JP6535398B2 - 獣毛繊維の鑑別方法 - Google Patents
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Description
被検獣毛繊維から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する抽出工程、
抽出した前記タンパク質群を電気泳動手段により分離して電気泳動パターンを得る電気泳動工程、及び、
得られた前記電気泳動パターンを予め準備した起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の電気泳動パターンと比較して、前記被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別する第1鑑別工程を有し、
前記電気泳動工程おいて、
起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の電気泳動パターンのうち、少なくともカシミヤを起源とする単一獣毛繊維の電気泳動パターンに対して、分子量が25kDa以下の領域における分解能が、10個以上のバンドに分解可能な電気泳動ゲルを使用することを特徴とする。
タンパク質群を抽出する前記抽出工程において、
タンパク質の分子内或いは分子間のジスルフィド結合を開裂するために還元剤を使用し、当該還元剤は、容量%濃度で6%より濃い濃度の2−メルカプトエタノール、又は、モル濃度で8〜12mM(ミリモル/リッター)のジチオスレイトールであることを特徴とする。
被検獣毛繊維から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する抽出工程、
抽出した前記タンパク質群を電気泳動手段により分離して電気泳動パターンを得る電気泳動工程、
前記電気泳動パターンを形成する複数のバンドのうち所定のバンドを切出す切出工程、
切出した前記バンド内のタンパク質を所定の消化酵素により消化して一連のペプチド群とする消化工程、
得られた前記ペプチド群を質量分析手段により分析して前記ペプチド群の質量分析パターンを得る質量分析工程、及び、
得られた前記質量分析パターンを予め準備した起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の質量分析パターンと比較して、前記被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別する第5鑑別工程を有し、
前記切出工程において、前記所定のバンドは、前記起源となる動物の種類が既知の獣毛繊維の電気泳動パターンと共通する分子量域に存在するバンドであって、且つ、分子量が30kDa以下、好ましくは20kDa以下にあるバンドであることを特徴とする。
前記切出工程において、前記所定のバンドは、前記起源となる動物の種類が既知の獣毛繊維の電気泳動パターンと共通する分子量域に存在するバンドであって、且つ、分子量が10kDa付近にあるタンパク質濃度の濃いバンドであることを特徴とする。
前記消化工程において、前記所定の消化酵素は、タンパク質を構成するアミノ酸であるリシンのC側末端から当該タンパク質を切断するエンドプロテアーゼであることを特徴とする。
前記質量分析工程において、前記質量分析手段は、液体クロマトグラフィー質量分析手段であることを特徴とする。
前記被検獣毛繊維は、カシミヤ、ウール、ヤク、モヘア、アンゴラ、アルパカ、ビキューナ、キャメル、及び、リャマからなる群のうち少なくとも1つの獣毛繊維を含有することを特徴とする。
本第1実施形態に係る獣毛繊維の鑑別方法は、抽出工程、電気泳動工程、及び、第1鑑別工程を有している。本第1実施形態においては、まず、検査対象である獣毛繊維(以下、「被検獣毛繊維」という。)から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する(抽出工程)。次に、抽出したタンパク質群を電気泳動装置で分離して各タンパク質の分子量の違いによる電気泳動パターン(タンパク質パターン)を得る(電気泳動工程)。
