクリーニングを、新脈管形成タンパク質活性のアッセ
イを使用して実施する。
【０１０８】 アミノ酸置換は、代表的に、単一残基の置換であり；挿入は、通常、約１〜２
０アミノ酸のオーダーであるが、かなりより長い挿入が耐性であり得る。欠失は
、約１〜約２０残基の範囲であるが、いくつかの場合では、欠失はより長くても
良い。
【０１０９】 置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組み合わせが、最終的な誘導体に到
達するために使用され得る。一般的には、これらの変化は、分子の変更を最少化
するために、少数のアミノ酸で実施される。しかし、特定の環境下では、より大
きな変化が耐性であり得る。新脈管形成タンパク質の特徴において小さな変更が
所望される場合、置換は以下の図表に従ってなされる： 図表１ 元々の残基 置換例 Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ，Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｓｎ，Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｅｕ，Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｉｌｅ，Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｒｇ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｌｅｕ，Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｍｅｔ，Ｌｅｕ，Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｒｐ，Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ，Ｌｅｕ。
【０１１０】 機能または免疫学的同定における実質的な変化は、図表１に示される置換より
も保存性の低い置換を選択することによってなされる。例えば、より顕著に影響
する置換がなされ得る：変更の領域におけるポリペプチド骨格構造、例えば、α
へリックス構造またはβシート構造；標的部位での分子の電荷もしくは疎水性；
または側鎖の嵩（ｂｕｌｋ）。一般的に、ポリペプチドの特性に最大の変化を生
じさせると予期される置換は、以下におけるような置換である：（ａ）親水性残
基（例えば、セリルまたはスレオニル）を、疎水性残基（例えば、ロイシル、イ
ソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニル）に対して（または、
疎水性残基によって）置換する；（ｂ）システインもしくはプロリンを、任意の
他の残基に対して（または、任意の他の残基によって）置換する；（ｃ）電気陽
性側鎖を有する残基（例えば、リシル、アルギニル、またはヒスチジニル）を、
電気陰性残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）に対して（または、電
気陰性残基によって）置換する；または、嵩高い側鎖を有する残基（例えば、フ
ェニルアラニン）を、側鎖を有さない残基（例えば、グリシン）に対して（また
は、側鎖を有さない残基によって）置換する。
【０１１１】 改変体は、代表的に、同じ質的な生物学的活性を示し、そして天然に存在する
アナログと同じ免疫応答を誘発するが、改変体はまた、必要とされる新脈管形成
タンパク質の特徴を改変するように選択される。あるいは、改変体は、新脈管形
成タンパク質の生物学的活性が変更されるように設計され得る。例えば、グリコ
シル化部位が、改変または除去され得る。
【０１１２】 新脈管形成ポリペプチドの共有結合的改変は、本発明の範囲に含まれる。共有
結合的改変の１つの型としては、選択された側鎖または新脈管形成ポリペプチド
のＮ末端残基もしくはＣ末端残基と反応し得る有機誘導体化因子と、新脈管形成
ポリペプチドの標的アミノ酸残基を反応させることを含む。二官能性因子での誘
導体化は、例えば、以下でより完全に記載されるような、抗新脈管形成ポリペプ
チド抗体を精製する方法またはスクリーニングアッセイにおいて使用するため、
水不溶性の支持体マトリックスまたは表面に新脈管形成ポリペプチドを架橋する
ために有用である。一般的に使用される架橋剤としては、例えば、以下が挙げら
れる：１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン，グルタルアルデ
ヒド，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル，例えば、４−アジドサリチル酸
を有するエステル，ホモ二官能性イミドエステル（ジスクシンイミジルエステル
（例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）を含む）
，二官能性マレイミド（例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）お
よび、メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのよ
うな薬剤。
【０１１３】 他の改変としては、以下が挙げられる：それぞれ、グルタミニルおよびアスパ
ラギニル残基の対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基に対する脱アミ
ド化、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル、スレオニル、またはチ
ロシル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジ
ン側鎖のαアミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ
，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，７９−８６
頁（１９８３）］、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキ
シル基のアミド化。
【０１１４】 本発明の範囲に含まれる新脈管形成ポリペプチドの共有結合的改変の別の型は
、このポリペプチドのネイティブなグリコシル化パターンの変更を含む。「ネイ
ティブなグリコシル化パターンの変更」は、本明細書中の目的では、ネイティブ
な配列の新脈管形成ポリペプチドにおいて見出される１以上の炭水化物部分を欠
失させること、および／または、ネイティブな配列の新脈管形成ポリペプチドに
おいて存在しない１以上のグリコシル化部位を付加すること、を意味することを
意図する。
【０１１５】 新脈管形成ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、そのアミノ酸配列を
変更することによって達成され得る。変更は、例えば、ネイティブな配列の新脈
管形成ポリペプチドに（Ｏ結合型グリコシル化部位に対して）、１以上のセリン
もしくはスレオニン残基を付加すること、または、１以上のセリンもしくはスレ
オニン残基で置換することによって作製され得る。新脈管形成アミノ酸配列は、
必要に応じて、ＤＮＡレベルでの変更を通して、特に、予め選択された塩基で新
脈管形成ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させ、その結果、コドンを、所
望されるアミノ酸に翻訳されるように生成させることによって、変更され得る。
【０１１６】 新脈管形成ポリペプチドにおける炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、
ポリペプチドにグリコシドを化学的または酵素的にカップリングさせることによ
る。このような方法は、当該分野において記載されている：例えば、ＷＯ８７／
０５３３０（１９８７年９月１１日公開），ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓ
ｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５９−３０６頁（１
９８１）。
【０１１７】 新脈管形成ポリペプチドに存在する炭水化物部分の除去は、化学的もしくは酵
素的に、またはグリコシル化の標的として供されるアミノ酸残基をコードするコ
ドンを変異置換することによって、達成され得る。化学的な脱グリコシル化技術
は、当該分野において公知であり、そして例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら，Ａ
ｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２（１９８７）および
Ｅｄｇｅら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）に記載
される。ポリペプチドにおける炭水化物部分の酵素的除去は、Ｔｈｏｔａｋｕｒ
ａら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０（１９８７）に記載される
ように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを使用するこ
とによって達成され得る。
【０１１８】 新脈管形成の共有結合的改変の別の型は、以下に示される様式で、種々の非タ
ンパク質のポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコ
ール、またはポリオキシアルキレン）のうちの１つに対して新脈管形成ポリペプ
チドを連結することを包含する：米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４
９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第
４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号。
【０１１９】 本発明の新脈管形成ポリペプチドはまた、別の異種のポリペプチドまたはアミ
ノ酸配列に融合された新脈管形成ポリペプチドを含むキメラ分子を形成する様式
で改変され得る。１つの実施形態では、このようなキメラ分子は、エピトープ（
これに、抗タグ抗体が選択的に結合し得る）を提供するタグポリペプチドとの新
脈管形成ポリペプチドの融合物を含む。エピトープタグは、一般的に、新脈管形
成ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。このような
新脈管形成ポリペプチドのエピトープタグ化形態の存在は、タグポリペプチドに
対する抗体を使用して検出され得る。また、エピトープタグを提供することによ
って、新脈管形成ポリペプチドが、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合する
別の型のアフィニティーマトリックスを使用するアフィニティー精製によって、
容易に精製されることを可能にする。代替的な実施形態では、キメラ分子は、免
疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との新脈管形成ポリペプチドの
融合物を含み得る。キメラ分子の二価形態について、このような融合物は、Ｉｇ
Ｇ分子のＦｃ領域に対してであり得る。
【０１２０】 種々のタグポリペプチドおよびその個々の抗体が、当該分野において周知であ
る。例としては、以下が挙げられる：ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）ま
たはポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ
ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２Ｃ５［Ｆｉｅｌｄら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９−２１６５（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグおよ
びそれに対する８Ｆ９，３Ｃ７，６Ｅ１０，Ｇ４，Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Ｅ
ｖａｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
５：３６１０−３６１６（１９８５）］；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タン
パク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７−５５３（１９９０）］。他のタグ
ポリペプチドとしては、Ｆｌａｇ−ペプチド［Ｈｏｐｐら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ，６：１２０４−１２１０（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド
［Ｍａｒｔｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４（１９９２）］；
チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．，２６６：１５１６３−１５１６６（１９９１）］；ならびに、Ｔ７遺伝子１
０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６**３９７（１９９０）
］。
【０１２１】 新脈管形成タンパク質の実施形態には、新脈管形成ファミリーの他の新脈管形
成タンパク質、および他の生物由来の新脈管形成タンパク質もまた含まれ、これ
らは以下に概説されるようにクローニングされそして発現される。従って、プロ
ーブまたは縮重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列を使用して、ヒ
トまたは他の生物由来の他の関連する新脈管形成タンパク質を見出し得る。当業
者によって理解されるように、特に有用なプローブおよび／またはＰＣＲプライ
マー配列は、新脈管形成核酸配列の固有の領域を含む。当該分野で一般に公知の
ように、好ましいＰＣＲプライマーは、約１５〜約３５ヌクレオチド長であり、
約２０〜約３０が好ましく、そして必要とされる場合、イノシンを含み得る。Ｐ
ＣＲ反応のための条件は、当該分野で周知である。
【０１２２】 さらに、本明細書中で概説されるように、例えば、さらなる配列の解明、エピ
トープまたは精製タグの付加、他の融合配列の付加などによって、図面の核酸に
よってコードされるタンパク質より長い新脈管形成タンパク質が作製され得る。
【０１２３】 新脈管形成タンパク質はまた、新脈管形成核酸によってコードされるように同
定され得る。従って、新脈管形成タンパク質は、本明細書中に概説されるように
、配列表の配列、またはそれらの相補体にハイブリダイズする核酸によってコー
ドされる。
【０１２４】 好ましい実施形態において、新脈管形成タンパク質が、例えば、免疫療法のた
めの抗体を生成するために使用される場合、新脈管形成タンパク質は、少なくと
も１つのエピトープまたは決定基を、全長タンパク質と共有すべきである。本明
細書中で「エピトープ」または「決定基」は、ＭＨＣの文脈で、抗体またはＴ細
胞レセプターを生成および／または結合するタンパク質の一部分を意味する。従
って、ほとんどの場合において、より小さい新脈管形成タンパク質に対して作製
される抗体は、全長タンパク質に結合し得る。好ましい実施形態において、エピ
トープは固有である；すなわち、固有のエピトープに対して生成された抗体は、
交差反応性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）をほとんど示さないか、また
は示さない。好ましい実施形態において、エピトープがＡＡＡ４ｐ１およびＡＡ
Ａ４ｐ２から選択される。別の好ましい実施形態において、エピトープは、ＡＡ
Ａ１ｐ１およびＡＡＡ１ｐ２から選択される。別の好ましい実施形態において、
エピトープは、ＡＡＡ７ｐ１、ＡＡＡ７ｐ２、ＡＡＡ７ｐ３およびＡＡＡ７ｐ１
ｍから選択される。
【０１２５】 １つの実施形態において、用語「抗体」は、抗体フラグメントを含み、これは
当該分野で公知であり、Ｆａｂ、Ｆａｂ2、一本鎖抗体（例えば、Ｆｖ）、キメ
ラ抗体などが挙げられ、抗体全体の改変よって生成されるかまたは組換えＤＮＡ
技術を使用して最初から合成されるものかのいずれかである。
【０１２６】 ポリクローナル抗体を調製する方法は、当業者に公知である。ポリクローナル
抗体は、例えば、免疫剤および所望ならばアジュバンドの１回以上の注入によっ
て、哺乳動物において惹起され得る。代表的に、免疫剤および／またはアジュバ
ンドは、複数の皮下注入または腹腔内注入によって、哺乳動物内に注入される。
免疫剤は、図面の核酸またはそれらのフラグメントまたはそれらの融合タンパク
質によってコードされるタンパク質を含み得る。免疫剤を、免疫される哺乳動物
において免疫原性であることが公知であるタンパク質に結合体化することは有用
で有り得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、以下が挙げられるが
これらに限定されない：鍵穴カザガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイ
