WO2014142229A1 - 獣毛繊維の鑑別方法 - Google Patents

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hair fibers
fiber
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増田　豪
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一般財団法人ニッセンケン品質評価センター
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Definitions

  • the present invention relates to a method for distinguishing animal hair fibers that distinguishes the type of animal that is the origin of animal hair fibers.
  • the present invention relates to a method for distinguishing animal hair fibers that distinguishes a mixture of animal hair fibers of different origins, and further distinguishes their mixed rate.
  • JIS L-1030-1 Fiber discrimination
  • JIS L-1030-2 Fiber product mix rate test method-No. The discrimination is performed based on the second part: fiber mixture ratio.
  • an inspector visually compares the animal hair fibers to be inspected with a standard photograph sample using an optical microscope. Further, in order to determine the mixing ratio of animal hair fibers in this discrimination method, the inspector obtains the number and diameter of different kinds of animal hair fibers contained in the animal hair fibers to be inspected visually using an optical microscope, or This is done by separating and measuring the weight of each.
  • Patent Document 1 listed below proposes a method for identifying animal hair fibers using DNA. According to this method, DNA extracted from animal hair fiber samples and primers specific to animal species are used to amplify DNA by polymerase chain reaction (PCR), and the base sequence of this amplified component is analyzed to analyze animal hair fibers. It distinguishes the animal species that is the origin of the sample.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Patent Document 2 a method for determining the mixed use rate of animal hair fibers in animal fiber products is proposed.
  • real-time PCR is performed using DNA extracted from animal hair fiber samples, a primer specific to the animal species, and a probe that specifically detects the sequence amplified by the primer, and derived from each animal species.
  • the ratio of the relative value of the amount of DNA in the animal is determined, and the mixture ratio of the animal hair fibers is identified based on a correspondence table with the ratio of the relative value of the DNA amount of the standard mixed animal hair fibers prepared in advance. .
  • the identification method of Patent Document 1 and the mixed rate determination method of Patent Document 2 both identify the animal species that are the origin of animal hair fibers or their mixed ratios based on the gene sequence of DNA extracted from animal hair fibers. To do. These methods make use of the fact that gene sequences differ for each animal species, and are expected to give biologically objective results.
  • the present invention addresses the above problems, has a comparatively simple discrimination operation, has objectivity, can be discriminated without relying on the experience and know-how of the inspector, and is pretreated or dyed into animal hair fibers. It is an object of the present invention to provide a method for differentiating animal hair fibers that can obtain an accurate discrimination result even in the case where the determination is made.
  • the present inventors In solving the above problems, the present inventors, as a result of diligent research, focused on proteins constituting animal hair fibers, and the combination of proteins extracted from animal hair fibers is the type of animal from which animal hair fibers originated. I found a difference. Moreover, it discovered that the combination of the peptide group derived from the specific protein taken out from these protein groups differed with the kind of animal from which the animal hair fiber originated. From these findings, the present inventors have completed the present invention.
  • the method for distinguishing animal hair fibers According to the description of claim 1, the method for distinguishing animal hair fibers according to the present invention, An extraction step for extracting a protein group constituting the animal hair fiber from the test animal hair fiber; An electrophoresis step of separating the extracted protein group by electrophoresis means to obtain an electrophoresis pattern; and The obtained electrophoresis pattern is compared with the electrophoresis pattern of a single animal hair fiber whose origin is a known animal species prepared in advance, and the animal species that is the origin of the test animal hair fiber is distinguished. It has the 1st discrimination process.
  • the present invention is the animal hair fiber identification method according to claim 1, Obtain a series of electrophoresis patterns in the same manner as in the extraction step and the electrophoresis step for a mixture of animal hair fibers prepared by mixing animal hair fibers of different origins that have been prepared in advance at a series of mixing ratios. Every The electrophoresis pattern obtained from the test animal hair fiber is compared with a series of electrophoresis patterns obtained from the mixed animal hair fiber, and the test animal hair fiber originates from at least two kinds of animals. The method further comprises a second discrimination step of differentiating at least two kinds of animals that are the origin of the test animal hair fibers and / or the mixed use ratio of the test animal hair fibers.
  • the present invention is the animal hair fiber identification method according to claim 2, Analyzing the relationship between the concentration and mobility of each band for the electrophoresis pattern of the single animal hair fiber and the series of electrophoresis patterns obtained from the mixed animal hair fiber, and storing them as a database , For the electrophoresis pattern obtained from the test animal hair fibers, analyzing the relationship between the concentration and mobility of each band, and The analysis data of the test animal hair fiber is collated with the data group of the database, and the consistency between the analysis data and the data group of the database is used as an index, and the test animal hair fiber contains at least two kinds of animals. It has the 3rd discrimination process which distinguishes the origin, the kind of at least 2 types of animals used as the origin of the above-mentioned test animal hair fiber, and / or the mixed rate of the above-mentioned test animal hair fiber .
  • the present invention is the animal hair fiber identification method according to claim 2 or 3, Using the test animal hair fiber mixed rate obtained in the second discrimination step or the third discrimination step, a single animal hair fiber whose type of animal that is the origin is known at the same ratio as the mixed rate.
  • a single animal hair fiber whose type of animal that is the origin is known at the same ratio as the mixed rate.
  • Each step for obtaining the electrophoresis pattern of the mixed comparative animal hair fiber and By repeating each step for performing the second discrimination step or the third discrimination step again at least once on the obtained electrophoretic pattern of the comparative animal hair fibers, the test animal The mixture ratio of the test animal hair fiber is identified by improving the consistency between the mixture ratio of the hair fiber and the mixture ratio of the comparative animal hair fiber.
  • the present invention is the animal hair fiber identification method according to claim 2,
  • the mixed animal hair fiber is a mixture of two kinds of animal hair fibers whose origins are known and mixed in a series of mixing ratios, For a series of electrophoretic patterns obtained from the mixed animal hair fibers, each step for determining the concentration of the band at the mobility that is specific and pre-qualified for the two animal hair fibers, For the electrophoretic pattern obtained from the test animal hair fiber, the step of determining the concentration of the band at the previously certified mobility, and The concentration of the band at the pre-approved mobility of the test animal hair fiber is compared with the band concentration at the pre-approved mobility of the mixed animal hair fiber, and the consistency of the density of these bands is used as an index. It has the 4th discrimination process which discriminate
  • this invention is the animal hair fiber identification method of Claim 5
  • the two types of animal hair fibers are cashmere and wool.
  • the present invention is the animal hair fiber identification method according to any one of claims 1 to 6,
  • the electrophoresis step of obtaining an electrophoresis pattern Among electrophoretic patterns of single animal hair fibers whose known animal types are known, the resolution in a region having a molecular weight of 25 kDa or less with respect to the electrophoresis patterns of single animal hair fibers originating from cashmere at least, It is characterized by using an electrophoresis gel that can be decomposed into 10 or more bands.
  • the present invention is the animal hair fiber identification method according to any one of claims 1 to 7,
  • a reducing agent is used to cleave intramolecular or intermolecular disulfide bonds of the protein, and the reducing agent is 2-mercaptoethanol at a concentration of 6% by volume or 8-12 mM at a molar concentration ( Mmol / liter) dithiothreitol.
  • the method for distinguishing animal hair fibers An extraction step for extracting a protein group constituting the animal hair fiber from the test animal hair fiber; An electrophoresis step of separating the extracted protein group by electrophoresis means to obtain an electrophoresis pattern; A cutting step of cutting out a predetermined band among the plurality of bands forming the electrophoresis pattern; A digestion step of digesting the protein in the cut out band with a predetermined digestive enzyme into a series of peptides, Mass analysis step of obtaining the mass analysis pattern of the peptide group by analyzing the obtained peptide group by mass spectrometry means, and The obtained mass spectrometry pattern is compared with a mass analysis pattern of a single animal hair fiber whose origin is prepared in advance, and the kind of animal that is the origin of the test animal hair fiber is identified. It has the 5th discrimination process.
  • the present invention is the animal hair fiber identification method according to claim 9, From a series of electrophoresis patterns obtained in the same manner as in the extraction step and the electrophoresis step, on a mixture of animal hair fibers prepared by mixing animal hair fibers of different origins, which are prepared in advance, at a series of mixing ratios.
  • a series of mass analysis patterns is obtained in the same manner as the cutting step, the digestion step, and the mass analysis step, Comparing the mass spectrometry pattern obtained from the test animal hair fiber with a series of mass analysis patterns obtained from the mixed animal hair fiber, the test animal hair fiber originates from at least two kinds of animals.
  • the present invention has a sixth discrimination step of discriminating at least two kinds of animals that are the origin of the test animal hair fiber and / or the mixed use rate of the test animal hair fiber.
  • the present invention is the animal hair fiber identification method according to claim 10, Steps of analyzing the relationship between each peak area value and retention time for each mass analysis pattern of the single animal hair fiber and a series of mass analysis patterns obtained from the mixed animal hair fibers and storing them as a database , For the mass spectrometry pattern obtained from the test animal hair fiber, analyzing the relationship between each peak area value and retention time, and The analysis data of the test animal hair fiber is collated with the data group of the database, and the consistency between the analysis data and the data group of the database is used as an index, and the test animal hair fiber contains at least two kinds of animals. It is characterized by having a seventh discrimination step for discriminating the origin, at least two types of animals that are the origin of the test animal hair fibers, and / or the mixed use rate of the test animal hair fibers. .
  • the present invention is the animal hair fiber identification method according to any one of claims 9 to 11,
  • the predetermined band is a band that exists in a molecular weight region that is in common with the electrophoresis pattern of animal hair fibers of which the animal species is known, and has a molecular weight of around 10 kDa. It is a band with a high protein concentration.
  • the present invention is the animal hair fiber identification method according to any one of claims 9 to 12,
  • the predetermined digestive enzyme is an endoprotease that cleaves the protein from the C-side end of lysine, which is an amino acid constituting the protein.
  • the present invention is the animal hair fiber identification method according to any one of claims 9 to 13,
  • the mass spectrometric means is a liquid chromatography mass spectrometric means.
  • the present invention is the animal hair fiber identification method according to any one of claims 1 to 5 and claims 7 to 14,
  • the test animal hair fiber contains at least one animal hair fiber selected from the group consisting of cashmere, wool, yak, mohair, Angola, alpaca, vicu ⁇ a, camel, and llama.
  • the present invention includes an extraction step and an electrophoresis step, extracts a protein group from the test animal hair fiber, and uses the electrophoresis pattern obtained from the protein group as a source animal. Is compared with the electrophoresis pattern of a single animal hair fiber of known type. It is based on the combination of the protein group which comprises animal hair fiber changing with kinds of animals.
  • the electrophoresis pattern of the test animal hair fiber is compared with the electrophoresis pattern of the mixed animal hair fiber obtained by mixing animal hair fibers of different origins with a series of mixing ratios.
  • the comparative animal hair fiber of the same mixing rate is prepared using the mixing rate of the test animal hair fiber obtained in the 2nd discrimination process or the 3rd discrimination process.
  • the electrophoretic pattern of the comparative animal hair fiber is obtained and when it substantially coincides with the electrophoretic pattern of the test animal hair fiber, the accuracy of the mixing rate of the test animal hair fiber obtained initially is confirmed.
  • the electrophoresis pattern of the obtained comparative animal hair fiber is greatly different from the electrophoresis pattern of the test animal hair fiber, the above operation is repeated for the comparative animal hair fiber whose mixing rate is adjusted again. .
  • the accuracy of the mixing ratio of the test animal hair fibers can be improved, and more accurate discrimination can be performed relatively easily and objectively.
  • the test animal hair fiber when the test animal hair fiber is comprised from two specific types of animal hair fibers, the relationship between the mobility specific to these two types of animal hair fibers and the density
  • the two types of animal hair fibers may be cashmere and wool.
  • the electrophoresis gel used in the electrophoresis step is one that has a resolution in a region of molecular weight of 25 kDa or less and can be decomposed into 10 or more bands with respect to the cashmere electrophoresis pattern. You may make it do. Thereby, the electrophoresis pattern of the test animal hair fiber becomes clear and more accurate discrimination can be performed.
  • the reducing agent used for cleaving the protein disulfide bond in the extraction step is 2-mercaptoethanol having a concentration of 6% by volume or 8-12 mM (molar concentration). Millimole / liter) dithiothreitol may be used.
  • a predetermined band is cut out from the electrophoresis pattern obtained in the electrophoresis step, and proteins in this band are digested with a predetermined digestive enzyme to form a series of peptide groups. Furthermore, the mass spectrometric pattern obtained from this peptide group is compared with the mass spectrometric pattern of a single animal hair fiber of known animal species. This is based on the fact that the combination of peptide groups that can be divided from the protein constituting the animal hair fiber varies depending on the type of animal.
  • the mass analysis pattern of the test animal hair fiber is compared with the mass analysis pattern of the mixed animal hair fiber obtained by mixing the animal hair fibers of different types of origin animals at a series of mixing ratios.
  • a series of mass spectrometry patterns obtained from single animal fiber and mixed animal fiber whose known animal types are known is analyzed, and these are compiled into a database to analyze the subject.
  • the animal hair fibers are mixed animal hair fibers originating from at least two kinds of animals, it is possible to more accurately distinguish between at least two kinds of animal origins and their mixed rate.
  • the inspector's experience and know-how, and also the intricate and long work by the inspector are not accompanied, and accurate discrimination is relatively easy, and Can be done more objectively.
  • the discrimination operation is relatively simple and objective, can be discriminated without relying on the experience and know-how of the inspector, and even when the animal hair fibers are pretreated or dyed. It is possible to provide an animal hair fiber discrimination method capable of obtaining an accurate discrimination result.
  • Embodiment which concerns on this invention, it is a gel image which shows the electrophoretic pattern of the animal hair fiber of cashmere (goat genus), camel (camel genus), wool (sheep genus), and yak (bovine genus).
  • It is an analysis chart which shows the relationship between a mobility and a density
  • animal hair fibers include all hair fibers mainly composed of natural keratin obtained from animals. Therefore, including sheep wool (referred to as “wool” in the present invention), animal hair other than sheep, for example, cashmere goat hair “cashmere”, angora goat hair “mohair”, angora moth hair “Angola” ”, A kind of cow yak hair“ Yak ”, camel hair“ Camel ”, small humpless camel alpaca hair“ Alpaca ”, also a small humpless camel Vicugna hair“ Vicuna ”, also a small humpless camel The llama hair “Lyama” can be mentioned.
  • animal hair fibers in the present invention include those used as fur and fur in addition to these. Examples include fox hair “fox”, weasel mink hair “mink”, rat chinchilla hair “chinchilla”, and rabbit hair “rabbit”. As can be seen from these examples, in the present invention, the same name may be used for the animal name and the animal hair name.
  • examples of the fiber product using animal hair fibers include woven fabrics, knitted fabrics, and non-woven fabrics such as felt using yarns obtained by spinning animal hair fibers.
  • the present invention is not limited to these, and includes fur, fur, and the like, and also includes cases where the hair fiber is used for stuffing.
  • these textile products include those subjected to dyeing or various finishing processes.
  • it is also applicable to discriminating fiber products in which high-quality animal hair fibers such as cashmere are mixed with other inexpensive animal hair fibers and fiber products in which animal hair fibers camouflaged by various processes are mixed. It is what.
  • the kind of animal does not mean only “species” as a biological taxonomic unit, but also uses a broad meaning that goes back to “genus” or “family”. Therefore, the type of animal to be identified by the method for distinguishing animal fiber according to the present invention is not limited to distinguishing the “species” of the animal that is the origin of the animal hair fiber, but the “genus” of the animal that is the origin. May also be used to identify the “family” of the animal that is the origin.
  • the animal hair fiber identification method includes an extraction process, an electrophoresis process, and a first identification process.
  • a protein group constituting the animal hair fiber is extracted from the animal hair fiber to be examined (hereinafter referred to as “test animal hair fiber”) (extraction step).
  • the extracted protein group is separated by an electrophoresis apparatus to obtain an electrophoresis pattern (protein pattern) based on a difference in molecular weight of each protein (electrophoresis step).
  • the gene sequence differs for each animal type, and the protein is encoded by the gene. Therefore, since the amino acid sequence of the protein differs for each animal type, the electrophoresis pattern of the protein group extracted from the animal hair fiber is unique to the animal type. Based on this fact, by comparing the electrophoresis pattern of the obtained animal hair fiber with the electrophoresis pattern of several single animal hair fibers whose origins are known, The type of animal that is the origin of the fiber is identified (first identification step).
  • the main constituent proteins of animal hair fibers are keratin and keratin-related proteins, and there are many kinds of molecular species having similar structures in these proteins. These protein groups have different combinations depending on the type of animal. In the present invention, by analyzing the structure of these protein groups, that is, combinations of a plurality of proteins, the type of animal that is the source of animal hair fibers is identified.
  • a protein group constituting the animal hair fiber is extracted.
  • the protein can be extracted as long as the animal hair itself remains even if the surface of the animal hair fiber is disguised such as descaling. it can. This is in contrast to the fact that it is very difficult to extract DNA from animal hair fibers that have been camouflaged.
  • the present inventors examined the electrophoretic pattern by extracting protein groups in the same manner for animal hair fiber itself, ground raw hair, bleached animal hair, and descaled animal hair. As a result, it was confirmed that there was no significant change in these electrophoresis patterns. Therefore, in the present invention, the protein may be extracted after pulverizing the test animal hair fiber, or the protein may be extracted while maintaining the shape of the animal hair without pulverization. . However, since the degree of descaling is not known for the descaled animal hair fibers, it is preferable to extract the protein after pulverizing the test animal hair fibers to some extent.
  • the specific protein extraction operation is performed as follows. First, when the test animal hair fiber is dyed or the like, the electrophoretic pattern may be disturbed. In the present invention, it is preferable to perform the removal operation of dyes, finishes, adjuvants and the like before protein extraction. As a result, the subsequent electrophoresis step is not affected by the dye or the like, and the accuracy of the electrophoresis pattern is increased and accurate discrimination can be performed.
  • a washing solution containing deoxycholic acid and lauroylsarcosic acid is used so as not to extract protein, and 70 ° C. to 100 ° C., preferably about 90 ° C. to 95 ° C.
  • a method such as washing several times at the temperature is preferred.
  • aqueous solutions containing various surfactants can be generally used.
  • the surfactant to be used is not particularly limited as long as it is solubilized without damaging the protein.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • a reducing agent in combination with the extract.
  • these reducing agents include 2-mercaptoethanol (2-ME), dithiothreitol (DTT), tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP), and the like.
  • test animal hair fibers are immersed in an extract containing a combination of a surfactant and a reducing agent, and extracted at a temperature of about 70 ° C. to 100 ° C., preferably about 90 ° C. to 95 ° C. Repeat the collecting operation several times. After these extracts are collected, they are concentrated to a predetermined concentration and used in the subsequent electrophoresis step.
  • cysteine residue so that the cysteine residue of the protein does not form a disulfide bond again.
  • a general method may be used to block the cysteine residue, and examples thereof include a method of alkylating using iodoacetamide, iodoacetic acid, acrylamide and the like.
  • the total amount of the protein thus obtained is preferably quantified.
  • the electrophoresis method to be used is not particularly limited, and any method may be used.
  • polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE method) using sodium dodecyl sulfate (SDS) is used.
  • SDS-PAGE method polyacrylamide gel electrophoresis
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • a polyacrylamide gel used in the SDS-PAGE method has a three-dimensional structure by copolymerization of acrylamide and its cross-linking agent N, N′-methylenebisacrylamide.
  • the total of this acrylamide and N, N′-methylenebisacrylamide is called the gel concentration, and a gel of about 10% to 20% can be generally used.
  • the polyacrylamide gel used in the present invention is preferably about 15% to 20% in order to separate keratin proteins and the like with higher resolution.
  • the operation of the SDS-PAGE method is not particularly limited, and a general method may be used.
  • a general method may be used.
  • an internal standard for example, bovine serum albumin is used to correct the mobility of the electrophoresis pattern.
  • the gel after electrophoresis is stained with a staining solution.
  • Dye dyeing or silver dyeing is used for dyeing. Examples of the dye used include Coomassie Brilliant Blue-R (CBB-R).
  • CBB-R Coomassie Brilliant Blue-R
  • the gel stained in this way represents an electrophoretic pattern (also referred to as “gel image”) composed of a plurality of bands having different mobility depending on the molecular weight.
  • the electrophoresis pattern (gel image) obtained in this way is unique to the type of animal that is the source of animal hair fibers.
  • the electrophoresis pattern obtained in the electrophoresis step is compared with the electrophoresis patterns of several types of single animal hair fibers whose origins are known.
  • an electrophoresis pattern by the same process as described above is prepared in advance for several types of single animal hair fibers with known animal types.
  • electrophoresis patterns of several single animal hair fibers of known types of animal origin may be created at the same time. By doing in this way, more accurate discrimination can be performed.
  • FIG. 1 shows electrophoretic patterns of four types of animal hair fibers that are specifically prepared with known animal types.
  • FIG. 1 shows electrophoresis patterns (gel images) of A: cashmere (goat genus), B: camel (camel genus), C: wool (sheep genus) and D: yak (bovine genus).
  • the stained dark portion is a band containing protein.
  • the upper band has lower mobility and higher molecular weight.
  • the lower the band the higher the mobility and the lower the molecular weight.