獣毛繊維の主要構成タンパク質は、ケラチン及びケラチン関連タンパク質であり、これらのタンパク質には、構造の良く似た多種類の分子種が存在する。これらのタンパク質群は、動物の種類によりその組み合わせが異なっている。本発明においては、これらのタンパク質群の構成、即ち複数のタンパク質の組合せを解析することにより、獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別するものである。
次に、抽出工程で得られたタンパク質群に対して、電気泳動法を用いて構成タンパク質を分離する。使用する電気泳動法は、特に限定するものではなく、どのような方法であってもよいが、本発明においては、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS−PAGE法)を用いることが好ましい。
このようにして得られた電気泳動パターン(ゲル画像)は、獣毛繊維の起源となる動物の種類に固有のものとなる。本第1実施形態においては、電気泳動工程で得られた電気泳動パターンを、起源となる動物の種類が既知の数種類の単一獣毛繊維の電気泳動パターンと比較する。
本第2実施形態に係る獣毛繊維の鑑別方法は、上記第1実施形態と同様に、抽出工程、電気泳動工程、及び、第1鑑別工程を有し、更に第2鑑別工程を有している。本第2実施形態においても、まず、被検獣毛繊維から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する(抽出工程)。次に、抽出したタンパク質群を電気泳動装置で分離して分子量の違いによる電気泳動パターンを得る(電気泳動工程)。
得られた電気泳動パターン(ゲル画像)は、獣毛繊維の混用率に比例して変化する。本第2実施形態においては、電気泳動工程で得られた被検獣毛繊維の電気泳動パターンを予め準備した混合獣毛繊維の一連の電気泳動パターンと比較する。このため、起源となる動物の種類が異なる獣毛繊維を一連の混用率で混合した混合獣毛繊維を準備し、これらに対して上記と同様の工程による一連の電気泳動パターンを予め準備する。
本第3実施形態に係る獣毛繊維の鑑別方法は、多くの標準試料に対して、上記第1実施形態において説明した電気泳動パターンの解析データを測定し、これをデータベース化することにより、未知の被検獣毛繊維の鑑別を客観的に、且つ、安定して行うようにするものである。
このようにして構築されたデータベースについて説明する。図5は、カシミヤ(ヤギ属)、キャメル(ラクダ属)、ウール(ヒツジ属)、ヤク(ウシ属)の原毛(単一獣毛繊維)、及び、カシミヤ(ヤギ属)とヤク(ウシ属)の混合(混合獣毛繊維)について、それぞれ複数の標準試料から作成したデータベースの一部を可視化したグラフである。この図5は、J:カシミヤ(ヤギ属)のグループ、及び、K:その他の獣毛繊維(混合獣毛繊維を含む)のグループという2つのグループに分類した場合の一例を示している。
本第4実施形態に係る獣毛繊維の鑑別方法は、上記第1実施形態〜第3実施形態と同様の各鑑別方法において、更なる鑑別精度の向上を目的とするものである。具体的には、まず、電気泳動工程において分解能の高いポリアクリルアミドゲルを使用するものである。また、抽出工程において、タンパク質の抽出効率が向上する特定の還元剤を使用するものである。更に、これらによって得られた明瞭な電気泳動パターンを利用して、被検獣毛繊維の混用率の鑑別精度を向上させるために「確かめ算試験」を使用するものである。以下、これらについて説明する。
上記第1実施形態で説明したように、電気泳動工程においてはドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を支持体に用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS−PAGE法)を用いることが好ましい。このSDS−PAGE法において、従来よりも分解能の高いポリアクリルアミドゲルを使用することにより、より正確な鑑別をすることができる。
上記第1実施形態で説明したように、タンパク質の抽出工程においては、タンパク質内のジスルフィド結合(S−S結合)を還元して開裂し、チオール基とするために、抽出液には還元剤を併用することが好ましい。また、上述のように、これらの還元剤としては、例えば、2−メルカプトエタノール(2−ME)、ジチオスレイトール(DTT)、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)などが挙げられる。