ログロブリン、およびダイズトリプシンインヒビター。使用され得るアジュバン
トの例としては、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバン
ド（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコレート（ｄｉｃｏｒ
ｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ））が挙げられる。免疫化プロトコルは、過度な実験を
行うことなく当業者によって選択され得る。
【０１２７】 抗体は、あるいは、モノクローナル抗体で有り得る。モノクローナル抗体は、
ハイブリドーマ方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｉｓｔｅｉｎ，Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって記載される方法）を使用して調製
され得る。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスター、または他の適切
な宿主動物が、代表的に、免疫剤を用いて免疫され、免疫剤に特異的に結合する
抗体を生成するかまたは生成し得るリンパ球を惹起し得る。あるいは、リンパ球
は、インビトロで免疫され得る。免疫剤は、代表的に、表１、表２、表３、表４
または表５の核酸、あるいはそれらのフラグメントまたはそれらの融合タンパク
質によってコードされるポリペプチドを含む。一般に、ヒト起源の細胞が所望さ
れる場合、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用されるか、または非ヒト哺乳動
物供給源が所望される場合、脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用される。次いで
、リンパ球が、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、
不死化細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）５９−１０３
頁］。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウ
シおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞
株が使用される。ハイブリドーマ細胞が適切な培養培地において培養され得、こ
の培地は、好ましくは、融合されていない不死化細胞の増殖または生存を阻害す
る１つ以上の物質を含む。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホ
リボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブ
リドーマのための培養培地は、代表的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、お
よびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠失細胞
の増殖を防ぐ。
【０１２８】 １つの実施形態において、抗体は、二特異的抗体である。二特異的抗体は、モ
ノクローナル抗体であり、好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体であり、これら
の抗体は、少なくとも２つの抗原に対する結合特異性を有する。本発明の場合に
おいて、結合特異性の１つは、図１または３〜６の核酸によってコードされるタ
ンパク質またはそれらのフラグメントに対し、他は、任意の他の抗原、および好
ましくは細胞表面タンパク質またはレセプターまたはレセプターサブユニットに
対し、好ましくは、腫瘍特異的なものである。
【０１２９】 好ましい実施形態において、新脈管形成タンパク質に対する抗体は、以下に記
載されるように、新脈管形成タンパク質の生物学的機能を減少させるかまたは排
除し得る。すなわち、抗新脈管形成タンパク質抗体（ポリクローナルまたは好ま
しくはモノクローナルのいずれか）の脈管形成組織（または新脈管形成を含む細
胞）への添加は、新脈管形成活性を減少し得るか、または排除し得る。一般に、
活性の少なくとも２５％の減少が好ましく、少なくとも約５０％が特に好ましく
、そして約９５〜１００％の減少がとりわけ好ましい。
【０１３０】 好ましい実施形態において、新脈管形成タンパク質に対する抗体は、ヒト化抗
体である。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、免疫グロブリン、免
疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’
、Ｆ（ａｂ’）2または抗体の他の抗原結合サブ配列）のキメラ分子（これらは
、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む）である。ヒト化抗体は、ヒト免
疫グロブリン（レシピエント抗体）を含み、ここで、レシピエントの相補的な決
定領域（ＣＤＲ）を形成する残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する
マウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残
基によって置換される。いくつかの場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワ
ーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシ
ピエント抗体または移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列のいずれにおい
ても見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、お
よび代表的に２つの可変ドメインの全てを、実質的に含み、ここで、ＣＤＲ領域
の全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そ
してＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配
列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領
域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、代表的に、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一
部分を含む［Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６
）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８
）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：
５９３−５９６（１９９２）］。
【０１３１】 非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。一般に、ヒト
化抗体は、非ヒトである供給源からヒト化抗体に導入された１以上のアミノ酸残
基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、移入残基をいわれ、こ
れらは、代表的に、移入可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的に、Ｗｉ
ｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法［Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５
２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３
２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：
１５３４−１５３６（１９８８）］に従って、ヒト抗体の対応する配列に対して
げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を置換することによって、実施され得る。従っ
て、このようなヒト化抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６
７号）、ここで、実質的にインタクトなヒト可変ドメインではないドメインが、
非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際に、ヒト化抗体は、
代表的に、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類
抗体における類似部位由来の残基によって置換されるヒト抗体である。
【０１３２】 ヒト抗体はまた、当該分野で公知の種々の技術（ファージディスプレイライブ
ラリー［ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，
２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２
：５８１（１９９１）］）を使用して生成され得る。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒ
ｎｅｒらの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である
［Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，７７頁（１９８５）および
Ｂｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９
１）］。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニッ
ク動物（例えば、マウス）に導入することによって作製され得、ここで、内因性
免疫グロブリン遺伝子は、部分的にまたは完全に不活性化されている。挑戦の際
に、ヒト抗体産生が観測され、これは、全ての観点においてヒトにみられるもの
に酷似し、遺伝子再構成、アセンブリ、および抗体レパートリーを含む。このア
プローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０
６号；５，５６９，８２５号；５，６２５，１２６号；５，６３３，４２５号；
５，６１１，０１６号、および以下の科学刊行物に記載される：Ｍａｒｋｓら，
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂ
ｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら
，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５−５１（１９９６
）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，
８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３ ６５−９３（１９９５）。
【０１３３】 免疫療法は、新脈管形成タンパク質に対して惹起された抗体を用いる新脈管形
成の処置を意味する。本明細書中で使用される場合、免疫療法は、受動的であり
得るか、または能動的であり得る。本明細書中で規定される受動的な免疫療法は
、抗体のレシピエント（患者）への受動的な移行である。能動的な免疫化は、レ
シピエント（患者）における抗体および／またはＴ細胞の誘導である。免疫応答
の誘導は、抗体が惹起される抗原をレシピエントに提供する結果である。当業者
に理解されるように、抗原は、抗体がレシピエントに惹起されることが所望され
るポリペプチドを注入すること、または抗原の発現のための条件下で抗原を発現
し得る核酸とレシピエントを接触させることによって提供され得る。
【０１３４】 好ましい実施形態において、新脈管形成タンパク質（このタンパク質に対して
抗体が惹起される）は、上記のような分泌タンパク質である。理論に束縛される
ことなく、処置のために使用される抗体は、分泌タンパク質に結合し、そして分
泌タンパク質がそのレセプターに結合することを妨げ、それによって、分泌新脈
管形成タンパク質を不活性する。
【０１３５】 別の好ましい実施形態において、新脈管形成タンパク質（このタンパク質に対
して抗体が惹起される）は、膜貫通タンパク質である。理論に縛られることなく
、処置に使用される抗体は、新脈管形成タンパク質の細胞外ドメインに結合し、
そしてそれが他のタンパク質（例えば、循環（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）リガン
ドまたは細胞関連分子）に結合することを妨げる。抗体は、膜貫通新脈管形成タ
ンパク質のダウンレギュレーションを引き起こし得る。当業者に理解されるよう
に、抗体は、新脈管形成タンパク質の細胞外ドメインに結合するタンパク質の競
合的インヒビターであってもよいし、非競合的インヒビターであってもよいし、
または不競合的なインヒビターであってもよい。この抗体はまた、新脈管形成タ
ンパク質のアンタゴニストである。さらに、この抗体は、膜貫通新脈管形成タン
パク質の活性化を妨げる。１つの局面において、この抗体が、他の分子の新脈管
形成タンパク質への結合を妨げる場合、この抗体は、細胞の増殖を妨げる。この
抗体はまた、細胞傷害剤（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＮＦ−γ、お
よびＩＬ−２を含むがこれらに限定されない）、または化学療法剤（５ＦＵ、ビ
ンブラスチン、アクチノマイシンＤ、シスプラチン、メトトレキサートなどを含
む）に対して、細胞を感作させる。いくつかの場合において、抗体は、膜貫通タ
ンパク質と複合体化され、それによって細胞傷害性を媒介する場合、血清相補体
を活性化するサブタイプに属する。従って、新脈管形成は、患者に、膜貫通新脈
管形成タンパク質に指向する抗体を投与することによって処置される。
【０１３６】 別の好ましい実施形態において、この抗体は、治療部分に結合体化される。１
つの局面において、治療部分は、新脈管形成タンパク質の活性を調節する小分子
である。別の局面において、治療部分は、新脈管形成タンパク質と会合するか、
またはこのタンパク質に非常に接近した分子の活性を調節する。治療部分は、酵
素活性（例えば、新脈管形成に関連したプロテアーゼ活性またはコラーゲナーゼ
活性）を阻害し得る。
【０１３７】 好ましい実施形態において、治療部分はまた、細胞障害剤であり得る。この方
法において、細胞障害剤を新脈管形成組織または細胞に標的化することは、罹患
した細胞の数の減少を生じ、それによって、新脈管形成に関連した症状を減少さ
せる。細胞傷害剤は、多数かつ種々であり、そして以下を含むが、これらに限定
されない：細胞傷害薬物または毒素またはこのような毒素の活性フラグメント。
適切な毒素およびそれらの対応するフラグメントとしては、ジフテリア（ｄｉｐ
ｔｈｅｒｉａ）Ａ鎖、細菌体外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン
（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍ
ｙｃｉｎｅ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）などが挙げられる。細胞傷害
剤はまた、新脈管形成タンパク質に対して惹起された抗体に放射性同位体を結合
することによって、または放射性核種を抗体に共有結合されているキレート化剤
に結合することによって、作製された放射性化学物質を含む。治療部分を膜貫通
新脈管形成タンパク質に標的化することは、新脈管形成を患う領域における治療
部分の局所濃度を増加させるように作用するだけでなく、治療部分に関連し得る
有害な副作用を減少するように作用する。
【０１３８】 別の好ましい実施形態において、新脈管形成タンパク質（このタンパク質に対
して抗体が惹起される）は、細胞内タンパク質である。この場合、抗体は、細胞
への侵入を容易にするタンパク質と結合体化され得る。１つの場合において、抗
体は、エンドサイトーシスによって細胞に入る。別の実施形態において、抗体を
コードする核酸が個体または細胞に投与される。さらに、新脈管形成タンパク質
は細胞内のどこにでも標的化され得（例えば、核）、そこの抗体は、その標的局
在化に対するシグナル（すなわち、核局在化シグナル）を含む。
【０１３９】 本発明の新脈管形成抗体は、新脈管形成タンパク質に特異的に結合する。本明
細書中の「特異的に結合する」とは、抗体が、少なくとも１０-4〜１０-6Ｍ-1の
範囲、好ましくは１０-7〜１０-9Ｍ-1の範囲の結合定数で、タンパク質に結合す
ることを意味する。
【０１４０】 好ましい実施形態において、新脈管形成タンパク質は、発現後精製されるかま
たは単離される。新脈管形成タンパク質は、どの他の成分がサンプル中に存在す
るかに依存して、当業者に公知の種々の方法で単離または精製され得る。標準的
な精製方法としては、電気泳動技術、分子技術、免疫学的技術およびクロマトグ
ラフィー技術（イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、なら
びにクロマトフォーカシングを含む）が挙げられる。例えば、新脈管形成タンパ
ク質は、標準的な抗新脈管形成タンパク質抗体カラムを使用して精製され得る。
