CN107014929A

CN107014929A - 一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法

Info

Publication number: CN107014929A
Application number: CN201710382317.XA
Authority: CN
Inventors: 曹琦琛; 苗晨; 杨云飞; 水雯箐
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2017-05-26
Filing date: 2017-05-26
Publication date: 2017-08-04
Anticipated expiration: 2037-05-26
Also published as: CN107014929B

Abstract

本发明基于实验手段确定了山羊绒的标志性肽段SEQ ID NO1、SEQ ID NO2以及细羊毛的标志性肽段SEQ ID NO3、SEQ ID NO4，上述标志物分别对山羊绒和细羊毛具有良好的特异性，若上述肽段能够通过生物质谱方法检出则可以相应证明山羊绒或细羊毛成分的存在，实验结果不会受到其他常规纺织品成分的影响。同时，由于其稳定性良好，不会受常规织物处理方法(如漂白、染色等)的影响，因此检测结果更加稳定。除了定性检测之外，可以利用上述标志性肽段的含量进行定量检测，肽段含量与山羊绒含量间具有较好的线性关系，检测结果准确。本发明以指向性优异的标志性肽段为基础开发了针对山羊绒与细羊毛的鉴别方法，可用于混纺织物中山羊绒和细羊毛的定性、定量分析。

Description

一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法

技术领域

本发明涉及明涉及纺织品检测技术领域，进一步涉及山羊绒与细羊毛的分子生物学鉴别与定量技术，具体涉及一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法。

背景技术

山羊绒(简称羊绒)是山羊外表皮层粗毛根部的一些薄薄的细绒，其纤维细、强度大、光泽好、保暖性强，由于产量稀少，因此价格也比较贵，是目前世界纺织原料中品质最好、价格最高的原料之一，被人们誉为“纤维宝石”、“软黄金”。细羊毛是绵羊身上一层类似于羊绒特质的很软的细毛，因此也被称为“细支羊毛”“拉细羊毛”。绵羊是没有绒毛的，细羊毛虽然特性与山羊绒极为相似，但并不是真正的羊绒，二者的区别主要体现在其纤维的长度和细度上面。

山羊绒的纤维比较短，纤维细度比较细，绒毛直径一般为14～17μm，长度为 32～40mm；而细羊毛的纤维细度就比较粗，其纤维长度也会长一些，毛的细度与毛的支数相关，常见的有70支，直径一般为18～20μm，长度约为55～100mm。由此可见，尽管其来源不同、物质基础也存在差异，但在表观形态层面极为近似，利用常规的观察方法很难区分，即使在显微镜观测条件下也需要细致比对才能正确判断。

由于山羊绒纺织性能优异、产量稀少、价格较高，在巨大的经济利益驱使下，山羊绒掺假伪造现象不断，近年来掺假手段越来越复杂，所用的掺假原料极易与山羊绒纤维混淆，其中细羊毛就是常见的掺假原料之一。细羊毛织物与山羊绒织物在形态和手感上都极难分辨，因此对山羊绒与细羊毛的准确鉴定势在必行。

目前对山羊绒产品的质量检验方法以物理性的显微观察法为主，由检验人员对纤维的细度、异型纤维率、含杂率、长度、强度、伸长度等进行检验(参见《关于山羊绒国家质量标准的制定意见》)。这类检测方法需要检验人员接触过大量的山羊绒样品，积累数十年的实践经验，主观性强。除了最常用的光学显微镜检测法，国外研究者也尝试过使用扫描电镜观察纺织纤维的表面形态和精细结构，但这种方法实验成本高、操作繁琐，而且无法区分与山羊绒纤维形、结构非常近似的其他种类纤维，其中就以细羊毛的混淆作用最为突出。另外，研究者也通过分析纤维材料中的脂质分子、DNA序列差异或者制备特异性识别山羊绒的抗体来鉴别其成分，这类探索性的方法往往受到生产过程中多种化学处理(比如漂白、染色)的干扰，使得结果出现偏差。

