JP2015215187A - Ｍａｌｄｉ−ｔｏｆ質量分析計による獣毛繊維製品中の獣毛の混用率鑑定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】獣毛繊維製品中の獣毛の混用率の正確で簡便な定量方法を提供する。【解決手段】１）被検獣毛繊維製品よりドデシル硫酸ナトリウムと還元剤を含むタンパク質抽出液にてタンパク質を抽出する工程、２）抽出されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかける工程、３）分子量４５０００付近の電気泳動バンドを切り出す工程、４）分子量４５０００付近のバンドに含まれるタンパク質をトリプシンで処理する工程、５）トリプシン処理したタンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計にかけ、ｍ／ｅ＝２４５０−２７５０の領域にあるピークを記録する工程、５）記録されたピーク中の動物種特異的ピークにより獣毛に含まれる動物種を同定する工程、６）動物種特異的ピークの面積を測定する工程、および７）得られた動物種特異的ピークの面積より、獣毛繊維製品に含まれる獣毛の混用率を計算する工程を含む、獣毛繊維製品中の獣毛の混用率の定量方法。【選択図】図４

Description

本願はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を用いて獣毛繊維製品中の獣毛種の混用率を定量する方法を提供する。

カシミヤ、アルパカなど高級繊維と呼ばれるものは世界的な供給が限られているため、羊毛類などと比べてはるかに高価である。そのため、これらの高価な繊維からなる製品中の正確な組成を明らかにするための定量技術は非常に重要である。現在、このような繊維製品中の獣毛類の組成を決めることができる技術としては、光学顕微鏡、電子顕微鏡を利用する方法がほとんど唯一の方法である。繊維を短い断片に切断し、それを顕微鏡の視野下で観察し、繊維の太さ、スケールの状態、毛髄の状態などの情報を元にして瞬時に繊維の種類を判断し、本数を数え、全体の組成を求める。この方法は非常に時間がかかるだけでなく、技術者の技量に依存する部分が大きく、最近では、顕微鏡画像をコンピュータに取り込み、画像解析を使う方法なども取り入れられているが、多くの問題点が残されている。さらに、繊維の種類によっては判別が非常に難しいものがあるだけでなく、強い加工を施された繊維などはスケールの状態が変化しているものもあり、判別を誤ることもある。こうした状況から、顕微鏡法に代わる、または、補完する定量法の開発が強く望まれてきた。

顕微鏡法の代替法としてはＤＮＡ法の研究（非特許文献１−３）が最も進んでおり、一部実用化されているだけでなく、国際標準化に向けた手続きが進められている（非特許文献４）。また、リアルタイムＰＣＲ法を用いて獣毛繊維の混用率を求める方法が提案されている(特許文献１)。これらＤＮＡ法は感度が非常に高いのが特徴であるが、濃染色されたものなど、一部の試料については検出が困難な場合があることが報告されている（非特許文献２）。また、ＤＮＡ法ではＤＮＡの抽出量が加工の影響を大きく受けることから、定量分析には困難な要素があると考えられる。この他に、抗原−抗体反応を利用した方法（非特許文献５）などが報告されている。

獣毛は主にケラチンＩ、ケラチンII、ケラチン関連タンパク質などのタンパク質から構成されている。ケラチンタンパク質には構造のよく似た多種類の分子種が存在すること、近縁種の動物間ではそのアミノ酸配列が９０％を超える相同性を有していることなどが知られている（非特許文献６）。

獣毛からのケラチンタンパク質の抽出において、カシミヤなどの獣毛をSDSを含むリン酸緩衝液中でDTTを還元剤として還元、溶解させると効率のよい抽出が達成されること、得られた抽出液をSDS-PAGE電気泳動で分離し、ケラチンＩが含まれているバンドをトリプシン処理した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で分析するとｍ／ｅ=2450-2750の領域に動物種特異的なピークが現れることが報告されている（非特許文献６）。しかしながら、動物種特異的ピークが定量に用い得るものかどうかは知られていない。