ここでいう「確かめ算試験」とは、上記第2実施形態又は第3実施形態の各鑑別工程で得られた被検獣毛繊維の混用率の鑑別精度を向上させる方法をいう。具体的には、まず、上記第2実施形態又は第3実施形態において被検獣毛繊維の電気泳動パターン(ゲル画像)を得る。例えば、2種類の被検獣毛繊維(Y1、Y2)に対して得られた電気泳動パターン(ゲル画像Y1−1、Y2−1)を図9に示す。これらのゲル画像(Y1−1、Y2−1)から上記第2鑑別工程又は第3鑑別工程において被検獣毛繊維の混用率を予測する(具体的には実施例で後述する)。次に、起源となる動物の種類が既知の複数の単一獣毛繊維を用いて、予測した混用率と同じ比率で混合した比較獣毛繊維を調製する。
本第5実施形態に係る獣毛繊維の鑑別方法は、上記第2実施形態と同様の鑑別方法において、被検獣毛繊維が特定の2種類の獣毛繊維で構成されている際に鑑別する第4鑑別工程を有している。この第4鑑別工程においては、上記第3実施形態のようなデータベース化をすることなく、これらの獣毛繊維に特有なバンドに着目することにより、被検獣毛繊維の混用率の鑑別を簡単に、且つ、高い精度で行うことを目的とするものである。
まず、カシミヤ(ヤギ属)とウール(ヒツジ属)の混用率を変化させた標準試料を調製し、これらの電気泳動パターン(ゲル画像Z1)を求める。図10に、カシミヤ:ウール=20:80、30:70、40:60、50:60、60:40、70:30に調整した各標準試料のゲル画像(Z11〜Z16)を示す。これらのゲル画像(Z11〜Z16)において、2種類の獣毛繊維の混用率の変化に対応して、バンド1とバンド2の濃度が変化していることが分かる。
本第6実施形態に係る獣毛繊維の鑑別方法は、抽出工程、電気泳動工程、切出工程、消化工程、質量分析工程、及び、第5鑑別工程を有している。本第6実施形態においては、上記第1実施形態と同様にして、まず、被検獣毛繊維からタンパク質群を抽出し(抽出工程)、抽出したタンパク質群を電気泳動装置で分離して電気泳動パターンを得る(電気泳動工程)。
電気泳動工程で得られた電気泳動パターン(ゲル試料)から当該電気泳動パターンを形成する複数のバンドのうち所定のバンド(ゲル切片)を切出す。切出すバンドは、比較対象とする単一獣毛繊維が決まっている場合には、その単一獣毛繊維と共通の移動度Rfに存在するバンドであることが必要である。従って、起源が未知の被検獣毛繊維に対しては、主要な複数の単一獣毛繊維に共通の移動度Rfに存在するバンドであることが好ましい。
切出したバンド(ゲル)の処理は通常の方法で行う。次に、この切出したゲル内のタンパク質に消化酵素を作用させてペプチド群に切断する。ゲル内のタンパク質に消化酵素を作用させる方法は、特に限定するものではないが、一般にゲル内消化を行うことが好ましい。このゲル内消化に使用する消化酵素は特に限定するものではなく、例えば、トリプシン、キモトリプシン、Lys−C、Glu−Cなどタンパク質の消化に一般的に使用される消化酵素を使用することができる。
次に、得られた被検獣毛繊維のペプチド群に対して、各ペプチドの分離と質量分析を行う。この質量分析工程においては、種々のイオン化手法と質量検出法を組み合わせればよい。イオン化手法としては、例えば、MALDI(Matrix−assistedlaser desorption/ionization)、ESI(Electrosprayionization)、NSI(Nano−spray ionization)などが利用される。また、質量検出法としては、TOF(Time of flight、飛行時間)法、イオントラップ(Ion trap)法、四重極(Quadropole)法などが利用される。
このようにして得られた質量分析パターンは、獣毛繊維の起源となる動物の種類に固有のものとなる。本第6実施形態においては、質量分析工程で得られた質量分析パターンを、起源となる動物の種類が既知の数種類の単一獣毛繊維の質量分析パターンと比較する。
