CN101007847A - 一种人角质细胞生长因子－2突变体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人KGF－2突变体，其突变体的氨基酸序列为序列表中序列2所示，基因序列为序列表中序列1所示。本发明也提供了包含突变体基因的表达载体及工程菌。本发明还提供了人KGF－2突变体的制备方法。制备步骤包括(1)在适合的表达条件下，培养大肠杆菌工程菌，且在表达载体的多克隆位点插入了基因序列，从而表达出人KGF－2突变体；(2)柱层析分离纯化出步骤(1)中表达的人角质细胞生长因子－2突变体。

Description

一种人角质细胞生长因子-2突变体及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种人角质细胞生长因子-2突变体及其制备方法。

背景技术

角质细胞生长因子-2(Keratinocyte growth factor-2，KGF-2)是一种碱性蛋白，由208个氨基酸残基组成，对酸和热不稳定。KGF-2因能特异刺激上皮细胞生长而得名，因为是成纤维细胞生长因子家族成员，所以又称为FGF-10。Emoto等克隆到人的KGF-2的cDNA，其编码的蛋白N端的37个氨基酸残基构成疏水信号肽，成熟肽含有171个氨基酸残基(38-208aa)，理论分子量为19.3kDa，对肝素有较强的亲和力(J Burn Care Rehabil 2000Jan-Feb；21(1Pt1)；5-9)。

下面是人KGF-2的一级结构，方框包围的部分是其N端的信号肽。

QALGQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGR

HVRSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLA

MNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHF

LPMVVHS(Genebank.AX591551)

KGF-2通过与靶细胞表面的跨膜酪氨酸激酶受体KGF2R(FGFR2IIIb)结合发挥生物学作用。KGF2R特异地表达于上皮细胞表面，KGF-2及其同源蛋白KGF-1均以高亲和力与KGF2R结合。KGF-2的主要功能是促进表皮细胞的增生和发育，在创伤愈合方面有重要作用。此外，KGF-2还有一定的辐射防护作用。Han等(JPathol 1999 Aug；188(4)：431-8)通过动物实验证实，KGF-2静脉注射，显著降低小鼠急性和慢性肠损伤。因此，KGF-2是一种对伤口愈合非常有帮助的蛋白因子，具有很高的临床应用潜力。比如美国人类基因组研究公司的KGF-2新药Repifermin就被用于治疗慢性溃疡。David C等对该药的临床测试进行了报道(Human Genome Sciences.January 29，2002)，结果表明Repifermin能加速慢性静脉溃疡的愈合，并且没有毒副作用。

1.KGF-2促进表皮细胞增生和发育的功能

研究显示KGF-2刺激角质细胞合成的能力比转化生长因子(TGF)和上皮细胞生长因子(EGF)强2至10倍。缺失KGF-2基因的小鼠表皮发育出现异常，如基底细胞的生成数量减少等。

KGF-2可能在正常前列腺上皮细胞的生长过程中发挥重要作用，其可与前列腺上皮细胞表面的KGF2R受体结合并促进细胞的生长。用RT-PCR和Northern印迹法检测表明KGF-2在人前列腺组织、前列腺上皮细胞中表达。加入KGF-2可促进原代培养的前列腺上皮细胞生长。原代培养的良性前列腺肥大患者的前列腺上皮细胞不表达KGF-2 mRNA，向其中加入KGF-2后观察到明显的促有丝分裂作用。已有证据表明KGF-2可促进肺泡II型上皮细胞、胰管、胃肠道上皮细胞和肝细胞的增殖，此外KGF-2还能促进乳腺上皮细胞增殖。

2.KGF-2在伤口愈合中的作用

在David C等进行的临床研究中，研究人员将患者随机分为三组，第一组患者根据溃疡面积大小按照每平方厘米5微克的剂量服用repifermin(KGF-2)，第二组患者固定服用1.3微克的repifermin，而第三组患者则按传统治疗方法服用安慰剂。结果发现这三组成员中分别有55％、53％和36％的患者90％以上的溃疡最终愈合。