特開2004-121229号公報

S.Subramanian, T. Karthik, N.N.Vijayaraaghavan, J. Biotechnol., 116, 153 (2005) K. Kerkhoff, G. Cescutti, L. Kruse, J. Muessig, Text. Res. J., 79, 69 (2009). W. Ji, L. Bai, M. X. Yang, Forensic Sci. Int., 208, 139 (2011). インターネットＵＲＬhttp://www.meti.go.jp/information/downloadfiles/c110204d02j.pdf C. Tonetti, C. Vineis, A. Aluigi, C. Tonin, Text. Res. J., 82, 766 (2012). 大箸信一、出村由香、佐野元昭 繊維学会誌 68巻276頁(2012)

本願は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を用いて獣毛繊維製品に使われる獣毛種の相対比を定量分析する方法を提供する。

本発明は下記方法を提供する：
１） 被検獣毛繊維製品よりドデシル硫酸ナトリウムと還元剤を含むタンパク質抽出液にてタンパク質を抽出する工程、
２） 抽出されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかける工程、
３） 分子量４５０００付近の電気泳動バンドを切り出す工程、
４） 分子量４５０００付近のバンドに含まれるタンパク質をトリプシンで処理する工程、
５） トリプシン処理したタンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計にかけ、ｍ／ｅ＝２４５０−２７５０の領域にあるピークを記録する工程、
５） 記録されたピーク中の動物種特異的ピークにより獣毛に含まれる動物種を同定する工程、
６） 動物種特異的ピークの面積を測定する工程、および
７） 得られた動物種特異的ピークの面積より、獣毛繊維製品に含まれる獣毛の混用率を計算する工程
を含む、獣毛繊維製品中の獣毛の混用率を定量する方法。

本発明によって初めてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を用いた獣毛の混用率を正確に測定することが可能となった。本発明の方法は高い精度で比較的短時間かつ簡便に獣毛繊維の混用率を測定することができる。

未処理（ａ）および漂白処理（ｂ）を行ったカシミヤのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析スペクトル（ｍ／ｅ＝７００−３０００部分）を重ねた図。 加工、未加工のカシミヤ、羊毛、ヤクのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析スペクトル。a) アラシャンホワイトカシミヤ、b) 漂白ホワイトカシミヤ、c) ブラウンカシミヤ、d) 脱色ブラウンカシミヤ、e) 極細原産羊毛、f) スケール除去極細原産羊毛、g) 蒸煮極細原産羊毛、h) ダークブラウンヤク、i) 漂白ヤク 獣毛と獣毛以外の繊維の混紡品のｍ／ｅ＝２４５０−２７５０の範囲のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析スペクトル。（ａ）カシミヤ６７％／絹３３％、（ｂ）綿８２％／カシミヤ１８％／羊毛ごく微量、（ｃ）カシミヤ７４％／ビニロン２６％、（ｄ）レーヨン４０％／ナイロン２７％／羊毛２６％／カシミヤ７％、（ｅ）カシミヤ８３％／羊毛１７％。 カシミヤ−羊毛標準試料を既知配合比で混合した試料のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析スペクトル。カシミヤ８０％、５０％、２０％の場合。 カシミヤ−羊毛標準試料を用いて作成した検量線。 カシミヤ−ヤク標準試料を用いて作成した検量線。 カシミヤ−羊毛標準試料からの繊維抽出液を異なる期間保存した試料を用いて作成した検量線。 カシミヤ−ヤク標準試料からの繊維抽出液を異なる期間保存した試料を用いて作成した検量線。

本発明において「獣毛繊維」とはほ乳動物の毛部分を意味する。本明細書において「獣毛繊維製品」の語には、動物から刈り取られた、処理をされていない原毛、洗毛、精練、漂白、染色、加工などを施したもの、更にこれらを紡いだ糸を含むものとする。また、「獣毛繊維製品」には、糸、織物、編物などに加工された製品、衣類等の最終製品へと加工された製品のいずれも含有するものとし、また従来知られた加工、例えば防縮、防皺、撥水、防虫、消臭、防汚加工等を施された製品も含まれるものとする。さらに、毛を刈り取ることなく、毛皮として提供される獣毛も本明細書においては「獣毛繊維製品」に含まれるものとする。