本第7実施形態に係る獣毛繊維の鑑別方法は、上記第6実施形態と同様に、抽出工程、電気泳動工程、切出工程、消化工程、質量分析工程、及び、第5鑑別工程を有し、更に第6鑑別工程を有している。本第7実施形態においても、まず、被検獣毛繊維から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する(抽出工程)。次に、抽出したタンパク質群を電気泳動装置で分離して分子量の違いによる電気泳動パターンを得る(電気泳動工程)。
得られた質量分析パターンは、上記第5鑑別工程と同様に分子量によって保持時間の異なる複数のピークから構成されている。この質量分析パターンは、獣毛繊維の起源となる動物の種類の混用率に比例して変化する。上記第5鑑別工程と同様にして、得られた質量分析パターンについて各ピークの位置(保持時間:疎水性度及び分子量に対応)に対する各ピークの面積値(ペプチド量に対応)を定量する。
本第8実施形態に係る獣毛繊維の鑑別方法は、多くの標準試料に対して、上記第6実施形態において説明した質量分析パターンの解析データを測定し、これをデータベース化することにより、未知の被検獣毛繊維の鑑別を客観的に、且つ、安定して行うようにするものである。
このようにして構築されたデータベースについて説明する。まず、カシミヤ(ヤギ属)、キャメル(ラクダ属)、ウール(ヒツジ属)、ヤク(ウシ属)の原毛(単一獣毛繊維)、及び、カシミヤ(ヤギ属)とヤク(ウシ属)の混合(混合獣毛繊維)について、それぞれ複数の標準試料の数値データからデータベースを構築した。
染色加工された被検試料1及び2(いずれも単一獣毛繊維)については、タンパク質抽出前に洗浄操作を行った。一方、被検試料3(混合獣毛繊維)については、洗浄操作を行うことなくタンパク質抽出を行った。まず、洗浄操作は、10mgの試料に対して250μLの洗浄液(12mM‐デオキシコール酸、12mM‐ラウロイルサルコシ酸、100mM‐トリス塩酸緩衝液(pH9.0))を添加した。試料が洗浄液に浸かるように懸濁した後、試料を95℃で20分間、加熱した。その後、15000×gで10分間、遠心分離した後、上清を除去した。上記の洗浄操作を計3回行った。
次に、被検試料1〜3から抽出した各タンパク質群に対して、それぞれ、次のようにして電気泳動を行った。電気泳動には、20ugのタンパク質を使用した。電気泳動前に、試料は等量の電気泳動用試料調製液(4%‐SDS、12%‐2−ME、250mM‐トリス塩酸緩衝液(pH6.8)、20%‐グリセロール、0.02%‐ブロモフェノールブルー)、及び、1ngのBSA(内部標準)と混和した後、95℃で5分間加熱した。電気泳動槽はBE−211(株式会社バイオクラフト)を使用し、20%SDS−ポリアクリルアミドゲル(テフコ株式会社:8cm長ゲル)を用いてタンパク質を分離した。
次に、得られた被検試料1〜3の電気泳動パターンを標準試料の電気泳動パターンと比較した。標準試料の電気泳動パターンには、上述の図1〜図3に示したA:カシミヤ、B:キャメル、C:ウール及びD:ヤクの電気泳動パターンを使用した。被検試料1の電気泳動パターンにおいて、バンド7がバンド6よりも濃く、両バンドの間隔は標準試料C:ウールよりも広いことから、被検試料1は、カシミヤと判別された。
上記実施例1及び実施例2の電気泳動工程で得られたゲルを脱色し、この脱色後のゲルから、10kDa付近にあるバンドを切り出した。ゲルに100μLの固定液(50%‐メタノール、5%‐酢酸)を添加し、DeepWell Maximizer(M/BR−022UP、タイテック株式会社)により攪拌した(10分間、25℃、1500rpm)。上清を除去した後、100μLのアセトニトリルをゲルに添加し、攪拌した。
このようにして得られた各ペプチド群は、それぞれ、ナノ液体クロマトグラフィータンデム質量分析法(nanoLC−MS/MS)を用いて分析した。nanoLCとしてUntimate3000(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)、オートサンプラーとしてHTC−PAL(CTCAnalyzer)を組み合わせたLTQ−Orbitrap(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)を測定に使用した。ReprosilC18 materials(3μm、DrMaisch社)を充填した分析カラムを使用した。