Jimenez等通过动物实验显示，小鼠皮肤受切割损伤后可引起KGF-2 mRNA上调表达，并可维持到伤后7天，与伤口愈合时间吻合。这表明KGF-2是促进伤口愈合的重要因素。此外，疤痕形成实验显示KGF-2不留明显疤痕。

3.KGF-2的辐射防护作用

KGF-2可提高辐射后小鼠肠千细胞的存活率，并能抵抗辐射引起的气道上皮细胞通透性增加。Knan等人应用离子微集落刺激法发现KGF-2能显著降低辐射引起的肠道损伤。Waters和Savla等人通过测定FITC-BSA外渗来分析培养的Calu-3和16HBE140单层细胞的通透性，结果发现在同等剂量的照射下，经KGF-2(50ng/ml)预处理的细胞对FITC-BSA的通透性明显下降，但KGF-2对未受辐射的单层细胞的通透性无影响。

4.KGF-2的应用

KGF-2能刺激上皮细胞再生、分化和迁移，有促进皮肤和胃肠道内膜伤口愈合的潜力。在伤口愈合模型中，KGF-2通过生成新皮肤使伤口在短时间内愈合，疤痕很少；在粘膜炎模型中，KGF-2减轻病情并加快愈合速度；在炎性肠道疾病模型中，KGF-2使受试对象胃肠道内膜几乎恢复了正常结构。

KGF-2还可用于治疗粘膜炎(David C.Human Genome Sciences.January19，2000)。粘膜炎常见于口腔和胃肠道，是放疗和化疗过程中相当严重的剂量依赖性毒性反应，症状为溃疡和红肿。严重时患者需要住院或延长住院治疗时间，以保证营养和控制疼痛。粘膜受破坏还可能引起严重的感染。

KGF-2还可用于治疗静脉溃疡。静脉溃疡源于慢性静脉供血不足，常造成踝部和小腿皮肤机能障碍。静脉曲张经常引发血液淤积、肿胀或水肿、以及鳞状皮肤病。当皮肤炎症发生时渐渐形成溃疡。目前的治疗方法主要是用清创术控制感染发展，治疗常连续数月且有失败的可能。美国人类基因组研究公司用KGF-2治疗慢性静脉溃疡的研究表明KGF-2有良好的疗效，且安全可靠，正常人体对其产生很好的耐受。

KGF-2是一种非常有潜力的用于伤口治疗的蛋白质分子，有上皮组织创伤处均可使用，如静脉溃疡、糖尿病溃疡、炎性肠道疾病及口腔和肠道黏膜炎。此外，KGF-2还可用于促进手术伤口愈合及减小癌症治疗的副作用。随着研究的不断深入，对KGF-2的生物学特性将有更深入的认识，并将在更广阔的医学领域找到其发挥作用的舞台。重组KGF-2点燃了摆脱慢性伤口困扰的希望。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种更能在大肠杆菌中高效表达且有活性的人角质细胞生长因子-2突变体。