タンパク質濃縮と関連する、限外濾過およびダイアフィルトレーション技術もま
た有用である。適切な精製技術の一般的なガイダンスについては、Ｓｃｏｐｅｓ
，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅ
ｒｌａｇ，ＮＹ（１９８２）を参照のこと。必要とされる精製の程度は、新脈管
形成タンパク質の使用に依存して変化する。いくつかの場合において、精製は必
要ではない。
【０１４１】 必要ならば、一旦発現および精製されると、新脈管形成タンパク質および核酸
は、多くの適用において有用である。
【０１４２】 １つの局面において、遺伝子の発現レベルは、新脈管形成の表現型において異
なる細胞状態に対して決定される；すなわち、通常組織（すなわち、新脈管形成
を起こしていない）および新脈管形成組織（そしていくつかの場合において、以
下に概説されるように、予後に関連する新脈管形成の種々の重篤度に対して）に
おける遺伝子の発現レベルは、発現プロフィールを提供するために評価される。
特定の細胞状態の発現プロフィールまたは発症点は、本質的に、状態の「フィン
ガープリント」である；２つの状態は、同様に発現される任意の特定の遺伝子を
有し得るが、多くの遺伝子の評価は、細胞の状態に固有である遺伝子発現プロフ
ィールの生成を可能にする。異なる状態の細胞の発現プロフィールを比較するこ
とによって、これらの状態の各々において、どの遺伝子が重要であるかに関する
情報（遺伝子のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションの両方を
含む）が得られる。次いで、診断が行われうるか、または以下が確かめれら得る
：特定の患者からの組織が、正常なまたは新脈管形成組織の遺伝子発現プロフィ
ールを有するのか。
【０１４３】 「差示的発現」、または本明細書中で使用される文法上の等価物は、細胞内お
よび細胞間での遺伝子の時間的および／または細胞発現パターンにおける定性的
および定量的差の両方をいう。従って、差示的に発現された遺伝子は、定性的に
、例えば、正常な組織 対 新脈管形成組織における、その変更された発現（活
性化または不活性化を含む）を有する。すなわち、遺伝子は、別の状態に対し、
特定の状態において、スイッチが入れられ（ｔｕｒｎ ｏｎ）得るか、またはス
イッチがきられ（ｔｕｒｎ ｏｆｆ）得る。当業者に明らかなように、２つ以上
の状態の任意の比較がなされ得る。このような定性的に調節された遺伝子は、１
つのこのような状態または細胞型において、標準的な技術によって検出可能であ
るが、両方において検出可能ではない、状態または細胞型内で発現パターンを示
す。あるいは、決定は、発現が増加または減少する場合に、定量的である；すな
わち、遺伝子の発現は、アップレギュレーションされて、転写物の量の増加を生
じるか、またはダウンレギュレーションされて転写物の量の減少を生じるかのい
ずれかである。発現が異なる程度は、以下に概略されるような標準的な特徴付け
技術を介して（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐTM発現アレイ
（Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：１６
７５−１６８０（１９９６））（本明細書中で明確に、参考として援用される）
の使用によって））、定量されるのに十分に大きくあることのみが必要である。
他の技術は、定量的逆トランスクリプターゼＰＣＲ、ノーザン分析およびＲＮａ
ｓｅ保護を含むが、これらに限定されない。上に概略されたように、好ましくは
、発現の変化（すなわち、アップレギュレーションおよびダウンレギュレーショ
ン）は、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約１００％、より好ま
しくは約１５０％、より好ましくは約２００％であり、３００〜少なくとも１０
００％が特に好ましい。
【０１４４】 当業者によって理解されるように、これは、遺伝子転写物レベル、またはタン
パク質レベルのいずれかにおける評価によってなされ得る；すなわち、遺伝子発
現の量は、遺伝子転写物のＤＮＡまたはＲＮＡ等価物に対する核酸プローブを使
用することによって、モニタリングされ得、そして遺伝子発現レベルの定量、あ
るいは最終遺伝子産物自体（タンパク質）が、例えば、新脈管形成タンパク質に
対する抗体の使用および標準的イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡなど）または他の技
術（質量分析アッセイ、２Ｄゲル電気泳動アッセイなど）を介してモニタリング
され得る。従って、新脈管形成遺伝子（新脈管形成表現型において重要であると
同定されるもの）に対応するタンパク質が、新脈管形成診断試験において評価さ
れ得る。
【０１４５】 好ましい実施形態において、遺伝子発現モニタリングが行われ、そして多くの
遺伝子（すなわち、発現プロフィール）が同時にモニタリングされるが、複数の
タンパク質発現モニタリングが、同様に行われ得る。同様に、これらのアッセイ
は、同様に個体基準に基づいて行われ得る。
【０１４６】 この実施形態において、新脈管形成核酸プローブは、特定の細胞における新脈
管形成配列の検出および定量のために、本明細書中に概説されるようなバイオチ
ップに付着される。これらのアッセイは、以下の実施例にさらに記載される。
【０１４７】 好ましい実施形態において、新脈管タンパク質をコードする核酸が検出される
。新脈管形成タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡが検出され得るが、新
脈管形成タンパク質をコードするｍＲＮＡが検出される方法が、特に興味深い。
サンプルにおけるｍＲＮＡの存在は、新脈管形成遺伝子が転写されて、ｍＲＮＡ
を形成することの指標であり、そしてタンパク質が発現されることを示唆する。
ｍＲＮＡを検出するためのプローブは、任意のヌクレオチド／デオキシヌクレオ
チドプローブであり得、このプローブは、ｍＲＮＡに相補的であり、そしてｍＲ
ＮＡとの塩基対であり、そしてオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含
むがこれらに限定されない。プローブはまた、本明細書中で規定されるような検
出可能な標識を含むべきである。１つの方法において、ｍＲＮＡは、試験される
核酸を固体支持体（例えば、ナイロン膜）に固定し、そしてプローブをサンプル
にハイブリダイズした後に検出される。非特異的に結合したプローブを除去する
ための洗浄に続いて、標識が検出される。別の方法において、ｍＲＮＡの検出が
、インサイチュで実施される。この方法において、透過処理された細胞または組
織サンプルが、検出可能に標識された核酸プローブと、そのプローブが標的ｍＲ
ＮＡにハイブリダイズすることを可能にするに十分な時間接触させられる。非特
異的に結合したプローブを除去するための洗浄に続いて、標識が検出される。例
えば、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ）標識リボプローブ（ＲＮＡプ
ローブ）（これは、新脈管形成タンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的である
）が、ジゴキシゲニンを抗ジゴキシゲニン２次抗体に結合させることによって、
検出され、ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモー４−クロロ−３−イ
ンドールホスフェートで着色（ｄｅｖｅｌｏｐ）される。
【０１４８】 好ましい実施形態において、本明細書中に記載されるタンパク質の３つのクラ
スのいずれか（分泌タンパク質、膜貫通タンパク質または細胞内タンパク質）が
、診断アッセイにおいて使用される。新脈管形成タンパク質、抗体、核酸、改変
タンパク質および細胞（新脈管形成配列を含む）が、診断アッセイにおいて使用
される。これは、個々の遺伝子または対応するポリペプチドレベルに対して実施
される。好ましい実施形態において、発現プロフィールは、好ましくは、発現プ
ロフィール遺伝子および／または対応するポリペプチドのモニタリングを可能に
するための、ハイスループットスクリーニング技術に関連して使用される。
【０１４９】 本明細書中に記載されそして規定されるように、新脈管形成タンパク質（細胞
管タンパク質、膜貫通タンパク質または分泌タンパク質を含む）は、新脈管形成
のマーカーとしての用途を見出す。推定新脈管形成組織または患者におけるこれ
らのタンパク質の検出は、新脈管形成の決定または診断を可能にする。当業者に
公知の種々の方法は、新脈管形成を検出する際の使用を見出す。１つの実施形態
において、抗体が、新脈管形成タンパク質を検出するために使用される。好まし
い方法は、サンプルまたは患者から、ゲル（代表的に、変性および還元タンパク
質ゲル、しかし、他の任意の型のゲル（等電フォーカシングゲルなどを含む）で
あり得る）上での電気泳動によってタンパク質を分離する。タンパク質の分離に
続いて、新脈管形成タンパク質は、新脈管形成タンパク質に対して惹起された抗
体を用いる免疫ブロッティングによって検出される。免疫ブロッティングの方法
は、当業者に周知である。
【０１５０】 別の好ましい実施形態において、新脈管形成タンパク質に対する抗体は、イン
サイチュ画像化技術における使用を見出す。この方法において、細胞は、新脈管
形成タンパク質に対する、１つの抗体から多くの抗体と接触される。非特異的な
抗体結合を除去するための洗浄に続いて、抗体の存在が検出される。１つの実施
形態において、抗体は、検出可能な標識を含む２次抗体と共にインキュベートす
ることによって、検出される。別の方法において、新脈管形成タンパク質に対す
る１次抗体は、検出可能な標識を含む。別の好ましい実施形態において、複数の
１次抗体の各々は、個別かつ検出可能な標識を含む。この方法は、複数の新脈管
形成タンパク質についての同時スクリーニングにおける特定の使用を見出す。当
業者に理解されるように、多くの他の組織学的画像化技術は、本発明において有
用である。
【０１５１】 好ましい実施形態において、標識が、蛍光測定器において検出され、この蛍光
測定器は、異なる波長の発光を検出および区別する能力を有する。さらに、蛍光
細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）が、この方法において使用され得る。
【０１５２】 別の好ましい実施形態において、抗体は、血液サンプルから新脈管形成を診断
する際の使用を見出す。先に記載されたように、特定の新脈管形成タンパク質は
、分泌／循環分子である。それによって、血液サンプルは、分泌された新脈管形
成タンパク質の存在について、プローブまたは試験されるサンプルとして有用で
ある。抗体は、当業者に理解されるように、先に記載のイムノアッセイ技術（Ｅ
ＬＩＳＡ、免疫ブロッティング（ウエスタンブロッティング）、免疫沈降、ＢＩ
ＡＣＯＲＥ技術など）のいずれかによって新脈管形成を検出するために使用され
得る。
【０１５３】 好ましい実施形態において、標識新脈管形成核酸プローブの組織アレイへのイ
ンサイチュハイブリダイゼションが行われる。例えば、組織サンプルのアレイ（
新脈管形成組織および／または正常組織を含む）が作製される。当該分野で公知
であるインサイチュハイブリダイゼーションが、次いで、行われ得る。
【０１５４】 個々と標準との間のフィンガープリントを比較する場合、当業者は、診断およ
び予後をなしうることが理解される。診断を示す遺伝子は、予後を示す遺伝子と
は異なりうることがさらに理解される。
【０１５５】 好ましい実施形態において、新脈管形成タンパク質、抗体、核酸、改変タンパ
ク質および細胞（新脈管形成配列を含む）が、予後アッセイにおいて使用される
。上記のように、遺伝子発現プロフィール（新脈管形成の重篤度と相関する）は
、長期にわたる予後の点から、生成され得る。再び、これが、タンパク質または
遺伝子のレベルのいずれかに対して行われ得、遺伝子の使用が好ましい。上記の
ように、新脈管形成プローブが、組織または患者における新脈管形成配列の検出
および定量のために、バイオチップに付着される。これらのアッセイは、上に概
説されたように診断について、進行される。
【０１５６】 好ましい実施形態において、本明細書中に記載されるタンパク質の３つのクラ
スのいずれも、薬物スクリーニングアッセイにおいて使用される。新脈管形成タ
ンパク質、抗体、核酸、改変タンパク質および細胞（新脈管形成配列を含む）は
、薬物スクリーニングアッセイにおいて、または「遺伝子発現プロフィール」ま
たはポリペプチドの発現プロフィールに対する薬物候補の効果を評価することよ
って使用される。好ましい実施形態において、発現プロフィールが、好ましくは
、候補薬剤を用いる処置の後に、発現プロフィール遺伝子のモニタリングを可能
にするハイスループットスクリーニング技術と関連して、使用される（Ｚｌｏｋ
ａｒｎｉｋ，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９，８４−８（１９９８），Ｈｅｉｄ，
１９９６ ＃６９）。
【０１５７】 好ましい実施形態において、新脈管形成タンパク質、抗体、核酸、改変タンパ
ク質および細胞（ネイティブまたは改変新脈管形成タンパク質を含む）は、スク
リーニングアッセイにおいて、使用される。すなわち、本発明は、新脈管形成表
現型を調節する組成物についてスクリーニングするための新規な方法を提供する
。上記のように、これは、個々の遺伝子レベルに関してまたは「遺伝子発現プロ
フィール」に対する薬物候補の効果を評価することによって、行われ得る。好ま
しい実施形態において、発現プロフィールは、好ましくは、候補薬剤を用いる処
置の後に、発現プロフィール遺伝子のモニタリングを可能にするハイスループッ
トスクリーニング技術と関連して使用される（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ（前出）を参
照のこと）。
【０１５８】 本明細書中の差示的に発現される遺伝子が同定されると、種々のアッセイが実
行され得る。好ましい実施形態において、アッセイが、個々の遺伝子またはタン
パク質のレベルに対して、行われ得る。すなわち、新脈管形成においてアップレ
ギュレーションされたと特定の遺伝子が同定されると、候補生物活性薬剤は、こ
の遺伝子の応答を調節するために；好ましくは、遺伝子をダウンレギュレーショ
ンするためにであるが、いくつかの状況において、遺伝子をアップレギュレーシ
ョンするために、スクリーニングされ得る。「調節」は、従って、遺伝子発現の
増加および減少の両方を含む。調節の好ましい量は、正常組織における 対 新
脈管形成を受ける組織における、遺伝子発現の本来の変化に依存し、その変化は
、少なくとも１０％、好ましくは５０％、より好ましくは１００〜３００％、そ
していくつかの実施形態において、３００〜１０００％以上である。従って、遺
伝子が、正常な組織に比べて脈管形成組織において４倍の増加を示す場合、約４
倍の減少が所望される；正常組織に比べて新脈管形成組織における１０倍の減少
は、所望される候補薬剤に対して、発現の１０倍の増加を与える。
【０１５９】 当業者によって理解されるように、これは、遺伝子レベルまたはタンパク質レ
ベルのいずれかにおける評価によって行われ得る；すなわち、遺伝子発現の量は
、核酸プローブを使用してモニタリングされ得、そして遺伝子発現レベルの定量
、あるいは遺伝子産物自体が、例えば、新脈管形成タンパク質に対する抗体の使
用および標準的なイムノアッセイを介して、モニタリングされ得る。
【０１６０】 好ましい実施形態において、遺伝子発現モニタリングが行われ、そして多くの
遺伝子（すなわち、発現プロフィール）が、同時にモニタリングされるが、複数
のタンパク質発現モニタリングが、同様に行われ得る。
【０１６１】 この実施形態において、新脈管形成核酸プローブは、特定の細胞における新脈
管形成配列の検出および定量のために、本明細書中で概略されるようなバイオチ
ップに付着される。これらのアッセイは、以下にさらに記述される。
【０１６２】 一般に、好ましい実施形態において、候補生物活性薬剤は、分析に前に細胞に
添加される。さらに、新脈管形成を調節するか、新脈管形成タンパク質を調節す
るか、新脈管形成タンパク質に結合するか、またはタンパク質の結合と抗体の結
合との間を妨害する候補生物活性薬剤を同定するために、スクリーンが提供され
る。
【０１６３】 本明細書中で使用されるような、用語「候補生物活性薬剤」または「薬物候補
」または文法的な等価物は、生物活性薬剤に対して試験される任意の分子（例え
ば、タンパク質、オリゴペプチド、有機小分子、多糖類、ポリヌクレオチドなど
）を記述し、この生物活性薬剤は、新脈管形成表現型または新脈管形成配列（核
酸配列およびタンパク質配列の両方を含む）の発現のいずれかを直接的にまたは
間接的に変更し得る。好ましい実施形態において、生物活性薬剤は、発現プロフ
ィール、あるいは本明細書中に提供される発現プロフィール核酸またはタンパク
質を調節する。特定の好ましい実施形態において、候補薬剤は、例えば、正常な
組織のフィンガープリントに対する新脈管形成表現型を抑制する。同様に、候補
薬剤は、好ましくは、重篤な新脈管形成表現型を抑制する。一般に、複数のアッ
セイ混合物が、種々の濃度に対する差示的応答を得るために、異なる薬剤濃度で
並行して実施される。代表的に、これらの濃度の１つは、ネガティブコントロー
ル（例えば、ゼロ濃度または検出レベル未満）として役割を果たす。
【０１６４】 １つの局面において、候補化合物は、新脈管形成タンパク質の効果を中和する
。「中和する」は、実質的に細胞に対する効果を有しないように、タンパク質の