まず、データベースの構築について説明する。上記標準試料92種類について、それぞれ、ペプチドを同定するためにMascotv2.2(Matrix Science社)を用い、同定されたペプチドの量(ピーク面積値)はMassNavigator v1.2により算出した。試料間におけるペプチドの保持時間のバラツキは合成ペプチドの保持時間を用いて補正した。具体的には各試料で検出された合成ペプチドの保持時間を標準試料(カシミヤ−A3、CCMI)において検出された保持時間と比較し、近似曲線(2次式)を作成した。近似曲線で得られた係数を用いて、各試料における保持時間を補正した。
平均予測精度=Σ|実際の混用率−予測混用率|/データ数・・・(1)
その結果、一般に使用される8cm長ゲルを使用した際の平均予測精度(±標準偏差)は、14.4±10.1%であった。これに対して、12cm長ゲルを使用した際の平均予測精度(±標準偏差)は、6.8±7.8%となり、分解能の高い12cm長ゲルを使用することにより、従来に比べ平均予測精度が約2倍に向上した。
1.上記実施例2においては、バンドのIntensityの補正を総バンドのIntensityに対する比で補正したが、これに限るものではなく、特定のバンドのIntensity(例えばBSA:内部標準)に対する比で補正するようにしてもよい。
2.上記実施例3においては、ピーク面積値の補正を総ピーク面積値に対する比で補正したが、これに限るものではなく、特定のペプチドのピーク面積値に対する比で補正するようにしてもよい。
3.上記実施例3においては、LC−MS/MSでペプチド群の分析を行っているが、これに限るものではなく、LCの検出器として紫外可視分光検出器を採用するようにしてもよい。
4.上記実施例3においては、LC−MS/MSでペプチド群の分析を行っているが、これに限るものではなく、クリーブランド法などを利用するようにしてもよい。
5.上記実施例1においては、タンパク質の抽出の際に獣毛繊維を粉砕することなく抽出を行っているが、これに限るものではなく、獣毛繊維を粉砕してからタンパク質を抽出するようにしてもよい。特に、脱スケールされた獣毛繊維に関しては、タンパク質を抽出する前に細かく粉砕することで、明瞭な電気泳動パターンを容易に得ることができる。
6.上記実施例2においては、移動度Rfの補正に2次式による近似式を用いているが、これに限るものではなく、正確に補正できるのであれば3次式その他であってもよい。
7.上記実施例3においては、LC−MS/MSにおける保持時間の補正に2次式による近似式を用いているが、これに限るものではなく、正確に補正できるのであれば3次式その他であってもよい。
8.上記実施例6の「確かめ算試験」においては、上記第2実施形態と同様にして比較試料の電気泳動パターンを求めた。従って、比較試料と被検試料との一致性は、両試料の電気泳動パターンを比較して判断した。しかし、これに限るものではなく、上記第3実施形態と同様にしてデータベースから比較試料の混用率を予測するようにしてもよい。この場合には、データベースから得られた比較獣毛繊維の混用率と、比較獣毛繊維を調製する際の混用率(データベースから得られた被検獣毛繊維の混用率に同じ)との一致性を判断するようにする。
B…キャメルの電気泳動パターン、
C…ウールの電気泳動パターン、
D…ヤクの電気泳動パターン、
E…カシミヤ:ヤク=100%:0%の電気泳動パターン、
F…カシミヤ:ヤク=70%:30%の電気泳動パターン、
G…カシミヤ:ヤク=50%:50%の電気泳動パターン、
H…カシミヤ:ヤク=30%:70%の電気泳動パターン、
I…カシミヤ:ヤク=0%:100%の電気泳動パターン、
J…電気泳動パターンのデータベースにおけるカシミヤのグループ、
K…電気泳動パターンのデータベースにおけるその他の獣毛繊維のグループ、
L…カシミヤの質量分析パターン、
M…キャメルの質量分析パターン、
N…ウールの質量分析パターン、
O…ヤクの質量分析パターン、
P…質量分析パターンのデータベースにおけるカシミヤのグループ、
Q…質量分析パターンのデータベースにおけるカシミヤとヤクの混合獣毛繊維のグループ、
R…質量分析パターンのデータベースにおけるその他の獣毛繊維のグループ、
S…被検獣毛繊維(カシミヤ)の電気泳動パターン、
T…被検獣毛繊維(ヤク)の電気泳動パターン、