また、本発明において「獣毛繊維製品」は獣毛のみからなる製品であっても、獣毛とその他綿、麻、絹等の天然繊維や各種合成繊維とを組み合わせて含む製品であってもよい。

本発明の方法において、被検対象となる獣毛繊維製品よりタンパク質を抽出する。必要に応じて、タンパク質の抽出処理の前に獣毛繊維の洗浄を行ってもよい。特に被検対象である獣毛繊維製品に繊維屑や油脂分が付着している場合には、洗浄をすることが好ましい。

獣毛繊維製品からのタンパク質の抽出は、従来公知のいずれの方法を用いてもよく、特に限定されない。具体的には、例えば獣毛繊維製品を細切、または破砕し、これを界面活性剤と還元剤とを含む緩衝液であるタンパク質抽出液にて処理することが挙げられる。

獣毛繊維製品はハサミで裁断、またはボールミルなどを用いて破砕すればよい。その後、乾燥させて以下の処理を行う。

還元剤としては、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリブチルホスフィンが例示され、ＤＴＴが特に好適に用いられる。界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が好適に用いられる。緩衝液としては、リン酸緩衝液が例示される。

タンパク質抽出液中、ＳＤＳの濃度は好ましくは１．５−８％、より好ましくは３−５％とすればよい。還元剤がＤＴＴである場合、その濃度は好ましくは３０−７０ｍＭ、より好ましくは４０−６０ｍＭとすればよい。緩衝液がリン酸緩衝液の場合、ｐＨを中性から弱アルカリ性、ｐＨ７．０−９．０、好ましくはｐＨ７．４−８．２好ましくは７．８程度とした０．１Ｍリン酸緩衝液が例示される。

タンパク質抽出液の量は特に限定的ではないが、細切または破砕した獣毛繊維重量に対して５−５００倍容量、好ましくは１０−５０倍容量とすればよい。

細切または破砕した獣毛繊維をタンパク質抽出液へ投入してタンパク質の抽出を行う。抽出温度は高い方が抽出効率が良いが、比較的低い温度で長時間抽出を行っても構わない。抽出温度は好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上の温度とするのが効率が良い。

抽出時間は上記のとおり温度によって適宜設定すればよいが、例えば９５℃にて抽出を行う場合は、３０分−２時間、好ましくは約１時間抽出する。所定時間経過後、遠心分離により上清を分取する。なお、遠心分離後の不溶物にタンパク質抽出液を加え加温して、繰り返して抽出を行ってもよい。繰り返し抽出をすることにより、同一試料からより多くのタンパク質を抽出することができる。

得られた上清、すなわちタンパク質抽出液は常法に沿ってシステインのＳＨ基をブロックする。ＳＨ基のブロックには例えばヨード酢酸アミド（ＩＡＡ）によりＳＨ基をカルバミドメチル化し、次いでＤＴＴを加えて反応を停止させればよい。

得られたタンパク質抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動は従来公知の方法で行えばよい。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により、分子量約４５０００（４００００−５００００の範囲にある最も４５０００に近いバンド）のゲルを切り出す。切り出したゲルを次いで常法によりトリプシン処理する。トリプシン処理は３０−４０℃で、２−２４時間行う。

トリプシン処理後、ゲルよりペプチドを溶出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ用マトリックスと混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析用金属プレートへスポットする。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によりトリプシン処理により得られたペプチドを分析する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により検出されるｍ／ｅ＝２４５０−２７５０の領域に生じるピークを記録する。

記録されたピークのうち、各獣毛が由来する動物種に対応する動物種特異的ピークを同定して獣毛が由来する動物種を決定する。獣毛繊維製品に含まれる可能性のある獣毛が由来する動物種を予測し、各動物種特異的ピークを予め確認しておく。動物種特異的ピークは標準獣毛繊維を上記のとおり分解してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計により分析してｍ／ｅ＝２４５０−２７５０の領域に生じるメインピークを特定することによって確認することができる。