活性が阻害されるかまたは相殺されるかのいずれかを意味する。
【０１６５】 候補薬剤は、多くの化学物質のクラスを包含するが、代表的に、それらは有機
分子、好ましくは小有機分子（１００ダルトンより大きく、そして約２５００ダ
ルトンより小さい分子量を有する）である。好ましい小分子は、２０００Ｄ未満
、または１５００Ｄ未満または１０００Ｄ未満または５００Ｄ未満である。候補
薬剤は、タンパク質との構造的な相互作用（特に、水素結合）のために必要な官
能基を含み、そして代表的には、少なくとも、アミン基、カルボニル基、ヒドロ
キシル基またはカルボキシル基、好ましくは、これらの化学官能基の少なくとも
２つを含む。候補薬剤は、しばしば、上記官能基の１つ以上で置換された環状炭
素または複素環構造および／もしくは芳香族または多芳香族（ｐｏｌｙａｒｏｍ
ａｔｉｃ）構造を含む。候補薬剤はまた、ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステ
ロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、それらの構造類似体、またはそ
れらの組み合わせを含む生体分子の中に見出される。特に好ましいのは、ペプチ
ドである。
【０１６６】 候補薬剤は、合成または天然の化合物のライブラリーを含む種々の広範な供給
源から得られる。例えば、多くの手段が、種々の広範な有機化合物および生体分
子のランダムおよび方向付けられた合成（ランダム化されたオリゴヌクレオチド
の発現を含む）について利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、および
動物の抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーが、利用可能であるかまたは
容易に作製される。さらに、天然のまたは合成的に作製されたライブラリーおよ
び化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段を介して改変される。
公知の薬理学的薬剤は、方向付けられたまたはランダムな化学的改変（例えば、
アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
）に供されて、構造類似体を生成し得る。
【０１６７】 好ましい実施形態において、候補生物活性薬剤はタンパク質である。本明細書
中の「タンパク質」は、少なくとも２つの共有結合されたアミノ酸を意味し、こ
れには、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドが含まれ
る。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペ
プチド模倣構造から作製され得る。従って、「アミノ酸」または「ペプチド残基
」は、本明細書中で使用される場合、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ
酸を意味する。例えば、ホモ−フェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシ
ン（ｎｏｒｅｌｅｕｃｉｎｅ）は、本発明の目的のためのアミノ酸であると考え
られる。「アミノ酸」はまた、イミノ酸残基（例えば、プロリンおよびヒドロキ
シプロリン）を含む。側鎖は、（Ｒ）配置または（Ｓ）配置のいずれかであり得
る。好ましい実施形態において、アミノ酸は（Ｓ）またはＬ−配置である。天然
に存在しない側鎖が使用される場合、非アミノ酸置換基が、例えば、インビボ分
解を防ぐかまたは遅らせるために使用され得る。
【０１６８】 好ましい実施形態において、候補生物活性剤は、天然に存在するタンパク質ま
たは天然に存在するタンパク質のフラグメントである。従って、例えば、タンパ
ク質を含む細胞抽出物、あるいは蛋白様細胞抽出物のランダムまたは直接の消化
物が、使用され得る。この方法において、原核生物タンパク質および真核生物タ
ンパク質のライブラリーは、本発明の方法におけるスクリーニングのために作製
され得る。本実施形態において、特に好ましいのは、細菌タンパク質、真菌タン
パク質、ウイルスタンパク質および哺乳動物タンパク質のライブラリーであり、
後者が好ましく、そしてヒトタンパク質が、特に好ましい。
【０１６９】 好ましい実施形態において、候補生物活性剤は、約５〜約３０アミノ酸のペプ
チドであり、約５〜約２０アミノ酸が好ましく、そして約７〜約１５が特に好ま
しい。これらのペプチドは、ランダムなペプチド、または「偏った（ｂｉａｓｅ
ｄ）」ランダムなペプチドとして、上記で概略された、天然に存在するタンパク
質の消化物であり得る。「ランダム化（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ）」または本明細
書中で文法上の等価物は、各核酸およびペプチドが、それぞれ、本質的にランダ
ムなヌクレオチドおよびアミノ酸からなることを意味する。一般的に、これらの
ランダムなペプチド（または以下で議論される核酸）は、化学的に合成されるの
で、それらは、任意のヌクレオチドまたはアミノ酸を、任意の位置に組み込み得
る。合成プロセスは、配列全体にわたる可能な組み合わせのすべてまたはほとん
どの形成を可能にするための、ランダム化したタンパク質または核酸を生じるた
めに設計され得る、従って、ランダム化された候補生物活性蛋白様薬剤のライブ
ラリーを形成する。
【０１７０】 １つの実施形態において、ライブラリーは、十分にランダム化され、優先的な
配列がないかまたは任意の位置で一定である。好ましい実施形態において、ライ
ブラリーは、偏っている。すなわち、配列内のいくつかの位置は、定常であるか
、または制限された数の可能性から選択されるかのいずれかである。例えば、好
ましい実施形態において、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、規定されたクラ
ス（例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏った（小さいか、大きい
のいずれか）残基）内で、核酸結合ドメインの作成のため、架橋のためのシステ
インの作成、ＳＨ−３ドメインためにプロリン、リン酸化部位のためスレオニン
、チロシンまたはヒスチジンなどに、またはプリンなどに向けてランダム化され
る。
【０１７１】 好ましい実施形態において、候補生物活性剤は、上記で定義されたような核酸
である。
【０１７２】 タンパク質について、上記で一般的に記載されるように、核酸候補生物活性剤
は、天然に存在する核酸、ランダムな核酸、または「偏った」ランダム核酸であ
り得る。例えば、原核生物ゲノムまたは真核生物ゲノムの消化物は、タンパク質
について上記に概略されたように使用され得る。
【０１７３】 好ましい実施形態において、候補生物活性剤は、有機化学分子であり、広範な
それらは、文献において利用可能である。
【０１７４】 候補薬剤が添加され、そして細胞が、ある程度の期間インキュベートされ得た
後、分析されるべき標的配列を含むサンプルは、バイオチップに添加される。必
要な場合、標的配列は、公知の技術を使用して調製される。例えば、サンプルは
、当業者に明白なような、公知の溶解緩衝液、エレクトロポレーションなどを使
用して、必要な場合に生じる、精製および／またはＰＣＲのような増幅を用いて
、細胞を溶解するために処理され得る。例えば、ヌクレオシドに共有結合的に付
着した標識を用いるインビトロ転写が行われる。一般的に、核酸は、ビオチン−
ＦＩＴＣまたはＰＥ、あるいはｃｙ３またはｃｙ５で標識される。
【０１７５】 好ましい実施形態において、標的配列は、例えば、蛍光シグナル、化学発光シ
グナル、化学シグナル、または放射活性シグナルで標識され、プローブへの標的
配列特異的な結合を検出手段を提供する。標識はまた、アルカリホスファターゼ
、または西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素であり得、適切な基質が提供
される場合に、検出され得る産物を産生する。あるいは、標識は、標識された化
合物または低分子（例えば、酵素に結合するが、酵素によって触媒も変化もしな
い酵素インヒビター）であり得る。標識はまた、部分または化合物（例えば、エ
ピトープタグまたはストレプトアビジンに特異的に結合するビオチン）であり得
る。
【０１７６】 ビオチンの例については、ストレプトアビジンは、上記のように標識され、そ
れによって、結合した標的配列についての検出可能なシグナルを、提供する。当
該分野で公知のように、未結合の標識されたストレプトアビジンは、分析の前に
除去される。
【０１７７】 当業者に明白なように、これらのアッセイは、ハイブリダイゼーションアッセ
イに関し得るか、または複数のプローブの使用を含む「サンドイッチアッセイ」
を含み得、それは一般に米国特許第５，６８１，７０２号、同第５，５９７，９
０９号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５９４，１１７号、同第５，５９
１，５８４号、同第５，５７１，６７０号、同第５，５８０，７３１号、同第５
，５７１，６７０号、同第５，５９１，５８４号、同第５，６２４，８０２号、
同第５，６３５，３５２号、同第５，５９４，１１８号、同第５，３５９，１０
０号、同第５，１２４，２４６号および同第５，６８１，６９７号に概略され、
それらのすべては、本明細書中に参考として援用される。この実施形態において
、一般的に、標的核酸は、上記に概略されたように調製され、次いで、ハイブリ
ダイゼーション複合体の形成を可能にする条件下で、複数の核酸プローブを備え
るバイオチップに添加される。
【０１７８】 広範なハイブリダイゼーション条件が、上記で概略された高度、中程度および
低度のストリンジェンシー条件を含んで本発明において使用され得る。このアッ
セイは、一般的に、標的の存在下のみで、標識プローブハイブリダイゼーション
複合体の形成を可能にするストリンジェンシーな条件下で行われる。ストリンジ
ェンシーは、温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピズム塩濃度ｐＨ、有
機溶媒濃度などを含むが、これらに限定されない、熱力学的変数であるステップ
パラメーターを変化することによって制御され得る。
【０１７９】 これらのパラメーターはまた、一般的に米国特許第５，６８１，６９７号に概
略されるように、非特異的結合を制御するために使用され得る。従って、非特異
的結合を減少するために、より高いストリンジェンシー条件で、特定の工程を行
うことは、望ましい。
【０１８０】 本明細書中で概略される反応は、当業者に明白な種々の方法で達成され得る。
反応の成分は、同時または任意の順番で連続して添加され得、好ましい実施形態
は以下に概略される。さらに、反応は、アッセイに含まれ得る種々の他の薬剤を
含み得る。これらは、最適なハイブリダイゼーションおよび検出を容易にするた
めに使用され得る、塩、緩衝液、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面
活性剤などのような試薬を含み、そして／または非特異的またはバックグラウン
ドの相互作用を減少する。さもなければアッセイの効率を改善する試薬（プロテ
アーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤、など）はまた、サン
プル調製方法および標的の精製度に依存して使用され得る。
【０１８１】 一旦アッセイが行われると、データは、個々の遺伝子の発現レベルおよび遺伝
子発現プロフィールを形成する状態の間の発現レベルにおける変化を決定するた
めに分析される。
【０１８２】 スクリーニングは、新脈管形成表現型を調節する薬物または生物活性剤を同定
するために行われる。具体的には、行われ得るいくつかの型のスクリーニングが
存在する。好ましい実施形態は、特定の発現プロフィールを誘導または抑制し得
る、候補薬剤のスクリーニングであり、従って、好ましくは、関連する表現型を
生じる。すなわち、正常組織の発現プロフィールに類似の新脈管形成において、
発現プロフィールを模倣し得るか、または生じ得る候補薬剤が、新脈管形成表現
型の抑制を生じると期待される。従って、この実施形態において、発現プロフィ
ールを模倣することまたは互いのプロフィールを変化することが、目的である。
【０１８３】 好ましい実施形態において、診断適用のために、任意の状態において重要な差
示的に発現された遺伝子を同定する場合、スクリーニングは、個々の遺伝子の発
現を変化するために行われ得る。すなわち、単一の遺伝子の発現の調節について
のスクリーニングが行われ得る；すなわち、発現プロフィールのすべてまたは一
部を模倣することを試みるよりも、個々の遺伝子の調節についてのスクリーニン
グが行われ得る。従って、例えば、特に２つの状態間で存在または非存在が独特
である、標的遺伝子の場合、スクリーニングが、標的遺伝子発現のモジュレータ
ーについて行われる。
【０１８４】 好ましい実施形態において、差示的に発現された遺伝子の発現産物の生物学的
機能を変化するために、スクリーニングは行われる。再び、特定の状態で、遺伝
子の重要性を同定する場合、遺伝子産物の生物学的活性を結合および／または調
節する薬剤のスクリーニングは、以下により十分に概略されるように行われ得る
。
【０１８５】 従って、遺伝子発現レベルまたはタンパク質レベルのいずれかで、新脈管形成
表現型を調整する候補薬剤のスクリーニングが行われ得る。
【０１８６】 さらに、スクリーニングは、候補薬剤に対して誘導される新規の遺伝子につい
て行われ得る。正常組織由来の遺伝子の発現を模倣するために、正常な発現パタ
ーンを生じる新脈管形成発現パターンを抑制する、または単一の新脈管形成遺伝
子発現プロフィールを調節するその能力に基づいて、候補薬剤が同定された後、
上記のスクリーニングは、薬剤に対して特異的に調節される遺伝子を同定するた
めに行われ得る。正常組織と薬剤で処理された新脈管形成組織との間の発現プロ
フィールの比較によって、正常組織でも、新脈管形成組織でも発現されないが、
薬剤で処置された組織で発現される遺伝子が明らかになった。これらの薬剤に特
異的な配列は、新脈管形成遺伝子またはタンパク質について本明細書中で記載さ
れる任意の方法によって同定され得、そして使用され得る。特に、これらの配列
およびそれらのコードするタンパク質は、薬剤で処理された細胞をマークおよび
同定する際の用途を見出す。さらに、抗体は、タンパク質を誘導する薬剤に対し
て惹起され得、そして処理された新脈管形成組織サンプルに対する新規の治療法
に標的化するために使用され得る。
【０１８７】 従って、１つの実施形態において、候補薬剤は、脈管形成細胞の集団に投与さ
れ、従ってこれらは、関連した新脈管形成発現プロフィールを有する。「投与」
または「接触」は、本明細書中では、取り込みおよび細胞内作用、または細胞表
面での作用のいずれかによって、薬剤が細胞に作用することを可能にする様式で
、候補薬剤が細胞に添加されることを意味する。いくつかの実施形態において、
蛋白様候補薬剤をコードする核酸（すなわち、ペプチド）は、ウイルス構築物（
例えば、レトロウイルス構築物）に入れられ得、そして細胞に添加され得、その
結果、ペプチド薬剤の発現が達成される；ＰＣＴ ＵＳ９７／０１０１９を参照
のこと（本明細書中に記載されるように参考として援用される）。
【０１８８】 一旦、候補薬剤が細胞に投与されると、所望ならば、これらの細胞は洗浄され
得、そして好ましくは生理学的条件下でいくらかの時間にわたってインキュベー
トされ得る。次いで、これらの細胞は、回収され、そして、本明細書中に概略さ
れるような新たな遺伝子発現プロフィールが作製される。
【０１８９】 従って、例えば、新脈管形成組織は、新脈管形成の表現型を減少するかまたは
抑制する薬剤についてスクリーニングされ得る。少なくとも１つの遺伝子の発現
プロフィールの変化は、この薬剤が新脈管形成活性に対して効果を有することを
示す。新脈管形成表現型についてのこのような徴候を規定することによって、こ
の表現型を改変する新たな薬剤のスクリーニングは、工夫され得る。この手順で
は、この薬剤標的は、新規である必要はなく、そして独自の発現スクリーニング
プラットホームにおいて示される必要はなく、また、この標的タンパク質につい
ての転写レベルは変化する必要はない。
【０１９０】 好ましい実施形態において、上記に概略されるように、スクリーニングは、個
々の遺伝子および遺伝子産物（タンパク質）に対して行われ得る。すなわち、差
示的に発現された特定の遺伝子が特定の状態において重要として同定されること
、遺伝子または遺伝子産物それ自体のいずれかの発現の調節因子をスクリーニン
グすることが、行われ得る。差示的に発現される遺伝子の遺伝子産物は、時折、
「新脈管形成タンパク質」として本明細書中で言及される。好ましい実施形態に
おいて、この新脈管形成タンパク質は、図４、８、１３、１８および２２に示さ
れるか、または図２、３、７、１２、１７、２１および２３に示される配列によ
ってコードされる。この新脈管形成タンパク質は、フラグメント、あるいは本明
細書中で示されるフラグメントに対する全長タンパク質であり得る。
【０１９１】 好ましくは、新脈管形成タンパク質は、約１４〜２４アミノ酸長のフラグメン
トである。より好ましくは、このフラグメントは、可溶性フラグメントである。
【０１９２】 好ましい実施形態において、このフラグメントはＡＡＡ１由来である。好まし
くは、このフラグメントは、非膜貫通領域を含む。好ましい実施形態において、
ＡＡＡ１フラグメントは、可溶性のためにＮ末端のシステインを有する。好まし
くは、このフラグメントは、ＡＡＡ１ｐ１およびＡＡＡ１ｐ２より選択される。