除了上述定性检测之外，确定纺织品中山羊绒含量对产品品质评价更为重要。为了获得纺织品中的山羊绒含量，首要的技术问题是确定一种有效的检测目标，由于纺织品中广泛存在其他蛋白成分，尤其存在诸如细羊毛等与山羊绒微观结构较为类似的蛋白，如果检测目标选择不合适则很容易影响检测结果。此外，标志物的检测信号与山羊绒实际含量间的对应关系是否稳定、实验操作难度乃至实验结果的重现性等技术问题都有待突破。尽管现有技术的研究者做过诸多尝试，但截至目前尚缺乏一种有效的定量方法。

在获得了理想标志物的基础上，从待测样品出发如何进行检测也影响着结果的准确性。在以测定待测样品中标志物肽段为手段的检测方法中，蛋白酶解是重要环节之一。现有技术中，采用限制性内切酶对蛋白质进行酶解，是采用质谱技术进行蛋白质(或多肽)标志物鉴定的重要预处理方法之一。该方法技术成熟度高、重复性好。最常用的蛋白酶为胰蛋白酶，其可以特异性的自赖氨酸和精氨酸两个位点处切断蛋白质氨基酸序列。蛋白质构成中上述两种氨基酸的含量及其在蛋白质序列中的分布，甚至蛋白质空间结构都会对胰蛋白酶酶解的效果具有直接的影响。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法，以解决现有技术中山羊绒与细羊毛难以区分的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术中山羊绒织物与细羊毛织物难以区分。

本发明要解决的再一技术问题是现有技术中难以确定纺织品中山羊绒成分的含量。

本发明要解决的又一技术问题是现有技术中山羊绒含量检测操作较繁琐。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法，包括以下步骤：

1)自待测样品中提取总蛋白质；

2)检测步骤1)所述的总蛋白质中序列为SEQ ID NO1的肽段含量或SEQ ID NO2的肽段含量；

3)检测步骤1)所述的总蛋白质中序列为SEQ ID NO3的肽段含量或SEQ ID NO4的肽段含量。

作为优选，还包括步骤4)：利用与步骤2)相同的检测方法确定纺织品中山羊绒含量与序列为SEQ ID NO1的肽段含量之间对应关系标准曲线，而后利用该标准曲线和步骤2)所检测得到的序列为SEQ ID NO1的肽段含量确定出待测样品中山羊绒含量。

作为优选，还包括步骤4)：利用与步骤2)相同的检测方法确定纺织品中山羊绒含量与序列为SEQ ID NO2的肽段含量之间对应关系标准曲线，而后利用该标准曲线和步骤2)所检测得到的序列为SEQ ID NO2的肽段含量确定出待测样品中山羊绒含量。

作为优选，还包括步骤4)：利用与步骤3)相同的检测方法确定纺织品中细羊毛含量与序列为SEQ ID NO3的肽段含量之间对应关系标准曲线，而后利用该标准曲线和步骤3)所检测得到的序列为SEQ ID NO3的肽段含量确定出待测样品中细羊毛含量。

作为优选，还包括步骤4)：利用与步骤3)相同的检测方法确定纺织品中细羊毛含量与序列为SEQ ID NO4的肽段含量之间对应关系标准曲线，而后利用该标准曲线和步骤3)所检测得到的序列为SEQ ID NO4的肽段含量确定出待测样品中细羊毛含量。

作为优选，步骤1)包括以下步骤：将待测样品分别通过乙醇、氯仿-甲醇溶液浸泡；收集固形物干燥，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀、取上清液待用。

作为优选，步骤2)和步骤3)所述的检测，是将步骤1)所述的总蛋白质利用胰蛋白酶和金黄色葡萄球菌V8蛋白酶共同酶解，而后利用生物质谱分析酶解产物。

作为优选，所述共同酶解包括以下步骤：将步骤1)得到的总蛋白溶解后加入二硫键还原剂孵育，而后加入巯基封闭试剂，最后加入胰蛋白酶和金黄色葡萄球菌V8蛋白酶于35～39℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，即得到酶解产物。