また、実施例４において確認されたように、哺乳動物のケラチンＩのトリプシン分解物はｍ／ｅ＝２４５０−２７５０の領域に種特異的なピークを有しており、当該ピークはカシミヤのケラチン３３Ａの３０７−３２９位の配列(配列番号１)と高いホモロジーを有するペプチドに由来するものである。現在多くの動物種のケラチンタンパク質の配列がデータベースに登録されている。かかるデータベースよりＮの隣のアミノ酸をＮ末端とし、Ｃ末端がＲであって、かつ配列番号１のペプチドと高いホモロジーを示すペプチドを同定し、そのアミノ酸配列からｍ／ｅ値を計算することができる。アミノ酸配列に基づくｍ／ｅ値の計算は、手計算、または、適当な計算ツール、例えば、http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/molmass/を用いて行うことができる。
かかるペプチドの例として、下記表４に記載のペプチドが挙げられ、これらのペプチドに基づき予め動物種特異的ピークを決定することができる。なお、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析結果のピーク位置から動物種特異的ピークを同定する場合、同定は測定値の誤差を考慮して行われる。

得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦチャートより動物種に由来するピークを同定し、獣毛繊維が由来する動物種を決定する。動物種特異的ピーク面積を測定する。動物種特異的ピークの面積に基づき、獣毛繊維の比率を決定する。例えば、Ａ１、Ａ２、Ａ３の３種類の獣毛の混紡製品であると特定された場合、獣毛繊維中のＡ１の相対比（Ａ１（％））は下記計算式によって得られる：
Ａ１（％）＝ＰＡ１×１００／（ＰＡ１＋ＰＡ２＋ＰＡ３）
（式中、ＰＡ１、ＰＡ２，ＰＡ３はそれぞれ獣毛繊維Ａ１、Ａ２およびＡ３のピーク面積を示す。）

より詳細な混用率を求める場合には、予め各獣毛種の標準混合試料を本発明の方法により分析して検量線を作成し、得られるデータを検量線により補正してもよい。

本発明の方法によって、獣毛繊維製品の獣毛の混用率を高い精度で測定することが可能である。獣毛繊維製品が獣毛繊維と獣毛繊維以外の繊維とを組み合わせたもの、例えば混紡品や交ぜ織りなどであることが予測される場合は、本発明の方法を顕微鏡法等従来公知の方法と組み合わせて用いてもよい。例えば顕微鏡法、溶解法などで獣毛繊維以外の同定、混用率の定量を行い、獣毛繊維間の混用率を本発明の方法で測定することが例示される。

以下実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。

獣毛の抽出及び同定に及ぼす繊維加工の影響
市販されている繊維製品のほとんどは、漂白、染色などさまざまな加工が加えられている。化学分析を行う場合、こうした加工が分析結果に影響を及ぼすことは少なくない。一方で、分析工程を単純化するためには前処理をできるだけ減らし、どの試料に対しても同一の前処理で済ませることが望ましい。そこで、獣毛製品の加工処理としてよく用いられている漂白、脱色、染色などのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計による測定に対する影響を調べた。

１ 試料
分析試料はCCMI Fiber Box 2011（http://www.cashmere.org/cm/fiber-box.php）中の繊維、織物を用いた。試料は更なる洗浄などは行わず、そのまま用いた。

２ 試薬
リン酸水素二ナトリウム・１２水塩、リン酸二水素ナトリウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）は和光純薬製試薬特級、生化学用、または同等品質の試薬を用いた。ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）はナカライテスク製を用いた。ヨード酢酸アミド（ＩＡＡ）はＢｉｏ−Ｒａｄ社の製品を用いた。トリスヒドロキシメチルアミノメタン、炭酸アンモニウムはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製を、トリシンは同仁化学研究所の製品を用いた。
アセトニトリルは関東化学製ＨＰＬＣ用を、トリフルオロ酢酸は和光純薬社製ＨＰＬＣ用を用いた。トリプシンはＰｒｏｍｅｇａ社タンパク質配列決定用を用い、α−シアノ−４−ヒドロキシ安息香酸（ＣＨＣＡ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社より購入した。