  • FIG. 1 when comparing A: cashmere (goat genus) with other animal hair fibers, even in visual discrimination, B: camel (camel genus) has a significantly different band pattern than A: cashmere (goat genus). . Further, D: yak (genus Bovine) has lower concentrations of bands 3, 4, 5, 7 and band 8, and higher concentrations of bands 9 and 12 than A: cashmere (goats). Further, C: wool (sheep genus) has a narrower interval between bands 6 and 7 and no band 12 than A: cashmere (goat genus).
  • the gel image of the obtained electrophoretic pattern is captured by a scanner, the position of each band (corresponding to the molecular weight) is digitized as the mobility Rf, and the concentration of each band (corresponding to the protein amount) is quantified. At this time, it is preferable to correct the mobility Rf of the band between a plurality of samples.
  • FIG. 1 Each electrophoresis pattern (gel image) shown in FIG. 1 is captured by a scanner, the position and concentration of each band are quantified, and analysis charts showing the relationship between mobility Rf and concentration (peak) are shown in FIGS. Show. 2 and 3, the horizontal axis represents the mobility Rf (corresponding to the molecular weight), and the mobility Rf increases and the molecular weight decreases toward the right side. The vertical axis represents the concentration of each band (corresponding to the amount of protein). The higher the peak and the larger the area, the greater the amount of protein.
  • FIG. 2 is a comparison of electrophoresis patterns (analysis charts) of A: cashmere (goat genus) and D: yak (bovine genus).
  • D: Yak (bovine genus) clearly shows that A: Cashmere (goat genus) has lower concentrations of bands 3, 4, 5, 7 and 8 and higher concentrations of bands 9 and 12 It is shown.
  • FIG. 3 is a comparison of electrophoretic patterns (analysis charts) of A: cashmere (goat genus) and C: wool (sheep genus). It is clearly shown that C: wool (sheep genus) is narrower than A: cashmere (goat genus), and the band 6 and band 7 are narrower and the band 12 is absent.
  • the electrophoresis pattern of the test animal hair fiber is compared with the electrophoresis pattern of the single animal hair fiber whose source animal type is known.
  • the type of animal that is the origin of the test animal hair fiber can be identified.
  • the animal hair fiber discrimination method includes an extraction step, an electrophoresis step, and a first discrimination step, and further includes a second discrimination step, as in the first embodiment. Yes. Also in the second embodiment, first, a protein group constituting the animal hair fiber is extracted from the test animal hair fiber (extraction step). Next, the extracted protein group is separated by an electrophoresis apparatus to obtain an electrophoresis pattern based on a difference in molecular weight (electrophoresis step).
  • the animal hair fiber to be examined does not originate from a single animal, but a case where two or more animal hair fibers are mixed is targeted. That is, in the first discrimination step of the first embodiment, the electrophoresis pattern of a plurality of single animal hair fibers whose animal types are known does not match the electrophoresis pattern of the animal hair fibers to be tested. Employed when the type cannot be clearly identified.
  • mixed animal hair fibers obtained by mixing animal hair fibers having different kinds of origin animals at a series of mixing ratios are prepared, and a series of electrophoresis patterns for these are prepared in advance. Then, in the second discrimination step, the electrophoresis pattern of the obtained animal hair fiber is compared with a series of electrophoresis patterns of the mixed animal hair fiber prepared in advance.
  • test animal hair fiber originates from a plurality of animals.
  • animal hair fibers of the animal hair fibers to be mixed are mixed with each other, and how much the animal hair fibers are mixed. .
  • (2-1) Second discrimination step The obtained electrophoresis pattern (gel image) changes in proportion to the mixing rate of animal hair fibers.
  • the electrophoresis pattern of the test animal hair fiber obtained at the electrophoresis process is compared with the series of electrophoresis patterns of the mixed animal hair fiber prepared beforehand. For this reason, mixed animal hair fibers are prepared by mixing animal hair fibers of different origins at a series of mixing ratios, and a series of electrophoresis patterns by the same process as described above are prepared in advance.
  • FIG. 4 shows a series of electrophoretic patterns in which two types of animal hair fibers prepared specifically are mixed.
  • FIG. 4 shows the ratio of cashmere: yak to E: 100% vs. 0%, F: 70% vs. 30%, G for the animal hair fibers originating from cashmere (goat genus) and yak (genus bovine).
  • the upper band has lower mobility and higher molecular weight.
  • the lower the band the higher the mobility and the lower the molecular weight.
  • the cashmere (goat genus) 100% electrophoresis pattern (gel image) and the yak (bovine genus) 100% electrophoresis pattern (gel image) are clearly different, In the electrophoretic pattern (gel image) in which these are mixed, it can be seen that the concentration of each band gradually changes in proportion to the mixing ratio (see FIG. 4).
  • the gel image of the obtained electrophoresis pattern is captured by a scanner in the same manner as in the first embodiment, and the position (molecular weight of each band) is determined.
  • Correspondence may be digitized as mobility Rf, and the concentration of each band (corresponding to the amount of protein) may be quantified.
  • the electrophoresis pattern of the test animal hair fiber is compared with the electrophoresis pattern of a series of mixed animal hair fibers, and the position and concentration of each band, or the mobility Rf By confirming the peak area, it is possible to distinguish that the animal hair fiber to be tested is a mixture of cashmere (goat genus) and yak (bovine genus) animal hair fibers. In addition, it is possible to distinguish the mixed use ratio of animal hair fibers of cashmere (goat genus) and yak (genus bovine).
  • the method for distinguishing animal hair fibers according to the third embodiment measures the electrophoretic pattern analysis data described in the first embodiment with respect to many standard samples, and creates a database to determine the unknown. This makes it possible to objectively and stably distinguish the test animal hair fibers.
  • the hair fibers protein groups are extracted in the same manner as in the first embodiment (extraction step), and then the extracted protein groups are separated by an electrophoresis apparatus to obtain an electrophoresis pattern (electrophoresis step).
  • a gel image is captured with a scanner in the same manner as in the first embodiment, and the position of each band (corresponding to the molecular weight) is quantified as the mobility Rf.
  • the band concentration (corresponding to the amount of protein) is quantified as the peak area.
  • FIG. 5 shows cashmere (goat genus), camel (camel genus), wool (sheep genus), yak (bovine genus) raw hair (single animal fiber), and cashmere (goat genus) and yak (cow genus). It is the graph which visualized a part of database created from several standard samples about each mixing (mixed animal hair fiber).
  • FIG. 5 shows an example of a case where classification is made into two groups: J: cashmere (goat genus) group and K: other animal hair fibers (including mixed animal hair fibers).
  • the numerical data obtained by analyzing the electrophoresis pattern of the test animal hair fiber is collated with this database, and the test animal hair fiber is cashmere (goat genus), or other It is possible to discriminate whether it is an animal hair fiber (including mixed animal hair fiber).
  • animal fibers other than cashmere can be similarly identified.
  • increasing the standard sample of the mixed animal hair fibers it is possible to distinguish what animal hair fibers are mixed at what mixing ratio.
  • the animal hair fiber discrimination method according to the fourth embodiment is intended to further improve the discrimination accuracy in each of the discrimination methods similar to those of the first to third embodiments. Specifically, first, a polyacrylamide gel with high resolution is used in the electrophoresis step. In the extraction step, a specific reducing agent that improves the extraction efficiency of the protein is used. Furthermore, a “confirmation test” is used in order to improve the discrimination accuracy of the mixed rate of the test animal hair fiber by utilizing the clear electrophoresis pattern obtained by these. Hereinafter, these will be described.
  • polyacrylamide gel electrophoresis SDS-
  • sodium dodecyl sulfate SDS
  • PAGE method is preferably used. In this SDS-PAGE method, more accurate discrimination can be performed by using a polyacrylamide gel having higher resolution than before.
  • a gel with higher resolution means a region having a molecular weight of 25 kDa or less (hereinafter referred to as “a protein region peculiar to animal species”, which is considered to be particularly important for distinguishing animal species that are the origin of animal hair fibers in electrophoresis. ".” Specifically, it refers to an electrophoresis gel capable of decomposing into 10 or more bands having a resolution in a region having a molecular weight of 25 kDa or less with respect to an electrophoresis pattern of a single animal hair fiber originating from at least cashmere.
  • the method for improving the resolution of the polyacrylamide gel is not particularly limited.
  • the resolution may be improved by increasing the gel length (corresponding to the support distance).
  • a polyacrylamide gel used in the SDS-PAGE method is a gel having a gel length of about 8 cm (hereinafter referred to as “8 cm long gel”).
  • the keratin protein or the like can be separated with higher resolution by changing the gel length from an 8 cm gel to a 12 cm gel (hereinafter referred to as “12 cm long gel”).
  • FIG. 6 shows an electrophoresis pattern (gel image) obtained by using an 8 cm long gel and a 12 cm long gel for three types of animal hair fibers of known animal types.
  • FIG. 6 shows electrophoresis patterns (gel images) of A8: cashmere (goat), C8: wool (sheep) and D8: yak (bovine) obtained using a commonly used 8 cm long gel.
  • the stained dark portion is a band containing protein.
  • the upper band has lower mobility and higher molecular weight.
  • the lower the band the higher the mobility and the lower the molecular weight.
  • the lower region (region having a low molecular weight) having a high mobility is shown as a protein region (AREA-1) specific to an effective animal species.
  • This animal species-specific protein region (AREA-1) is a region having a molecular weight of 25 kDa or less.
  • FIG. 6 it can be seen that the resolution of the protein region (AREA-1) peculiar to animal species is improved in the 12 cm long gel compared to the 8 cm long gel.
  • FIG. 7 shows a comparison of an 8 cm long gel and a 12 cm long gel by extracting the cashmere (goat genus) electrophoresis pattern from the electrophoresis pattern (gel image) of FIG. 6.
  • the resolution of the animal region-specific protein region (AREA-1) is compared.
  • the electrophoresis pattern of cashmere (goat genus) in the case of an 8 cm long gel, it is decomposed into seven bands 3 to 9.
  • the case of a 12 cm long gel it is broken down into 10 bands 3 to 12.
  • a polyacrylamide gel having a high resolution such as a 12 cm long gel, it is possible to improve the discrimination accuracy of the test animal hair fiber.
  • a reducing agent that improves protein extraction efficiency
  • disulfide bonds (SS bonds) in the protein are reduced and cleaved.
  • a reducing agent in combination with the extract.
  • examples of these reducing agents include 2-mercaptoethanol (2-ME), dithiothreitol (DTT), tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP), and the like.
  • 2-mercaptoethanol (2-ME) or dithiothreitol (DTT) is preferably used.
  • the concentration of the reducing agent in the extract when using 2-mercaptoethanol (2-ME) is preferably greater than 6% by volume, and more preferably greater than 10%. More preferably.
  • the concentration of the reducing agent in the extract when dithiothreitol (DTT) is used is preferably 8 to 12 mM (mmol / liter) in terms of molar concentration, and more preferably about 10 mM (mmol / liter). More preferably it is used.
  • FIG. 8 shows an electrophoresis pattern (gel image) of yak (bovine genus) obtained using each of (concentration) dithiothreitol (DTT) (specifically, it will be described later in Examples).
  • the “confirmation test” here refers to the mixed use rate of the test animal hair fibers obtained in each of the discrimination steps of the second embodiment or the third embodiment.
  • a method of improving discrimination accuracy Specifically, first, an electrophoresis pattern (gel image) of the test animal hair fiber is obtained in the second embodiment or the third embodiment.
  • FIG. 9 shows electrophoresis patterns (gel images Y1-1, Y2-1) obtained for two types of test animal hair fibers (Y1, Y2). From these gel images (Y1-1, Y2-1), the mixing rate of the test animal hair fibers is predicted in the second discrimination step or the third discrimination step (specifically, it will be described later in Examples).
  • comparative animal hair fibers mixed at the same ratio as the predicted mixture ratio are prepared.
  • the electrophoresis pattern (gel images Y1-2, Y2-2 in FIG. 9) of the comparative animal hair fibers is obtained for the prepared comparative animal hair fibers in the same manner as in the second or third embodiment.
  • These gel images (Y1-2, Y2-2) are subjected to the second discrimination process or the third discrimination process again to obtain the mixed animal hair fiber mixing ratio (specifically in the examples). Will be described later).
  • the mixing rate of the comparative animal hair fibers obtained in this way is almost the same as the mixing rate when preparing the comparative animal hair fibers (same as the mixing rate of the test animal hair fibers obtained initially)
  • the accuracy of the mixing rate of the test animal hair fiber obtained initially is confirmed.
  • the animal hair fiber discrimination method according to the fifth embodiment is discriminated when the test animal hair fiber is composed of two specific types of animal hair fibers in the same discrimination method as in the second embodiment. It has the 4th discrimination process. In this fourth discrimination step, it is easy to discriminate the mixed rate of test animal hair fibers by focusing on the bands specific to these animal hair fibers without creating a database as in the third embodiment. In addition, it is intended to be performed with high accuracy.
  • the specific two types of animal hair fibers constituting the test animal hair fibers are not particularly limited, but in the electrophoresis pattern of each animal hair fiber, a specific band that can distinguish them Must exist.
  • a description will be given of a test animal hair fiber in which two kinds of animal hair fibers of cashmere (goat genus) and wool (sheep genus) are mixed.
  • FIG. 10 shows an electrophoresis pattern (A) of cashmere (goat genus) and an electrophoresis pattern (C) of wool (sheep genus) constituting the test animal hair fiber.
  • band 1 and band 2 are bands specific to cashmere (goat genus) and wool (sheep genus).
  • the test animal hair fiber is composed of cashmere (goat genus) and wool (sheep genus)
  • concentrations of band 1 and band 2 change corresponding to the change in the mixing ratio of the two kinds of animal hair fibers.
  • the change in the density of band 1 and band 2 can be clearly discriminated corresponding to the change in the mixing ratio of the two kinds of animal hair fibers. Therefore, by analyzing the electrophoresis pattern for the test animal hair fiber, an analysis chart showing the relationship between the mobility Rf and the concentration is obtained and compared with the analysis chart (Z22 to Z26) of FIG. It is possible to easily distinguish the mixed ratio of fibers with high accuracy (specifically, it will be described later in Examples).
  • the animal hair fiber identification method includes an extraction process, an electrophoresis process, a cutting process, a digestion process, a mass spectrometry process, and a fifth identification process.
  • a protein group is extracted from the test animal hair fiber (extraction step), and the extracted protein group is separated by an electrophoresis apparatus and subjected to electrophoresis. A pattern is obtained (electrophoresis step).
  • a predetermined band is cut out from a plurality of bands forming the electrophoresis pattern from the electrophoresis pattern of the obtained animal hair fibers (cutting step).
  • the protein in the cut out band is digested with a predetermined digestive enzyme and divided into a series of peptides (digestion step).
  • the obtained peptide group is analyzed by a mass spectrometer to obtain a mass analysis pattern (peptide pattern) based on a difference in molecular weight of each peptide (mass analysis step).
  • the electrophoresis pattern of the protein group extracted from animal hair is unique to the animal type.
  • the length and amino acid sequence of peptides produced when these proteins are cleaved at a specific amino acid moiety are also specific to the animal type. Based on this, by comparing the mass analysis pattern of the obtained animal hair fibers with the mass analysis pattern of several animal hair fibers of known origin, The type of animal that is the origin is identified (fifth identification step).
  • steps following the cutting step can be performed using the electrophoresis pattern (gel sample) obtained in the first embodiment.
  • a predetermined band (gel slice) is cut out from a plurality of bands forming the electrophoresis pattern from the electrophoresis pattern (gel sample) obtained in the electrophoresis step.
  • the band to be cut out needs to be a band existing at the mobility Rf common to the single animal hair fiber. Therefore, for the test animal hair fiber whose origin is unknown, it is preferable that the band exists in the mobility Rf common to a plurality of main single animal hair fibers.
  • the band to be cut out preferably has a protein whose molecular weight is not so large.
  • a band having a molecular weight of 30 kDa or less, preferably 20 kDa or less, and more preferably 10 kDa is preferable. This is because when the molecular weight of the protein present in the band is larger than 30 kDa, many peptides appear in the subsequent digestion process, the resolution is lowered in the mass spectrometric process, and clear discrimination cannot be performed.
  • the excised band (gel) is treated by a usual method.
  • a digestive enzyme is made to act on the protein in this cut-out gel, and it cut
  • the method for allowing a digestive enzyme to act on the protein in the gel is not particularly limited, but it is generally preferable to perform in-gel digestion.
  • the digestive enzyme used for this in-gel digestion is not particularly limited.
  • digestive enzymes generally used for digesting proteins such as trypsin, chymotrypsin, Lys-C, and Glu-C can be used.
  • keratin protein particularly a protein with a small molecular weight
  • Lys-C which is a kind of endoprotease that cleaves a protein from the C-side end of lysine, which is a kind of amino acid constituting the protein. Is preferably used.
  • Lys-C the appearance amount of the peptide becomes appropriate, the resolution is improved in the subsequent mass analysis step, and a clear discrimination can be made.
  • the accuracy of mass spectrometry is greatly improved by cutting out a protein having a relatively small molecular weight in the cutting step and further using a specific digestive enzyme called Lys-C. .
  • Mass Spectrometry Step Next, separation and mass analysis of each peptide are performed on the obtained peptide group of the animal hair fiber.
  • various ionization methods and mass detection methods may be combined.
  • the ionization technique for example, MALDI (Matrix-assisted laser deformation / ionization), ESI (Electrospray ionization), NSI (Nano-spray ionization), or the like is used.
  • a TOF (Time of Flight) method, an ion trap method, a quadrupole method, or the like is used as a mass detection method.
  • LC-MS mass spectrometer
  • TOF-MS time-of-flight mass spectrometer
  • nano liquid chromatography tandem mass spectrometer nanoLC-MS / MS
  • NSI NSI with a high S / N ratio and liquid chromatography
  • the obtained mass spectrometry pattern is composed of a plurality of peaks having different retention times depending on the molecular weight.
  • the mass analysis pattern obtained in this way is specific to the type of animal that is the origin of animal hair fibers.
  • the mass analysis pattern obtained in the mass analysis step is compared with mass analysis patterns of several types of single animal hair fibers whose origins are known.
  • mass analysis patterns by the same process as described above are prepared in advance for several types of single animal hair fibers with known animal types. Further, when creating a mass analysis pattern of test animal hair fibers, mass analysis patterns of several types of single animal hair fibers whose origins are known may be created at the same time. By doing in this way, more accurate discrimination can be performed.
  • FIG. 6 shows mass analysis patterns of four types of animal hair fibers that have been specifically created and whose types of animals are known.
  • FIG. 6 shows mass spectrometry patterns of L: cashmere (goat genus), M: camel (camel genus), N: wool (sheep genus) and O: yak (bovine genus).
  • L cashmere (goat genus)
  • M camel
  • N wool
  • O yak (bovine genus).
  • the peak on the left side has a shorter retention time and a smaller molecular weight of the peptide.
  • the peak on the right side has a longer retention time and a higher molecular weight of the peptide.
  • the area value of each peak (corresponding to the amount of peptide) with respect to the position of each peak (retention time: corresponding to the degree of hydrophobicity and molecular weight) of the obtained mass spectrometry pattern is quantified.
  • the mass analysis pattern of the test animal hair fiber is compared with the mass analysis pattern of the single animal hair fiber whose source animal type is known, and the position of each peak.
  • the type of animal that is the origin of the test animal hair fiber.
  • the animal hair fiber discrimination method includes an extraction step, an electrophoresis step, a cutting step, a digestion step, a mass analysis step, and a fifth discrimination step, as in the sixth embodiment. Furthermore, it has a sixth discrimination process. Also in the seventh embodiment, first, a protein group constituting the animal hair fiber is extracted from the test animal hair fiber (extraction step). Next, the extracted protein group is separated by an electrophoresis apparatus to obtain an electrophoresis pattern based on a difference in molecular weight (electrophoresis step).
  • a predetermined band is cut out from a plurality of bands forming the electrophoretic pattern from the electrophoretic pattern of the obtained test animal hair fiber (cutting step).
  • the protein in the cut out band is digested with a predetermined digestive enzyme and divided into a series of peptides (digestion step).
  • the obtained peptide group is separated and analyzed by a mass spectrometer to obtain a mass analysis pattern based on a difference in molecular weight of each peptide (mass analysis step).
  • the subject animal hair fiber does not originate from a single animal type, but a case where two or more animal hair fibers are mixed. That is, in the fifth discrimination step of the sixth embodiment, the mass analysis pattern of a plurality of animal hair fibers whose origins are known is not compatible with the mass analysis pattern of the animal hair fiber to be examined. Employed when the type cannot be clearly identified.
  • mixed animal hair fibers prepared by mixing animal hair fibers of different types of animals as the origin at a series of mixing ratios are prepared, and a series of mass analysis patterns for these are prepared in advance. Then, in the sixth discrimination step, the electrophoresis pattern of the obtained animal hair fiber is compared with a series of mass analysis patterns of the mixed animal hair fiber prepared in advance.
  • test animal hair fiber originates from a plurality of animals.
  • animal hair fibers of the animal hair fibers to be mixed are mixed with each other, and how much the animal hair fibers are mixed. .
  • the extraction process and the electrophoresis process in the seventh embodiment are the same as those in the first embodiment, and the cutting process, the digestion process, and the mass spectrometry process are the same as those in the sixth embodiment. The explanation is omitted here.