本发明所述的人角质细胞生长因子-2突变体，其特征在于：突变体编码的蛋白质序列为：

MALGQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKI EKNGKVSGTKKEN

CPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNG

RQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS。

编码权利要求1的突变体的基因，其特征在于：突变体基因为化学合成，基因序列为：

5’ATG GCA CTG GGT CAG GAT ATG GTT AGT CCG GAA GCG ACC AAC AGC TCG

AGC AGT AGC TTC TCG AGC CCG AGT AGC GCA GGC CGC CAT GTG CGT TCG TAT AAT

CAC CTG CAG GGT GAT GTT CGC TGG CGT AAA CTG TTT AGC TTC ACG AAA TAC TTT

CTG AAA ATC GAA AAA AAC GGC AAA GTG AGT GGC ACC AAA AAA GAA AAT TGC CCG

TAT AGC ATT CTG GAA ATC ACG TCG GTT GAA ATT GGT GCG GTG GCA GTT AAA GCG

ATC AAC AGC AAT TAC TAT CTG GCA CGC AAC AAA AAA GGT AAA CTG TAC GGC AGT

AAA GAA TTC AAT AAC GAT TGC AAA CTG AAA GAA CGT ATT GAA GAA AAT GGT TAT

AAC ACC TAC GCG AGC TTT AAT TGG CAG CAT AAC GGC CGC CAG ATG TAT GTG GCA

CTG AAT GGT AAA GGC GCG CCG CGT CGC GGT CAG AAA ACG CGT CGC AAA AAC ACC

TCG GCA CAC TTC CTG CCG ATG GTT GTG CAT AGC TAA 3’。

本发明所述的人角质细胞生长因子-2突变体，其特征在于：突变体将人角质细胞生长因子-2成熟肽N端的Q突变为M。

本发明的第二个目的在于提供一种表达载体，其特征在于：在所述的表达载体的多克隆位点插入了本发明前述的突变体基因。

本发明的第三个目的在于提供一种大肠杆菌宿主细胞，其特征在于：该工程细胞携带了本发明前述的表达载体。

本发明的第四个目的在于提供前述人角质细胞生长因子-2突变体的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

(1)在适合的表达条件下，培养大肠杆菌工程菌，该工程细胞携带的表达载体是pET30a(+)，且在所述表达载体的多克隆位点插入了本发明前述的基因序列，从而表达出本发明前述的人角质细胞生长因子-2突变体；

(2)柱层析分离纯化出步骤(1)中表达的人角质细胞生长因子-2突变体。

本发明前述的人角质细胞生长因子-2突变体的制备方法，其特征在于：在所述载体插入人角质细胞生长因子-2突变体基因的位点是Nde I和Hind III。

本发明前述的人角质细胞生长因子-2突变体的制备方法，其特征在于：其制备步骤(2)中的柱层析为离子交换层析、疏水相互作用层析、亲和层析、尺寸排阻层析，及其组合。

本发明前述的人角质细胞生长因子-2突变体的制备方法，其特征在于：其制备步骤(2)中的柱层析的次序为离子交换层析，亲和层析、尺寸排阻层析。

本发明的新颖性在于

1.分子具有新颖性。所得的蛋白是有活性的人KGF-2突变体，可实现天然表达。与分泌表达相比可提高产量。于融合表达相比可以简化工艺过程。

2.DNA序列具有新颖性。用于编码此突变体的DNA序列是不同于原始序列的，也就是说是经过优化设计化学合成的。

3.提纯方案具有新颖性。用于提纯的方案是精心设计的，用尽量少的操作达到纯度要求。前一步的产物不经处理即可进入下一步，简化了操作，提高了收率。

本发明的优点：

(1)表达量高。采用了大肠杆菌的偏爱密码子，去除了许多人KGF-2基因中的稀有密码子(对大肠杆菌而言)，通过系统的比较，得到了表达量最高的KGF-2突变体。

(2)工艺简单。由于蛋白是可溶性表达，使得纯化工艺简单化。另外，通过选择适当的层析次序及缓冲体系，前一步的产物几乎不经处理即可进入下一步的纯化步骤，降低了成本并提高了收率。

附图说明

图1是人角质细胞生长因子-2突变体的制备方法中的纯化层析图谱。

图2是人角质细胞生长因子-2突变体的制备方法中尺寸排阻层析的分子筛洗脱峰的电泳图(1为Marker，分子量从上到下依次为97.4、66、43、31、20.1、14.4Kd)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。但它们不是对本发明的限定。

实施例一

构建不同的KGF-2突变体表达质粒

天然人KGF-2的成熟肽有171个氨基酸残基，实验表明去除KGF-2 N端的前26个氨基酸残基并不影响KGF-2与其受体的结合，其中去除26个氨基酸残基的KGF-2与其受体结合的复合物还得到了结晶，并得到了三维结构解析。为了在大肠杆菌中高效表达KGF-2，可考虑去除部分N端不影响其活性的氨基酸残基。化学合成编码人KGF-2 C端145-171个氨基酸残基的核苷酸序列。由于是化学合成，为最大程度地在大肠杆菌中表达KGF-2，合成时采用了大肠杆菌的偏爱密码子。为实现天然表达，简化后续处理工艺，在5’端加上起始密码子ATG，3’端加上了终止密码子TAA。通过常规重组DNA操作将合成地DNA插入表达载体pET30a(+)的Nde I和Hind III位点间。