【０１９３】 好ましい実施形態において、このフラグメントは荷電され、そしてＡＡＡ４の
Ｃ末端由来である。１つの実施形態において、このフラグメントのＣ末端は、遊
離酸として働き、そしてＮ末端は結合（すなわちシステインとの結合）のための
遊離アミンである。１つの実施形態において、このフラグメントは、ＡＡＡ４の
内部ペプチド重複親水性ストレッチである。好ましい実施形態において、この末
端はブロックされる。好ましくは、ＡＡＡ４のフラグメントは、ＡＡＡ４ｐ１ま
たはＡＡＡ４ｐ２より選択される。別の実施形態において、このフラグメントは
、Ｎ末端由来の新規なフラグメントである。１つの実施形態において、このフラ
グメントはＮ末端の外側の配列を除外し、別の実施形態において、このフラグメ
ントは、少なくともＮ末端の一部を含む。本明細書中において、「Ｎ末端」は、
さらに上記した「Ｎ末端」と交換可能に使用される。
【０１９４】 １つの実施形態において、新脈管形成タンパク質は、本明細書中に記載される
免疫原性因子と結合される。１つの実施形態において、新脈管形成タンパク質は
、ＢＳＡと結合される。
【０１９５】 従って、好ましい実施形態において、特定の遺伝子の発現の調節因子について
のスクリーニングが、実施され得る。これは、上記に概略されるように実施され
るが、一般には、１つのみかまたはいくつかの遺伝子の発現が、評価される。
【０１９６】 好ましい実施形態において、差示的に発現されるタンパク質に結合し得る候補
薬剤を見出すスクリーニングが、まず設計され、次いで、これらの薬剤は、差示
的に発現される活性を調節するためのこの候補薬剤の能力を評価するアッセイに
おいて使用され得る。従って、当業者に明白なように、実施され得る多くの異な
るアッセイ（結合アッセイおよび活性アッセイ）が存在する。
【０１９７】 好ましい実施形態において、結合アッセイが行われる。一般に、精製または単
離された遺伝子産物が使用される；すなわち、１つ以上の差示的に発現される核
酸の遺伝子産物が作製される。一般に、これは、当該分野において公知として行
われる。例えば、抗体が、タンパク質遺伝子産物に対して作製され、そして標準
免疫アッセイを行い、存在するタンパク質の量を決定する。あるいは、新脈管形
成タンパク質を含む細胞が、アッセイに使用され得る。
【０１９８】 従って、好ましい実施形態において、その方法は、新脈管形成タンパク質およ
び候補生物活性剤を結合させる工程、ならびにこの候補薬剤の新脈管形成タンパ
ク質への結合を決定する工程を包含する。好ましい実施形態は、例えば、ヒト疾
患の動物モデルの開発について他の哺乳動物タンパク質もまた使用され得るにも
かかわらず、ヒト新脈管形成タンパク質を利用する。いくつかの実施形態におい
て、本明細書中で概略されるように、新脈管形成タンパク質の改変体または誘導
体が、使用され得る。
【０１９９】 一般に、本明細書中の方法の好ましい実施形態において、新脈管形成タンパク
質または候補薬剤は、単離されたサンプルを受容する領域を有する不溶性支持体
（例えば、マイクロタイタープレート、アレイなど）に非拡散可能（ｎｏｎ−ｄ
ｉｆｆｕｓａｂｌｙ）に結合される。不溶性支持体は、任意の組成物からなり得
、これらの組成物が結合され得るものは、可溶性物質から容易に分離され、そし
てさもなければ、スクリーニングの全ての方法と相互交換可能である。このよう
な支持体の表面は、固相またはポーラスおよび任意の簡便な形状であり得る。適
切な不溶性支持体の例は、マイクロタイタープレート、アレイ、膜およびビーズ
を含む。これらは、代表的にガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、
多糖、ナイロンまたはニトロセルロース、テフロン（登録商標）などからなる。
マイクロタイタープレートおよびアレイは、特に簡便である。なぜなら、多くの
アッセイが、少量の試薬およびサンプルを使用して連続して実施され得るからで
ある。組成物の特定の結合様式は、試薬および本発明の全ての方法と相互変換可
能である限り重要ではなく、この組成物の活性を維持しかつ非拡散可能である。
結合の好ましい方法は、抗体（タンパク質を支持体に結合する場合、リガンド結
合部位または活性化配列のいずれかを立体的にブロックしない）の使用、「粘着
性」またはイオン性の支持体への直接結合、化学的クロスリンク、表面上のタン
パク質または薬剤の合成などを含む。タンパク質または薬剤の結合に続いて、余
分な非結合物質が、洗浄によって除去される。次いで、サンプルを除いた領域は
、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたは他の無害のタンパク質もしく
は他の部分でのインキュベーションを通じてブロックされ得る。
【０２００】 好ましい実施形態において、新脈管形成タンパク質を、支持体に結合し、そし
て候補生物活性剤をアッセイに添加する。あるいは、この候補薬剤を支持体に結
合し、そしてこの新脈管形成タンパク質を添加する。新規の結合剤は、特定の抗
体、化学ライブラリーのスクリーニングにおいて同定された非天然の結合剤、ペ
プチドアナログなどを含む。ヒト細胞に対して低い毒性を有する薬剤についての
スクリーニングが、特に興味深い。標識されたインビトロのタンパク質−タンパ
ク質結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合に関する免
疫アッセイ、機能的アッセイ（リン酸化アッセイなど）などを含む、広範な種々
のアッセイが、この目的に使用され得る。
【０２０１】 新脈管形成タンパク質に対する候補生物活性剤の結合の決定を、多くの方法で
行い得る。好ましい実施形態において、候補生物活性剤は標識され、そして結合
が直接決定される。例えば、このことは、新脈管形成タンパク質の全てまたは一
部を固相支持体に接触させること、標識された候補薬剤（例えば、蛍光標識）を
添加すること、余分な因子を洗い流すこと、およびこの標識が固相支持体上に存
在するか否かを決定することによって行われ得る。種々のブロッキング工程およ
び洗浄工程は、当該分野において公知として利用され得る。
【０２０２】 本明細書中において「標識した（された）」によって、検出可能なシグナル（
例えば、放射性同位元素、蛍光剤、酵素、抗体、磁気粒子のような粒子、化学蛍
光剤、または特異的結合分子などを提供する標識で、この化合物が直接的にかま
たは間接的に標識されることが意味される。特異的結合分子は、ビオチンとスト
レプトアビジン、ジゴキシンとアンチジゴキシンなどのような対を含む。特異的
結合メンバーについて、相補的メンバーは、上記に概略されるような公知の手順
に従って、検出を提供する分子で正常に標識される。標識は、直接または非直接
に検出可能なシグナルを提供し得る。
【０２０３】 いくつかの実施形態において、１つの成分のみが標識される。例えば、タンパ
ク質（またはタンパク質の候補薬剤）は、125Ｉを使用してかまたは蛍光基で、
チロシン位において標識され得る。あるいは、１つより多い成分が、異なる標識
（例えば、タンパク質に対して125Ｉ、そして候補因子について蛍光基）で標識
され得る。
【０２０４】 好ましい実施形態において、候補生物活性剤の結合は、競合的結合アッセイの
使用を通じて決定される。この実施形態において、競合剤は、標的分子（すなわ
ち、新脈管形成）に結合することが公知の結合部分（例えば、抗体、ペプチド、
結合パートナー、リガンドなど）である。特定の条件下で、生物活性剤に置き換
わる結合部分を有する、生物活性剤とその結合部分との間のような競合的結合が
存在し得る。
【０２０５】 １つの実施形態において、候補生物活性剤は標識される。存在するならば、候
補生物活性剤またはその競合剤のいずれかまたは両方を、結合し得るに十分な時
間だけ、まずタンパク質に添加する。インキュベーションは、最適な活性を容易
にする任意の温度（代表的には、４℃と４０℃との間）で実施され得る。インキ
ュベーション時間は、最適活性について選択されるが、また迅速な高スループッ
トスクリーニングを容易にするように最適化され得る。代表的には、０．１時間
と１時間との間で十分である。余分な薬剤は、一般には除去されるかまたは洗浄
される。次いで、第２の成分が添加され、そして引き続いて、結合を表示する標
識された成分を存在させるかまたは存在させない。
【０２０６】 好ましい実施形態において、競合剤をまず添加し、次いで、候補生物活性剤を
添加する。競合剤の置換は、候補生物活性剤が新脈管形成タンパク質に結合して
おり、次いで、新脈管形成タンパク質の活性に結合し得かつ潜在的に調節し得る
。この実施形態において、いずれかの成分が標識され得る。従って、例えば、競
合剤が標識される場合、洗浄溶液中の標識の存在は、この薬剤による置換を示す
。あるいは、候補生物活性剤が標識される場合、支持体上の標識の存在は、置換
を示す。
【０２０７】 代替の実施形態において、候補生物活性剤をまず添加し、インキュベーション
および洗浄を行い、引き続き、競合剤を添加する。競合剤による結合の非存在は
、生物活性剤が高親和性で新脈管形成タンパク質に結合されることを示し得る。
従って、候補生物活性剤が標識される場合、競合剤の結合の欠如と連結した支持
体上の標識の存在は、候補薬剤が新脈管形成タンパク質に結合し得ることを示し
得る。
【０２０８】 好ましい実施形態において、その方法は、新脈管形成タンパク質の活性を調節
し得る生物活性剤を同定するための差示的なスクリーニングを含む。この実施形
態において、方法は、第１のサンプルにおいて新脈管形成タンパク質および競合
剤を結合させる工程を包含する。第２のサンプルは、候補生物活性剤、新脈管形
成タンパク質および競合剤を含む。競合剤の結合は、両方のサンプルについて決
定される。そしてこれら２つのサンプルの間の結合における変化または差異は、
新脈管形成タンパク質に結合し得かつ潜在的にその活性を調節し得る因子の存在
を示す。すなわち、競合剤の結合が第１のサンプルに比べて第２のサンプルにお
いて異なる場合、この薬剤は、新脈管形成タンパク質に結合し得る。
【０２０９】 あるいは、好ましい実施形態は、差示的なスクリーニングを利用して、天然の
新脈管形成タンパク質に結合するが改変した新脈管形成タンパク質には結合し得
ない薬物候補を同定する。新脈管形成タンパク質の構造は、モデル化され得、そ
してその部位と相互作用する薬剤を合成するための合理的薬物設計に使用され得
る。新脈管形成生物活性に影響する薬物候補はまた、このタンパク質の活性を増
加するかまたは減少するかのいずれかの能力について薬物をスクリーニングする
ことによって同定される。
【０２１０】 陽性コントロールおよび陰性コントロールが、アッセイにおいて使用され得る
。好ましくは、全てのコントロールおよび試験サンプルは、統計的に顕著な結果
を得るために少なくとも３回実施される。全てのサンプルのインキュベーション
は、このタンパク質に対するこの薬剤の結合のために十分な時間にわたる。イン
キュベーションに引き続き、全てのサンプルは、非特異的結合物質を洗い流し、
そして一般には標識された薬剤の結合量が決定される。例えば、放射標識が使用
される場合、そのサンプルは、結合化合物の量を決定するためにシンチレーショ
ンカウンター中で計数され得る。
【０２１１】 種々のほかの試薬は、スクリーニングアッセイに含まれ得る。これらは、塩、
中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などのような試薬を含む。
これらは、最適なタンパク質−タンパク質結合を容易にするために、および／ま
たは非特異的相互作用もしくはバックグラウンド相互作用を減少するために使用
され得る。アッセイの効率を改善する試薬（プロテアーゼインヒビター、ヌクレ
アーゼインヒビター、抗微生物剤など）はまた、使用され得る。成分の混合物は
、必須の結合に提供されるために添加され得る。
【０２１２】 新脈管形成タンパク質の活性を調節する薬剤についてのスクリーニングはまた
、行われ得る。好ましい実施形態において、新脈管形成タンパク質の活性を調節
し得る生物活性剤についてのスクリーニングのための方法は、上記のような、候
補生物活性剤を新脈管形成タンパク質のサンプルに添加する工程、および新脈管
形成タンパク質の生物学的活性における改変を決定する工程を包含する。「新脈
管形成タンパク質の活性の調節」は、活性の増加、活性の減少、または存在する
活性の型または種類における変化を含む。従って、この実施形態において、候補
因子は、新脈管形成タンパク質への結合（これは必要であり得ないが）、および
本明細書中に規定されるような生物学的活性もしくは生化学的活性の改変の両方
を行うべきである。この方法は、一般には上記に概略されるようなインビトロで
のスクリーニング方法、および新脈管形成タンパク質の存在、分布、活性または
量における改変についての細胞のインビボでのスクリーニングの両方を含む。
【０２１３】 従って、この実施形態において、この方法は、新脈管形成サンプルおよび候補
生物活性剤を結合させる工程、ならびに新脈管形成における効果を評価する工程
を包含する。本明細書中における「新脈管形成活性」または文法的な等価物によ
って、新脈管形成の生物学的活性（新脈管形成におけるその役割を含むが、これ
に限定されない）の１つが意味される。１つの実施形態において、新脈管形成活
性は、ＡＡＡ４、ＡＡＡ１、Ｅｄｇ−１、α５β１インテグリン、エンドムチン
およびマトリックスメタロプロテイナーゼ１０の活性化を含む。新脈管形成活性
のインヒビターは、１つ以上の新脈管形成活性のいずれかの阻害である。
【０２１４】 好ましい実施形態において、新脈管形成タンパク質の活性は、増加される；別
の好ましい実施形態において、新脈管形成タンパク質の活性は、減少される。従
って、アンタゴニストである生物活性剤は、いくつかの実施形態において好まし
く、そしてアゴニストである生物活性剤は、他の実施形態において好ましくあり
得る。
【０２１５】 好ましい実施形態において、本発明は、新脈管形成タンパク質の活性を調節し
得る生物活性剤についてスクリーニングするための方法を提供する。本方法は、
上記に規定されるように、新脈管形成タンパク質を含む細胞に候補生物活性剤を
添加する工程を包含する。好ましい細胞型は、ほとんど全ての細胞である。これ
らの細胞は、新脈管形成タンパク質をコードする組換え体核酸を含む。好ましい
実施形態において、候補薬剤のライブラリーを、複数の細胞において試験する。
【０２１６】 １つの局面において、生理学的シグナル（例えば、ホルモン、抗体、ペプチド
、抗原、サイトカイン、増殖因子、活動電位、薬理学的因子（化学療法、放射線
、発癌物質（ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃｓ）または他の細胞（すなわち、細胞−
細胞接触）を含む））の曝露が存在するかまたは存在しないか、あるいは前に行
うかまたは後に行うかの条件下でアッセイが評価される。別の実施形態において
、判定は、細胞周期プロセスの異なる段階で決定される。
【０２１７】 この方法において、生物活性剤が同定される。薬理学的活性を有する化合物は
、新脈管形成タンパク質の活性を増加または干渉し得る。１つの実施形態におい
て、本明細書中で使用される場合「新脈管形成タンパク質活性」は、以下を少な
くとも１つ含む：本明細書中で規定されるような新脈管形成タンパク質活性、Ｅ
ｄｇ−１への結合、Ｅｄｇ−１の活性化、またはＥｄｇ−１の基質の活性化。１
つの実施形態において、新脈管形成活性は、新脈管形成組織の調節されない増殖
、または組織における動脈の増殖として規定される。１つの局面において、本明
細書中で規定されるような新脈管形成活性は、新脈管形成組織でのＥｄｇ−１の
アップレギュレーションにおけるＥｄｇ−１の活性に関する。
【０２１８】 別の実施形態において、新脈管形成タンパク質活性は、以下の少なくとも１つ
を含む：新脈管形成活性、ＡＡＡ４、ＡＡＡ１、Ｅｄｇ−１、α５β１インテグ
リン、エンドムチン、マトリックスメタロプロテイナーゼ１０の１つとの結合、
またはＡＡＡ４、ＡＡＡ１、Ｅｄｇ−１、α５β１インテグリン、エンドムチン
、マトリックスメタロプロテイナーゼ１０それぞれの基質の活性化。１つの実施
形態において、ＡＡＡ１は、そのＮ末端を含む。１つの局面において、本明細書
中に規定されるような新脈管形成活性は、新脈管形成組織でのＡＡＡ４、ＡＡＡ
１、Ｅｄｇ−１、α５β１インテグリン、エンドムチン、マトリックスメタロプ
ロテイナーゼ１０それぞれのアップレギュレーションにおけるＡＡＡ４、ＡＡＡ
１、Ｅｄｇ−１、α５β１インテグリン、エンドムチン、マトリックスメタロプ
ロテイナーゼ１０の活性に関する。
【０２１９】 １つの実施形態において、新脈管形成細胞分裂を阻害する方法が、提供される
。この方法は、新脈管形成インヒビターの投与を含む。
【０２２０】 別の実施形態において、新脈管形成を阻害する方法が提供される。この方法は
、新脈管形成インヒビターの投与を含む。
【０２２１】 さらなる実施形態において、細胞または新脈管形成を有する個体を処理する方
法が、提供される。この方法は、新脈管形成インヒビターの投与を含む。
【０２２２】 １つの実施形態において、新脈管形成インヒビターは、上記に記載されるよう
な抗体である。別の実施形態において、新脈管形成インヒビターは、アンチセン
ス分子である。本明細書中で使用される場合、アンチセンス分子は、新脈管形成
分子についての標的ｍＲＮＡ（センス）配列またはＤＮＡ（アンチセンス）配列
に結合し得る単鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を含む、アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを含む。好ましいアン