  • the obtained mass spectrometry pattern is composed of a plurality of peaks having different retention times depending on the molecular weight as in the fifth identification process.
  • This mass spectrometric pattern changes in proportion to the mixed rate of the animal type that is the origin of animal hair fibers.
  • the area value (corresponding to the amount of peptide) of each peak with respect to the position of each peak (retention time: corresponding to the degree of hydrophobicity and molecular weight) of the obtained mass spectrometry pattern is quantified.
  • the mass analysis pattern of the test animal hair fibers is compared with the mass analysis pattern of a series of mixed animal hair fibers, and the relationship between the retention time of each peak and the area value is confirmed. By doing so, it can be distinguished that the test animal hair fiber originates from a plurality of animals.
  • the animal hair fibers to be tested should be accurately identified as to what kind of animal hair fibers are mixed, and at what degree of mixing these animal hair fibers. Can do.
  • the method for differentiating animal hair fibers according to the eighth embodiment measures the mass spectrometry pattern analysis data described in the sixth embodiment with respect to many standard samples, and creates a database to determine the unknown. This makes it possible to objectively and stably distinguish the test animal hair fibers.
  • the area value of each peak (corresponding to the peptide amount) with respect to the position of each peak (retention time: corresponding to hydrophobicity and molecular weight) in the same manner as in the sixth embodiment.
  • Quantify By making a lot of the numerical data obtained in this way into a database together with the history of the standard sample, objective discrimination can be performed in the seventh discrimination step. A specific method will be described in Examples described later.
  • FIG. 13 shows a graph in which the known mixed rate of these groups is plotted on the vertical axis and the mixed rate predicted from the database is plotted on the horizontal axis.
  • FIG. 13 is classified into three groups: P: cashmere (goat genus) group, Q: cashmere (goat genus) and yak (bovine genus) mixed group, and R: other animal hair fiber group. ing. Furthermore, in FIG. 13, the mixed ratio of cashmere (goat genus) and yak (genus bovine) is accurately shown on a straight line.
  • the numerical data obtained by analyzing the mass analysis pattern of the test animal hair fiber is collated with this database, and whether the test animal hair fiber is cashmere (goat genus) or cashmere (goat). It is possible to discriminate whether it is a mixture of genus) and yak (genus Bovine) or other animal hair fibers. Furthermore, when the test animal hair fiber is a mixture of cashmere (goat genus) and yak (bovine genus), the mixed use rate can be accurately distinguished.
  • animal fibers other than cashmere (goats) and mixed animal fibers other than cashmere (goats) and yaks (bovines) can be identified in the same way. It is.
  • test samples 92 standard samples shown below as animal hair fibers and 3 types of test animal hair fibers (hereinafter also referred to as “test samples”). Prepared.)
  • a single animal hair fiber (Toyobo Industries Co., Ltd.) dyed with cashmere as the test sample 1 and a single animal fiber (Yobu Tree Corporation) dyed with yak as the test sample 2 Prepared.
  • the mixed animal hair fiber which mixed cashmere and the yak raw hair (CCMI) so that it might become 7: 3 by weight ratio as the test sample 3 was prepared. The origin of the test sample was tested in such a way that the inspector did not know it.
  • Example 1 based on the first embodiment and the second embodiment, three types of test samples are discriminated from the electrophoresis pattern.
  • cleaning operation was performed before protein extraction.
  • protein extraction was performed without performing a washing operation.
  • the washing operation was performed by adding 250 ⁇ L of a washing solution (12 mM deoxycholic acid, 12 mM lauroyl sarcosic acid, 100 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0)) to a 10 mg sample. After suspending the sample soaked in the washing solution, the sample was heated at 95 ° C. for 20 minutes. Then, after centrifuging at 15000 ⁇ g for 10 minutes, the supernatant was removed. The above washing operation was performed 3 times in total.
  • Protein extraction was performed by adding 250 ⁇ L of extraction solution (2% -SDS, 6% -2-ME, 125 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8)) to 10 mg sample, and at 95 ° C. for 20 minutes. Heated. Thereafter, the mixture was centrifuged at 15000 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant was recovered as a protein extract. The extraction operation was repeated twice in total.
  • extraction solution 2% -SDS, 6% -2-ME, 125 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8)
  • Acetone precipitation was performed to concentrate the protein before electrophoresis.
  • For the acetone precipitation first, three times the amount of cold acetone was added to the sample amount and stirred. The sample was allowed to stand at ⁇ 80 ° C. for 3 hours, and then centrifuged at 15000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C. After removing the supernatant, the sample was dried with a centrifugal concentrator CC-105 (Tomy Seiko Co., Ltd.). The protein was dissolved in 60 ⁇ L of extract (2% -SDS, 6% -2-ME, 125 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8)).
  • each protein group extracted from the test samples 1 to 3 was subjected to electrophoresis as follows.
  • 20 ug of protein was used.
  • the sample was prepared with an equal volume of sample preparation solution for electrophoresis (4% -SDS, 12% -2-ME, 250 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8), 20% -glycerol, 0.02% -Bromophenol blue) and 1 ng BSA (internal standard) and then heated at 95 ° C. for 5 minutes.
  • the electrophoresis tank used was BE-211 (Biocraft Co., Ltd.), and the protein was separated using 20% SDS-polyacrylamide gel (Tefco Co., Ltd .: 8 cm long gel).
  • Electrophoresis was performed at a constant current of 25 mA per sheet.
  • 3 ⁇ L of BlueStar Prestained Protein Marker (Nippon Genetics) was used for electrophoresis.
  • the gel after electrophoresis was shaken with a 7.5% -acetic acid solution for 15 minutes and then shaken with a staining solution (0.25% -CBB-R, 50% -methanol, 10% -acetic acid) for 20 minutes.
  • a staining solution 0.25% -CBB-R, 50% -methanol, 10% -acetic acid
  • the electrophoresis patterns of the test samples 1 to 3 were obtained.
  • the electrophoresis pattern of the obtained test sample 1 is shown in FIG. In FIG. 14, the gel image is indicated by S1, and the analysis chart is indicated by S2.
  • the electrophoresis pattern of the obtained test sample 2 is shown in FIG. In FIG. 15, the gel image is indicated by T1, and the analysis chart is indicated by T2.
  • the electrophoresis pattern of the obtained test sample 3 is shown in FIG. In FIG. 16, the gel image is indicated by U1, and the analysis chart is indicated by U2.
  • the electrophoresis patterns of the obtained test samples 1 to 3 were compared with the electrophoresis patterns of the standard samples.
  • the electrophoresis pattern of the standard sample the electrophoresis patterns of A: cashmere, B: camel, C: wool and D: yak shown in FIGS. 1 to 3 described above were used.
  • the band 7 is darker than the band 6 and the interval between both bands is wider than that of the standard sample C: wool. Therefore, the test sample 1 was determined to be cashmere.
  • the darkness of the bands 3, 4, 5 and 6 is equivalent to the band 7, and the band 9 is darker than the band 8.
  • Yak was determined.
  • the darkness of the bands 3, 4, 5, and 6 with respect to the band 1 or 2 is thinner than that of the standard sample A: cashmere, and the bands 9 and 12 with respect to the band 8. From this, the test sample 3 was determined to be a mixture of cashmere and yak.
  • Example 2 based on the third embodiment, three types of test samples are distinguished from the electrophoresis pattern database.
  • the mobility Rf of the bands of about 70 kDa (BSA: internal standard), 60 kDa, 50 kDa, 20 kDa, 15 kDa, 10 kDa is extracted for each sample, and compared with the mobility Rf of the standard sample (cashmere-A3, CCMI).
  • An approximate curve (secondary equation) was created.
  • the mobility Rf in each sample was corrected using the coefficient obtained from the approximate curve.
  • the intensity at each mobility Rf was corrected by the intensity of the total band.
  • Numeral data of 92 types of standard samples is SIMCA® ver. Classification by principal component analysis using 13.0 (Umetrics). As a result of the principal component analysis, it was classified into two groups: a cashmere group and another animal hair fiber (non-cashmere) group (see FIG. 5).
  • Example 3 is for discriminating three kinds of test samples from a mass analysis pattern database of peptide groups based on the eighth embodiment.
  • each gel sample obtained in the electrophoresis process of the standard sample and the test sample in Example 1 was used.
  • Lys-C solution (0.01 ug / ⁇ L, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the gel and allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 70 ⁇ L of Lys-C solution was added and allowed to stand at room temperature for 65 minutes. After adding 20 ⁇ L of 50 mM ammonium hydrogen carbonate solution, the solution was allowed to stand at 37 ° C. overnight. The supernatant was collected after digestion and 100 ⁇ L of 30% -acetonitrile, 3% -trifluoroacetic acid (TFA) was added to the gel. After the gel was stirred with Deep Well Maximizer (10 minutes, 25 ° C., 1500 rpm), the supernatant was collected. This operation was performed again. After adding 100 ⁇ L of acetonitrile to the gel, the mixture was stirred with Deep Well Maximizer (10 minutes, 25 ° C., 1500 rpm), and the supernatant was collected. This operation was performed again.
  • Deep Well Maximizer
  • the mass spectrometric pattern of the obtained test sample 1 is shown in FIG.
  • the mass spectrometric pattern of the obtained test sample 2 is shown in FIG.
  • the mass spectrometric pattern of the obtained test sample 3 is shown in FIG.
  • the peak area value of each peptide was corrected with the total peak area value.
  • the numerical data of 92 kinds of standard samples were grouped by principal component analysis using SIMCA ver.13.0. As a result of the principal component analysis, it is classified into three groups: a cashmere group, a non-cashmere group, and a cashmere and other animal fiber mixed group (in this embodiment, a cashmere and yak mixed group). It was done.
  • test sample 2 was classified into a non-cashmere group.
  • test sample 3 was classified into a mixed cashmere / yak group.
  • test sample 3 is And plotted at a weight ratio of 7: 3.
  • the discrimination operation is relatively simple and objective, can be discriminated without relying on the experience and know-how of the inspector, and the animal fiber is pretreated and dyed. Even if it exists, the discrimination method of the animal hair fiber which can obtain an exact discrimination result can be provided.
  • Example 4 uses a polyacrylamide gel with high resolution based on the fourth embodiment (see FIGS. 6 and 7).
  • Each database was constructed using patterns. Using each of the obtained databases, the mixed ratios for five types of test samples with known mixed ratios were predicted.
  • Average prediction accuracy ⁇
  • the average prediction accuracy ( ⁇ standard deviation) when using a commonly used 8 cm long gel was 14.4 ⁇ 10.1%.
  • the average prediction accuracy ( ⁇ standard deviation) when using a 12 cm long gel is 6.8 ⁇ 7.8%.
  • the average prediction is higher than the conventional one. The accuracy has been improved about twice.
  • Example 5 uses a reducing agent that improves protein extraction efficiency based on the fourth embodiment.
  • 6% 2-mercaptoethanol (2-ME) hereinafter referred to as “6% -2ME”
  • 15% 2-mercaptoethanol in terms of volume% concentration
  • 2-ME) hereinafter referred to as “15% -2ME”
  • 10 mM dithiothreitol hereinafter referred to as “10 mM-DTT”
  • An electrophoresis pattern was obtained (see FIG. 8).
  • the actual mixed rate of the test sample was 100% yak.
  • the predicted blending rate obtained with 6% -2ME was 24.8% wool.
  • the predicted mixture ratio obtained with 15% -2ME was greatly improved to 2.8% for wool.
  • the cashmere prediction mixture ratio was below 0%, and the yak prediction mixture ratio was above 100%.
  • the predicted mixed rate is less than 0%, the actual mixed rate can be determined to be 0% almost without exception.
  • the predicted mixed rate exceeds 100%, the actual mixed rate can be determined as 100% almost without exception.
  • the predicted mixed use rate obtained with 10 mM-DTT exceeded 100% for the predicted mixed use rate of yak, and the predicted mixed use rate for cashmere and yak both fell below 0%. From this, it can be determined that yak is 100% from the predicted mixed use rate obtained with 10 mM-DTT.
  • Example 6 uses the “verification calculation test” based on the fourth embodiment.
  • electrophoresis patterns are obtained for two types of test samples (Y1, Y2) whose mixing ratios are known.
  • FIG. 9 shows the electrophoresis pattern of the test sample (Y1) as a gel image (Y1-1). Further, the electrophoresis pattern of the test sample (Y2) is shown by a gel image (Y2-1).
  • Example 6 the mixed rate of the test samples (Y1, Y2) was predicted from these gel images (Y1-1, Y2-1) in the same manner as in the second discrimination step of the second embodiment.
  • first comparison sample the first comparative animal hair fiber mixed with the same ratio as the predicted mixed use rate using a plurality of single animal hair fibers whose origins are known.
  • the electrophoresis pattern (Y1-2, Y2-2) of the first comparative sample is obtained for the prepared first comparative sample in the same manner as in the second embodiment (see FIG. 9).
  • the actual mixed rate of the test samples (Y1, Y2) is known.
  • the mixed rate of the test sample is unknown. Therefore, in actual discrimination, the electrophoresis pattern (Y1-2, Y2-2) obtained from the first comparison sample is compared with the electrophoresis pattern (Y1-1, Y2-1) of the test sample. If these electrophoretic patterns substantially match, it can be determined that the predicted mixed use rate initially obtained from the test sample is accurate.
  • a second comparative animal hair fiber (hereinafter referred to as “second comparison sample”), which is modified using a plurality of single animal hair fibers whose origins are known, with reference to the mixed ratio of the first comparison sample. ) Is prepared.
  • the electrophoresis pattern (Y1-3, Y2-3) of the second comparative sample is obtained for the prepared second comparative sample in the same manner as in the second embodiment (see FIG. 9).
  • the electrophoresis pattern (Y1-3, Y2-3) obtained from the second comparative sample is compared with the electrophoresis pattern (Y1-1, Y2-1) of the test sample. The same operation is repeated until these electrophoresis patterns almost coincide.
  • Table 2 shows values of the actual mixed rate of the test samples (Y1, Y2) in Example 6, the mixed rate of each first comparative sample, and the mixed rate of each second comparative sample.
  • the band characteristic for wool (band 1 in FIG. 9) is darker than the test sample, and is still The accuracy is not good.
  • the electrophoresis pattern of the second comparative sample prepared with reference to the mixed ratio (%) of the first comparative sample is similar to the test sample (see FIG. 9).
  • Example 7 is based on the fifth embodiment, and the database is created when the test sample is composed of two kinds of animal hair fibers of cashmere (goat genus) and wool (sheep genus). In addition, discrimination of the mixed rate of the test sample is performed easily and with high accuracy.
  • FIG. 10 shows an electrophoresis pattern (A) of 100% cashmere and an electrophoresis pattern (C) of 100% wool constituting the test sample (Y3) in Example 7.
  • band 1 and band 2 are bands specific to cashmere (goat genus) and wool (sheep genus).
  • concentrations of band 1 and band 2 change corresponding to the change in the mixing ratio of the two kinds of animal hair fibers.
  • the change in the density of band 1 and band 2 can be clearly discriminated corresponding to the change in the mixture ratio of cashmere and wool.
  • Example 7 an electrophoresis pattern is obtained for a test sample (Y3) with a known mixing rate (gel image Y3-1 in FIG. 10). Next, the gel image (Y3-1) is analyzed to obtain an analysis chart (Y3-2) showing the relationship between the mobility Rf and the concentration (see FIG. 11). Next, the analysis chart (Y3-2) of the obtained test sample (Y3) is compared with the analysis charts (Z22 to Z26) of the standard samples obtained in advance.
  • the discrimination operation is relatively simple and objective, can be discriminated without relying on the experience and know-how of the inspector, and the animal fiber is pretreated and dyed. Even if it exists, the discrimination method of the animal hair fiber which can obtain an exact discrimination result can be provided.
  • the correction of the band intensity is corrected by the ratio of the total band to the intensity.
  • the correction is not limited to this, and the correction is performed by the ratio of the specific band to the intensity (for example, BSA: internal standard). May be.
  • BSA internal standard
  • the correction of the peak area value is corrected by the ratio to the total peak area value, but the present invention is not limited to this, and the correction may be made by the ratio to the peak area value of a specific peptide.
  • Example 3 the peptide group is analyzed by LC-MS / MS, but the present invention is not limited to this, and an ultraviolet-visible spectroscopic detector may be employed as the LC detector. 4).
  • the peptide group is analyzed by LC-MS / MS.
  • the present invention is not limited to this, and the Cleveland method or the like may be used. 5.
  • extraction is performed without pulverizing animal hair fibers during protein extraction.
  • the present invention is not limited to this, and protein is extracted after pulverizing animal hair fibers. Also good. In particular, regarding the descaled animal hair fibers, a clear electrophoresis pattern can be easily obtained by finely crushing before extracting the protein. 6).
  • an approximate expression based on a quadratic expression is used to correct the mobility Rf.
  • the present invention is not limited to this, and a cubic expression or the like may be used as long as it can be corrected accurately. 7).
  • the approximate expression based on the quadratic expression is used to correct the retention time in the LC-MS / MS.
  • the present invention is not limited to this. May be. 8).
  • the electrophoresis pattern of the comparative sample was obtained in the same manner as in the second embodiment. Therefore, the coincidence between the comparative sample and the test sample was judged by comparing the electrophoresis patterns of both samples.
  • the present invention is not limited to this, and the mixed use rate of the comparative sample may be predicted from the database in the same manner as in the third embodiment.
  • the match rate of the comparative animal hair fibers obtained from the database coincides with the mix rate when preparing the comparative animal hair fibers (same as the mix rate of the test animal hair fibers obtained from the database). Try to judge gender.
  • Disguised fiber products that are mixed with high-quality animal hair fibers such as cashmere and other cheap animal hair fibers are on the market.
  • a rapid and accurate identification method is desired at the time of import / export.
  • the present invention provides an accurate discrimination means for such market demands and does not rely on the experience and know-how of the inspector unlike the conventional method.
  • camouflage is clever, it is not possible to objectively discriminate the type of animal that is the origin of animal hair fibers, and there has never been an accurate discrimination result even if camouflaged. It will be an epoch-making discrimination tool.
  • the present invention provides an effective discrimination means for market stability and international fair trade, and is simply a conventional method JIS L 1030-1 (Fiber product mixture rate test method-1st Part: Fiber discrimination) and JIS L 1030-2 (Fiber product mixing rate test method-Part 2: Fiber mixing rate) be able to.
  • Mass spectrometry pattern of cashmere M ... Camel mass spectrometry pattern
  • N Mass spectrometry pattern of wool
  • O ... yak mass spectrometry pattern
  • P Cashmere group in the mass spectrometry pattern database
  • Q Group of cashmere and yak mixed animal hair fibers in the mass spectrometry pattern database
  • R Other animal hair fiber groups in the mass spectrometry pattern database
  • S electrophoresis pattern of test animal hair fiber (cashmere)
  • T electrophoresis pattern of test animal hair fiber (yak)
  • U electrophoresis pattern of test animal hair fiber (mixed cashmere and yak)
  • V Mass analysis pattern of test animal hair fiber (cashmere)
  • W Mass analysis pattern of test animal hair fiber
  • AREA-1 Protein region specific to animal species, AREA-2: Common protein region.