作为优选，所述二硫键还原剂是二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦。在此优选技术方案中，二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦仅是效果较佳的优选例，在本发明的技术思路下，其他常规的二硫键还原剂同样可以用于实现本发明。

作为优选，所述巯基封闭试剂是碘乙酰胺或碘乙酸。在此优选技术方案中，碘乙酰胺、碘乙酸仅是效果较佳的优选例，在本发明的技术思路下，其他常规的巯基封闭试剂同样可以用于实现本发明。

作为优选，步骤2)所述检测是氨基酸序列测定。

作为优选，步骤2)所述生物质谱分析是通过色谱-生物质谱联用系统检测实现的。

本发明中所述的山羊绒，是指生长在山羊外表皮层，掩在山羊粗毛根部的一层薄薄的细绒，其应当具有本领域技术人员理解的常规含义；其具体限定范围可依据GB 18267-2013所规定的山羊绒定义来确定。本发明所述的细羊毛，是指绵羊身上一层类似于羊绒特质的很软的细毛，其具体限定为：产自与绵羊体表的、直径为18～20μm、长度为55～100mm的羊毛。

在以上技术方案中，序列为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的肽段被确定为山羊绒的标志性肽段，当利用液相色谱-生物质谱方法检测发现待测物总蛋白中具有上述两肽段之一时，则证明待测物中含有山羊绒成分，反之则不含有山羊绒成分。同时，序列为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的肽段被确定为细羊毛的标志性肽段，当利用液相色谱-生物质谱方法检测发现待测物总蛋白中具有上述两肽段之一时，则证明待测物中含有细羊毛成分，反之则不含有细羊毛成分。进一步的，可以利用待测物总蛋白中以上标志性肽段的含量反应其中山羊绒或细羊毛的含量。

其中，确定山羊绒含量与标志性肽段含量之间对应关系标准曲线，可以是通过以下方法实现的：取山羊绒标准品，与其他纺织品混合成为其中含有5％、10％、 20％、30％、50％、70％等不同含量山羊绒的待测物，再利用上述已知山羊绒含量的待测物执行目标肽段含量检测，从而得到山羊绒含量与目标肽段含量之间的对应关系，进而可以绘制成标准曲线。当绘制出标准曲线以后，可以将某待测物的检测结果带入标准曲线公式求得该待测物中的山羊绒含量。在以上标准曲线的应用中，应当注意规避系统性误差。

本发明基于实验手段确定了山羊绒的标志性肽段SEQ ID NO1、SEQ ID NO2 以及细羊毛的标志性肽段SEQ ID NO3、SEQ ID NO4，上述标志物分别对山羊绒和细羊毛具有良好的特异性，若上述肽段能够通过生物质谱方法检出则可以相应证明山羊绒或细羊毛成分的存在，实验结果不会受到其他常规纺织品成分的影响。同时，由于其稳定性良好，不会受常规织物处理方法(如漂白、染色等)的影响，因此检测结果更加稳定。

除了定性检测之外，可以利用上述标志性肽段的含量进行定量检测，肽段含量与山羊绒含量间具有较好的线性关系，检测结果准确。本发明以指向性优异的标志性肽段为基础开发了针对山羊绒与细羊毛的鉴别方法，可用于混纺织物中山羊绒和细羊毛的定性、定量分析，其操作简便、准确有效，具有突出的推广前景。

此外，本发明研究发现，单独采用胰蛋白酶对所涉及的毛绒纤维蛋白(主要为角蛋白keratin及角蛋白相关蛋白keratin associate protein，其性质较普通蛋白质具有较大差异)进行酶解处理，虽可以获得一定效果，但可供进行纤维种属鉴别的标志性肽段数量较少，不利于混纺织物中山羊绒和细羊毛鉴定分析方法的开发。故而本发明在胰蛋白酶基础上联合使用金黄色葡萄球菌V8蛋白酶进行共同酶解处理。在该酶解条件下，可以特异性的自赖氨酸、精氨酸和谷氨酸三个位点处切断蛋白质氨基酸序列。从而极大的扩展了可供进行纤维种属鉴别的标志性肽段数量，经实验验证，该方法所获得的标志性候选肽段数量可增加2-3倍，经反复验证，最终选择四条肽段用于实现本发明。