チセンス分子は、ＡＡＡ４、ＡＡＡ１、Ｅｄｇ−１、α５β１インテグリン、エ
ンドムチン、またはマトリックスメタロプロテイナーゼ１０についてであり、よ
り好ましくは、表５中の新脈管形成配列、またはそのリガンドもしくはアクチベ
ーターについてである。最も好ましいアンチセンス分子は、Ｅｄｇ−１またはそ
のリガンドもしくはアクチベーターについてである。本発明に従って、アンチセ
ンス配列またはセンス配列は、一般に少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましく
は、約１４〜３０ヌクレオチドのフラグメントを含む。所定のタンパク質をコー
ドするｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンス配列またはセンス配列を誘導する能
力は、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２
６５９、１９８８）ならびにｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ６：９５８、１９８８）に記載される。
【０２２３】 アンチセンス分子は、ＷＯ９１／０４７５３に記載されるような、リガンド結
合分子との結合物の形成による標的核酸配列を含む細胞中に導入され得る。適切
なリガンド結合分子は、以下を含むがこれらに限定されない：細胞表面レセプタ
ー、増殖因子、他のサイトカイン、または細胞表面レセプターに結合する他のリ
ガンド。好ましくは、リガンド結合分子の結合は、リガンド結合分子がその対応
する分子またはレセプターへ結合する能力を実質的には干渉しないか、あるいは
、センスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそ
の結合したバージョンの細胞内への侵入を実質的にはブロックしない。あるいは
、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９
０／１０４４８に記載されるように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成に
よって、標的核酸配列を含む細胞に導入され得る。アンチセンス分子またはノッ
クアウトモデルおよびノックインモデルの使用はまた、処理の方法に加えて、上
記に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて使用され得ることが理解
される。
【０２２４】 所望の薬理学的活性を有する化合物は、以前に記載されたように、生理学的に
受容可能なキャリア中で宿主に投与され得る。この薬剤は、経口または非経口の
種々の方法（例えば、皮下、腹腔内、脈管内など）で投与され得る。導入の様式
に依存して、化合物は、種々の方法で処方され得る。この処方における治療的に
活性な化合物の濃度は、約０．１−１００重量％まで変動し得る。この薬剤は、
単独でかまたは他の処置（すなわち、放射線）と組み合わせて投与され得る。
【０２２５】 薬学的組成物は、種々の形態（例えば、顆粒、錠剤、丸剤、坐剤、カプセル、
懸濁物、軟膏、ローションなど）で調製され得る。薬学的等級の有機キャリアま
たは無機キャリアおよび／または経口および局所での使用に適切な希釈液を使用
して、治療的に活性な化合物を含む組成物を作製し得る。当該分野において公知
の希釈液は、水溶性培地、植物性および動物性の油および脂を含む。安定剤、可
湿剤および乳化剤、変化する浸透圧または妥当なｐＨ値を確保するための緩衝液
についての塩、および皮膚貫通増強剤が、補助剤として使用され得る。
【０２２６】 学説に縛られることなく、種々の新脈管形成配列が新脈管形成に重要であるよ
うだ。従って、新脈管形成遺伝子の変異体または改変体に基づく障害が決定され
得る。１つの実施形態において、本発明は、細胞における少なくとも１つの内因
性新脈管形成遺伝子の配列の全てまたは一部を決定する工程を包含する、種々の
新脈管形成遺伝子を含む細胞を同定するための方法を提供する。当業者によって
明白であるように、これは、任意の数の配列決定技術を使用して行われ得る。好
ましい実施形態において、本発明は、個体の新脈管形成遺伝子の少なくとも１つ
の配列の全てまたは一部を決定する工程を包含する、その個体の新脈管形成遺伝
子型を同定する方法を提供する。これは、一般にその個体の少なくとも１つの組
織において行われ、そして同一組織の多くの組織または異なるサンプルの評価を
含み得る。この方法は、公知の新脈管形成遺伝子（すなわち、野生型遺伝子）に
対して、配列決定された新脈管形成遺伝子の配列を比較する工程を包含し得る。
【０２２７】 次いで、新脈管形成遺伝子の全てまたは一部の配列を、公知の新脈管形成遺伝
子の配列と比較して、いかなる差異が存在するか否かを決定し得る。これは、多
くの公知の相同性プログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔなど）を使用してなされ
得る。好ましい実施形態において、患者の新脈管形成遺伝子と公知の新脈管形成
遺伝子との間の配列における差異の存在は、本明細書中に概略されるような、疾
患状態または疾患状態への傾向を示す。
【０２２８】 好ましい実施形態において、これらの新脈管形成遺伝子をプローブとして使用
し、ゲノム中のの新脈管形成遺伝子のコピー数を決定する。
【０２２９】 別の好ましい実施形態において、これらの新脈管形成遺伝子をプローブとして
使用して、これらの新脈管形成遺伝子の染色体局在を決定する。染色体局在のよ
うな情報は、特に、染色体異常（例えば、転座など）がこの新脈管形成遺伝子座
において同定される場合に、診断または予後の提供における用途を見い出す。
【０２３０】 従って、１つの実施形態において、細胞または生物における新脈管形成を調節
する方法が提供される。１つの実施形態において、これらの方法は、内因性新脈
管形成タンパク質の生物学的活性を減少または排除する抗新脈管形成抗体を、細
胞に投与する工程を包含する。あるいは、これらの方法は、新脈管形成タンパク
質をコードする組換え核酸を、細胞または生物に投与する工程を包含する。当業
者に理解されるように、これは、多くの方法において達成され得る。好ましい実
施形態において、例えば、その新脈管形成配列が新脈管形成においてダウンレギ
ュレーションされている場合、この新脈管形成遺伝子の活性が、例えば、公知の
遺伝子治療技術を使用して、内因性新脈管形成配列を過剰発現させるかまたはこ
の新脈管形成配列をコードする遺伝子を投与することによって、細胞における新
脈管形成の量を増加させることによって増加される。好ましい実施形態において
、これらの遺伝子治療技術としては、増強化相同組換え（ＥＨＲ）を使用する外
因性遺伝子の組み込みが挙げられ、これは、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８
６８（その全体が参考として本明細書中で援用される）に記載される。あるいは
、例えば、その新脈管形成配列が新脈管形成においてアップレギュレーションさ
れている場合、内因性新脈管形成遺伝子の活性が、例えば、新脈管形成アンチセ
ンス核酸の投与によって減少される。
【０２３１】 １つの実施形態において、本発明の新脈管形成タンパク質は、本明細書中に記
載されるように有用な、新脈管形成タンパク質に対するポリクローナル抗体およ
びモノクローナル抗体を生成するために使用され得る。同様に、これらの新脈管
形成タンパク質を、標準技術を使用して、アフィニティークロマトグラフィーカ
ラムに結合させ得る。次いで、これらのカラムを使用して、新脈管形成抗体を精
製し得る。好ましい実施形態において、これらの抗体は、新脈管形成タンパク質
に固有のエピトープに対して生成され；すなわち、これらの抗体は、他のタンパ
ク質に対して、ほとんどまたは全く交差反応性を示さない。これらの抗体は、多
くの適用における用途を見い出す。例えば、これらの新脈管形成抗体は、標準的
なアフィニティークロマトグラフィーカラムに結合され得、そして新脈管形成タ
ンパク質を精製するために使用され得る。これらの抗体はまた、上記に概略した
ように、ブロッキングポリペプチドとして使用され得る。なぜなら、これらは、
新脈管形成タンパク質に対して特異的に結合するからである。
【０２３２】 １つの実施形態において、新脈管形成タンパク質およびそのモジュレーターの
治療有効量が、患者に投与される。本明細書中で「治療的有効用量」とは、投与
された場合に効果を生じる用量を意味する。正確な用量は、処置の目的に依存し
、公知の技術を使用して当業者によって確認され得る。当該分野で公知のように
、新脈管形成の低下の調整、全身送達 対 局所的送達、および新規プロテアー
ゼの合成、ならびに年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、薬
物相互作用および症状の重篤度が必要とされ得、そして当業者によって慣用的な
実験を用いて確認される。
【０２３３】 本発明の目的についての「患者」には、ヒトおよび他の動物（特に、哺乳動物
）の両方、ならびに生物が含まれる。従って、これらの方法は、ヒト治療および
獣医学適用の両方に適用可能である。好ましい実施形態において、患者は、哺乳
動物であり、そして最も好ましい実施形態において、患者は、ヒトである。
【０２３４】 本発明の新脈管形成タンパク質およびそのモジュレーターの投与は、上記で議
論したような種々の様式（経口、皮下、静脈内、鼻内、経皮、腹腔内、筋内、肺
内、膣内、直腸内または眼内を含むが、これらに限定されない）でなされ得る。
いくつかの例において、例えば、創傷および炎症の処置において、これらの新脈
管形成タンパク質およびモジュレーターは、溶液またはスプレーとして直接的に
適用され得る。
【０２３５】 本発明の薬学的組成物は、患者への投与に適切な形態で新脈管形成タンパク質
を含有する。好ましい実施形態において、これらの薬学的組成物は、水溶性形態
（例えば、薬学的に受容可能な塩として存在する）にあり、これは、酸付加塩お
よび塩基付加塩の両方を含むことを意味する。「薬学的に受容可能な酸付加塩」
とは、遊離塩基の生物学的有効性を保持し、そして無機酸および有機酸とは、生
物学的に形成されないか、さもなければ、望ましくない酸付加塩をいう。無機酸
は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などであり、有機酸は、例
えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸
、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マ
ンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サ
リチル酸などである。「薬学的に受容可能な塩基付加塩」としては、無機塩基由
来の塩基付加塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウ
ム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、アル
ミニウム塩など）が含まれる。アンモニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カ
ルシウム塩およびマグネシウム塩が特に好ましい。薬学的に受容可能な有機非毒
性塩基由来の塩としては、１級アミン、２級アミンおよび３級アミン、置換アミ
ン（天然に存在する置換アミンを含む）、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹
脂（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジメチルアミン、トリエ
チルアミン、トリプロピルアミンおよびエタノールアミン）の塩が挙げられる。
【０２３６】 薬学的組成物はまた、以下の１以上を含み得る：キャリアタンパク質（例えば
、血清アルブミン）；緩衝液；充填剤（微結晶セルロース、ラクトース、トウモ
ロコシデンプンおよび他のデンプン）；結合剤；甘味剤および他の矯味矯臭剤；
着色剤；およびエチレングリコール。添加剤は、当該分野で周知であり、そして
種々の処方物において使用される。
【０２３７】 好ましい実施形態において、新脈管形成タンパク質およびモジュレーターは、
治療剤として投与され、そして上記に概略されるように処方され得る。同様に新
脈管形成遺伝子（新脈管形成コード領域の全長配列、部分配列または調節配列を
含む）が、当該分野で公知のように、遺伝子治療適用において投与され得る。こ
れらの新脈管形成遺伝子は、当業者に理解されるように、遺伝子治療（すなわち
、ゲノム内への組み込み）またはアンチセンス組成物のいずれかとしての、アン
チセンス適用を含み得る。
【０２３８】 好ましい実施形態において、新脈管形成遺伝子は、単一の遺伝子または新脈管
形成遺伝子の組み合わせのいずれかで、ＤＮＡワクチンとして投与される。裸の
ＤＮＡワクチンは、当該分野で一般的に公知である。Ｂｒｏｗｅｒ、Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６：１３０４−１３０５（１９９８）。
【０２３９】 １つの実施形態において、本発明の新脈管形成遺伝子は、ＤＮＡワクチンとし
て使用される。ＤＮＡワクチンとしての遺伝子の使用方法は、当業者に周知であ
り、そして新脈管形成患者における発現のためのプロモーターの制御下に新脈管
形成遺伝子または新脈管形成遺伝子の一部を配置する工程を包含する。ＤＮＡワ
クチンに使用される新脈管形成遺伝子は、全長新脈管形成タンパク質をコードし
得るが、より好ましくは、この新脈管形成タンパク質由来のペプチドを含む新脈
管形成タンパク質の一部をコードする。好ましい実施形態において、患者は、新
脈管形成遺伝子由来の複数のヌクレオチド配列を含むＤＮＡワクチンで免疫され
る。同様に、本明細書中で定義されるような複数の新脈管形成遺伝子またはその
一部で患者を免疫することが可能である。理論に制限されることなく、このＤＮ
Ａワクチンによってコードされるポリペプチドの発現により、新脈管形成タンパ
ク質を発現する細胞を認識しそして破壊または排除する、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘ
ルパーＴ細胞および抗体が誘導される。
【０２４０】 好ましい実施形態において、これらのＤＮＡワクチンは、ＤＮＡワクチンと共
に、アジュバント分子をコードする遺伝子を含む。このようなアジュバント分子
としては、このＤＮＡワクチンによってコードされる新脈管形成ポリペプチドに
対する免疫学的応答を増加するサイトカインが挙げられる。さらなるアジュバン
トまたは代替的アジュバントは、当業者に公知であり、そして本発明における用
途を見い出す。
【０２４１】 別の好ましい実施形態において、新脈管形成遺伝子は、新脈管形成の動物モデ
ルの作製における用途を見い出す。当業者に理解されるように、この同定された
新脈管形成遺伝子が新脈管形成組織において抑制または減少されている場合、ア
ンチセンスＲＮＡがこの新脈管形成遺伝子に指向される遺伝子治療技術もまた、
この遺伝子の発現を減少または抑制する。このように生成された動物は、生体活
性な薬物候補のスクリーニングにおける用途を見い出す、新脈管形成の動物モデ
ルとして作用する。同様に遺伝子ノックアウト技術（例えば、適切な遺伝子ター
ゲッティングベクターでの相同組換えの結果としての）は、新脈管形成タンパク
質の不在を生じる。所望の場合、新脈管形成タンパク質の組織特異的発現または
ノックアウトが必要とされ得る。
【０２４２】 この新脈管形成タンパク質が、新脈管形成において過剰発現されることもまた
可能である。それ自体で、この新脈管形成タンパク質を過剰発現する、トランス
ジェニック動物が作製され得る。所望の発現レベルに依存して、種々の強度のプ
ロモーターが、この導入遺伝子を発現するために使用され得る。また、組み込ま
れた導入遺伝子のコピー数が決定され、そしてこの導入遺伝子の発現レベルの決
定のために比較される。このような方法によって作製された動物は、新脈管形成
の動物モデルとしての用途を見い出し、そして新脈管形成を処置するための生体
活性な分子についてのスクリーニングにおいてさらに有用である。
【０２４３】 上記の例は、本発明の真の範囲を決して限定するようには作用せず、むしろ例
示的目的で提供されるということが理解される。本明細書中で引用される全ての
参考文献および登録番号の配列は、その全体が参考として援用される。
【０２４４】 （実施例） （実施例１ 組織調製、標識チップおよびフィンガープリント） （ＴＲＩｚｏｌ試薬を使用して組織から総ＲＮＡを精製する） 組織重量を推測する。Ｐｏｌｙｔｒｏｎ ３１００ホモジナイザーを使用して
、５０ｍｇの組織あたり１ｍｌのＴＲＩｚｏｌにおいて組織サンプルをホモジェ
ナイズする。使用する発生器／プローブは、組織サイズに依存する。ホモジェナ
イズする組織量に対して大きすぎる発生器は、サンプルの損失を生じ、ＲＮＡ収
率を低下する。０．６ｇより大きい重量の組織については２０ｍｍ発生器を使用
する。実験容量が２ｍｌより大きい場合、次いで、１５ｍｌポリプロピレンチュ
ーブ（Ｆａｌｃｏｎ ２０５９）中で組織をホモジェナイズする。１０ｍｌより
も多くチューブを満たさない。
【０２４５】 （ホモジェナイゼーション） 発生器を使用する前に、最後の使用後に、発生器にセッケンＨ２０を流し、激
しくリンスすることによって洗浄されるべきである。ＥｔＯＨを流して滅菌する
。準備完了時まで組織を凍結させておく。凍結組織に直接ＴＲＩｚｏｌを添加し
、ホモジェナイズする。
【０２４６】 ホモジェナイゼーション後、４℃で、７５００×ｇ、１５分間（Ｓｏｒｖａｌ