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Abstract

　鑑別操作が比較的簡単で客観性を有し、検査員の経験やノウハウに頼ることなく鑑別でき、且つ、獣毛繊維に前処理や染色加工がなされている場合でも、正確な鑑別結果を得ることのできる獣毛繊維の鑑別方法を提供する。　被検獣毛繊維から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する抽出工程、抽出したタンパク質群を電気泳動手段により分離して電気泳動パターンを得る電気泳動工程、及び、得られた電気泳動パターンを予め準備した起源となる動物の種類及び混用率が既知の獣毛繊維の電気泳動パターンと比較して、被検獣毛繊維の起源となる動物の種類或いはその混用率を鑑別する鑑別工程を有する。更に高精度の鑑別を行うために、電気泳動パターンの特定バンドから得たペプチド群を分析する質量分析工程を組み合わせる。

Description

獣毛繊維の鑑別方法
　本発明は、獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別する獣毛繊維の鑑別方法に関するものである。また、本発明は、起源の異なる獣毛繊維が混合されたものを鑑別し、更に、それらの混用率を鑑別する獣毛繊維の鑑別方法に関するものである。
　市場には多くの獣毛繊維を用いた繊維製品が高級品として流通している。獣毛繊維の中でも特に高級品とされるカシミヤを用いた繊維製品には、他の獣毛繊維を混合しての偽装が多く行われている。従って、一般の消費者が繊維製品を購入する際に偽装を見分けることができず、公正取引上の大きな問題となっている。例えば、カシミヤ（ヤギ属）と見分けが付きにくいヤク（ウシ属）の毛を混合し、或いは、ウール（ヒツジ属）のスケールを除去（「脱スケール」という。）して混合するなど手の込んだ偽装が行われている。
　そこで、繊維製品の輸出入の際には、各国の繊維関係の検査機関で鑑別して取引の安全を図っている。これらの検査機関では、例えば日本においては、ＪＩＳ Ｌ １０３０‐１（繊維製品の混用率試験方法‐第１部：繊維鑑別）、及び、ＪＩＳ Ｌ １０３０‐２（繊維製品の混用率試験方法‐第２部：繊維混用率）に基づいて鑑別を行っている。
　この鑑別方法において獣毛繊維を鑑別するには、検査員が光学顕微鏡を用いて目視により検査対象の獣毛繊維を標準写真見本と対比させて行っている。また、この鑑別方法において獣毛繊維の混用率を求めるには、検査員が光学顕微鏡を用いて目視により検査対象の獣毛繊維に含まれる異種の獣毛繊維の本数や直径を求め、或いは、分別してそれぞれの重量を測定するなどの方法で行っている。
　従って、これらの方法においては、各検査機関の検査員の経験とノウハウの違いによる鑑別結果のばらつきが生じるという問題があった。また、混用率を求める場合には、検査員による非常に煩雑で長時間に亘る作業が伴うという問題があった。更に、獣毛繊維に手の込んだ偽装が行われている場合には、上記方法のみでは正確な鑑別が行えないという問題があった。
　これに対して、上記の光学顕微鏡を用いた目視による鑑別方法を補完する方法が提案されている。例えば、下記特許文献１においては、ＤＮＡによる獣毛繊維の同定方法が提案されている。この方法によれば、獣毛繊維試料から抽出したＤＮＡと動物種に特異的なプライマーを用いてポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によってＤＮＡを増幅し、この増幅成分の塩基配列を分析して獣毛繊維試料の起源となる動物種を鑑別するというものである。
　また、下記特許文献２においては、獣毛繊維製品中の獣毛繊維の混用率鑑定法が提案されている。この方法によれば、獣毛繊維試料から抽出したＤＮＡと動物種に特異的なプライマーと当該プライマーによって増幅される配列を特異的に検出するプローブを用いてリアルタイムＰＣＲを行って、各動物種由来のＤＮＡ量の相対値の比率を求め、予め用意された一連の標準混合獣毛繊維のＤＮＡ量の相対値の比率との対応表に基づいて獣毛繊維の混用率を鑑別するというものである。
特開２０００－２１００８４号公報 特開２００４－１２１２２９号公報
　上記特許文献１の同定方法、及び、上記特許文献２の混用率鑑定法は、いずれも獣毛繊維から抽出したＤＮＡの遺伝子配列により、獣毛繊維の起源となる動物種或いはその混用率を鑑別するものである。これらの方法は、動物種ごとに遺伝子配列が異なることを利用するものであり、生物学的に客観的な結果を与えることが期待される。
　しかし、鑑別の試料となる獣毛繊維からＤＮＡを抽出し、これを増幅する操作は非常に煩雑であり、多くの繊維関係の検査機関で通常業務として行うことは容易ではない。また、市場に流通する繊維製品は、通常、種々の前処理や染色加工がなされている。これらの前処理や染色加工は、獣毛繊維に対して物理的或いは化学的な方法で行われ、獣毛繊維自体に何らかのダメージを与えている。従って、前処理や染色加工がなされた獣毛繊維から損傷のないＤＮＡを抽出することは困難であり、正確な鑑別を行うことができないという問題があった。
　そこで、本発明は、上記問題に対処して、鑑別操作が比較的簡単で客観性を有し、検査員の経験やノウハウに頼ることなく鑑別でき、且つ、獣毛繊維に前処理や染色加工がなされている場合でも、正確な鑑別結果を得ることのできる獣毛繊維の鑑別方法を提供することを目的とする。
　上記課題の解決にあたり、本発明者らは、鋭意研究の結果、獣毛繊維を構成するタンパク質に着目し、獣毛繊維から抽出したタンパク質群の組み合わせが、獣毛繊維の起源となる動物の種類により異なることを発見した。また、これらのタンパク質群から取り出した特定のタンパク質に由来するペプチド群の組み合わせが、獣毛繊維の起源となる動物の種類により異なることを発見した。これらの発見から、本発明者らは本発明の完成に至った。
　即ち、本発明に係る獣毛繊維の鑑別方法は、請求項１の記載によると、
　被検獣毛繊維から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する抽出工程、
　抽出した前記タンパク質群を電気泳動手段により分離して電気泳動パターンを得る電気泳動工程、及び、
　得られた前記電気泳動パターンを予め準備した起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の電気泳動パターンと比較して、前記被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別する第１鑑別工程を有している。
　また、本発明は、請求項２の記載によると、請求項１に記載の獣毛繊維の鑑別方法であって、
　予め準備した起源となる動物の種類が異なる獣毛繊維を一連の混用率で混合した混合獣毛繊維に対して、前記抽出工程及び前記電気泳動工程と同様にして一連の電気泳動パターンを得ておき、
　前記被検獣毛繊維から得られた電気泳動パターンを前記混合獣毛繊維から得られた一連の電気泳動パターンと比較して、前記被検獣毛繊維が少なくとも２種類の動物を起源とすること、前記被検獣毛繊維の起源となる少なくとも２種類の動物の種類、及び／又は、前記被検獣毛繊維の混用率を鑑別する第２鑑別工程を有することを特徴とする。
　また、本発明は、請求項３の記載によると、請求項２に記載の獣毛繊維の鑑別方法であって、
　前記単一獣毛繊維の電気泳動パターン、及び、前記混合獣毛繊維から得られた一連の電気泳動パターンについて、それぞれ、各バンドの濃度と移動度との関係を解析してデータベースとして蓄積する工程、
　前記被検獣毛繊維から得られた前記電気泳動パターンについて、各バンドの濃度と移動度との関係を解析する工程、及び、
　前記被検獣毛繊維の解析データを前記データベースのデータ群と照合して、前記解析データと前記データベースのデータ群との一致性を指標として、前記被検獣毛繊維が少なくとも２種類の動物を起源とすること、前記被検獣毛繊維の起源となる少なくとも２種類の動物の種類、及び／又は、前記被検獣毛繊維の混用率を鑑別する第３鑑別工程を有することを特徴とする。
　また、本発明は、請求項４の記載によると、請求項２又は３に記載の獣毛繊維の鑑別方法であって、
　前記第２鑑別工程又は前記第３鑑別工程において得られた前記被検獣毛繊維の混用率を用いて、起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維を前記混用率と同じ比率で混合した比較獣毛繊維の電気泳動パターンを得るための各工程、及び、
　得られた前記比較獣毛繊維の電気泳動パターンに対して、再度、前記第２鑑別工程又は前記第３鑑別工程の鑑別を行うための各工程を
　少なくとも１回以上繰り返すことにより、前記被検獣毛繊維の混用率と前記比較獣毛繊維の混用率の一致性を向上させることにより、前記被検獣毛繊維の混用率を鑑別することを特徴とする。
　また、本発明は、請求項５の記載によると、請求項２に記載の獣毛繊維の鑑別方法であって、
　前記混合獣毛繊維は、起源となる動物の種類が既知の２種類の獣毛繊維を一連の混用率で混合したものであって、
　前記混合獣毛繊維から得られた一連の電気泳動パターンについて、それぞれ、前記２種類の獣毛繊維に特有であって予め認定した移動度におけるバンドの濃度を求める工程、
　前記被検獣毛繊維から得られた前記電気泳動パターンについて、前記予め認定した移動度におけるバンドの濃度を求める工程、及び、
　前記被検獣毛繊維の前記予め認定した移動度におけるバンドの濃度を前記混合獣毛繊維の前記予め認定した移動度におけるバンドの濃度と照合して、これらのバンドの濃度の一致性を指標として前記被検獣毛繊維の混用率を鑑別する第４鑑別工程を有することを特徴とする。
　また、本発明は、請求項６の記載によると、請求項５に記載の獣毛繊維の鑑別方法であって、
　前記２種類の獣毛繊維は、カシミヤ及びウールであることを特徴とする。
　また、本発明は、請求項７の記載によると、請求項１～６のいずれか１つに記載の獣毛繊維の鑑別方法であって、
　電気泳動パターンを得る前記電気泳動工程おいて、
　起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の電気泳動パターンのうち、少なくともカシミヤを起源とする単一獣毛繊維の電気泳動パターンに対して、分子量が２５ｋＤａ以下の領域における分解能が、１０個以上のバンドに分解可能な電気泳動ゲルを使用することを特徴とする。
　また、本発明は、請求項８の記載によると、請求項１～７のいずれか１つに記載の獣毛繊維の鑑別方法であって、
　タンパク質群を抽出する前記抽出工程において、
　タンパク質の分子内或いは分子間のジスルフィド結合を開裂するために還元剤を使用し、当該還元剤は、容量％濃度で６％より濃い濃度の２－メルカプトエタノール、又は、モル濃度で８～１２ｍＭ（ミリモル／リッター）のジチオスレイトールであることを特徴とする。
　また、本発明に係る獣毛繊維の鑑別方法は、請求項９の記載によると、
　被検獣毛繊維から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する抽出工程、
　抽出した前記タンパク質群を電気泳動手段により分離して電気泳動パターンを得る電気泳動工程、
　前記電気泳動パターンを形成する複数のバンドのうち所定のバンドを切出す切出工程、
　切出した前記バンド内のタンパク質を所定の消化酵素により消化して一連のペプチド群とする消化工程、
　得られた前記ペプチド群を質量分析手段により分析して前記ペプチド群の質量分析パターンを得る質量分析工程、及び、
　得られた前記質量分析パターンを予め準備した起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の質量分析パターンと比較して、前記被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別する第５鑑別工程を有している。
　また、本発明は、請求項１０の記載によると、請求項９に記載の獣毛繊維の鑑別方法であって、
　予め準備した起源となる動物の種類が異なる獣毛繊維を一連の混用率で混合した混合獣毛繊維に対して、前記抽出工程及び前記電気泳動工程と同様にして得た一連の電気泳動パターンから前記切出工程、前記消化工程、及び、前記質量分析工程と同様にして一連の質量分析パターンを得ておき、
　前記被検獣毛繊維から得られた前記質量分析パターンを前記混合獣毛繊維から得られた一連の質量分析パターンと比較して、前記被検獣毛繊維が少なくとも２種類の動物を起源とすること、前記被検獣毛繊維の起源となる少なくとも２種類の動物の種類、及び／又は、前記被検獣毛繊維の混用率を鑑別する第６鑑別工程を有することを特徴とする。
　また、本発明は、請求項１１の記載によると、請求項１０に記載の獣毛繊維の鑑別方法であって、
　前記単一獣毛繊維の質量分析パターン、及び、前記混合獣毛繊維から得られた一連の質量分析パターンについて、それぞれ、各ピーク面積値と保持時間との関係を解析してデータベースとして蓄積する工程、
　前記被検獣毛繊維から得られた前記質量分析パターンについて、各ピーク面積値と保持時間との関係を解析する工程、及び、
　前記被検獣毛繊維の解析データを前記データベースのデータ群と照合して、前記解析データと前記データベースのデータ群との一致性を指標として、前記被検獣毛繊維が少なくとも２種類の動物を起源とすること、前記被検獣毛繊維の起源となる少なくとも２種類の動物の種類、及び／又は、前記被検獣毛繊維の混用率を鑑別する第７鑑別工程を有することを特徴とする。
　また、本発明は、請求項１２の記載によると、請求項９～１１のいずれか１つに記載の獣毛繊維の鑑別方法であって、
　前記切出工程において、前記所定のバンドは、前記起源となる動物の種類が既知の獣毛繊維の電気泳動パターンと共通する分子量域に存在するバンドであって、且つ、分子量が１０ｋＤａ付近にあるタンパク質濃度の濃いバンドであることを特徴とする。
　また、本発明は、請求項１３の記載によると、請求項９～１２のいずれか１つに記載の獣毛繊維の鑑別方法であって、
　前記消化工程において、前記所定の消化酵素は、タンパク質を構成するアミノ酸であるリシンのＣ側末端から当該タンパク質を切断するエンドプロテアーゼであることを特徴とする。
　また、本発明は、請求項１４の記載によると、請求項９～１３のいずれか１つに記載の獣毛繊維の鑑別方法であって、
　前記質量分析工程において、前記質量分析手段は、液体クロマトグラフィー質量分析手段であることを特徴とする。
　また、本発明は、請求項１５の記載によると、請求項１～５及び請求項７～１４のいずれか１つに記載の獣毛繊維の鑑別方法であって、
　前記被検獣毛繊維は、カシミヤ、ウール、ヤク、モヘア、アンゴラ、アルパカ、ビキューナ、キャメル、及び、リャマからなる群のうち少なくとも１つの獣毛繊維を含有することを特徴とする。
　上記構成によれば、本発明は、抽出工程及び電気泳動工程を有しており、被検獣毛繊維からタンパク質群を抽出し、このタンパク質群から得られた電気泳動パターンを、起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の電気泳動パターンと比較する。獣毛繊維を構成するタンパク質群の組合せが、動物の種類により異なることを根拠とする。
　従って、客観的な鑑別をすることができ、被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を正確に鑑別することができる。これらの操作は比較的簡単であり、また、機器分析であることから、検査員の経験とノウハウの違いによる鑑別結果のばらつきが生じるということがない。
　また、獣毛繊維に脱スケールなどの偽装が行われている場合であっても、本発明においては、タンパク質を対象とすることから、従来のＤＮＡの抽出のように偽装によるダメージから抽出に困難性が伴うということがない。
　また、上記構成によれば、被検獣毛繊維の電気泳動パターンを、起源となる動物の種類が異なる獣毛繊維を一連の混用率で混合した混合獣毛繊維の電気泳動パターンと比較する。このことにより、被検獣毛繊維が少なくとも２種類の動物を起源とする混合獣毛繊維であっても、起源となる少なくとも２種類の動物の種類とその混用率を鑑別することができる。
　更に、上記構成によれば、起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維及び混合獣毛繊維から得られた一連の電気泳動パターンを解析し、これらをデータベース化することにより、更に正確な鑑別を可能とする。このことにより、より正確な鑑別を比較的簡単、且つ、客観的に行うことができる。
　また、上記構成によれば、第２鑑別工程又は第３鑑別工程において得られた被検獣毛繊維の混用率を用いて、同じ混用率の比較獣毛繊維を調製する。この比較獣毛繊維の電気泳動パターンを求め、被検獣毛繊維の電気泳動パターンとほぼ一致する場合には、当初得られた被検獣毛繊維の混用率の正確性が確認される。
　一方、得られた比較獣毛繊維の電気泳動パターンが、被検獣毛繊維の電気泳動パターンと大きく異なっている場合には、再度混用率を調製した比較獣毛繊維に対して上記操作を繰り返す。このことにより、被検獣毛繊維の混用率の正確性を向上させることができ、より正確な鑑別を比較的簡単、且つ、客観的に行うことができる。
　また、上記構成によれば、被検獣毛繊維が特定の２種類の獣毛繊維から構成されている場合には、これら２種類の獣毛繊維に特有な移動度とバンドの濃度との関係と照合することにより、被検獣毛繊維の混用率を鑑別することができる。この場合、特定の２種類の獣毛繊維は、カシミヤ及びウールであってもよい。
　また、上記構成によれば、電気泳動工程に使用する電気泳動ゲルは、カシミヤの電気泳動パターンに対して、分子量が２５ｋＤａ以下の領域における分解能が、１０個以上のバンドに分解可能なものを使用するようにしてもよい。このことにより、被検獣毛繊維の電気泳動パターンが明瞭となってより正確な鑑別をすることができる。
　また、上記構成によれば、抽出工程においてタンパク質のジスルフィド結合を開裂するために使用する還元剤は、容量％濃度で６％より濃い濃度の２－メルカプトエタノール、又は、モル濃度で８～１２ｍＭ（ミリモル／リッター）のジチオスレイトールを使用するようにしてもよい。このことにより、被検獣毛繊維からのタンパク質の抽出効率が向上し、電気泳動パターンが明瞭となってより正確な鑑別をすることができる。
　一方、上記構成によれば、電気泳動工程で得られた電気泳動パターンから所定のバンドを切出し、このバンド内のタンパク質を所定の消化酵素により消化して一連のペプチド群とする。更に、このペプチド群から得られた質量分析パターンを、起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の質量分析パターンと比較する。獣毛繊維を構成するタンパク質から分割できるペプチド群の組合せが、動物の種類により異なることを根拠とする。
　従って、更に客観的な鑑別をすることができ、被検獣毛繊維の起源となる動物の種類をより正確に鑑別することができる。これらの操作は比較的簡単であり、また、機器分析であることから、検査員の経験とノウハウの違いによる鑑別結果のばらつきが生じるということがない。
　また、上記構成によれば、被検獣毛繊維の質量分析パターンを、起源となる動物の種類が異なる獣毛繊維を一連の混用率で混合した混合獣毛繊維の質量分析パターンと比較する。このことにより、被検獣毛繊維が少なくとも２種類の動物を起源とする混合獣毛繊維であっても、起源となる少なくとも２種類の動物の種類と、その混用率をより正確に鑑別することができる。
　更に、上記構成によれば、起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維及び混合獣毛繊維から得られた一連の質量分析パターンを解析し、これらをデータベース化することにより、被検獣毛繊維が少なくとも２種類の動物を起源とする混合獣毛繊維であっても、起源となる少なくとも２種類の動物の種類と、その混用率をより正確に鑑別することができる。このことにより、正確な混用率を求める場合にも、検査員の経験とノウハウ、更に、検査員による非常に煩雑で長時間の作業が伴うということがなく、正確な鑑別を比較的簡単、且つ、より客観的に行うことができる。
　よって、本発明においては、鑑別操作が比較的簡単で客観性を有し、検査員の経験やノウハウに頼ることなく鑑別でき、且つ、獣毛繊維に前処理や染色加工がなされている場合でも、正確な鑑別結果を得ることのできる獣毛繊維の鑑別方法を提供することができる。
本発明に係る第１実施形態において、カシミヤ（ヤギ属）、キャメル（ラクダ属）、ウール（ヒツジ属）及びヤク（ウシ属）の獣毛繊維の電気泳動パターンを示すゲル画像である。 図１の電気泳動パターンのうち、カシミヤ（ヤギ属）とヤク（ウシ属）のゲル画像を解析して移動度と濃度との関係を示す解析チャートである。 図１の電気泳動パターンのうち、カシミヤ（ヤギ属）とウール（ヒツジ属）のゲル画像を解析して移動度と濃度との関係を示す解析チャートである。 本発明に係る第２実施形態において、カシミヤ（ヤギ属）及びヤク（ウシ属）の獣毛繊維を異なる混用率で混合した一連の電気泳動パターンを示すゲル画像である。 本発明に係る第３実施形態において、複数の標準試料の電気泳動パターンから作成したデータベースの一部を可視化したグラフである。 本発明に係る第４実施形態において、カシミヤ（ヤギ属）、ウール（ヒツジ属）及びヤク（ウシ属）の獣毛繊維に対して分解能の異なる２種類のゲルを使用して得られた電気泳動パターンを示すゲル画像である。 図６の電気泳動パターンのうち、カシミヤ（ヤギ属）に対して分解能の異なる２種類のゲルを使用して得られた電気泳動パターンを比較するゲル画像である。 本発明に係る第４実施形態において、抽出液中の還元剤の濃度或いは種類を変化させた際のヤク（ウシ属）に対する電気泳動パターンを比較するゲル画像である。 本発明に係る第４実施形態において、「確かめ算試験」における２種類の被検獣毛繊維に対する電気泳動パターンの変化を示すゲル画像である。 本発明に係る第５実施形態において、カシミヤ（ヤギ属）とウール（ヒツジ属）の混用率を変化させた標準試料及び被検獣毛繊維の電気泳動パターンを示すゲル画像である。 図１０の標準試料及び被検獣毛繊維のゲル画像を解析した解析チャートである。 本発明に係る第６実施形態において、カシミヤ（ヤギ属）、キャメル（ラクダ属）、ウール（ヒツジ属）及びヤク（ウシ属）の獣毛繊維の質量分析パターンを示すグラフである。 本発明に係る第８実施形態において、複数の標準試料の質量分析パターンから作成したデータベースの一部を可視化したグラフである。 実施例１における、被検獣毛繊維（カシミヤ）の電気泳動パターンを示すゲル画像と解析チャートである。 実施例１における、被検獣毛繊維（ヤク）の電気泳動パターンを示すゲル画像と解析チャートである。 実施例１における、被検獣毛繊維（カシミヤとヤクの混合）の電気泳動パターンを示すゲル画像と解析チャートである。 実施例３における、被検獣毛繊維（カシミヤ）の質量分析パターンを示すグラフである。 実施例３における、被検獣毛繊維（ヤク）の質量分析パターンを示すグラフである。 実施例３における、被検獣毛繊維（カシミヤとヤクの混合）の質量分析パターンを示すグラフである。