实施例二

表达分析挑选最佳突变体

将构建好的KGF-2突变体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，抗生素筛选转化子。挑选分离良好的菌落接种含适当抗生素的LB培养基，加入IPTG至1mM培养4小时诱导KGF-2突变体表达。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细菌总蛋白，考马斯亮蓝R250染色，凝胶扫描分析表达的KGF-2占总蛋白的百分比。通过比较，我们选择了去除N端第一个Q的突变体。去除Q，则M后的氨基酸残基刚好是A。这与N端规则非常吻合：第二个氨基酸残基是Q将使得表达的蛋白质不稳定，而第二个氨基酸残基是A则极大地稳定了表达的蛋白质。选择的DNA序列及其编码的蛋白质序列见下(SEQ ID：N0.1)。

SEQ ID：N0.1

长度：516bp

类型：脱氧核糖核酸

链数：双链

几何结构：线性

来源：化学合成

特征：编码人KGF-2的2-171个氨基酸残基，N端多一M。

人KGF-2突变体基因序列(序列对大肠杆菌优化)：

5’ ATG GCA CTG GGT CAG GAT ATG GTT AGT CCG GAA GCG ACC AAC AGC TCG AGC

AGT AGC TTC TCG AGC CCG AGT AGC GCA GGC CGC CAT GTG CGT TCG TAT AAT CAC

CTG CAG GGT GAT GTT CGC TGG CGT AAA CTG TTT AGC TTC ACG AAA TAC TTT CTG

AAA ATC GAA AAA AAC GGC AAA GTG AGT GGC ACC AAA AAA GAA AAT TGC CCG TAT

AGC ATT CTG GAA ATC ACG TCG GTT GAA ATT GGT GCG GTG GCA GTT AAA GCG ATC

AAC AGC AAT TAC TAT CTG GCA CGC AAC AAA AAA GGT AAA CTG TAC GGC AGT AAA

GAA TTC AAT AAC GAT TGC AAA CTG AAA GAA CGT ATT GAA GAA AAT GGT TAT AAC

ACC TAC GCG AGC TTT AAT TGG CAG CAT AAC GGC CGC CAG ATG TAT GTG GCA CTG

AAT GGT AAA GGC GCG CCG CGT CGC GGT CAG AAA ACG CGT CGC AAA AAC ACC TCG

GCA CAC TTC CTG CCG ATG GTT GTG CAT AGC TAA 3’。

人KGF-2突变体编码的蛋白质序列：

MALGQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKEN

CPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNG

RQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS。

实施例三

重组KGF-2突变体的诱导表达

将实施例二中选定的工程菌接种在含相应抗生素的LB培养基中，以100-300次/分振荡培养12-14小时。按1∶100-1∶20的比例接种含同样抗生素的LB培养基，继续培养3-6小时，培养温度为20-37℃，振荡速度为100-300次/分。加入IPTG至终浓度为0.1-2mM，继续培养3-4小时。

实施例四

重组KGF-2突变体的制备

实施例三的培养物通过离心或过滤除去培养基，获得菌体。缓冲液悬浮菌体后，通过超声波或机械破碎等方式破碎细胞。离心除去细胞碎片，获得可溶组分(上清)。目标蛋白存在于可溶组分中，通过柱层析分离纯化。适用于本发明的层析包括阳离子交换层析，阴离子交换层析，尺寸排阻层析(分子筛)和亲和层析等。a)离子交换层析：选择与破菌缓冲液相同的缓冲体系，直接上样，对样品进行富集和提纯。用盐浓度梯度、pH梯度或盐浓度阶段洗脱。b)亲和层析：由于与其它成纤维细胞生长因子(FGF)一样，KGF-2(FGF10)也有肝素结合区，能与肝素强烈作用，故选择肝素亲和层析介质进行目标蛋白的分离提纯，用盐梯度或肝素梯度洗脱。c)尺寸排阻层析：用于目标蛋白的纯化及脱盐处理。