U…被検獣毛繊維(カシミヤとヤクの混合)の電気泳動パターン、
V…被検獣毛繊維(カシミヤ)の質量分析パターン、
W…被検獣毛繊維(ヤク)の質量分析パターン、
X…被検獣毛繊維(カシミヤとヤクの混合)の質量分析パターン、
Y…被検獣毛繊維(混合)の電気泳動パターン、
Z…標準試料(カシミヤとウールの混合)の電気泳動パターン、
AREA−1…動物種特有のタンパク質領域、
AREA−2…共通のタンパク質領域。
Claims (7)
- 被検獣毛繊維から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する抽出工程、
抽出した前記タンパク質群を電気泳動手段により分離して電気泳動パターンを得る電気泳動工程、及び、
得られた前記電気泳動パターンを予め準備した起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の電気泳動パターンと比較して、前記被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別する第1鑑別工程を有し、
前記電気泳動工程おいて、
起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の電気泳動パターンのうち、少なくともカシミヤを起源とする単一獣毛繊維の電気泳動パターンに対して、分子量が25kDa以下の領域における分解能が、10個以上のバンドに分解可能な電気泳動ゲルを使用することを特徴とする獣毛繊維の鑑別方法。 - タンパク質群を抽出する前記抽出工程において、
タンパク質の分子内或いは分子間のジスルフィド結合を開裂するために還元剤を使用し、当該還元剤は、容量%濃度で6%より濃い濃度の2−メルカプトエタノール、又は、モル濃度で8〜12mM(ミリモル/リッター)のジチオスレイトールであることを特徴とする請求項1に記載の獣毛繊維の鑑別方法。 - 被検獣毛繊維から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する抽出工程、
抽出した前記タンパク質群を電気泳動手段により分離して電気泳動パターンを得る電気泳動工程、
前記電気泳動パターンを形成する複数のバンドのうち所定のバンドを切出す切出工程、
切出した前記バンド内のタンパク質を所定の消化酵素により消化して一連のペプチド群とする消化工程、
得られた前記ペプチド群を質量分析手段により分析して前記ペプチド群の質量分析パターンを得る質量分析工程、及び、
得られた前記質量分析パターンを予め準備した起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の質量分析パターンと比較して、前記被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別する第5鑑別工程を有し、
前記切出工程において、前記所定のバンドは、前記起源となる動物の種類が既知の獣毛繊維の電気泳動パターンと共通する分子量域に存在するバンドであって、且つ、分子量が30kDa以下にあるバンドであることを特徴とする獣毛繊維の鑑別方法。
- 前記切出工程において、前記所定のバンドは、前記起源となる動物の種類が既知の獣毛繊維の電気泳動パターンと共通する分子量域に存在するバンドであって、且つ、分子量が10kDa付近にあるタンパク質濃度の濃いバンドであることを特徴とする請求項3に記載の獣毛繊維の鑑別方法。
- 前記消化工程において、前記所定の消化酵素は、タンパク質を構成するアミノ酸であるリシンのC側末端から当該タンパク質を切断するエンドプロテアーゼであることを特徴とする請求項3又は4に記載の獣毛繊維の鑑別方法。
- 前記質量分析工程において、前記質量分析手段は、液体クロマトグラフィー質量分析手段であることを特徴とする請求項3〜5のいずれか1つに記載の獣毛繊維の鑑別方法。
- 前記被検獣毛繊維は、カシミヤ、ウール、ヤク、モヘア、アンゴラ、アルパカ、ビキューナ、キャメル、及び、リャマからなる群のうち少なくとも1つの獣毛繊維を含有することを特徴とする請求項1〜6のいずれか1つに記載の獣毛繊維の鑑別方法。
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