３ 繊維の粉砕
繊維はハサミで細断、または、レッチェ社製ボールミル（ＭＭ４００）で粉砕した。粉砕した繊維は室温で真空乾燥後、用いた。

４ 繊維からのタンパク質の抽出
２５ｍｇの繊維を１．５ｍｌマイクロチューブに秤り取り、５０ｍｍｏｌ／ｌのＤＴＴを含む４％ＳＤＳを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）であるタンパク質抽出液を０．５ｍｌ加え、９５℃に保つことで反応を開始した。反応はアルミブロックバスを用い、静置状態で行った。１時間経過後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、抽出液と不溶物を分けた。分離した抽出液に１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度になるようにＩＡＡを加え、２５℃で３０分間反応し、２５ｍｍｏｌ／ｌのＤＴＴ１０μｌを添加して反応を停止した。１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を以降の分析に用いた。遠心分離後の不溶物に再度、ＤＴＴ、ＳＤＳを含むリン酸緩衝液を含むタンパク質抽出液を０．５ｍｌ加え、９５℃で３時間反応させ、遠心分離後同様の操作を行った。

５ 電気泳動
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動は既製ゲル（アトー社製ｅ・パジェル、ゲルサイズ９０ｍｍｘ８３ｍｍ、厚さ１ｍｍ）及び電気泳動槽（アトー社製ＡＥ−６５１３Ｐ型）を用いて行った。染色はクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）（アトー社製イージーステイン・アクア）で行い、水中で振とうして脱色した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲルから分子量４５０００付近のバンドを切り出した。電気泳動ゲルからのバンドの切り出し、ＣＢＢの除去、ゲル内トリプシン処理、トリプシン処理ペプチドの溶出、マトリックスとの混合、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析用金属プレートへのスポッティングをｘｃｉｓｅ（ＰｒｏｔｅｏｍｅＳｙｓｔｅｍｓ、島津製作所）を用いて行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析のマトリックスとしてはＣＨＣＡを用いた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置は島津ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲｐｌｕｓを用い、タンパク質の同定にはＭａｔｒｉｘＳｃｉｅｎｃｅ社製Ｍａｓｃｏｔを用いた。測定並びに同定は各装置の販売元の提供するマニュアルに基づいて行った。データベースとしてはＮＣＢＩおよびＭＳＤＢを利用した。

図１は、未処理および漂白処理を行ったカシミヤのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析スペクトル（ｍ／ｅ＝７００−３０００部分）を重ねたものである。

図1からわかるように、重ねた両者のスペクトルはほとんど違いがなく、加工により新たなピークが生じることもなかった。

図２は、加工、未加工のカシミヤ、羊毛、ヤクのMALDI-TOF質量分析スペクトルを示す。各使用した獣毛は下記である：
a) アラシャンホワイトカシミヤ、b) 漂白ホワイトカシミヤ、c) ブラウンカシミヤ、d) 脱色ブラウンカシミヤ、e) 極細原産羊毛、f) スケール除去極細原産羊毛、g) 蒸煮極細原産羊毛、h) ダークブラウンヤク、i) 漂白ヤク。
ｍ／ｅ＝２４５０−２７５０の領域にはカシミヤでｍ／ｅ＝２６９２、羊毛で２６６５、ヤクで２５０４付近に動物種特異的ピークが現れるが、分析を行った全ての試料についてこれらのピークが認められた。また、各種加工により新たなピークの出現も認められなかった。

以上のことから、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析におけるピーク位置には白色繊維をより白くするための漂白、有色繊維を白くするための脱色などの加工の影響は全くないことが確認された。

次いで、カシミヤを染色し、ニットまたは織物に加工した試料について同様の分析を行った。結果を表１に示す。全ての試料について、図１と同位置のカシミヤ特異的ピーク（ｍ／ｅ＝２６９２）が観察された。

綿、絹、化学繊維などとの混紡の影響
市販されている獣毛製品の多くは、綿、絹、麻などの天然繊維やナイロン、レーヨンなどの化学繊維、他の獣毛繊維などと混紡されている。このような混紡製品であっても単品同様の方法で分析可能かどうかは、方法の汎用化にとって非常に重要である。

混紡品を実施例１と同様の方法にて溶解、抽出してタンパク質溶液を得た。得られたタンパク質溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分離し、４５０００付近のバンドを切り出し、実施例１と同様にしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析スペクトルを得た。