　本発明において、獣毛繊維とは、動物より得られる天然ケラチン質を主成分とする毛繊維の全てを含むものである。従って、羊の羊毛（本発明においては「ウール」という。）を含み、羊以外の動物の毛、例えば、カシミヤ山羊の毛「カシミヤ」、アンゴラ山羊の毛「モヘア」、アンゴラ兎の毛「アンゴラ」、牛の一種ヤクの毛「ヤク」、ラクダの毛「キャメル」、小型こぶなしラクダのアルパカの毛「アルパカ」、同じく小型こぶなしラクダのビクーニャの毛「ビキューナ」、同じく小型こぶなしラクダのリャマの毛「リャマ」などが挙げられる。
　また、本発明における獣毛繊維には、これら以外にも毛皮やファーとして使用されるものも含まれる。例えば、キツネの毛「フォックス」、イタチの一種ミンクの毛「ミンク」、ネズミの一種チンチラの毛「チンチラ」、ウサギの毛「ラビット」などが挙げられる。これらの例から分かるように、本発明においては、動物の名前と獣毛の名前に同じ呼び名を使用することがある。
　本発明において、獣毛繊維を用いた繊維製品とは、例えば、獣毛繊維を紡績した糸を用いた織物や編物或いはフェルトなどの不織布を挙げることができる。しかし、これらに限らず、毛皮やファーなども含み、更に、毛繊維のまま詰め物などに使用される場合も含むものとする。また、これらの繊維製品には、染色加工或いは各種仕上加工が施されたものも含む。特に、本発明においては、カシミヤなどの高級な獣毛繊維に他の安価な獣毛繊維を混合した繊維製品、及び、各種加工で偽装した獣毛繊維を混合した繊維製品を鑑別する場合も対象とするものである。
　また、本発明において、動物の種類とは、生物学上の分類単位としての「種」のみを意味するものではなく、「属」或いは「科」まで遡った広い意味でも使用するものとする。従って、本発明に係る獣毛繊維の鑑別方法で鑑別する動物の種類とは、当該獣毛繊維の起源となる動物の「種」を鑑別することに限らず、起源となる動物の「属」を鑑別すること、或いは、起源となる動物の「科」を鑑別することを意味する場合もある。
　以下、本発明に係る獣毛繊維の鑑別方法について、各実施形態により詳細に説明する。
　《第１実施形態》
　本第１実施形態に係る獣毛繊維の鑑別方法は、抽出工程、電気泳動工程、及び、第１鑑別工程を有している。本第１実施形態においては、まず、検査対象である獣毛繊維（以下、「被検獣毛繊維」という。）から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する（抽出工程）。次に、抽出したタンパク質群を電気泳動装置で分離して各タンパク質の分子量の違いによる電気泳動パターン（タンパク質パターン）を得る（電気泳動工程）。
　なお、動物の種類ごとに遺伝子の配列は異なり、タンパク質は遺伝子にコードされている。従って、動物の種類ごとにタンパク質のアミノ酸配列は異なるため、獣毛繊維から抽出されたタンパク質群の電気泳動パターンは動物の種類固有のものとなる。このことを根拠として、得られた被検獣毛繊維の電気泳動パターンを、起源となる動物の種類が既知の数種類の単一獣毛繊維の電気泳動パターンと比較することにより、被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別する（第１鑑別工程）。
　以下、本第１実施形態における各工程を詳細に説明する。
　（１－１）抽出工程
　獣毛繊維の主要構成タンパク質は、ケラチン及びケラチン関連タンパク質であり、これらのタンパク質には、構造の良く似た多種類の分子種が存在する。これらのタンパク質群は、動物の種類によりその組み合わせが異なっている。本発明においては、これらのタンパク質群の構成、即ち複数のタンパク質の組合せを解析することにより、獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別するものである。
　本発明においては、獣毛繊維からこれを構成するタンパク質群を抽出する。このように、獣毛繊維を構成するタンパク質群に着目することにより、獣毛繊維の表面に脱スケールなどの偽装加工がなされていても、獣毛そのものが残っている限りタンパク質を抽出することができる。この点において、偽装加工がなされた獣毛繊維からＤＮＡを抽出することが非常に困難であることと対照的である。
　本発明者らは、獣毛繊維の原毛そのもの、粉砕した原毛、漂白した獣毛、及び、脱スケールした獣毛について、それぞれ同様にしてタンパク質群を抽出して電気泳動パターンを検討した。その結果、これらの電気泳動パターンには大きな変化がないことを確認した。従って、本発明においては、被検獣毛繊維を粉砕してからタンパク質を抽出するようにしてもよく、或いは、粉砕することなく獣毛の形状を維持したままタンパク質を抽出するようにしてもよい。但し、脱スケールした獣毛繊維については、脱スケールの程度が不明なため、被検獣毛繊維をある程度粉砕してからタンパク質を抽出するようにすることが好ましい。
　具体的なタンパク質の抽出操作は、以下のようにして行う。まず、被検獣毛繊維に染色加工などがなされている場合には、電気泳動パターンが乱れることがある。本発明においては、染料、仕上剤及び補助剤などの除去操作をタンパク質抽出前に行うことが好ましい。このことにより、続く電気泳動工程において染料等の影響を受けることがなく、電気泳動パターンの精度が上がり正確な鑑別を行うことができる。
　この洗浄操作には、タンパク質を抽出することのないように、例えば、デオキシコール酸とラウロイルサルコシ酸とを含有する洗浄液などを用いて、７０℃～１００℃、好ましくは９０℃～９５℃程度の温度で数回洗浄を行うなどの方法が好ましい。また、染色された被検獣毛繊維に対しては、染料種別に合わせた脱色処理を行うようにしてもよい。例えば、酸化処理、還元処理、酸処理、アルカリ処理或いはキレート処理などが挙げられる。これらの場合、タンパク質が破壊されず且つ抽出されない条件で行うことが好ましい。
　次に、タンパク質の抽出操作を行う。タンパク質の抽出液としては、一般に各種界面活性剤を含有する水溶液などを使用することができる。使用する界面活性剤は、タンパク質にダメージを与えずに可溶化するものであれば特に限定するものではないが、例えば、ケラチンタンパク質の溶解性を高める界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を使用することが好ましい。
　また、タンパク質の抽出に際しては、タンパク質内のジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）を還元して開裂し、システイン残基とすることで可溶化が容易となる。そのため、抽出液には還元剤を併用することが好ましい。これらの還元剤としては、例えば、２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などが挙げられる。
　この抽出操作においては、界面活性剤と還元剤を併用した抽出液に被検獣毛繊維を浸漬し、７０℃～１００℃、好ましくは９０℃～９５℃程度の温度で抽出して抽出液を回収する操作を数回繰り返す。これらの抽出液を回収後、所定濃度に濃縮して続く電気泳動工程に使用する。
　ここで、タンパク質のシステイン残基が再度ジスルフィド結合を形成することのないよう、システイン残基を封鎖しておくことが好ましい。システイン残基の封鎖には、一般的な方法を使用すればよく、例えば、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、アクリルアミドなどを使用してアルキル化するなどの方法が挙げられる。なお、このようにして得られたタンパク質の総量は、定量しておくことが好ましい。
　（１－２）電気泳動工程
　次に、抽出工程で得られたタンパク質群に対して、電気泳動法を用いて構成タンパク質を分離する。使用する電気泳動法は、特に限定するものではなく、どのような方法であってもよいが、本発明においては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法）を用いることが好ましい。
　一般に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法に使用するポリアクリルアミドゲルは、アクリルアミドとその架橋剤であるＮ,Ｎ'－メチレンビスアクリルアミドとの共重合により三次元構造を有している。このアクリルアミドとＮ,Ｎ'－メチレンビスアクリルアミドとの総和をゲル濃度といい、一般に１０％～２０％程度のゲルを使用することができる。本発明において使用するポリアクリルアミドゲルは、特にケラチンタンパク質等をより高分解能で分離するために、１５％～２０％程度のゲルを使用することが好ましい。
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法の操作は、特に限定するものではなく一般的な方法を使用すればよい。例えば、泳動用緩衝液や通電条件においても電気泳動パターンの分解能と鮮明性を考慮して条件設定することが好ましい。また、電気泳動パターンを得る際には、内部標準を併用することが好ましい。内部標準としては、例えば、牛の血清アルブミンなどを使用して、電気泳動パターンの移動度補正に使用する。
　電気泳動後のゲルは、染色液を用いてタンパク質を染色する。染色には、染料染色或いは銀染色などが使用される。使用される染料としては、例えば、クマシーブリリアントブルー－Ｒ（ＣＢＢ－Ｒ）などが挙げられる。このようにして染色したゲルは、分子量によって移動度の異なる複数のバンドから構成される電気泳動パターン（「ゲル画像」ともいう。）を表している。
　（１－３）第１鑑別工程
　このようにして得られた電気泳動パターン（ゲル画像）は、獣毛繊維の起源となる動物の種類に固有のものとなる。本第１実施形態においては、電気泳動工程で得られた電気泳動パターンを、起源となる動物の種類が既知の数種類の単一獣毛繊維の電気泳動パターンと比較する。
　このため、動物の種類が既知の数種類の単一獣毛繊維に対して、上記と同様の工程による電気泳動パターンを予め準備する。また、被検獣毛繊維の電気泳動パターンを作成する際に、起源となる動物の種類が既知の数種類の単一獣毛繊維の電気泳動パターンを同時に作成するようにしてもよい。このようにすることで、より正確な鑑別をすることができる。
　一例として、具体的に作成した動物の種類が既知の４種類の獣毛繊維の電気泳動パターンを図１に示す。図１は、Ａ：カシミヤ（ヤギ属）、Ｂ：キャメル（ラクダ属）、Ｃ：ウール（ヒツジ属）及びＤ：ヤク（ウシ属）の電気泳動パターン（ゲル画像）を示している。図１において、染色された濃度の濃い部分がタンパク質を含むバンドである。図１において、上方のバンドほど移動度が小さく分子量が大きい。一方、下方のバンドほど移動度が大きく分子量が小さい。
　図１において、Ａ：カシミヤ（ヤギ属）と他の獣毛繊維を比較すると、目視鑑別においても、Ｂ：キャメル（ラクダ属）は、Ａ：カシミヤ（ヤギ属）に比べ、バンドパターンが大きく異なる。また、Ｄ：ヤク（ウシ属）は、Ａ：カシミヤ（ヤギ属）に比べ、バンド３、４、５、７及びバンド８の濃度が薄く、また、バンド９及びバンド１２の濃度が濃い。また、Ｃ：ウール（ヒツジ属）は、Ａ：カシミヤ（ヤギ属）に比べ、バンド６とバンド７の間隔が狭く、また、バンド１２が無い。
　ここで、得られた電気泳動パターンをより客観的に比較する方法について説明する。まず、得られた電気泳動パターンのゲル画像をスキャナーで取り込み、各バンドの位置（分子量に対応）を移動度Ｒｆとして数値化し、各バンドの濃度（タンパク質量に対応）を定量する。このとき、複数の試料間のバンドの移動度Ｒｆは、補正しておくことが好ましい。
　図１に示す各電気泳動パターン（ゲル画像）をスキャナーで取り込み、各バンドの位置と濃度を定量し、移動度Ｒｆと濃度（ピーク）との関係として示した解析チャートを図２及び図３に示す。図２及び図３において、横軸は移動度Ｒｆ（分子量に対応）であり、右側ほど移動度Ｒｆが大きく分子量が小さい。縦軸は、各バンドの濃度（タンパク質量に対応）であり、ピークが高く面積が大きいほどタンパク質量が多い。
　ここでは、偽装混合されることの多いヤク（ウシ属）とウール（ヒツジ属）の解析チャートをカシミヤ（ヤギ属）の解析チャートと比較する。図２は、Ａ：カシミヤ（ヤギ属）とＤ：ヤク（ウシ属）の電気泳動パターン（解析チャート）を比較したものである。Ｄ：ヤク（ウシ属）は、Ａ：カシミヤ（ヤギ属）に比べ、バンド３、４、５、７及びバンド８の濃度が薄く、また、バンド９及びバンド１２の濃度が濃いことが明確に示されている。
　また、図３は、Ａ：カシミヤ（ヤギ属）とＣ：ウール（ヒツジ属）の電気泳動パターン（解析チャート）を比較したものである。Ｃ：ウール（ヒツジ属）は、Ａ：カシミヤ（ヤギ属）に比べ、バンド６とバンド７の間隔が狭く、また、バンド１２が無いことが明確に示されている。
　このように、本第１実施形態においては、被検獣毛繊維の電気泳動パターンを、起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の電気泳動パターンと比較して、各バンドの位置と濃度、又は、移動度Ｒｆとピーク面積を確認することで、被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別することができる。特に、カシミヤ（ヤギ属）のような高級な獣毛繊維に対して、偽装して混合されることの多いヤク（ウシ属）やウール（ヒツジ属）を明確に区別することができる。
　《第２実施形態》
　本第２実施形態に係る獣毛繊維の鑑別方法は、上記第１実施形態と同様に、抽出工程、電気泳動工程、及び、第１鑑別工程を有し、更に第２鑑別工程を有している。本第２実施形態においても、まず、被検獣毛繊維から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する（抽出工程）。次に、抽出したタンパク質群を電気泳動装置で分離して分子量の違いによる電気泳動パターンを得る（電気泳動工程）。
　なお、本第２実施形態においては、被検獣毛繊維が単一の動物を起源とするものではなく、２種以上の獣毛繊維が混合されている場合を対象とする。つまり、上記第１実施形態の第１鑑別工程において、被検獣毛繊維の電気泳動パターンに対して動物の種類が既知の複数の単一獣毛繊維の電気泳動パターンが適合せず、動物の種類を明確に鑑別できない場合に採用する。
　本第２実施形態においては、起源となる動物の種類が異なる獣毛繊維を一連の混用率で混合した混合獣毛繊維を準備し、これらに対する一連の電気泳動パターンを予め準備する。その上で、第２鑑別工程において、得られた被検獣毛繊維の電気泳動パターンを予め準備した混合獣毛繊維の一連の電気泳動パターンと比較する。
　このことにより、被検獣毛繊維が複数の動物を起源とすることを鑑別することができる。また、被検獣毛繊維がどのような動物の獣毛繊維を混合するものであるか、更に、それらの獣毛繊維をどの程度の混用率で混合するものであるかを鑑別することができる。
　以下、本第２実施形態における各工程を詳細に説明する。但し、本第２実施形態における抽出工程、電気泳動工程及び第１鑑別工程については、上記第１実施形態と同様であり、ここではその説明を省略する。
　（２－１）第２鑑別工程
　得られた電気泳動パターン（ゲル画像）は、獣毛繊維の混用率に比例して変化する。本第２実施形態においては、電気泳動工程で得られた被検獣毛繊維の電気泳動パターンを予め準備した混合獣毛繊維の一連の電気泳動パターンと比較する。このため、起源となる動物の種類が異なる獣毛繊維を一連の混用率で混合した混合獣毛繊維を準備し、これらに対して上記と同様の工程による一連の電気泳動パターンを予め準備する。
　一例として、具体的に作成した２種の獣毛繊維を混合した一連の電気泳動パターンを図４に示す。図４は、カシミヤ（ヤギ属）及びヤク（ウシ属）を起源とする獣毛繊維に対して、カシミヤ：ヤクの割合を、Ｅ：１００％対０％、Ｆ：７０％対３０％、Ｇ：５０％対５０％、Ｈ：３０％対７０％、Ｉ：０％対１００％、の混用率で混合した一連の混合獣毛繊維の電気泳動パターン（ゲル画像）を示している。図４において、上方のバンドほど移動度が小さく分子量が大きい。一方、下方のバンドほど移動度が大きく分子量が小さい。
　上記第１実施形態で説明したように、カシミヤ（ヤギ属）１００％の電気泳動パターン（ゲル画像）とヤク（ウシ属）１００％の電気泳動パターン（ゲル画像）は、明確に異なっており、これらが混合された電気泳動パターン（ゲル画像）は、それぞれのバンドの濃度が混用率に比例して徐々に変化していることが分かる（図４参照）。
　ここで、得られた電気泳動パターンをより客観的に比較するために、上記第１実施形態と同様にして、得られた電気泳動パターンのゲル画像をスキャナーで取り込み、各バンドの位置（分子量に対応）を移動度Ｒｆとして数値化し、各バンドの濃度（タンパク質量に対応）を定量するようにしてもよい。
　このように、本第２実施形態においては、被検獣毛繊維の電気泳動パターンを一連の混合獣毛繊維の電気泳動パターンと比較して、各バンドの位置と濃度、又は、移動度Ｒｆとピーク面積を確認することで、被検獣毛繊維がカシミヤ（ヤギ属）とヤク（ウシ属）の獣毛繊維が混合されたものであることを鑑別することができる。また、カシミヤ（ヤギ属）とヤク（ウシ属）の獣毛繊維の混用率も鑑別することができる。
　同様にして、カシミヤ（ヤギ属）とヤク（ウシ属）以外の混合獣毛繊維に対しても、それぞれ一連の電気泳動パターンを予め準備しておくことにより、起源となる動物の種類を鑑別することができる。特に、高級な獣毛繊維に対して偽装して混合されることの多いヤク（ウシ属）やウール（ヒツジ属）が混合されていることを確認することができる。
　《第３実施形態》
　本第３実施形態に係る獣毛繊維の鑑別方法は、多くの標準試料に対して、上記第１実施形態において説明した電気泳動パターンの解析データを測定し、これをデータベース化することにより、未知の被検獣毛繊維の鑑別を客観的に、且つ、安定して行うようにするものである。
　本第３実施形態においては、まず、獣毛繊維の起源が明確な多くの標準試料（単一獣毛繊維）、及び、獣毛繊維の起源と混用率が明確な多くの標準試料（混合獣毛繊維）について、上記第１実施形態と同様にしてタンパク質群を抽出し（抽出工程）、次に、抽出したタンパク質群を電気泳動装置で分離して電気泳動パターンを得る（電気泳動工程）。
　このようにして得られた多くの電気泳動パターンに対して、上記第１実施形態と同様にしてゲル画像をスキャナーで取り込み、各バンドの位置（分子量に対応）を移動度Ｒｆとして数値化し、各バンドの濃度（タンパク質量に対応）をピーク面積として定量する。このようにして得られた多くの数値データをその標準試料の履歴と共にデータベース化することにより、第３鑑別工程において客観的な鑑別を行うことができる。具体的な方法は、後述の実施例において説明する。
　（３－１）第３鑑別工程
　このようにして構築されたデータベースについて説明する。図５は、カシミヤ（ヤギ属）、キャメル（ラクダ属）、ウール（ヒツジ属）、ヤク（ウシ属）の原毛（単一獣毛繊維）、及び、カシミヤ（ヤギ属）とヤク（ウシ属）の混合（混合獣毛繊維）について、それぞれ複数の標準試料から作成したデータベースの一部を可視化したグラフである。この図５は、Ｊ：カシミヤ（ヤギ属）のグループ、及び、Ｋ：その他の獣毛繊維（混合獣毛繊維を含む）のグループという２つのグループに分類した場合の一例を示している。
　この例においては、被検獣毛繊維の電気泳動パターンを解析して得られた数値データをこのデータベースと照合して、当該被検獣毛繊維がカシミヤ（ヤギ属）であるか、或いは、その他の獣毛繊維（混合獣毛繊維を含む）であるかを鑑別することができる。
　同様にして、データベースの分類を変更することにより、カシミヤ（ヤギ属）以外の獣毛繊維についても同様の鑑別が可能である。更に、混合獣毛繊維の標準試料を多くすることにより、被検獣毛繊維がどのような獣毛繊維をどのような混用率で混合するものであるかを鑑別することができる。
　《第４実施形態》
　本第４実施形態に係る獣毛繊維の鑑別方法は、上記第１実施形態～第３実施形態と同様の各鑑別方法において、更なる鑑別精度の向上を目的とするものである。具体的には、まず、電気泳動工程において分解能の高いポリアクリルアミドゲルを使用するものである。また、抽出工程において、タンパク質の抽出効率が向上する特定の還元剤を使用するものである。更に、これらによって得られた明瞭な電気泳動パターンを利用して、被検獣毛繊維の混用率の鑑別精度を向上させるために「確かめ算試験」を使用するものである。以下、これらについて説明する。
　（４－１）分解能の高いポリアクリルアミドゲルの使用
　上記第１実施形態で説明したように、電気泳動工程においてはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を支持体に用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法）を用いることが好ましい。このＳＤＳ－ＰＡＧＥ法において、従来よりも分解能の高いポリアクリルアミドゲルを使用することにより、より正確な鑑別をすることができる。