ｌスーパースピードにおいて）または１２，０００×ｇ、１０分間（Ｅｐｐｅｎ
ｄｏｒｆ遠心分離機において）での遠心分離によって、ホモジネートから不溶性
物質を除去する。清澄したホモジネートを新しいチューブに移す。ここで、これ
らのサンプルは、−６０℃〜−７０℃で凍結され得る（そして、少なくとも１ヶ
月間維持され得る）か、または引き続いて精製し得る。
【０２４７】 （相分離） このホモジネートしたサンプルを、５分間、室温でインキュベートする。元の
ホモジェナイゼーションにおいて使用した１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬あたり０．
２ｍｌのクロロホルムを添加する。チューブを堅くキャップし、そしてチューブ
を１５秒間、手で（ボルテックスしないこと）激しく攪拌する。サンプルを室温
で、２〜３分間インキュベートする。４℃で３０分間、Ｓｏｒｖａｌｌスーパー
スピード中、６５００ｒｐｍで、サンプルを遠心分離する（１２，０００×ｇま
でで１０分間スピンしてもよいが、遠心分離機中でチューブが破壊する危険性が
ある）。
【０２４８】 （ＲＮＡ沈殿） 水相を新しいチューブに移す。ＤＮＡまたはタンパク質の分離が所望される場
合、有機相を保存する。元のホモジェナイゼーションにおいて使用した１ｍｌの
ＴＲＩｚｏｌ試薬あたり０．５ｍｌのイソプロピルアルコールを添加する。チュ
ーブを堅くキャップし、そして反転させて混合する。サンプルを、１０分間室温
でインキュベートする。４℃で２０分間、Ｓｏｒｖａｌｌ中、６５００ｒｐｍで
、サンプルを遠心分離する。
【０２４９】 （ＲＮＡの洗浄） 上清を除去する。冷７５％エタノールでペレットを洗浄する。最初のホモジェ
ナイゼーションに使用した１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬あたり１ｍｌの７５％エタ
ノールを使用する。チューブを堅くキャップし、そして数回反転させてペレット
を緩める（ボルテックスしないこと）。４℃で５分間、＜８０００ｒｐｍ（＜７
５００×ｇ）で遠心分離する。洗浄液を除去する。ペレットを注意深くエッペン
ドルフチューブに移す（チューブにすべり落ちたペレットを、新しいチューブに
移す。必要な場合、ピペットチップを使用してペレットの先導を補助する）。実
験する容量に依存して、ＲＮＡを沈殿させるためにどのサイズのチューブが望ま
しいかを決定し得る。本発明者らが、大きい１５ｍｌチューブ中でＲＮＡを残留
させることを試みた場合、乾燥するために非常に長い時間がかかり（すなわち、
ＲＮＡは乾燥されなかった）、最終的には、より小さいチューブにＲＮＡを移さ
なければならなかった。フード中でペレットを乾燥させる。適切な容量のＤＥＰ
Ｃ Ｈ2ＯにＲＮＡを再懸濁する。２〜５μｇ／μｌが得られる。吸光度を読み
取る。
【０２５０】 （総ＲＮＡからポリＡ＋ｍＲＮＡを精製するか、またはＱｉａｇｅｎのＲＮｅ
ａｓｙキットで総ＲＮＡを洗浄する） 総ＲＮＡからのポリＡ+ｍＲＮＡの精製。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ懸濁液を３７℃に
加温し、そしてＲＮＡへの添加直前に混合する。Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ
（溶出緩衝液）を７０℃でインキュベートする。２×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆ
ｅｒ（２×結合緩衝液）に沈殿物が存在する場合には、これを６５℃に温める。
Ｏｌｉｇｏｔｅｘ Ｈａｎｄｂｏｏｋの１６頁の表２に従って、総ＲＮＡを、Ｄ
ＥＰＣ処理した水、２×Ｂｉｎｄｉｎｇ ＢｕｆｆｅｒおよびＯｌｉｇｏｔｅｘ
と共に混合する。３分間、６５℃でインキュベートする。１０分間、室温でイン
キュベートする。
【０２５１】 １４，０００〜１８，０００ｇで、２分間、遠心分離する。遠心分離が「弱設
定（ｓｏｆｔ ｓｅｔｔｉｎｇ）」を有する場合には、これを使用する。Ｏｌｉ
ｇｏｔｅｘペレットを乱すことなく上清を除去する。少量の溶液を残し、Ｏｌｉ
ｇｏｔｅｘの損失を減少し得る。ポリＡ+ｍＲＮＡの満足な結合および溶出が生
じたことが確認されるまで、上清を保存しておく。
【０２５２】 Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ＯＷ２に穏やかに再懸濁し、そしてスピンカラム上
にペレット化する。このスピンカラムは、全速（可能ならば、弱設定）で１分間
遠心させる。
【０２５３】 スピンカラムを新しい収集チューブに移し、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ＯＷ２
中で穏やかに懸濁し、そして上記のように遠心分離する。
【０２５４】 スピンカラムを新しいチューブに移し、２０〜１００μｌの前加熱した（７０
℃）Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒで溶出する。上下にピペッティングしてＯｌ
ｉｇｏｔｅｘ樹脂を穏やかに再懸濁する。上記のように遠心分離する。新しい溶
出緩衝液で溶出を繰り返すか、または最初の溶出物を使用して溶出容量を低く維
持する。
【０２５５】 希釈したＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒをブランクとして使用して、吸光度を
読み取る。
【０２５６】 ｃＤＮＡ合成への進行前に、このｍＲＮＡを沈殿させる。残存するいくつかの
成分またはＯｌｉｇｏｔｅｘ精製手順からのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒは、
以降のｍＲＮＡの酵素反応を阻害する。
【０２５７】 （エタノール沈殿） ０．４容量の７．５Ｍ ＮＨ4ＯＡｃ＋２．５容量の冷１００％エタノールを
添加する。１時間〜一晩、−２０℃で（または２０〜３０分間、−７０℃で）沈
殿させる。４℃で３０分間、１４，０００〜１６，０００×ｇで遠心分離する。
ペレットを０．５ｍｌの８０％エタノール（−２０℃）で洗浄し、次いで、室温
で５分間、１４，０００〜１６，０００×ｇで遠心分離する。８０％エタノール
洗浄を繰り返す。フード中でペレットから最後の少量のエタノールを乾燥する（
スピード真空を使用しないこと）。ペレットをＤＥＰＣ Ｈ2Ｏ中、１μｇ／μ
ｌの濃度で懸濁する。
【０２５８】 （ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキットを使用して総ＲＮＡを洗浄する） １００μｇ以下をＲＮｅａｓｙカラムに添加する。サンプルを、ＲＮａｓｅフ
リーの水で１００μｌの容量に調整する。サンプルに３５０μｌのＢｕｆｆｅｒ
ＲＬＴを添加し、次いで２５０μｌのエタノール（１００％）を添加する。ピ
ペッティングによって混合し（遠心分離しないこと）、次いで、ＲＮｅａｓｙミ
ニスピンカラムにサンプルをアプライする。＞１０，０００ｒｐｍで１５秒間遠
心分離する。収率が心配な場合、フロースルーをカラムに再度アプライし、そし
て再度遠心分離する。カラムを新しい２ｍｌの収集チューブに移す。５００μｌ
のＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥを添加し、そして＞１０，０００ｒｐｍで１５秒間遠心
分離する。フロースルーを廃棄する。５００μｌのＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥを添加
し、そして＞１０，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離する。フロースルーを廃棄
し、次いで、最大速度で２分間遠心分離し、カラム膜を乾燥する。カラムを新し
い１．５ｍｌの収集チューブに移し、そしてカラム膜上に直接、３０〜５０μｌ
のＲＮａｓｅフリーの水をアプライする。＞１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分
離する。溶出を繰り返す。吸光度を読み取る。必要な場合、酢酸アンモニウムお
よび２．５×容量の１００％エタノールと共にエタノール沈殿する。
【０２５９】 （Ｇｉｂｃｏの「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆ
ｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」キットを使用してｃＤＮＡを作製する） （第１鎖ｃＤＮＡの合成） ５μｇの総ＲＮＡまたは１μｇのポリＡ＋ｍＲＮＡを、開始材料として使用す
る。総ＲＮＡに対して、２μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴを使用する。ポ
リＡ＋ｍＲＮＡに対して、１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴを使用する。
第１鎖合成混合液の最終容量は、２０μｌである。ＲＮＡは、１０μｌ以下の容
量に存在しなければならない。１μｌの１００ｐｍｏｌ Ｔ７−Ｔ２４オリゴと
共に、７０℃で１０分間、ＲＮＡをインキュベートする。氷上で、７μｌの：、
４μｌの５×１st Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（第１鎖緩衝液）、２μｌの０
．１Ｍ ＤＴＴおよび１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰミックスを添加する。３７℃
で２分間インキュベートし、次いで、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴを添加し、
３７℃で１時間インキュベートする。
【０２６０】 （第２鎖合成） 第１鎖反応液を氷上に置く。 以下を添加する： ９１μｌ ＤＥＰＣ Ｈ２Ｏ ３０μｌ ５×２nd Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ ３μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰミックス １μｌ １０Ｕ／μｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ ４μｌ １０Ｕ／μｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ １μｌ ２Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｈ。 ２個より多いサンプルが存在する場合、上記を混合液にする。混合しそして１６
℃で２時間インキュベートする。２μｌ Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを添加する
。１６℃で５分間インキュベートする。１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加す
る。
【０２６１】 （ｃＤＮＡの洗浄） Ｐｈａｓｅ−Ｌｏｃｋゲルチューブを使用する、フェノール：クロロホルム：
イソアミルアルコール（２５：２４：１）精製： ＰＬＧチューブを、最大速度で３０秒間遠心分離する。ｃＤＮＡ混合液をＰＬ
Ｇチューブに移す。等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを
添加し、激しく振盪する（ボルテックスしないこと）。最大速度で５分間遠心分
離する。上方の水溶液を新しいチューブに移す。エタノール沈殿する：７．５×
５Ｍ ＮＨ4ＯＡｃ＋２．５容量の冷１００％エタノールを添加する。直ぐに、
最大速度で２０分間、室温で遠心分離する。上清を除去し、次いで、冷８０％エ
タノールで２回ペレットを洗浄する。出来るだけ多くのエタノール洗浄液を除去
し、ペレットを風乾させる。ペレットを３μｌのＲＮａｓｅフリーの水に再懸濁
する。
【０２６２】 （インビトロ転写（ＩＶＴ）およびビオチンでの標識） １．５μｌのｃＤＮＡを、薄壁ＰＣＲチューブ内にペレット化する。
【０２６３】 （ＮＴＰ標識混合液を作製する）： 以下を室温で合わせる： ２μｌ Ｔ７ １０×ＡＴＰ（７５ｍＭ）（Ａｍｂｉｏｎ） ２μｌ Ｔ７ １０×ＧＴＰ（７５ｍＭ）（Ａｍｂｉｏｎ） １．５μｌ Ｔ７ １０×ＣＴＰ（７５ｍＭ）（Ａｍｂｉｏｎ） １．５μｌ Ｔ７ １０×ＵＴＰ（７５ｍＭ）（Ａｍｂｉｏｎ） ３．７５μｌ １０ｍＭ Ｂｉｏ−１１−ＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ− Ｍａｎｎｈｅｉｍ／ＲｏｃｈまたはＥｎｚｏ） ３．７５μｌ １０ｍＭ Ｂｉｏ−１６−ＣＴＰ（Ｅｎｚｏ） ２μｌ １０×Ｔ７転写緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ） ２μｌ １０×Ｔ７酵素混合液（Ａｍｂｉｏｎ）。 全反応液の最終容量は、２０μｌである。ＰＣＲ機において３７℃で６時間イン
キュベートする。
【０２６４】 （ＩＶＴ産物のＲＮｅａｓｙ洗浄） ＲＮｅａｓｙカラムについての先の説明に従うか、またはＱｉａｇｅｎのＲＮ
ｅａｓｙプロトコルハンドブックを参照する。
【０２６５】 ｃＲＮＡは、おそらくエタノール沈殿される必要を有する。フラグメント化工
程に適合する容量に再懸濁する。
【０２６６】 （フラグメント化） 通常、１５μｇの標識ＲＮＡをフラグメント化する。フラグメント化反応液容
量をなるべく最小化する；１０μｌ容量が推奨されるが２０μｌで差し控えない
。２０μｌよりも高くしてはいけない。なぜなら、フラグメント化緩衝液中のマ
グネシウムは、ハイブリダイゼーション緩衝液中での沈殿に寄与するからである
。１×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ（フラグメント化）緩衝液中で、９４℃で３
５分間インキュベートすることによって、ＲＮＡをフラグメント化する。
【０２６７】 （５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ緩衝液） ２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−アセテート、ｐＨ８．１ ５００ｍＭ ＫＯＡｃ １５０ｍＭ ＭｇＯＡｃ 標識ＲＮＡ転写物は、フラグメント化の前後で分析され得る。サンプルを、１
５分間６５℃に加熱しそして１％アガロース／ＴＢＥゲル上で電気泳動し、転写
物サイズの範囲のおよその見解を得る。
【０２６８】 （ハイブリダイゼーション） ２００μｌ（１０μｇ ｃＲＮＡ）のハイブリダイゼーション混合液を、チッ
プ上に置く。複数のハイブリダイゼーションがなされる場合（例えば、５つのチ
ップセットによるサイクリング）、次いで、３００μｌ以上の開始ハイブリダイ
ゼーション混合液を作製することが推奨される。
【０２６９】 ハイブリダイゼーション混合液： フラグメント標識ＲＮＡ（５０ｎｇ／μｌ 最終濃度） ５０ｐＭ ９４８−ｂコントロールオリゴ １．５ｐＭ ＢｉｏＢ ５ｐＭ ＢｉｏＣ ２５ｐＭ ＢｉｏＤ １００ｐＭ ＣＲＥ ０．１ｍｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ ０．５ｍｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ １×ＭＥＳハイブリダイゼーション緩衝液で３００μｌにする。
【０２７０】 本明細書中で使用する生成物についての説明マニュアルは、それら全体が本明
細書中で援用される。
【０２７１】 （本明細書中に提供される標識化プロトコル） （ハイブリダイゼーション反応）： 非ビオチン化ＩＶＴ（ＲＮｅａｓｙカラムで精製した）で開始する。 （組織からＩＶＴへの工程については、実施例１を参照のこと） ＩＶＴアンチセンスＲＮＡ；４μｇ： μｌ ランダムヘキサマー（１μｇ／μｌ）： ４μｌ Ｈ2Ｏ： μｌ １４μｌ ７０℃で１０分間インキュベートする。氷上に置く。
【０２７２】 （逆転写）： ５×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ（ＢＲＬ）緩衝液： ６μｌ ０．１Ｍ ＤＴＴ： ３μｌ ５０×ｄＮＴＰミックス： ０．６μｌ Ｈ2Ｏ： ２．４μｌ Ｃｙ３またはＣｙ５ ｄＵＴＰ（１ｍＭ）： ３μｌ ＳＳ ＲＴ ＩＩ（ＢＲＬ）： １μｌ １６μｌ ハイブリダイゼーション反応液に添加する。 ４２℃で３０分間インキュベートする。 １μｌのＳＳＩＩを添加し、さらに１時間進行させる。 氷上に置く。 ５０×ｄＮＴＰミックス（２５ｍＭの冷ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、１
０ｍＭのｄＴＴＰ：各２５μｌの１００ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴ
Ｐ；１０μｌの１００ｍＭ ｄＴＴＰ（Ｈ2Ｏで１５μｌにする）。ｄＮＴＰは
Ｐｈａｒｍａｃｉａ製である））。
【０２７３】 （ＲＮＡ分解）： ８６μｌ Ｈ２Ｏ
１．５μｌ １Ｍ ＮａＯＨ／２ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、６５℃で１０分間イ
ンキュベートする。
【０２７４】 １０μｌ １０Ｎ ＮａＯＨ ４μｌ ５０ｍＭ ＥＤＴＡ
Ｕ−Ｃｏｎ ３０ ７０００ｇで１０分間、５００μｌ ＴＥ／サンプルをスピンし、フロースルー
を精製のために保存する。
【０２７５】 （Ｑｉａｇｅｎ精製）： ５００μｌの緩衝液ＰＢ中にｕ−ｃｏｎで回収した材料を懸濁する。 ｗ／ノーマルＱｉａｇｅｎプロトコルを進行する。
【０２７６】 （ＤＮＡｓｅ消化）： １μｌの１／１００希釈 ＤＮＡｓｅ／３０μｌのＲｘを添加し、３７℃で１５