図３にｍ／ｅ＝２４５０−２７５０の範囲のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析スペクトルを示す。この範囲では獣毛特異的なスペクトルのみが認められ、混紡製品に由来する新たなピークは全く認められなかった。絹はタンパク質であり、妨害ピークが現れることが予測されたが、ｍ／ｅ＝２４５０−２７５０の範囲には絹由来のピークは全く認められなかった。
カシミヤと羊毛の混紡品については両種の特異的なピークがそれぞれ認められた。

実施例１および２に示す通り、カシミヤ、羊毛、ヤクについてはｍ／ｅ＝２４５０−２７５０の範囲に特異的なピークが認められる。他の獣毛において同じ範囲に特異的ピークが認められるかどうかを調べた。
表２に示す動物種の獣毛類について実施例１と同じ処理を行い、同様の分析を行った。その結果を表２に示す。

全ての獣毛についてｍ／ｅ＝２４５０−２７５０の範囲に主ピークが認められ、多くの動物種についてその位置が互いに異なった。表中ピーク１は最もピーク面積の大きいピーク、ピーク２は２番目のピークを示す。

一部の近縁種、例えば、キャメルとアルパカ、カシミヤとモヘヤ、ウサギとアンゴラウサギなどはそれぞれ全く同じ位置にピークが現れた。いずれの獣毛についてもカシミヤ、羊毛、ヤクと重複するピークは示さず、この領域のピークを得る動物種の同定が可能であることが確認された。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により得られるｍ／ｅ＝２４５０−２７５０において認められるピークについて、ＭＳ／ＭＳ分析を行い、アミノ酸配列を決定した。

カシミヤ、羊毛、ヤクそれぞれの標品として中国産ホワイト、メンヤンロン、中国産ヤクの原毛を使用した。原毛中のタンパク質をそれぞれ実施例１の方法に従って抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分離した。具体的にはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で抽出タンパク質を分離した後、分子量４５０００付近のバンドを切り出し、常法によりトリプシン処理した。処理液をｎａｎｏ−ＬＣ（ＫＹテクノロジー社製）で分離し、各フラクションをＣＨＣＡと混合し、金属プレートにスポットした。

各フラクションをＭＡＬＤＩＴＯＦ／ＴＯＦ４８００ｐｌｕｓ（ＡＢＳｃｉｅｘ）でＭＳ／ＭＳ分析し、ＮＣＢＩデータベースを参照して各ピークのペプチドのアミノ酸配列を決定した。結果を表３に示す

ｍ／ｅ＝２６９１付近に現れるカシミヤ特異的なピークのアミノ酸配列を決定し、このピークはケラチン３３Ａの３０７−３２９位の配列を有する部分ペプチドに由来することが確認された。同様に、ｍ／ｅ＝２６６４の羊毛特異的ピークはケラチン３３Ｂの３０７−３２９位に相当し、ｍ／ｅ＝２５０４のヤク特異的ピークはケラチンＩマイクロフィブリル47.6 kDa-likeの３０９−３３１に相当することが確認された。

２３個のアミノ酸からなるこれらの部分配列は、お互いにその構造が非常によく似ており、カシミヤと羊毛では１個、カシミヤとヤクの間では４個のアミノ酸が置換しているのみであった。

ＮＣＢＩのデータベースを使用し、上記のカシミヤのケラチン３３Ａの部分ペプチド配列（配列番号１）に対し、相同性の高い他の動物種の配列をＢＬＡＳＴ検索した結果を表４に示す。多くの動物のケラチン３３Ａまたは配列類似タンパク質の相同性の高い配列が検出された。表中、下線はカシミヤのケラチン３３Ａの３０７−３２９位アミノ酸配列と相違するアミノ酸を示す。実施例２で示したようにカシミヤ、羊毛、ヤク以外の動物についてもｍ／ｅ＝２４５０−２７５０の領域に動物種特異的なピークが現れることから、これらのピークは各ペプチド配列に対応するものと考えられる。

なお、配列中にシステインが含まれ、切断されたＳＨ基をカルバミドメチル基で保護する場合は、システイン基をカルバミドメチル化した値から計算されたｍ／ｅ値を元に特異的ピークを特定する。