　ここで、より分解能の高いゲルとは、電気泳動法において獣毛繊維の起源となる動物種を鑑別するために特に重要と考えられる、分子量が２５ｋＤａ以下の領域（以下「動物種特有のタンパク質領域」ということもある。）における分解能が良好なものをいう。具体的には、少なくともカシミヤを起源とする単一獣毛繊維の電気泳動パターンに対して、分子量が２５ｋＤａ以下の領域における分解能が、１０個以上のバンドに分解可能な電気泳動ゲルをいう。
　ポリアクリルアミドゲルの分解能を向上させる方法は、特に限定するものではないが、例えば、ゲル長（支持体距離に対応）を長くして分解能を向上させるようにしてもよい。一般にＳＤＳ－ＰＡＧＥ法に使用するポリアクリルアミドゲルは、ゲル長が８ｃｍ程度のゲル（以下「８ｃｍ長ゲル」という。）を使用する。本第４実施形態においては、このゲル長を８ｃｍのゲルから１２ｃｍのゲル（以下「１２ｃｍ長ゲル」という。）に変更することにより、ケラチンタンパク質等をより高分解能で分離することができる。
　一例として、動物の種類が既知の３種類の獣毛繊維に対して８ｃｍ長ゲルと１２ｃｍ長ゲルとを使用して得られた電気泳動パターン（ゲル画像）を図６に示す。図６は、一般に使用される８ｃｍ長ゲルを使用して得られたＡ８：カシミヤ（ヤギ属）、Ｃ８：ウール（ヒツジ属）及びＤ８：ヤク（ウシ属）の電気泳動パターン（ゲル画像）、並びに、分解能の高い１２ｃｍ長ゲルを使用して得られたＡ１２：カシミヤ（ヤギ属）、Ｃ１２：ウール（ヒツジ属）及びＤ１２：ヤク（ウシ属）の電気泳動パターン（ゲル画像）を比較したものである。
　なお、図６において、各ゲルの支持体距離を目視的に合わせるために、１２ｃｍ長ゲルを長さ方向に縮小して８ｃｍ長ゲルに対応させている。図６において、染色された濃度の濃い部分がタンパク質を含むバンドである。図６において、上方のバンドほど移動度が小さく分子量が大きい。一方、下方のバンドほど移動度が大きく分子量が小さい。
　図６のゲル画像において、移動度が大きい下方の領域（分子量が小さい領域）を鑑別に有効な動物種特有のタンパク質領域（ＡＲＥＡ－１）として示している。この動物種特有のタンパク質領域（ＡＲＥＡ－１）は、分子量が２５ｋＤａ以下の領域である。図６において、８ｃｍ長ゲルに比べ１２ｃｍ長ゲルの方が動物種特有のタンパク質領域（ＡＲＥＡ－１）の分解能が向上していることが分かる。
　図７は、図６の電気泳動パターン（ゲル画像）のうち、カシミヤ（ヤギ属）の電気泳動パターンを抜き出して８ｃｍ長ゲルと１２ｃｍ長ゲルを比較するものである。図７のゲル画像において、動物種特有のタンパク質領域（ＡＲＥＡ－１）の分解能を比較する。カシミヤ（ヤギ属）の電気泳動パターンにおいて、８ｃｍ長ゲルの場合には、バンド３～９の７個のバンドに分解されている。これに対して、１２ｃｍ長ゲルの場合には、バンド３～１２の１０個のバンドに分解されている。このことにより、例えば、１２ｃｍ長ゲルのような分解能の高いポリアクリルアミドゲルを使用することにより、被検獣毛繊維の鑑別精度を向上させることができる。
　なお、動物種によって同じ１２ｃｍ長ゲルを使用しても２５ｋＤａ以下の領域のバンドの数は異なるものである。しかし、鑑別を特に必要とするカシミヤ（ヤギ属）において１０個以上のバンドに分解される分解能の高いゲルを各獣毛繊維に適用すれば、カシミヤと他の獣毛との識別が容易なものとなる。
　（４－２）タンパク質の抽出効率が向上する還元剤の使用
　上記第１実施形態で説明したように、タンパク質の抽出工程においては、タンパク質内のジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）を還元して開裂し、チオール基とするために、抽出液には還元剤を併用することが好ましい。また、上述のように、これらの還元剤としては、例えば、２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などが挙げられる。
　本第４実施形態においては、これらの還元剤の中でも、２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ）、或いは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を使用することが好ましい。また、２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ）を使用する際の抽出液中の還元剤濃度は、容量％濃度で６％より濃い濃度で使用することが好ましく、更に、１０％より濃い濃度で使用することがより好ましい。一方、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を使用する際の抽出液中の還元剤濃度は、モル濃度で８～１２ｍＭ（ミリモル／リッター）で使用することが好ましく、更に、略１０ｍＭ（ミリモル／リッター）で使用することがより好ましい。これらの還元剤をこのような濃度で使用することにより、抽出工程におけるタンパク質の抽出効率が向上し、続く電気泳動工程で得られる電気泳動パターンが明瞭となってより正確な鑑別をすることができる。
　一例として、容量％濃度で６％（従来の濃度）と１５％（本第４実施形態の濃度）の２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ）、及び、モル濃度で１０ｍＭ（本第４実施形態の濃度）のジチオスレイトール（ＤＴＴ）をそれぞれ使用して得られたヤク（ウシ属）の電気泳動パターン（ゲル画像）を図８に示す（具体的には実施例で後述する）。
　（４－３）「確かめ算試験」の使用
　ここでいう「確かめ算試験」とは、上記第２実施形態又は第３実施形態の各鑑別工程で得られた被検獣毛繊維の混用率の鑑別精度を向上させる方法をいう。具体的には、まず、上記第２実施形態又は第３実施形態において被検獣毛繊維の電気泳動パターン（ゲル画像）を得る。例えば、２種類の被検獣毛繊維（Ｙ１、Ｙ２）に対して得られた電気泳動パターン（ゲル画像Ｙ１－１、Ｙ２－１）を図９に示す。これらのゲル画像（Ｙ１－１、Ｙ２－１）から上記第２鑑別工程又は第３鑑別工程において被検獣毛繊維の混用率を予測する（具体的には実施例で後述する）。次に、起源となる動物の種類が既知の複数の単一獣毛繊維を用いて、予測した混用率と同じ比率で混合した比較獣毛繊維を調製する。
　次に、調製した比較獣毛繊維に対して上記第２実施形態又は第３実施形態と同様にして比較獣毛繊維の電気泳動パターン（図９のゲル画像Ｙ１－２、Ｙ２－２）を求める。これらのゲル画像（Ｙ１－２、Ｙ２－２）に対して、再度、第２鑑別工程又は第３鑑別工程の鑑別を行って比較獣毛繊維の混用率を得る（具体的には実施例で後述する）。このようにして得られた比較獣毛繊維の混用率が、比較獣毛繊維を調製する際の混用率（当初得られた被検獣毛繊維の混用率に同じ）とほぼ一致する場合には、当初得られた被検獣毛繊維の混用率の正確性が確認される。
　一方、得られた比較獣毛繊維の混用率が、比較獣毛繊維を調製する際の混用率（当初得られた被検獣毛繊維の混用率に同じ）と大きく異なっている場合には、再度、混用率を変更した他の比較獣毛繊維を調製する。次に、この他の比較獣毛繊維の電気泳動パターン（図９のゲル画像Ｙ１－３、Ｙ２－３）を求める。これらのゲル画像（Ｙ１－３、Ｙ２－３）に対して、再度、第２鑑別工程又は第３鑑別工程の鑑別を行って他の比較獣毛繊維の混用率を得る（具体的には実施例で後述する）。このような操作を繰り返すことで、被検獣毛繊維の混用率の正確性を向上させることができる。このことにより、より正確な混用率の鑑別を比較的簡単、且つ、客観的に行うことができる。
　《第５実施形態》
　本第５実施形態に係る獣毛繊維の鑑別方法は、上記第２実施形態と同様の鑑別方法において、被検獣毛繊維が特定の２種類の獣毛繊維で構成されている際に鑑別する第４鑑別工程を有している。この第４鑑別工程においては、上記第３実施形態のようなデータベース化をすることなく、これらの獣毛繊維に特有なバンドに着目することにより、被検獣毛繊維の混用率の鑑別を簡単に、且つ、高い精度で行うことを目的とするものである。
　なお、本発明においては、被検獣毛繊維を構成する特定の２種類の獣毛繊維は、特に限定するものではないが、各獣毛繊維の電気泳動パターンにおいて、これらを区別できる特定のバンドが存在することが必要である。本第５実施形態においては、カシミヤ（ヤギ属）とウール（ヒツジ属）の２種類の獣毛繊維が混合された被検獣毛繊維を例にして説明する。
　被検獣毛繊維を構成するカシミヤ（ヤギ属）の電気泳動パターン（Ａ）とウール（ヒツジ属）の電気泳動パターン（Ｃ）とを図１０に示す。図１０において、２つの電気泳動パターン（Ａ、Ｃ）を比較すると、バンド１及びバンド２は、カシミヤ（ヤギ属）とウール（ヒツジ属）に特有なバンドであることが分かる。被検獣毛繊維がカシミヤ（ヤギ属）とウール（ヒツジ属）で構成されていることが既知である場合には、電気泳動パターンの全てのバンドを解析することなく、バンド１及びバンド２に着目することにより、被検獣毛繊維の混用率の鑑別を簡単、且つ、高い精度で行うことができる。
　（５－１）第４鑑別工程
　まず、カシミヤ（ヤギ属）とウール（ヒツジ属）の混用率を変化させた標準試料を調製し、これらの電気泳動パターン（ゲル画像Ｚ１）を求める。図１０に、カシミヤ：ウール＝２０：８０、３０：７０、４０：６０、５０：６０、６０：４０、７０：３０に調整した各標準試料のゲル画像（Ｚ１１～Ｚ１６）を示す。これらのゲル画像（Ｚ１１～Ｚ１６）において、２種類の獣毛繊維の混用率の変化に対応して、バンド１とバンド２の濃度が変化していることが分かる。
　次に、これらのゲル画像（Ｚ１１～Ｚ１６）を解析して移動度Ｒｆと濃度との関係を示す解析チャート（Ｚ２）を作成する（図１１参照）。図１１に、カシミヤ：ウール＝３０：７０、４０：６０、５０：６０、６０：４０、７０：３０に調整した各標準試料の解析チャート（Ｚ２２～Ｚ２６）を示す。これらの解析チャート（Ｚ２２～Ｚ２６）において、２種類の獣毛繊維の混用率の変化に対応して、バンド１とバンド２の濃度の変化が明確に判別できる。そこで、被検獣毛繊維に対する電気泳動パターンを解析して移動度Ｒｆと濃度との関係を示す解析チャートを求め、図１１の解析チャート（Ｚ２２～Ｚ２６）と比較することにより、被検獣毛繊維の混用率の鑑別を簡単、且つ、高い精度で行うことができる（具体的には実施例で後述する）。
　《第６実施形態》
　本第６実施形態に係る獣毛繊維の鑑別方法は、抽出工程、電気泳動工程、切出工程、消化工程、質量分析工程、及び、第５鑑別工程を有している。本第６実施形態においては、上記第１実施形態と同様にして、まず、被検獣毛繊維からタンパク質群を抽出し（抽出工程）、抽出したタンパク質群を電気泳動装置で分離して電気泳動パターンを得る（電気泳動工程）。
　更に、本第６実施形態においては、得られた被検獣毛繊維の電気泳動パターンから当該電気泳動パターンを形成する複数のバンドのうち所定のバンドを切出す（切出工程）。次に、切出したバンド内のタンパク質を所定の消化酵素により消化して一連のペプチド群に分割する（消化工程）。次に、得られたペプチド群を質量分析装置で分析して各ペプチドの分子量の違いによる質量分析パターン（ペプチドパターン）を得る（質量分析工程）。
　なお、上述のように、獣毛から抽出されたタンパク質群の電気泳動パターンは動物の種類固有のものである。また、これらのタンパク質を特定のアミノ酸部分で切断した際に生じるペプチドの長さやアミノ酸配列も動物の種類固有のものとなる。このことを根拠として、得られた被検獣毛繊維の質量分析パターンを、起源となる動物の種類が既知の数種類の獣毛繊維の質量分析パターンと比較することにより、被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別する（第５鑑別工程）。
　以下、本第６実施形態における各工程を詳細に説明する。但し、本第６実施形態における抽出工程及び電気泳動工程については、上記第１実施形態と同様であり、ここではその説明を省略する。なお、本第６実施形態においては、上記第１実施形態で得られた電気泳動パターン（ゲル試料）を利用して切出工程以下の工程を行うことができる。
　（６－１）切出工程
　電気泳動工程で得られた電気泳動パターン（ゲル試料）から当該電気泳動パターンを形成する複数のバンドのうち所定のバンド（ゲル切片）を切出す。切出すバンドは、比較対象とする単一獣毛繊維が決まっている場合には、その単一獣毛繊維と共通の移動度Ｒｆに存在するバンドであることが必要である。従って、起源が未知の被検獣毛繊維に対しては、主要な複数の単一獣毛繊維に共通の移動度Ｒｆに存在するバンドであることが好ましい。
　本発明においては、特に、カシミヤ（ヤギ属）のような高級な獣毛繊維に対して、偽装して混合されることの多いヤク（ウシ属）やウール（ヒツジ属）を明確に区別する場合があることから、これらの単一獣毛繊維に共通の移動度Ｒｆに存在するバンドであることがより好ましい。
　また、切出すバンドは、タンパク質の分子量がそれほど大きくないものが好ましく、例えば、分子量が３０ｋＤａ以下、好ましくは２０ｋＤａ以下、更に好ましくは１０ｋＤａ付近にあるバンドがよい。バンド内に存在するタンパク質の分子量が３０ｋＤａより大きい場合には、続く消化工程において、多くのペプチドが出現し質量分析工程において分解能が低下し、明確な鑑別ができなくなるからである。
　上記のことから、本発明においては、カシミヤ（ヤギ属）、ヤク（ウシ属）、ウール（ヒツジ属）、更にキャメル（ラクダ属）を加えた獣毛繊維に共通の移動度Ｒｆ値に存在するバンドであって、且つ、分子量が１０ｋＤａ付近にあるタンパク質濃度の濃いバンドを選択して切出すことが好ましい。
　（６－２）消化工程
　切出したバンド（ゲル）の処理は通常の方法で行う。次に、この切出したゲル内のタンパク質に消化酵素を作用させてペプチド群に切断する。ゲル内のタンパク質に消化酵素を作用させる方法は、特に限定するものではないが、一般にゲル内消化を行うことが好ましい。このゲル内消化に使用する消化酵素は特に限定するものではなく、例えば、トリプシン、キモトリプシン、Ｌｙｓ－Ｃ、Ｇｌｕ－Ｃなどタンパク質の消化に一般的に使用される消化酵素を使用することができる。
　なお、本発明においては、ケラチンタンパク質、特に分子量の小さいタンパク質を対象とすることから、タンパク質を構成するアミノ酸の一種であるリシンのＣ側末端からタンパク質を切断するエンドプロテアーゼの一種であるＬｙｓ－Ｃを使用することが好ましい。Ｌｙｓ－Ｃを使用することにより、ペプチドの出現量が適切になり、続く質量分析工程において分解能が向上し、明確な鑑別をすることができる。
　このように、本第６実施形態においては、切出工程で比較的分子量の小さいタンパク質を切出し、更に、Ｌｙｓ－Ｃという特定の消化酵素を使用することにより、質量分析の精度が大幅に向上する。
　（６－３）質量分析工程
　次に、得られた被検獣毛繊維のペプチド群に対して、各ペプチドの分離と質量分析を行う。この質量分析工程においては、種々のイオン化手法と質量検出法を組み合わせればよい。イオン化手法としては、例えば、ＭＡＬＤＩ（Ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）、ＥＳＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）、ＮＳＩ（Ｎａｎｏ－ｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）などが利用される。また、質量検出法としては、ＴＯＦ（Ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ、飛行時間）法、イオントラップ（Ｉｏｎ ｔｒａｐ）法、四重極（Ｑｕａｄｒｏｐｏｌｅ）法などが利用される。
　本発明においては、一般にペプチド群の分析に使用される液体クロマトグラフィーと組み合わせた質量分析計（ＬＣ－ＭＳ）や飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ－ＭＳ）を使用することができる。また、別な分離方法として再度、電気泳動法を使用するクリーブランド法などを使用することも可能である。
　なお、本発明においては、Ｓ／Ｎ比の高いＮＳＩと液体クロマトグラフィーとを組み合わせた、ナノ液体クロマトグラフィータンデム質量分析計（ｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）などを使用することが好ましい。
　このようにして、被検獣毛繊維のペプチド群に対する分子量の違いによる質量分析パターンを得る。得られた質量分析パターンは、分子量によって保持時間の異なる複数のピークから構成されている。
　（６－４）第５鑑別工程
　このようにして得られた質量分析パターンは、獣毛繊維の起源となる動物の種類に固有のものとなる。本第６実施形態においては、質量分析工程で得られた質量分析パターンを、起源となる動物の種類が既知の数種類の単一獣毛繊維の質量分析パターンと比較する。
　このため、動物の種類が既知の数種類の単一獣毛繊維に対して、上記と同様の工程による質量分析パターンを予め準備する。また、被検獣毛繊維の質量分析パターンを作成する際に、起源となる動物の種類が既知の数種類の単一獣毛繊維の質量分析パターンを同時に作成するようにしてもよい。このようにすることで、より正確な鑑別をすることができる。
　一例として、具体的に作成した動物の種類が既知の４種類の獣毛繊維の質量分析パターンを図６に示す。図６は、Ｌ：カシミヤ（ヤギ属）、Ｍ：キャメル（ラクダ属）、Ｎ：ウール（ヒツジ属）及びＯ：ヤク（ウシ属）の質量分析パターンを示している。図６において、左方のピークほど保持時間が短くペプチドの分子量が小さい。一方、右方のピークほど保持時間が長くペプチドの分子量が大きい。
　図６において、目視鑑別においても、Ｌ：カシミヤ（ヤギ属）、Ｍ：キャメル（ラクダ属）、Ｎ：ウール（ヒツジ属）及びＯ：ヤク（ウシ属）の質量分析パターンは、いずれも特徴的なピークを有し、動物の種類による差異は明確である。
　ここで、得られた質量分析パターンをより客観的に比較する方法について説明する。まず、得られた質量分析パターンについて各ピークの位置（保持時間：疎水性度及び分子量に対応）に対する各ピークの面積値（ペプチド量に対応）を定量する。
　これらの数値データを基に、例えば、特定の保持時間のピークの面積値と総面積値との関係を比較することにより、より客観的な鑑別が可能となる。或いは、特定の保持時間のピークの面積値と別の保持時間のピークの面積値との関係を比較するようにしてもよい。このとき、複数の試料間の保持時間は、補正しておくことが好ましい。
　このように、本第６実施形態においては、被検獣毛繊維の質量分析パターンを、起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の質量分析パターンと比較して、各ピークの位置と高さ、又は、保持時間と面積値の関係を確認することで、被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別することができる。特に、カシミヤ（ヤギ属）のような高級な獣毛繊維に対して、偽装して混合されることの多いヤク（ウシ属）やウール（ヒツジ属）を明確に区別することができる。
　《第７実施形態》
　本第７実施形態に係る獣毛繊維の鑑別方法は、上記第６実施形態と同様に、抽出工程、電気泳動工程、切出工程、消化工程、質量分析工程、及び、第５鑑別工程を有し、更に第６鑑別工程を有している。本第７実施形態においても、まず、被検獣毛繊維から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する（抽出工程）。次に、抽出したタンパク質群を電気泳動装置で分離して分子量の違いによる電気泳動パターンを得る（電気泳動工程）。
　更に、得られた被検獣毛繊維の電気泳動パターンから当該電気泳動パターンを形成する複数のバンドのうち所定のバンドを切出す（切出工程）。次に、切出したバンド内のタンパク質を所定の消化酵素により消化して一連のペプチド群に分割する（消化工程）。次に、得られたペプチド群を分離すると共に質量分析装置で分析して各ペプチドの分子量の違いによる質量分析パターンを得る（質量分析工程）。
　なお、本第７実施形態においては、被検獣毛繊維が単一の動物の種類を起源とするものではなく、２種以上の獣毛繊維が混合されている場合を対象とする。つまり、上記第６実施形態の第５鑑別工程において、被検獣毛繊維の質量分析パターンに対して起源となる動物の種類が既知の複数の獣毛繊維の質量分析パターンが適合せず、動物の種類を明確に鑑別できない場合に採用する。
　本第７実施形態においては、起源となる動物の種類が異なる獣毛繊維を一連の混用率で混合した混合獣毛繊維を準備し、これらに対する一連の質量分析パターンを予め準備する。その上で、第６鑑別工程において、得られた被検獣毛繊維の電気泳動パターンを予め準備した混合獣毛繊維の一連の質量分析パターンと比較する。
　このことにより、被検獣毛繊維が複数の動物を起源とすることを鑑別することができる。また、被検獣毛繊維がどのような動物の獣毛繊維を混合するものであるか、更に、それらの獣毛繊維をどの程度の混用率で混合するものであるかを鑑別することができる。
　本第７実施形態における抽出工程及び電気泳動工程については、上記第１実施形態と同様であり、また、切出工程、消化工程、及び、質量分析工程については、上記第６実施形態と同様であるのでここではその説明を省略する。
　（７－１）第６鑑別工程
　得られた質量分析パターンは、上記第５鑑別工程と同様に分子量によって保持時間の異なる複数のピークから構成されている。この質量分析パターンは、獣毛繊維の起源となる動物の種類の混用率に比例して変化する。上記第５鑑別工程と同様にして、得られた質量分析パターンについて各ピークの位置（保持時間：疎水性度及び分子量に対応）に対する各ピークの面積値（ペプチド量に対応）を定量する。
　これらの数値データを基に、例えば、特定の保持時間のピークの面積値と総面積値との関係を比較することにより、客観的な鑑別が可能となる。或いは、特定の保持時間のピークの面積値と別の保持時間のピークの面積値との関係を比較するようにしてもよい。