分間インキュベートする。
【０２７７】 ９５℃、５分間、酵素を変性させる。
【０２７８】 （サンプル調製）： 以下を添加する： Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ： １０μｌ ５０×ｄＮＴＰ： １μｌ ２０×ＳＳＣ： ２．３μｌ ピロリン酸Ｎａ： ７．５μｌ １０ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ １／１０希釈： １μｌ ２１．８μｌの最終容量 スピード真空機中で乾燥する １５μｌ Ｈ2Ｏ中に再懸濁する ０．３８μｌ １０％ ＳＤＳを添加する ９５℃で２分間加熱する 室温で２０分間ゆっくりと冷却する。 スライド上に置き、そして６４℃で一晩ハイブリダイズさせる。
【０２７９】 （ハイブリダイゼーション後の洗浄）： ３×ＳＳＣ／０．０３％ ＳＤＳ： ２分 （２５０ｍｌのＨ2Ｏ中、３７．５
ｍｌの２０×ＳＳＣ＋０．７５ｍｌの１０％ ＳＤＳ） １×ＳＳＣ： ５分 （２５０ｍｌのＨ2Ｏ中、１２．５ｍｌの２０×ＳＳＣ）
０．２×ＳＳＣ： ５分 （２５０ｍｌのＨ2Ｏ中、２．５ｍｌの２０×ＳＳＣ
） １０００ＲＰＭ、１分間の遠心分離でスライドを乾燥させる。 適切なＰＭＴおよびチャネルで走査する。
【０２８０】 これらの結果を、表および図に示す。遺伝子のリストは、インビトロ新脈管形
成モデルにおいて培養された細胞由来である。示されるように、登録番号のいく
つかは、発現配列タグ（ＥＳＴ）を含む。従って、本明細書中の１つの実施形態
において、発現プロフィール内の遺伝子（発現プロフィール遺伝子とも名付けた
）は、ＥＳＴを含み、必ずしも全長ではない。
【０２８１】
【表１】
【０２８２】
【表２】
【０２８３】
【表３】
【０２８４】
【表４】
【０２８５】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、図１に示す配列の発現レベルのグラフである。発現プロフィールを、
４つの群に集団化する。Ｃ１（青色）、Ｃ２（赤色）、Ｃ３（緑色）、およびＣ
４（濃黄色）。
【図２】 図２は、新脈管形成タンパク質ＡＡＡ４をコードする配列を含む、核酸（ｍＲ
ＮＡ）の実施形態を示す。開始コドンおよび終止コドンに、下線が引かれている
。
【図３】 図３は、ＡＡＡ４をコードする核酸配列のオープンリーディングフレームを示
す。開始コドンおよび終止コドンに、下線が引かれている。
【図４】 図４は、ＡＡＡ４のアミノ酸配列の実施形態を示す。シグナルペプチドに二重
下線が引かれており、そして膜貫通配列に下線が引かれている。本明細書中の１
つの実施形態においては、ＡＡＡ４は、可溶性である。従って、シグナルペプチ
ドは省略され得、そして膜貫通ドメインは欠失され得るか、不活化され得るか、
または短縮され得る。
【図５】 図５は、ペプチドＡＡＡ４ｐ１およびＡＡＡ４ｐ２を示す。
【図６】 図６は、経時的な新脈管形成モデル、および他の非脈管形成組織における、Ａ
ＡＡ４の発現を示す。
【図７】 図７は、新脈管形成タンパク質ＡＡＡ１をコードする核酸配列の実施形態を示
す。推定終止コドンに、下線が引かれている。
【図８】 図８は、ＡＡＡ１についてのアミノ酸配列の実施形態を示す。膜貫通ドメイン
に下線が引かれている。１つの実施形態においては、ＡＡＡ１は可溶性である。
好ましい実施形態においては、膜貫通ドメインが欠失または不活化されるか、あ
るいはＡＡＡ１が短縮されて膜貫通ドメインを欠失している。
【図９】 図９は、ＡＡＡ１ｐ１およびＡＡＡ１ｐ２を示す。
【図１０】 図１０は、種々の組織における異なる時点でのＡＡＡ１の相対的発現を示すグ
ラフを示す。「Ｅｘｐ３」とは、内皮細胞を使用しての経時的な管形成を示す、
新脈管形成モデルである。
【図１１】 図１１は、新脈管形成タンパク質Ｅｄｇ−１をコードする配列を含む、核酸ｍ
ＲＮＡの実施形態を示す。開始コドンおよび終止コドンに、下線が引かれている
。
【図１２】 図１２は、Ｅｄｇ−１をコードするオープンリーディングフレームを示し、こ
こで、開始コドンおよび終止コドンに、下線が引かれている。
【図１３】 図１３は、新脈管形成タンパク質Ｅｄｇ−１についてのアミノ酸配列の実施形
態を示し、ここで、膜貫通ドメインに下線が引かれている。本明細書中の好まし
い実施形態においては、Ｅｄｇ−１の可溶性形態が提供される。１つの実施形態
においては、膜貫通ドメインが欠失され、不活化され、そして／あるいはこのタ
ンパク質は、このドメイン（残りの可溶性領域の再連結ありまたはなし）を除外
するように短縮される。
【図１４】 図１４は、本明細書中に提供される４つのペプチド配列およびそのそれぞれの
溶解度を示す。
【図１５】 図１５は、種々の組織にわたるＥｄｇ−１の発現を示す。
【図１６】 図１６は、新脈管形成についてのモデル（Ｅｘｐｔ１、Ｅｘｐｔ３、Ｅｘｐｔ
３）への、Ｅｄｇ−１の導入の時間経過を示し、ここで、低い継代のヒト内皮細
胞が、培養中の数日間にわたって、管構造体に形成される。時間フレームにおい
て生じたＥｄｇ−１の再現性のある誘導は、その管形成プロセスにおける役割に
一致する。
【図１７】 図１７は、組織再造形タンパク質α５β１インテグリン（時々ＶＬＡ−５と呼
ばれる）についてのコード配列を含む、核酸配列の実施形態を示し、ここで、開
始コドンおよび終止コドンに、下線が引かれている。
【図１８】 図１８は、組織再造形タンパク質α５β１インテグリンのアミノ酸配列の実施
形態を示し、ここで、膜貫通ドメインに下線が引かれている。
【図１９】 図１９は、管形成の時間経過にわたる、α５β１インテグリンの５つの発現プ
ロフィールの結果を示す棒グラフを示す。特に、管モデル１、２および３は、単
一の単離されたヒト内皮細胞由来の管構造体を形成するモデルを示す；「ＥＣ／
ＰＭＡ」モデルは、アメリカヤマゴボウマイトジェン抗原で刺激された内皮細胞
を示し、そして身体環椎プロフィールは、種々の正常な細胞型および組織におけ
る発現を示す。
【図２０】 図２０Ａおよび２０Ｂは、管形成の新脈管形成の結果を示し、ここで、図２０
Ａは、アイソタイプコントロールであり、そして図２０Ｂは、４８時間後の特異
的抗体拮抗作用を示す。
【図２１】 図２１は、新脈管形成タンパク質であるエンドムチンの配列に対するコード配
列を含む、核酸配列の実施形態を示し、ここで、開始コドンおよび終止コドンに
、枠が付いている。
【図２２】 図２２は、新脈管形成タンパク質であるエンドムチンのアミノ酸配列の実施形
態を示し、ここで、シグナル配列は太字になっており、そして膜貫通ドメインに
は下線が引かれている。
【図２３】 図２３は、新脈管形成タンパク質であるマトリックスメタロプロテイナーゼ１
０（ストロメライシン２（ｓｔｒｏｍｏｌｙｓｉｎ ２）とも呼ばれる）につい
てのコード配列を含む、核酸配列の実施形態を示し、ここで、開始コドンおよび
終止コドンに、枠が付いている。
【図２４】 図２４は、種々の組織にわたるマトリックスメタロプロテイナーゼ１０の発現
を示す。
【図２５】 図２５は、種々の組織にわたるマトリックスメタロプロテイナーゼ１０の発現
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８４ 45/00 Ａ６１Ｐ 9/00 ４Ｃ０８５ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 9/00 16/18 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｍ 1/00 Ａ 16/18 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｍ 1/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｍ 33/50 37/00 １０２ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｆ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 BB10 BB14 BB46 BB48 BB50 BB51 CB01 DA13 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA09 CA12 HA11 HA14 HA17 4B029 AA07 FA12 4B063 QA01 QA13 QA19 QQ08 QQ43 QR32 QR55 QR62 QR77 QR84 QS25 QS34 4B064 AG27 CA19 DA01 DA13 4C084 AA13 AA17 NA14 ZA361 ZA441 ZA511 ZA891 ZB111 ZB211 ZB261 ZC411 4C085 AA03 AA13 AA14 BB17 CC03 DD62 EE01 4C086 AA01 AA02 EA16 NA14 ZA36 ZA44 ZA51 ZA89 ZB11 ZB21 ZB26 ZC41 4H045 AA10 AA11 AA20 CA40 DA76 EA20 EA50 FA74

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 薬物候補をスクリーニングする方法であって、以下： ａ）表１、表２、表３、表４および表５の核酸またはそのフラグメントからな
    る群より選択されるタンパク質をコードする発現プロフィール遺伝子を発現する
    細胞を提供する工程； ｂ）薬物候補を該細胞に添加する工程；ならびに ｃ）該発現プロフィール遺伝子の発現に対する該薬物候補の効果を決定する工
    程、 を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記決定する工程が、前記薬物候補の非存在下での発現のレ
    ベルと、該薬物候補の存在下での発現のレベルとを比較することを包含し、ここ
    で、該薬物候補が存在する場合には、該薬物候補の濃度が変化し得、そしてここ
    で、該比較が、該薬物候補の添加または除去の後に起こり得る、請求項１に記載
    の方法。
  3. 【請求項３】 前記プロフィール遺伝子の発現が、前記薬物候補の導入の結
    果として減少する、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 新脈管形成調節因子タンパク質（ＡＭＰ）に結合し得る生物
    活性薬剤についてのスクリーニングの方法であって、ここで、該ＡＭＰが、表１
    、表２、表３、表４および表５の核酸またはそのフラグメントからなる群より選
    択される核酸によってコードされ、該方法が、該ＡＭＰと候補生物活性薬剤とを
    合わせる工程、および該ＡＭＰに対する該候補薬剤の結合を決定する工程を包含
    する、方法。
  5. 【請求項５】 新脈管形成調節因子タンパク質（ＡＭＰ）の活性を調節し得
    る生物活性薬剤についてスクリーニングするための方法であって、ここで、該Ａ
    ＭＰが、表１、表２、表３、表４および表５の核酸またはそのフラグメントから
    なる群より選択される核酸によってコードされ、該方法が、以下： ａ）該ＡＭＰと候補生物活性薬剤とを合わせる工程；および ｂ）該ＡＭＰの生物活性に対する該候補薬剤の効果を決定する工程、 を包含する、方法。
  6. 【請求項６】 候補新脈管形成薬物の効果を評価する方法であって、以下： ａ）該薬物を患者に投与する工程； ｂ）該患者から細胞サンプルを取り出す工程；および ｃ）該細胞の発現プロフィールを決定する工程、 を包含する、方法。
  7. 【請求項７】 前記発現プロフィールと、健全な個体の発現プロフィールと
    を比較する工程をさらに包含する、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 新脈管形成を診断する方法であって、以下： ａ）表１、表２、表３、表４および表５の核酸またはそのフラグメントからな
    る群より選択される１つ以上の遺伝子の、第一の個体の第一の組織型における発
    現を決定する工程；ならびに ｂ）該第一の個体または第二の罹患していない個体に由来の第二の正常組織型
    からの、該遺伝子の発現を比較する工程であって、ここで、該発現の差異が、該
    第一の個体が新脈管形成を起こしている組織を有することを示す、工程、 を包含する、方法。
  9. 【請求項９】 表１、表２、表３、表４および表５に記載の配列からなる群
    より選択される核酸セグメントを含む、バイオチップであって、ここで、該バイ
    オチップが、１０００より少ない核酸プローブを含む、バイオチップ。
  10. 【請求項１０】 少なくとも２つの核酸セグメントを含む、請求項９に記載
    のバイオチップ。
  11. 【請求項１１】 新脈管形成調節因子タンパク質（ＡＭＰ）またはそのフラ
    グメントと、該ＡＭＰまたはそのフラグメントに結合する抗体との結合を、妨害
    し得る生物活性薬剤について、スクリーニングするための方法であって、該方法
    が、以下： ａ）ＡＭＰまたはそのフラグメント、候補生物活性薬剤、および該ＡＭＰまた
    はそのフラグメントに結合する抗体を、合わせる工程；ならびに ｂ）該ＡＭＰまたはそのフラグメントと、該抗体との結合を、決定する工程、
    を包含する、方法。
  12. 【請求項１２】 新脈管形成調節因子タンパク質（ＡＭＰ）の活性を阻害す
    るための方法であって、ここで、該ＡＭＰが、表１、表２、表３、表４および表
    ５の核酸またはそのフラグメントからなる群より選択される核酸によってコード
    されており、該方法が、該ＡＭＰにインヒビターを結合させる工程を包含する、
    方法。
  13. 【請求項１３】 前記インヒビターが抗体である、請求項１２に記載の方法
    。
  14. 【請求項１４】 新脈管形成に関連する障害を処置する方法であって、新脈
    管形成調節因子タンパク質（ＡＭＰ）のインヒビターを患者に投与する工程を包
    含し、ここで、該ＡＭＰが、表１、表２、表３、表４および表５の核酸またはそ
    のフラグメントからなる群より選択される核酸によってコードされている、方法
    。
  15. 【請求項１５】 前記インヒビターが抗体である、請求項１４に記載の方法
    。
  16. 【請求項１６】 ＡＭＰまたはそのフラグメントの効果を中和する方法であ
    って、該タンパク質に対して特異的な薬剤と、該タンパク質とを、中和を生じさ
    せるに十分な量で接触させる工程を包含する、方法。
  17. 【請求項１７】 治療部分を脈管形成組織に局在化するための方法であって
    、該組織を、該治療部分が結合体化したＡＭＰまたはそのフラグメントに対する
    抗体に曝露する工程を包含する、方法。
  18. 【請求項１８】 前記治療部分が細胞傷害性因子である、請求項１７に記載
    の方法。
  19. 【請求項１９】 前記治療部分が放射性同位体である、請求項１７に記載の
    方法。
  20. 【請求項２０】 細胞において新脈管形成を阻害するための方法であって、
    ここで、該方法が、表１、表２、表３、表４または表５の核酸に対するアンチセ
    ンス分子を含有する組成物を、細胞に投与する工程を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 表１、表２、表３、表４もしくは表５の核酸またはそのフ
    ラグメントによってコードされるタンパク質に特異的に結合する、抗体。
  22. 【請求項２２】 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２１に記載
    の抗体。
  23. 【請求項２３】 前記抗体がヒト化抗体である、請求項２１に記載の抗体。
  24. 【請求項２４】 前記抗体が抗体フラグメントである、請求項２１に記載の
    抗体。
  25. 【請求項２５】 表１、表２、表３、表４もしくは表５の核酸またはその相
    補体の配列に対して、少なくとも９５％相同である配列を有する、核酸。
  26. 【請求項２６】 表１、表２、表３、表４もしくは表５の核酸またはその相
    補体と、高ストリンジェンシー下でハイブリダイズする、核酸。
  27. 【請求項２７】 請求項２５または２６に記載の核酸によってコードされる
    、ポリペプチド。
  28. 【請求項２８】 個体において免疫応答を惹起する方法であって、該方法が
    、請求項２７に記載のポリペプチドまたはそのフラグメントを含有する組成物を
    該個体に投与する工程を包含する、方法。
  29. 【請求項２９】 個体において免疫応答を惹起する方法であって、該方法が
    、表１、表２、表３、表４もしくは表５の核酸またはそのフラグメントの配列を
    含む核酸を含有する組成物を、該個体に投与する工程を包含する、方法。
  30. 【請求項３０】 新脈管形成に関連する障害を有する個体の予後を決定する
    ための方法であって、サンプル中のＡＭＰのレベルを決定する工程を包含し、こ
    こで、高いレベルのＡＭＰが、乏しい予後を示す、方法。
  31. 【請求項３１】 新脈管形成に関連する障害を処置する方法であって、新脈
    管形成に関連する障害を有する個体に、治療部分が結合体化したＡＭＰに対する
    抗体またはそのフラグメントを投与する工程を包含する、方法。
  32. 【請求項３２】 前記治療部分が細胞傷害性因子である、請求項３１に記載
    の方法。
  33. 【請求項３３】 前記治療部分が放射性同位体である、請求項３１に記載の
    方法。
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