獣毛繊維混紡品中のカシミヤの定量分析
カシミヤと羊毛、カシミヤとヤクの標準混合試料を作成し、混合組成と特異ピークの面積比との関係を調べた。標準試料の作成にはカシミヤとして中国産ホワイト、羊毛としてメンヤンロン、ヤクとして中国産ヤクの原毛を使用した。混合比に応じて各試料を正確に秤量し、ハサミでカットしながら混合した。さらに、ミキサーミル用の金属容器に移し、液体窒素で冷却、粉砕し、微粒子化すると共に、完全な混合状態とした後、室温で真空乾燥した。

それぞれの混合比の試料を実施例１と同じ方法にて還元・溶解してタンパク質を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分離し、分子量４５０００付近のケラチンＩに相当するバンドを切り出した。切り出したバンドをトリプシン処理後、マトリックスと混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を行った。例として、カシミヤ−羊毛系でカシミヤ８０％、５０％、２０％の場合のスペクトルを図４に示した。得られた質量分析スペクトルでそれぞれの動物種特異的ピークの面積を出力し、次式にしたがってピーク面積比を求めた。なお、データの正確性を期すため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の測定は各試料につき最低６回行い、その平均値を使用した。

カシミヤ−羊毛混紡系
カシミヤピーク（％）＝ＰＡ_Ｃｘ１００／（ＰＡｃ＋ＰＡｗ）
カシミヤ−ヤク混紡系
カシミヤピーク（％）＝ＰＡ_Ｃｘ１００／（ＰＡｃ＋ＰＡ_Ｙ）

ここで、ＰＡ_Ｃ：カシミヤ特異的ピークの面積
ＰＡ_Ｗ：羊毛特異的ピークの面積
ＰＡ_Ｙ：ヤク特異的ピークの面積

カシミヤ−羊毛系の結果を図５に、カシミヤ−ヤク系の結果を図６に示す。両者とも良好な直線関係が認められ、図５グラフはｙ＝０．９９２６ｘ−１．９２７５、図６のグラフはｙ＝０．９９９４ｘ−３．６８３４であった。

カシミヤと羊毛またはカシミヤとヤクからなる混用率未詳の試料について、それぞれの特異的ピーク面積比（％）を図５または図６のグラフで補正することにより、より正確な混用率の測定が可能となる。

実施例５において用いたものと同一試料について、抽出作業から実施例５と同じ試験を繰り返した。試料の保存による結果のバラツキを確認するため、1日−４．５ヶ月の期間室温で保存した試料を用いた試験を行った。カシミヤ−羊毛試料の保存期間を表５に、カシミヤ−ヤクの保存期間を表６に示す：

結果を図７及び８に示す。図７はカシミヤ−羊毛系について作成した7本の検量線であり、図８はカシミヤ−ヤク系について作成した９本の検量線を示す

いずれも繰り返し再現性は極めてよかった。カシミヤ−羊毛系において図７に示した検量線は最大4ヶ月保存したものであるが、1年以上保存したものからもほぼ同一の検量線が得られ、繊維抽出液は1年以上安定であることが確認された。
カシミヤ−ヤク系についてはカシミヤ−羊毛系に比べて分析ごとの変動が多少見られたが、実用には十分耐える再現性を示した。

本方法の有効性を更に明らかにするため、試料作成第三者のみが混合比を知るブラインドテスト用試料９種の供与を受け、定量分析を行った。各試料の混用率は分析終了後に試料作成者から通知を受けた。

試料はいずれもスライバーで、大部分は茶、黒などに染色されていた（内訳）。試料をハサミでカットした後、ミキサーミルで粉砕し、実施例１の方法に従って、抽出、分離、分析を行った。タンパク質抽出は２回行い、２回の抽出液を混合して分析試料とした。それぞれの分析試料についてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計による測定チャートのｍ／ｅ＝２４５０−２７５０の範囲に認められる、カシミヤ、羊毛、ヤクそれぞれの代表ピークの面積を測定し、その比を算出した。例としてカシミヤ配合量の計算式を下記に示す。
カシミヤ混用率（％）＝ＰＡｃ×１００／（ＰＡｃ＋ＰＡｗ＋ＰＡｙ）

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計による測定は６回以上繰り返し、計算された混用率の平均値を得た。結果を表７に示す。