　このように、本第７実施形態においては、被検獣毛繊維の質量分析パターンを、一連の混合獣毛繊維の質量分析パターンと比較して、各ピークの保持時間と面積値の関係を確認することで、被検獣毛繊維が複数の動物を起源とすることを鑑別することができる。また、被検獣毛繊維がどのような動物の獣毛繊維を混合するものであるか、更に、それらの獣毛繊維をどの程度の混用率で混合するものであるかを正確に鑑別することができる。
　《第８実施形態》
　本第８実施形態に係る獣毛繊維の鑑別方法は、多くの標準試料に対して、上記第６実施形態において説明した質量分析パターンの解析データを測定し、これをデータベース化することにより、未知の被検獣毛繊維の鑑別を客観的に、且つ、安定して行うようにするものである。
　本第８実施形態においては、まず、獣毛繊維の起源が明確な多くの標準試料（単一獣毛繊維）、及び、獣毛繊維の起源と混用率が明確な多くの標準試料（混合獣毛繊維）について、上記第６実施形態と同様にしてペプチド群を質量分析して質量分析パターンを得る（質量分析工程）。
　得られた多くの質量分析パターンに対して、上記第６実施形態と同様にして、各ピークの位置（保持時間：疎水性度及び分子量に対応）に対する各ピークの面積値（ペプチド量に対応）を定量する。このようにして得られた多くの数値データをその標準試料の履歴と共にデータベース化することにより、第７鑑別工程において客観的な鑑別を行うことができる。具体的な方法は、後述の実施例において説明する。
　（８－１）第７鑑別工程
　このようにして構築されたデータベースについて説明する。まず、カシミヤ（ヤギ属）、キャメル（ラクダ属）、ウール（ヒツジ属）、ヤク（ウシ属）の原毛（単一獣毛繊維）、及び、カシミヤ（ヤギ属）とヤク（ウシ属）の混合（混合獣毛繊維）について、それぞれ複数の標準試料の数値データからデータベースを構築した。
　一例として、カシミヤ（ヤギ属）のグループ、カシミヤ（ヤギ属）とヤク（ウシ属）の混合グループ、及び、その他の獣毛繊維のグループという３つのグループに分類した。ここで、データを可視化するために、これらのグループの既知混用率を縦軸に、データベースから予測される混用率を横軸にとったグラフを図１３に示す。
　この図１３は、Ｐ：カシミヤ（ヤギ属）のグループ、Ｑ：カシミヤ（ヤギ属）とヤク（ウシ属）の混合グループ、及び、Ｒ：その他の獣毛繊維のグループという３つのグループに分類されている。更に、図１３では、カシミヤ（ヤギ属）とヤク（ウシ属）の混用率が直線上に正確に現れている。
　この例においては、被検獣毛繊維の質量分析パターンを解析して得られた数値データをこのデータベースと照合して、当該被検獣毛繊維がカシミヤ（ヤギ属）であるか、カシミヤ（ヤギ属）とヤク（ウシ属）の混合であるか、或いは、その他の獣毛繊維であるかを鑑別することができる。更に、被検獣毛繊維がカシミヤ（ヤギ属）とヤク（ウシ属）の混合である場合には、その混用率を精度よく鑑別することができる。
　同様にして、データベースの分類を変更することにより、カシミヤ（ヤギ属）以外の獣毛繊維、及び、カシミヤ（ヤギ属）とヤク（ウシ属）以外の混合獣毛繊維についても同様の鑑別が可能である。
　以下、上記各実施形態による獣毛繊維の鑑別方法を各実施例により、具体的に説明する。まず、各実施例のうち、実施例１～実施例３においては、獣毛繊維として下記に示す９２種類の標準試料、及び、３種類の被検獣毛繊維（以下「被検試料」ともいう。）を準備した。
　まず、起源が明確な単一獣毛繊維の標準試料として、カシミヤ（６２種類）、ヤク（１０種類）、ウール（９種類）、及び、キャメル（３種類）の原毛（ＣＣＭＩ Ｆｉｂｅｒ Ｂｏｘ：Ｃａｓｈｍｅｒｅ ａｎｄ Ｃａｍｅｌ Ｈａｉｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を準備した。また、起源及び混用率が明確な混合獣毛繊維の標準試料として、カシミヤとヤクの原毛（ＣＣＭＩ）を重量比で９：１、８：２、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８、９：１になるように混合した試料を準備した。
　次に、被検試料１としてカシミヤの染色加工された単一獣毛繊維（東洋紡糸工業株式会社）を、被検試料２としてヤクの染色加工された単一獣毛繊維（ダブルツリー株式会社）を準備した。また、被検試料３としてカシミヤとヤクの原毛（ＣＣＭＩ）を重量比で７：３となるように混合した混合獣毛繊維を準備した。なお、被検試料の起源は、検査員には分からないようにして試験した。
　本実施例１は、上記第１実施形態及び第２実施形態に基づいて、３種類の被検試料を電気泳動パターンから鑑別するものである。
　（１）抽出工程
　染色加工された被検試料１及び２（いずれも単一獣毛繊維）については、タンパク質抽出前に洗浄操作を行った。一方、被検試料３（混合獣毛繊維）については、洗浄操作を行うことなくタンパク質抽出を行った。まず、洗浄操作は、１０ｍｇの試料に対して２５０μＬの洗浄液（１２ｍＭ‐デオキシコール酸、１２ｍＭ‐ラウロイルサルコシ酸、１００ｍＭ‐トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０））を添加した。試料が洗浄液に浸かるように懸濁した後、試料を９５℃で２０分間、加熱した。その後、１５０００×ｇで１０分間、遠心分離した後、上清を除去した。上記の洗浄操作を計３回行った。
　タンパク質の抽出は、１０ｍｇの試料に対して２５０μＬの抽出液（２％‐ＳＤＳ、６％‐２－ＭＥ、１２５ｍＭ‐トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８））を添加し、９５℃で２０分間、加熱した。その後、１５０００×ｇで１０分間、遠心分離し、上清をタンパク質抽出液として回収した。抽出操作は計２回繰り返した。
　電気泳動前にタンパク質を濃縮するためにアセトン沈殿を行った。アセトン沈殿は、まず、試料量に対して３倍量の冷アセトンを添加し攪拌した。試料を－８０℃で３時間静置した後、１５０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離を行った。上清を除去した後、試料を遠心濃縮機ＣＣ－１０５（株式会社トミー精工）で乾燥させた。タンパク質は、６０μＬの抽出液（２％‐ＳＤＳ、６％‐２－ＭＥ、１２５ｍＭ‐トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８））で溶解した。
　その後、システイン側鎖をアルキル化するために、試料に６μＬの５００ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を添加し、３０分間、室温、暗所でインキュベートした。抽出されたタンパク質の量は６６０ｎｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて定量した。なお、定量用標準試料（内部標準）としてウシの血清アルブミン（ＢＳＡ、和光純薬工業株式会社）を使用した。
　（２）電気泳動工程
　次に、被検試料１～３から抽出した各タンパク質群に対して、それぞれ、次のようにして電気泳動を行った。電気泳動には、２０ｕｇのタンパク質を使用した。電気泳動前に、試料は等量の電気泳動用試料調製液（４％‐ＳＤＳ、１２％‐２－ＭＥ、２５０ｍＭ‐トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）、２０％‐グリセロール、０．０２％‐ブロモフェノールブルー）、及び、１ｎｇのＢＳＡ（内部標準）と混和した後、９５℃で５分間加熱した。電気泳動槽はＢＥ－２１１（株式会社バイオクラフト）を使用し、２０％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（テフコ株式会社：８ｃｍ長ゲル）を用いてタンパク質を分離した。
　１枚あたり２５ｍＡの定電流で電気泳動を行った。分子量マーカとして、３μＬのＢｌｕｅＳｔａｒ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（日本ジェネティクス株式会社）を電気泳動に使用した。電気泳動後のゲルは７．５％‐酢酸溶液で１５分間振とうした後、染色液（０．２５％‐ＣＢＢ－Ｒ、５０％‐メタノール、１０％‐酢酸）で２０分間振とうした。脱色操作には、５％‐メタノール、７％‐酢酸溶液を用いた。
　このようにして、被検試料１～３の電気泳動パターンを得た。得られた被検試料１の電気泳動パターンを図１４に示す。図１４において、ゲル画像をＳ１、解析チャートをＳ２で示す。また、得られた被検試料２の電気泳動パターンを図１５に示す。図１５において、ゲル画像をＴ１、解析チャートをＴ２で示す。また、得られた被検試料３の電気泳動パターンを図１６に示す。図１６において、ゲル画像をＵ１、解析チャートをＵ２で示す。
　（３）鑑別工程
　次に、得られた被検試料１～３の電気泳動パターンを標準試料の電気泳動パターンと比較した。標準試料の電気泳動パターンには、上述の図１～図３に示したＡ：カシミヤ、Ｂ：キャメル、Ｃ：ウール及びＤ：ヤクの電気泳動パターンを使用した。被検試料１の電気泳動パターンにおいて、バンド７がバンド６よりも濃く、両バンドの間隔は標準試料Ｃ：ウールよりも広いことから、被検試料１は、カシミヤと判別された。
　また、被検試料２の電気泳動パターンにおいて、バンド３、４、５及び６の濃さはバンド７と同等であり、バンド８よりもバンド９の方が濃かったことから、被検試料２は、ヤクと判定された。一方、被検試料３の電気泳動パターンにおいて、バンド１、若しくはバンド２に対するバンド３、４、５及び６の濃さは標準試料Ａ：カシミヤより薄く、さらにバンド８に対してバンド９及びバンド１２が濃いことから、被検試料３は、カシミヤとヤクの混合と判別された。
　本実施例２は、上記第３実施形態に基づいて、３種類の被検試料を電気泳動パターンのデータベースから鑑別するものである。
　まず、データベースの構築について説明する。上記標準試料９２種類について、それぞれ、ゲル画像をスキャナーで取り込んだ。ゲル画像はＢａｓｉｃ Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ（Ｂｉｏ Ｉｍａｇｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）で読み込み、各バンドの濃さ（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）及びバンドの移動度Ｒｆを数値化した。各試料間における移動度Ｒｆの誤差を補正するために、Ｂａｓｉｃ Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒで取り込んだ数値をＥｘｃｅｌ ２０１０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）で読み込んだ。
　その後、試料ごとに約７０ｋＤａ（ＢＳＡ：内部標準）、６０ｋＤａ、５０ｋＤａ、２０ｋＤａ、１５ｋＤａ、１０ｋＤａのバンドの移動度Ｒｆを抽出し、標準試料（カシミヤ－Ａ３、ＣＣＭＩ）の移動度Ｒｆと比較し、近似曲線（２次式）を作成した。近似曲線で得られた係数を用いて、各試料における移動度Ｒｆを補正した。バンドのＩｎｔｅｎｓｉｔｙは、各移動度ＲｆにおけるＩｎｔｅｎｓｉｔｙを総バンドのＩｎｔｅｎｓｉｔｙで補正した。
　９２種類の標準試料の数値データは、ＳＩＭＣＡ ｖｅｒ．１３．０（Ｕｍｅｔｒｉｃｓ）を用いて主成分分析により分類された。主成分分析の結果、カシミヤのグループとその他の獣毛繊維（非カシミヤ）のグループの２つのグループに分類した（図５参照）。
　次に、被検試料１～３の電気泳動パターンから同様にして得られた数値データ（バンドの移動度Ｒｆ及びＩｎｔｅｎｓｉｔｙ）を上記データベースに構築されたモデルに与えたところ、被検試料１は、カシミヤのグループに分類された。一方、被検試料２及び被検試料３は、その他の獣毛繊維（非カシミヤ）のグループに分類された。
　本実施例３は、上記第８実施形態に基づいて、３種類の被検試料をペプチド群の質量分析パターンのデータベースから鑑別するものである。なお、本実施例３においては、上記実施例１において標準試料及び被検試料の電気泳動工程で得られた各ゲル試料を使用した。
　（１）消化工程
　上記実施例１及び実施例２の電気泳動工程で得られたゲルを脱色し、この脱色後のゲルから、１０ｋＤａ付近にあるバンドを切り出した。ゲルに１００μＬの固定液（５０％‐メタノール、５％‐酢酸）を添加し、Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｍａｘｉｍｉｚｅｒ（Ｍ／ＢＲ－０２２ＵＰ、タイテック株式会社）により攪拌した（１０分間、２５℃、１５００ｒｐｍ）。上清を除去した後、１００μＬのアセトニトリルをゲルに添加し、攪拌した。
　上層を除去した後、１００μＬの１０ｍＭ‐ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｍａｘｉｍｉｚｅｒで攪拌した（１０分間、５６℃、１５００ｒｐｍ)。上清を除去した後、１００μＬのＩＡＡを添加し、Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｍａｘｉｍｉｚｅｒで攪拌した（１０分間、２５℃、１５００ｒｐｍ）。
　上清を除去した後、１００μＬのアセトニトリルを添加し、Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｍａｘｉｍｉｚｅｒで攪拌した（１０分間、２５℃、１５００ｒｐｍ）。上清を除去した後、再度１００μＬのアセトニトリルを添加し、Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｍａｘｉｍｉｚｅｒで攪拌した（１０分間、２５℃、１５００ｒｐｍ）。上清を除去した後、遠心濃縮機ＣＣ－１０５で５分間、ゲルを乾燥させた。
　ゲルに２０μＬのＬｙｓ－Ｃ溶液（０．０１ｕｇ／μＬ、和光純薬工業株式会社）を添加し、４℃で３０分間静置させた。その後、７０μＬのＬｙｓ－Ｃ溶液を添加し、室温で６５分間静置させた。２０μＬの５０ｍＭ‐炭酸水素アンモニウム溶液を添加した後、３７℃で一晩静置させた。消化処理後に上清を回収し、ゲルに１００μＬの３０％‐アセトニトリル、３％‐トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加した。ゲルをＤｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｍａｘｉｍｉｚｅｒで攪拌した（１０分間、２５℃、１５００ｒｐｍ）後、上清を回収した。この操作を再度行った。ゲルに１００μＬのアセトニトリルを添加した後、Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｍａｘｉｍｉｚｅｒで攪拌し（１０分間、２５℃、１５００ｒｐｍ）、上清を回収した。この操作を再度行った。
　上清は全て同じ容器に回収した。溶媒を遠心濃縮機ＣＣ－１０５で除去した後、ペプチドを５０μＬの１％ＴＦＡで溶解した。ペプチドはＳＤＢ－ＸＣ（３Ｍ社）を詰めたミニカラムで脱塩及び濃縮した。試料溶媒を遠心濃縮機ＣＣ－１０５で除去した後、ペプチドを１０μＬの６種類の合成ペプチド（２０ｆｍｏｌ／μＬ／ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む５％‐アセトニトリル、０．１％‐ＴＦＡで溶解した。
　（２）質量分析工程
　このようにして得られた各ペプチド群は、それぞれ、ナノ液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いて分析した。ｎａｎｏＬＣとしてＵｎｔｉｍａｔｅ３０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）、オートサンプラーとしてＨＴＣ－ＰＡＬ（ＣＴＣ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を組み合わせたＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を測定に使用した。Ｒｅｐｒｏｓｉｌ Ｃ１８ ｍａｔｅｒｉａｌｓ（３μｍ、Ｄｒ Ｍａｉｓｃｈ社）を充填した分析カラムを使用した。
　分析には５μＬの試料を用いた。移動相の流速は、５００ｎＬ／ｍｉｎとした。移動相Ａ及びＢは０．５％‐酢酸及び０．５％‐酢酸、８０％‐アセトニトリルをそれぞれ用いた。Ｍａｓｓ Ｎａｖｉｇａｔｏｒ ｖ１．２（三井情報株式会社）を用いて、質量分析データからペプチド及びフラグメンテーションイオンの情報をＭａｓｃｏｔ Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｆｏｒｍａｔ（ＭＧＦ）で抽出した。
　このようにして、上記標準試料９２種類、及び、被検試料１～３の質量分析パターンを得た。得られた被検試料１の質量分析パターンを図１７に示す。得られた被検試料２の質量分析パターンを図１８に示す。得られた被検試料３の質量分析パターンを図１９に示す。
　（３）鑑別工程
　まず、データベースの構築について説明する。上記標準試料９２種類について、それぞれ、ペプチドを同定するためにＭａｓｃｏｔ ｖ２．２（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用い、同定されたペプチドの量（ピーク面積値）はＭａｓｓ Ｎａｖｉｇａｔｏｒ ｖ１．２により算出した。試料間におけるペプチドの保持時間のバラツキは合成ペプチドの保持時間を用いて補正した。具体的には各試料で検出された合成ペプチドの保持時間を標準試料（カシミヤ－Ａ３、ＣＣＭＩ）において検出された保持時間と比較し、近似曲線（２次式）を作成した。近似曲線で得られた係数を用いて、各試料における保持時間を補正した。
　各ペプチドのピーク面積値は総ピーク面積値で補正した。９２種類の標準試料の数値データはＳＩＭＣＡ ｖｅｒ.１３．０を用いて主成分分析によりグループ分けを行った。主成分分析の結果、カシミヤのグループ、非カシミヤのグループ、及び、カシミヤと他の獣毛繊維の混合のグループ（本実施例３においては、カシミヤとヤクの混合のグループ）の３つのグループに分類された。
　次に、被検試料１～３の質量分析パターンから同様にして得られた数値データ（保持時間及びピーク面積値）を上記データベースに構築されたモデルに与えたところ、被検試料１は、カシミヤのグループに分類された。また、被検試料２は、非カシミヤのグループに分類された。一方、被検試料３は、カシミヤとヤクの混合のグループに分類された。
　更に、既知混合比を縦軸に、モデルから予測される混合比を横軸にとったモデル（図１３参照）に対して、被検試料３の数値データを与えたところ、被検試料３は、重量比７：３の位置にプロットされた。
　このように、上記実施例１～実施例３においては、染色加工された被検試料１及び２に対して、その起源となる動物の種類を正確に鑑別することができた。また、２種類の獣毛繊維が混合された被検試料３に対して、混合された獣毛繊維の種類と混用率を正確に鑑別することができた。これらの操作は、比較的容易であり、また、機器分析であることから、検査員の経験やノウハウに頼ることなく客観的な鑑別をすることができた。
　これらのことから、本発明においては、鑑別操作が比較的簡単で客観性を有し、検査員の経験やノウハウに頼ることなく鑑別でき、且つ、獣毛繊維に前処理や染色加工がなされている場合でも、正確な鑑別結果を得ることのできる獣毛繊維の鑑別方法を提供することができる。
　次に、上記第４実施形態に基づいて、鑑別精度を向上する実施例４～実施例６、並びに、第５実施形態に基づいて、被検獣毛繊維（以下「被検試料」ともいう。）の混用率の鑑別を簡単に行うことができる実施例７について説明する。
　本実施例４は、上記第４実施形態に基づいて、分解能の高いポリアクリルアミドゲルを使用するものである（図６及び図７参照）。本実施例４においては、８ｃｍ長ゲルを使用して得られた９２種類の混用率既知試料の電気泳動パターンと、１２ｃｍ長ゲルを使用して得られた７９種類の混用率既知試料の電気泳動パターンとを使用して、それぞれデータベースを構築した。得られた各データベースを使用して、混用率が既知の５種類の被検試料に対する混用率を予測した。
　次に、得られた各データベースにおける平均予測精度を計算した。平均予測精度の計算には、下記の式（１）を使用した。

　　　平均予測精度＝Σ｜実際の混用率－予測混用率｜／データ数・・・（１）

　その結果、一般に使用される８ｃｍ長ゲルを使用した際の平均予測精度（±標準偏差）は、１４．４±１０．１％であった。これに対して、１２ｃｍ長ゲルを使用した際の平均予測精度（±標準偏差）は、６．８±７．８％となり、分解能の高い１２ｃｍ長ゲルを使用することにより、従来に比べ平均予測精度が約２倍に向上した。
　本実施例５は、上記第４実施形態に基づいて、タンパク質の抽出効率が向上する還元剤を使用するものである。本実施例５においては、図８に示すように容量％濃度で６％の２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ）（以下「６％－２ＭＥ」という。）と、１５％の２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ）（以下「１５％－２ＭＥ」という。）、及び、モル濃度で１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）（以下「１０ｍＭ－ＤＴＴ」という。）をそれぞれ使用してヤク（ウシ属）の電気泳動パターン（ゲル画像）を得た（図８参照）。
　図８のゲル画像において、６％－２ＭＥで得られたゲル画像に対して、１５％－２ＭＥで得られたゲル画像においては、移動度が大きい下方の領域（動物種特有のタンパク質領域（ＡＲＥＡ－１））の分解能が向上しており、この領域が重点的に抽出されたことを示している。