通过选择适当的层析次序及缓冲体系，前一步的产物几乎不经处理即可进入下一步的纯化步骤，降低了成本并提高了得率。经过2-3步纯化，可得到KGF-2突变体纯品，纯度达95％以上。

实施例五

KGF-2突变体表达体系的选择

(1)KGF-2突变体表达体系的构建

表达质粒为pET30a(+)，宿主菌为大肠杆菌DH5α。根据常规基因化学合成方法，合成去掉N端0-26个氨基酸残基的KGF-2基因，用大肠杆菌偏爱密码子代替原始密码子。在基因5’端加上起始密码子ATG和Nde I限制性酶切位点，在基因3’端加上终止密码子TAA和Hind III位点。将合成的基因按常规重组DNA操作手段克隆进pET30a(+)的Nde I和Hind III位点间，通过碱裂解法提取质粒，酶切筛选插入片断大小正确的克隆，进一步测序鉴定。所得克隆的序列与我们设计的一致。

(2)突变体表达体系的表达分析及选择

将得到的突变体克隆用碱裂解法提取质粒，用热冲击法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。卡那霉素抗性筛选，得到抗性菌落。接种菌落于含卡那霉素50μg/mL的LB中，37℃振荡培养过夜。按1∶100转接过夜培养物，37℃振荡培养4小时，加入IPTG至终浓度1mM，诱导表达4小时。离心收集菌体，SDS-PAGE分析表达的蛋白占细菌总蛋白的百分比。结果表明诱导后，去掉N端第一个氨基酸残基(Q)的突变体表达量最高。

实施例六

KGF-2突变体的纯化

(1)参照实施例五中之(2)诱导重组蛋白表达。发酵产物4℃，6000rpm离心15分，得菌体。

(2)超声波裂解细胞，13000rpm离心30分，收集上清。

(3)层析纯化目标蛋白

a.阳离子交换层析

介质：SP Sepharose FF

溶液A：20mM Tris.Cl(pH8.0)

溶液B：溶液A+1M NaCl

将裂菌上清直接上柱，用溶液A洗至电导和紫外吸收均不再变化，在10倍柱床体积内用线性梯度将溶液从0％升至50％，收集KGF-2突变体峰。层析图谱如图1所示。

b.亲和层析

介质：Heparin Sepharose CL-6B

溶液A：20mM Tris.Cl(pH8.0)

溶液B：溶液A+1M NaCl

将阳离子层析收集到的KGF-2突变体峰上柱，用溶液A洗至电导和紫外吸收均不再变化，用100％B洗脱，收集KGF-2突变体峰。

c.尺寸排阻层析(分子筛)

介质：Sephadex G-25

溶液A：20mM Tris.Cl(pH8.0)

将亲和层析收集到的KGF-2突变体峰上柱，然后用溶液A洗脱，收集蛋白质峰，避开盐峰。

经过纯化后，得到了纯度达95％，且盐浓度较低的KGF-2突变体。分子筛洗脱峰的电泳图见图2

序列表

<110>杭州北斗生物技术有限公司

<120>一种人角质细胞生长因子-2突变体及其制备方法

<160>2

<170>PatentIn Version 3.3

<210>1

<211>516

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)…(516)