表７中、括弧内の数値は分析後に試料作成者より通知された混用率を示す。
試料1-01から試料1-09迄の9試料全てについて混用率と本発明の方法による分析値が極めてよく一致し、本分析法の妥当性が支持される。

繊維製品の定量分析と顕微鏡法との比較
実施例７において本方法が未知の獣毛繊維の混用率の定量分析に適用可能であることを明らかにした。また、実施例１で種々の加工を施しても本発明の方法に用いられるピーク位置に変化が無いことを確認した。次いで本発明者らは本発明の定量分析法と現在用いられている顕微鏡法にて種々の試料の混用率の分析を行った。

用いた試料は、カシミヤ100％の製品、カシミヤと羊毛の混紡品、カシミヤ、羊毛とシルク、綿などとの獣毛ではない天然繊維との混紡品、カシミヤ、羊毛とナイロン、レーヨン等の化学繊維との混紡品を用いた。

結果を下記表に示す。表８はカシミヤ、羊毛単独、あるいは両者のみの混紡製品の混用率の分析結果である。表９は、カシミヤ、羊毛と天然繊維、化学繊維との混紡品の各繊維の混用率の分析結果である。

カシミヤ単独及びカシミヤと羊毛の混紡品については表８に示すように様々な色に染色されたニット、織物など１４製品について分析、比較を行った。いずれの試料についても抽出、分析ともに特に問題になる点はなく、全て同じ方法で結果を得ることができた。比較したほとんどの試料について顕微鏡法との違いは大きくても５％程度で、非常によく一致した。

カシミヤ、羊毛と天然繊維、化学繊維との混紡品については表９に示す１５試料の結果を示した。獣毛繊維並びに絹以外の繊維はタンパク質抽出液にほとんど不溶であると考えられ、実施例１の方法で、抽出、分析を行った。絹はタンパク質であり、質量分析に影響を及ぼすことが懸念されたが、特に影響は認められなかった。

なお、本発明の方法では獣毛部分のみの分析結果となる。表９の顕微鏡法の結果には、全体における混用率と獣毛部分のみの混用率を記載して両法の比較を行った。両法の結果は極めてよく一致し、化学繊維等の混在が獣毛繊維部分の混用率の分析に全く影響を及ぼさないことが示された。特に、全体の中でカシミヤ部分の含量が３−４％と非常に低い試料、３−０６、３−１３、３−１５についてもよい一致が見られており、本発明の方法は獣毛含量が低い試料に対しても有効であることがわかる。

Claims (5)

1. １） 被検獣毛繊維製品よりドデシル硫酸ナトリウムと還元剤を含むタンパク質抽出液にてタンパク質を抽出する工程、
   ２） 抽出されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかける工程、
   ３） 分子量４５０００付近の電気泳動バンドを切り出す工程、
   ４） 分子量４５０００付近のバンドに含まれるタンパク質をトリプシンで処理する工程、
   ５） トリプシン処理したタンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計にかけ、ｍ／ｅ＝２４５０−２７５０の領域にあるピークを記録する工程、
   ５） 記録されたピーク中の動物種特異的ピークにより獣毛に含まれる動物種を同定する工程、
   ６） 動物種特異的ピークの面積を測定する工程、および
   ７） 得られた動物種特異的ピークの面積より、獣毛繊維製品に含まれる獣毛の混用率を計算する工程
   を含む、獣毛繊維製品中の獣毛の混用率を定量する方法。
2. 還元剤がジチオスレイトールである、請求項１記載の方法。
3. ある動物の動物種特異的ピークを、データベースにより当該動物のケラチンＩタンパク中、Ｎ隣のアミノ酸がＮ末端、Ｃ末端がＲであって、かつ配列番号１のペプチドと高いホモロジーを示すペプチドを検索し、当該ペプチドのアミノ酸配列から計算して決定する、請求項１または２記載の方法。
4. 予め獣毛種を複数の混用率で混合した試料を用いて作成された検量線を用いて、得られた混用率を補正する工程を更に含む、請求項１−３いずれかに記載の方法。
5. カシミヤ、羊毛、ヤクからなる群から選択される２以上の獣毛繊維の混用率を調べる、請求項１−４いずれかに記載の方法。

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