　一方、１０ｍＭ－ＤＴＴで得られたゲル画像においては、動物種特有のタンパク質領域（ＡＲＥＡ－１）だけでなく、移動度が小さい上方の領域（共通のタンパク質領域（ＡＲＥＡ－２））を含め、全体的に抽出効率が向上している。
　次に、これらの電気泳動パターンから混用率を予測した。混用率を予測には、６％－２ＭＥを使用して１２ｃｍ長ゲルで作成したデータベースを使用した。それぞれの電気泳動パターンから予測した混用率の値を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本実施例５においては、被検試料の実際の混用率は、ヤク１００％であった。この被検試料に対して、６％－２ＭＥで得られた予測混用率は、ウール２４．８％であった。これに対して、１５％－２ＭＥで得られた予測混用率は、ウール２．８％と大幅に改善された。また、カシミヤの予測混用率が０％を下回り、ヤクの予測混用率が１００％を上回った。予測混用率が０％を下回る場合は、ほぼ例外なく実際の混用率は０％と判断できる。同様に、予測混用率が１００％を上回る場合は、ほぼ例外なく実際の混用率は１００％と判断できる。
　一方、１０ｍＭ－ＤＴＴで得られた予測混用率は、ヤクの予測混用率が１００％を上回り、カシミヤとヤクの予測混用率がいずれも０％を下回った。このことより、１０ｍＭ－ＤＴＴで得られた予測混用率から、ヤク１００％と判断できる。
　これらのことより、抽出液中の還元剤として１５％－２ＭＥ、又は、１０ｍＭ－ＤＴＴを使用することにより、被検試料の鑑別精度を向上させることができる。
　本実施例６は、上記第４実施形態に基づいて、「確かめ算試験」を使用するものである。本実施例６においては、混用率既知の２種類の被検試料（Ｙ１、Ｙ２）に対して電気泳動パターンを得る。図９に被検試料（Ｙ１）の電気泳動パターンをゲル画像（Ｙ１－１）で示す。また、被検試料（Ｙ２）の電気泳動パターンをゲル画像（Ｙ２－１）で示す。
　本実施例６においては、これらのゲル画像（Ｙ１－１、Ｙ２－１）から上記第２実施形態の第２鑑別工程と同様にして被検試料（Ｙ１、Ｙ２）の混用率を予測した。次に、起源となる動物の種類が既知の複数の単一獣毛繊維を用いて、予測した混用率と同じ比率で混合した１回目の比較獣毛繊維（以下「第１比較試料」という。）を調製した。
　次に、調製した第１比較試料に対して上記第２実施形態と同様にして第１比較試料の電気泳動パターン（Ｙ１－２、Ｙ２－２）を求める（図９参照）。本実施例６においては、被検試料（Ｙ１、Ｙ２）の実際の混用率は既知である。しかし、実際の鑑別においては被検試料の混用率は不明である。そこで、実際の鑑別においては、第１比較試料から得られた電気泳動パターン（Ｙ１－２、Ｙ２－２）を被検試料の電気泳動パターン（Ｙ１－１、Ｙ２－１）と比較する。これらの電気泳動パターンがほぼ一致すれば、被検試料から最初に得られた予測混用率が正確であるものと判断できる。
　一方、第１比較試料から得られた電気泳動パターン（Ｙ１－２、Ｙ２－２）が被検試料の電気泳動パターン（Ｙ１－１、Ｙ２－１）と大きく異なっている場合には、再度、起源となる動物の種類が既知の複数の単一獣毛繊維を用いて、第１比較試料の混用率を参考にして修正した２回目の比較獣毛繊維（以下「第２比較試料」という。）を調製する。
　次に、調製した第２比較試料に対して上記第２実施形態と同様にして第２比較試料の電気泳動パターン（Ｙ１－３、Ｙ２－３）を求める（図９参照）。この第２比較試料から得られた電気泳動パターン（Ｙ１－３、Ｙ２－３）を被検試料の電気泳動パターン（Ｙ１－１、Ｙ２－１）と比較する。これらの電気泳動パターンがほぼ一致するまで、同様の操作を繰り返す。
　表２に本実施例６における被検試料（Ｙ１、Ｙ２）の実際の混用率、各第１比較試料の混用率、及び、各第２比較試料の混用率の値を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２において、被検試料Ｙ１の実際の混用率（％）は、カシミヤ：ヤク：ウール＝６０：２５：１５である。しかし、第１比較試料（カシミヤ：ヤク：ウール＝５５：１０：３５）から得られた電気泳動パターンは、ウールに特徴的なバンド（図９のバンド１）が被検試料よりも濃く、未だ精度が良好ではない。これに対して、第１比較試料の混用率（％）を参考に調製された第２比較試料の電気泳動パターンは被検試料と類似している（図９参照）。このように、被検試料の混用率（％）は、第１比較試料よりも第２比較試料（カシミヤ：ヤク：ウール＝６０：３０：１０）と近く、鑑別精度が向上したことが分かる。
　一方、被検試料Ｙ２の実際の混用率（％）は、カシミヤ：ヤク：ウール＝１００：０：０である。しかし、第１比較試料（カシミヤ：ヤク：ウール＝７０：５：２５）から得られた電気泳動パターンは、ウールに特徴的なバンド（図９のバンド１）およびヤクに多く存在するバンド（図９のバンド２）が被検試料よりも濃く、未だ精度が良好ではない。これに対して、第１比較試料の混用率（％）を参考に調製された第２比較試料の電気泳動パターンは被検試料と類似しており、実際の混用率（カシミヤ：ヤク：ウール＝１００：０：０）と一致した。
　このように、比較試料を調製する際に使用した混用率とその電気泳動パターンをもとに新たな比較試料を調製し、これらの電気泳動パターンと被検試料の電気泳動パターンとの一致性がほぼ得られるまで同様の操作を繰り返す。この「確かめ算試験」を使用することにより、被検試料の混用率の正確性を向上させることができる。このことにより、より正確な混用率の鑑別を比較的簡単、且つ、客観的に行うことができる。
　本実施例７は、上記第５実施形態に基づいて、被検試料がカシミヤ（ヤギ属）とウール（ヒツジ属）の２種類の獣毛繊維で構成されている際に、データベース化をすることなく、被検試料の混用率の鑑別を簡単、且つ、高い精度で行うものである。本実施例７において、被検試料（Ｙ３）を構成するカシミヤ１００％の電気泳動パターン（Ａ）とウール１００％の電気泳動パターン（Ｃ）とを図１０に示す。図１０において、２つの電気泳動パターン（Ａ、Ｃ）を比較すると、バンド１及びバンド２は、カシミヤ（ヤギ属）とウール（ヒツジ属）に特有なバンドであることが分かる。
　そこで、カシミヤ（ヤギ属）とウール（ヒツジ属）の混用率を変化させた標準試料を調製し、これらの電気泳動パターン（図１０のゲル画像Ｚ１）を求める。図１０に、カシミヤ：ウール＝２０：８０、３０：７０、４０：６０、５０：６０、６０：４０、７０：３０に調整した各標準試料のゲル画像（Ｚ１１～Ｚ１６）を示す。これらのゲル画像（Ｚ１１～Ｚ１６）において、２種類の獣毛繊維の混用率の変化に対応して、バンド１とバンド２の濃度が変化していることが分かる。
　次に、これらのゲル画像（Ｚ１）を解析して移動度Ｒｆと濃度との関係を示す解析チャート（Ｚ２）を作成する（図１１参照）。図１１に、カシミヤ：ウール＝３０：７０、４０：６０、５０：６０、６０：４０、７０：３０に調整した各標準試料の解析チャート（Ｚ２２～Ｚ２６）を示す。これらの解析チャート（Ｚ２２～Ｚ２６）において、カシミヤとウールの混用率の変化に対応して、バンド１とバンド２の濃度の変化が明確に判別できる。
　本実施例７においては、混用率既知の被検試料（Ｙ３）に対して電気泳動パターンを得る（図１０のゲル画像Ｙ３－１）。次に、このゲル画像（Ｙ３－１）を解析して移動度Ｒｆと濃度との関係を示す解析チャート（Ｙ３－２）を得る（図１１参照）。次に、得られた被検試料（Ｙ３）の解析チャート（Ｙ３－２）を先に求めておいた各標準試料の解析チャート（Ｚ２２～Ｚ２６）と比較する。
　図１１において、バンド１とバンド２の濃度（図１１の縦軸）がカシミヤとウールの混用率によって変化していることが確認できる。カシミヤの混用率が上昇するに従って、バンド１の濃度が薄くなり、これに伴い、バンド２の濃度が濃くなっていることが分かる。そこで、被検試料（Ｙ３）の解析チャート（Ｙ３－２）と各標準試料の解析チャート（Ｚ２２～Ｚ２６）とを比較すると、被検試料（Ｙ３）の解析チャート（Ｙ３－２）は、カシミヤ：ウール＝４０：６０の標準試料の解析チャート（Ｚ２３）と重なることが確認できる。
　よって、本実施例７においては、電気泳動パターンの解析に当たり、移動度Ｒｆの補正や主成分分析による全てのバンドの解析をすることなく、バンド１及びバンド２に着目することにより、被検試料の混用率の鑑別を簡単、且つ、高い精度で行うことができる。
　これらのことから、本発明においては、鑑別操作が比較的簡単で客観性を有し、検査員の経験やノウハウに頼ることなく鑑別でき、且つ、獣毛繊維に前処理や染色加工がなされている場合でも、正確な鑑別結果を得ることのできる獣毛繊維の鑑別方法を提供することができる。
　なお、本発明の実施にあたり、上記各実施例に限らず次のような種々の変形例が挙げられる。
１．上記実施例２においては、バンドのＩｎｔｅｎｓｉｔｙの補正を総バンドのＩｎｔｅｎｓｉｔｙに対する比で補正したが、これに限るものではなく、特定のバンドのＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（例えばＢＳＡ：内部標準）に対する比で補正するようにしてもよい。
２．上記実施例３においては、ピーク面積値の補正を総ピーク面積値に対する比で補正したが、これに限るものではなく、特定のペプチドのピーク面積値に対する比で補正するようにしてもよい。
３．上記実施例３においては、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳでペプチド群の分析を行っているが、これに限るものではなく、ＬＣの検出器として紫外可視分光検出器を採用するようにしてもよい。
４．上記実施例３においては、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳでペプチド群の分析を行っているが、これに限るものではなく、クリーブランド法などを利用するようにしてもよい。
５．上記実施例１においては、タンパク質の抽出の際に獣毛繊維を粉砕することなく抽出を行っているが、これに限るものではなく、獣毛繊維を粉砕してからタンパク質を抽出するようにしてもよい。特に、脱スケールされた獣毛繊維に関しては、タンパク質を抽出する前に細かく粉砕することで、明瞭な電気泳動パターンを容易に得ることができる。
６．上記実施例２においては、移動度Ｒｆの補正に２次式による近似式を用いているが、これに限るものではなく、正確に補正できるのであれば３次式その他であってもよい。
７．上記実施例３においては、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにおける保持時間の補正に２次式による近似式を用いているが、これに限るものではなく、正確に補正できるのであれば３次式その他であってもよい。
８．上記実施例６の「確かめ算試験」においては、上記第２実施形態と同様にして比較試料の電気泳動パターンを求めた。従って、比較試料と被検試料との一致性は、両試料の電気泳動パターンを比較して判断した。しかし、これに限るものではなく、上記第３実施形態と同様にしてデータベースから比較試料の混用率を予測するようにしてもよい。この場合には、データベースから得られた比較獣毛繊維の混用率と、比較獣毛繊維を調製する際の混用率（データベースから得られた被検獣毛繊維の混用率に同じ）との一致性を判断するようにする。
　カシミヤなどの高級な獣毛繊維に安価な他の獣毛繊維を混合した偽装繊維製品が市場に出回っている。特に、繊維製品の取引がグローバル化した現在において、輸出入の際に迅速、且つ、正確な鑑別方法が望まれている。
　本発明は、このような市場の要求に対して的確な鑑別手段を提供するものであり、また、従来法のように検査員の経験やノウハウに頼ることがない。特に、偽装が巧妙になる現在において、獣毛繊維の起源となる動物の種類を客観的に鑑別できること、また、偽装がなされていても正確な鑑別結果が得られるということは、これまでにない画期的な鑑別手段となる。
　このことから、本発明は、市場の安定や国際間の公正取引に有効な鑑別手段を提供するものであり、単に従来法であるＪＩＳ Ｌ １０３０‐１（繊維製品の混用率試験方法‐第１部：繊維鑑別）、及び、ＪＩＳ Ｌ １０３０‐２（繊維製品の混用率試験方法‐第２部：繊維混用率）を補完する鑑別手段に留まらず、国際標準として利用可能な鑑別手段を提供することができる。
Ａ…カシミヤの電気泳動パターン、
Ｂ…キャメルの電気泳動パターン、
Ｃ…ウールの電気泳動パターン、
Ｄ…ヤクの電気泳動パターン、
Ｅ…カシミヤ：ヤク＝１００％：０％の電気泳動パターン、
Ｆ…カシミヤ：ヤク＝７０％：３０％の電気泳動パターン、
Ｇ…カシミヤ：ヤク＝５０％：５０％の電気泳動パターン、
Ｈ…カシミヤ：ヤク＝３０％：７０％の電気泳動パターン、
Ｉ…カシミヤ：ヤク＝０％：１００％の電気泳動パターン、
Ｊ…電気泳動パターンのデータベースにおけるカシミヤのグループ、
Ｋ…電気泳動パターンのデータベースにおけるその他の獣毛繊維のグループ、
Ｌ…カシミヤの質量分析パターン、
Ｍ…キャメルの質量分析パターン、
Ｎ…ウールの質量分析パターン、
Ｏ…ヤクの質量分析パターン、
Ｐ…質量分析パターンのデータベースにおけるカシミヤのグループ、
Ｑ…質量分析パターンのデータベースにおけるカシミヤとヤクの混合獣毛繊維のグループ、
Ｒ…質量分析パターンのデータベースにおけるその他の獣毛繊維のグループ、
Ｓ…被検獣毛繊維（カシミヤ）の電気泳動パターン、
Ｔ…被検獣毛繊維（ヤク）の電気泳動パターン、
Ｕ…被検獣毛繊維（カシミヤとヤクの混合）の電気泳動パターン、
Ｖ…被検獣毛繊維（カシミヤ）の質量分析パターン、
Ｗ…被検獣毛繊維（ヤク）の質量分析パターン、
Ｘ…被検獣毛繊維（カシミヤとヤクの混合）の質量分析パターン、
Ｙ…被検獣毛繊維（混合）の電気泳動パターン、
Ｚ…標準試料（カシミヤとウールの混合）の電気泳動パターン、
ＡＲＥＡ－１…動物種特有のタンパク質領域、
ＡＲＥＡ－２…共通のタンパク質領域。

Claims (15)

  1. 　被検獣毛繊維から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する抽出工程、
    　抽出した前記タンパク質群を電気泳動手段により分離して電気泳動パターンを得る電気泳動工程、及び、
    　得られた前記電気泳動パターンを予め準備した起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の電気泳動パターンと比較して、前記被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別する第１鑑別工程を有する獣毛繊維の鑑別方法。
  2. 　予め準備した起源となる動物の種類が異なる獣毛繊維を一連の混用率で混合した混合獣毛繊維に対して、前記抽出工程及び前記電気泳動工程と同様にして一連の電気泳動パターンを得ておき、
    　前記被検獣毛繊維から得られた電気泳動パターンを前記混合獣毛繊維から得られた一連の電気泳動パターンと比較して、前記被検獣毛繊維が少なくとも２種類の動物を起源とすること、前記被検獣毛繊維の起源となる少なくとも２種類の動物の種類、及び／又は、前記被検獣毛繊維の混用率を鑑別する第２鑑別工程を有することを特徴とする請求項１に記載の獣毛繊維の鑑別方法。
  3. 　前記単一獣毛繊維の電気泳動パターン、及び、前記混合獣毛繊維から得られた一連の電気泳動パターンについて、それぞれ、各バンドの濃度と移動度との関係を解析してデータベースとして蓄積する工程、
    　前記被検獣毛繊維から得られた前記電気泳動パターンについて、各バンドの濃度と移動度との関係を解析する工程、及び、
    　前記被検獣毛繊維の解析データを前記データベースのデータ群と照合して、前記解析データと前記データベースのデータ群との一致性を指標として、前記被検獣毛繊維が少なくとも２種類の動物を起源とすること、前記被検獣毛繊維の起源となる少なくとも２種類の動物の種類、及び／又は、前記被検獣毛繊維の混用率を鑑別する第３鑑別工程を有することを特徴とする請求項２に記載の獣毛繊維の鑑別方法。
  4. 　前記第２鑑別工程又は前記第３鑑別工程において得られた前記被検獣毛繊維の混用率を用いて、起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維を前記混用率と同じ比率で混合した比較獣毛繊維の電気泳動パターンを得るための各工程、及び、
    　得られた前記比較獣毛繊維の電気泳動パターンに対して、再度、前記第２鑑別工程又は前記第３鑑別工程の鑑別を行うための各工程を
    　少なくとも１回以上繰り返すことにより、前記被検獣毛繊維の混用率と前記比較獣毛繊維の混用率の一致性を向上させることにより、前記被検獣毛繊維の混用率を鑑別することを特徴とする請求項２又は３に記載の獣毛繊維の鑑別方法。
  5. 　前記混合獣毛繊維は、起源となる動物の種類が既知の２種類の獣毛繊維を一連の混用率で混合したものであって、
    　前記混合獣毛繊維から得られた一連の電気泳動パターンについて、それぞれ、前記２種類の獣毛繊維に特有であって予め認定した移動度におけるバンドの濃度を求める工程、
    　前記被検獣毛繊維から得られた前記電気泳動パターンについて、前記予め認定した移動度におけるバンドの濃度を求める工程、及び、
    　前記被検獣毛繊維の前記予め認定した移動度におけるバンドの濃度を前記混合獣毛繊維の前記予め認定した移動度におけるバンドの濃度と照合して、これらのバンドの濃度の一致性を指標として前記被検獣毛繊維の混用率を鑑別する第４鑑別工程を有することを特徴とする請求項２に記載の獣毛繊維の鑑別方法。
  6. 　前記２種類の獣毛繊維は、カシミヤ及びウールであることを特徴とする請求項５に記載の獣毛繊維の鑑別方法。
  7. 　電気泳動パターンを得る前記電気泳動工程おいて、
    　起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の電気泳動パターンのうち、少なくともカシミヤを起源とする単一獣毛繊維の電気泳動パターンに対して、分子量が２５ｋＤａ以下の領域における分解能が、１０個以上のバンドに分解可能な電気泳動ゲルを使用することを特徴とする請求項１～６のいずれか１つに記載の獣毛繊維の鑑別方法。
  8. 　タンパク質群を抽出する前記抽出工程において、
    　タンパク質の分子内或いは分子間のジスルフィド結合を開裂するために還元剤を使用し、当該還元剤は、容量％濃度で６％より濃い濃度の２－メルカプトエタノール、又は、モル濃度で８～１２ｍＭ（ミリモル／リッター）のジチオスレイトールであることを特徴とする請求項１～７のいずれか１つに記載の獣毛繊維の鑑別方法。
  9. 　被検獣毛繊維から当該獣毛繊維を構成するタンパク質群を抽出する抽出工程、
    　抽出した前記タンパク質群を電気泳動手段により分離して電気泳動パターンを得る電気泳動工程、
    　前記電気泳動パターンを形成する複数のバンドのうち所定のバンドを切出す切出工程、
    　切出した前記バンド内のタンパク質を所定の消化酵素により消化して一連のペプチド群とする消化工程、
    　得られた前記ペプチド群を質量分析手段により分析して前記ペプチド群の質量分析パターンを得る質量分析工程、及び、
    　得られた前記質量分析パターンを予め準備した起源となる動物の種類が既知の単一獣毛繊維の質量分析パターンと比較して、前記被検獣毛繊維の起源となる動物の種類を鑑別する第５鑑別工程を有する獣毛繊維の鑑別方法。
  10. 　予め準備した起源となる動物の種類が異なる獣毛繊維を一連の混用率で混合した混合獣毛繊維に対して、前記抽出工程及び前記電気泳動工程と同様にして得た一連の電気泳動パターンから前記切出工程、前記消化工程、及び、前記質量分析工程と同様にして一連の質量分析パターンを得ておき、
    　前記被検獣毛繊維から得られた前記質量分析パターンを前記混合獣毛繊維から得られた一連の質量分析パターンと比較して、前記被検獣毛繊維が少なくとも２種類の動物を起源とすること、前記被検獣毛繊維の起源となる少なくとも２種類の動物の種類、及び／又は、前記被検獣毛繊維の混用率を鑑別する第６鑑別工程を有することを特徴とする請求項９に記載の獣毛繊維の鑑別方法。
  11. 　前記単一獣毛繊維の質量分析パターン、及び、前記混合獣毛繊維から得られた一連の質量分析パターンについて、それぞれ、各ピーク面積値と保持時間との関係を解析してデータベースとして蓄積する工程、
    　前記被検獣毛繊維から得られた前記質量分析パターンについて、各ピーク面積値と保持時間との関係を解析する工程、及び、
    　前記被検獣毛繊維の解析データを前記データベースのデータ群と照合して、前記解析データと前記データベースのデータ群との一致性を指標として、前記被検獣毛繊維が少なくとも２種類の動物を起源とすること、前記被検獣毛繊維の起源となる少なくとも２種類の動物の種類、及び／又は、前記被検獣毛繊維の混用率を鑑別する第７鑑別工程を有することを特徴とする請求項１０に記載の獣毛繊維の鑑別方法。
  12. 　前記切出工程において、前記所定のバンドは、前記起源となる動物の種類が既知の獣毛繊維の電気泳動パターンと共通する分子量域に存在するバンドであって、且つ、分子量が１０ｋＤａ付近にあるタンパク質濃度の濃いバンドであることを特徴とする請求項９～１１のいずれか１つに記載の獣毛繊維の鑑別方法。
  13. 　前記消化工程において、前記所定の消化酵素は、タンパク質を構成するアミノ酸であるリシンのＣ側末端から当該タンパク質を切断するエンドプロテアーゼであることを特徴とする請求項９～１２のいずれか１つに記載の獣毛繊維の鑑別方法。
  14. 　前記質量分析工程において、前記質量分析手段は、液体クロマトグラフィー質量分析手段であることを特徴とする請求項９～１３のいずれか１つに記載の獣毛繊維の鑑別方法。
  15. 　前記被検獣毛繊維は、カシミヤ、ウール、ヤク、モヘア、アンゴラ、アルパカ、ビキューナ、キャメル、及び、リャマからなる群のうち少なくとも１つの獣毛繊維を含有することを特徴とする請求項１～５及び請求項７～１４のいずれか１つに記載の獣毛繊維の鑑別方法。
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