<223>KGF-2编码核苷酸序列

<400>1

atggcactgg gtcaggatat ggttagtccg gaagcgacca acagctcgag cagtagcttc 60

tcgagcccga gtagcgcagg ccgccatgtg cgttcgtata atcacctgca gggtgatgtt 120

cgctggcgta aactgtttag cttcacgaaa tactttctga aaatcgaaaa aaacggcaaa 180

gtgagtggca ccaaaaaaga aaattgcccg tatagcattc tggaaatcac gtcggttgaa 240

attggtgcgg tggcagttaa agcgatcaac agcaattact atctggcacg caacaaaaaa 300

ggtaaactgt acggcagtaa agaattcaat aacgattgca aactgaaaga acgtattgaa 360

gaaaatggtt ataacaccta cgcgagcttt aattggcagc ataacggccg ccagatgtat 420

gtggcactga atggtaaagg cgcgccgcgt cgcggtcaga aaacgcgtcg caaaaacacc 480

tcggcacact tcctgccgat ggttgtgcat agctaa                           516

<210>2

<211>171

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Met Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser

1                5                  10                  15

Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Phe Ser Ser Ala Gly Arg His Val

                 20                  25                 30

Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu

                 35                 40                  45

Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly Lys

                 50                  55                 60

Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu

                65                  70                  75

Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn

                 80                  85                  90

Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly

                 95                 100                 105

Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Lue Lys Glu Arg Ile Glu

                110                 115                 120

Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn

                125                 130                 135

Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg

                140                 145                 150

Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro

                160                 165                 170

Claims (8)

1.一种人角质细胞生长因子-2突变体，其特征在于：突变体编码的蛋白质序列为：

MALGQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS。

2.编码权利要求1的突变体基因，其特征在于：突变体基因为化学合成，基因序列为：

5’ATG GCA CTG GGT CAG GAT ATG GTT AGT CCG GAA GCG ACC AAC AGC TCG AGCAGT AGC TTC TCG AGC CCG AGT AGC GCA GGC CGC CAT GTG CGT TCG TAT AAT CACCTG CAG GGT GAT GTT CGC TGG CGT AAA CTG TTT AGC TTC ACG AAA TAC TTT CTGAAA ATC GAA AAA AAC GGC AAA GTG AGT GGC ACC AAA AAA GAA AAT TGC CCG TATAGC ATT CTG GAA ATC ACG TCG GTT GAA ATT GGT GCG GTG GCA GTT AAA GCG ATCAAC AGC AAT TAC TAT CTG GCA CGC AAC AAA AAA GGT AAA CTG TAC GGC AGT AAAGAA TTC AAT AAC GAT TGC AAA CTG AAA GAA CGT ATT GAA GAA AAT GGT TAT AACACC TAC GCG AGC TTT AAT TGG CAG CAT AAC GGC CGC CAG ATG TAT GTG GCA CTGAAT GGT AAA GGC GCG CCG CGT CGC GGT CAG AAA ACG CGT CGC AAA AAC ACC TCGGCA CAC TTC CTG CCG ATG GTT GTG CAT AGC TAA 3’。

3.一种表达载体，其特征在于：在所述的表达载体的多克隆位点插入了权利要求2所述的突变体基因。

4.一种大肠杆菌宿主细胞，其特征在于：该工程细胞携带了权利要求3所述的表达载体。

5.根据权利要求1所述的人角质细胞生长因子-2突变体的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

(1)在适合的表达条件下，培养大肠杆菌工程菌，该工程细胞携带的表达载体是pET30a(+)，且在所述表达载体的多克隆位点插入了权利要求2所述的基因序列，从而表达出权利要求1所述的人角质细胞生长因子-2突变体；

(2)柱层析分离纯化出步骤(1)中表达的人角质细胞生长因子-2突变体。

6.根据权利要求5所述的人角质细胞生长因子-2突变体的制备方法，其特征在于：在所述载体插入人角质细胞生长因子-2突变体基因的位点是Nde I和Hind III。

7.根据权利要求5所述的人角质细胞生长因子-2突变体的制备方法，其特征在于：其制备步骤(2)中的柱层析为离子交换层析、疏水相互作用层析、亲和层析、尺寸排阻层析，及其组合。

8.根据权利要求5所述的人角质细胞生长因子-2突变体的制备方法，其特征在于：其制备步骤(2)中的柱层析的次序为离子交换层析，亲和层析、尺寸排阻层析。

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