附图说明

图1是本发明实施例1中标准山羊绒纤维的液相色谱-生物质谱检测结果图；

图2是本发明实施例1中标准细羊毛纤维的液相色谱-生物质谱检测结果图；

图3是本发明实施例1中标准山羊绒纤维与标准细羊毛纤维混合物的液相色谱-生物质谱检测结果图；

图4是本发明实施例1中标准兔绒纤维的液相色谱-生物质谱检测结果图；

图5是本发明实施例2中山羊绒纤维含量测定标准曲线；

图6是本发明实施例3中代号为S1的样品的液相色谱-生物质谱检测结果图；

图7是本发明实施例3中代号为S2的样品的液相色谱-生物质谱检测结果图；

在以上附图1～7中，所有可检出的标准肽段均标注在谱图中，未标注表示该标准肽段未被检出。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90 到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例1(山羊绒、细羊毛组成鉴别方法的特异性实验)

一、材料

标准山羊绒纤维样品、标准细羊毛纤维样品、标准兔绒纤维样品由天津纺织工程研究院提供。

二、方法

分别取山羊绒纤维标准品、细羊毛纤维标准品进行混合。将上述混合样品及标准山羊绒纤维样品、标准细羊毛纤维样品、标准兔绒纤维样品作为受试物，提取总蛋白质并采用生物质谱分析技术检测羊绒标志性肽段YAVPVVTVSSPE、 CGPCSSYVR和细羊毛标志性肽段TCCEPTVCQSTCYQPTPCVSSPVR、 SHSAWSILPR。

(1)自纺织纤维样品中提取蛋白：

将纺织纤维样品剪碎，乙醇浸泡，氯仿-甲醇溶液浸泡。滤去浸泡溶液后干燥纤维样品，加入蛋白提取溶液提取。过滤，滤液离心，取上清液用丙酮沉淀蛋白。

(2)胰蛋白酶与金黄色葡萄球菌V8蛋白酶共同酶解处理：

取蛋白，用8M尿素、100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，或8M尿素、50-100mM碳酸氢铵溶液溶解。取蛋白溶液30μL加二硫苏糖醇至终浓度为 10-20mM，37℃，孵育4小时。加入碘乙酰胺使终浓度为40mM，避光孵育40 分钟。再加入二硫苏糖醇使终浓度为10mM。加入50mM碳酸氢铵溶液稀释至 300μL，按蛋白：酶＝1：50(w/w)加入胰蛋白酶；按蛋白：酶＝1：40(w/w) 加入金黄色葡萄球菌V8蛋白酶，37℃孵育4小时。再按蛋白：酶＝1:100(w/w) 加入胰蛋白酶；按蛋白：酶＝1:40(w/w)，加入金黄色葡萄球菌V8蛋白酶，37℃孵育12小时。加入甲酸至pH＝3，终止酶切。

取C18脱盐柱进行脱盐。依次次加入乙腈，乙腈-水-甲酸(70：29.5：0.5， v/v/v)溶液及0.5％甲酸水溶液活化并平衡柱子。加入样本，流过C18脱盐柱。加入0.5％甲酸水溶液洗涤柱子，洗掉杂质。最后用0.2mL乙腈洗脱，收集洗脱液。用冷冻离心浓缩仪干燥，-80℃保存待分析。

(3)生物质谱分析

将上述处理后的纺织纤维蛋白的酶解样品注入色谱-生物质谱联用系统检测，利用生物质谱分析方法获得羊绒标志性肽段YAVPVVTVSSPE、CGPCSSYVR 和细羊毛标志性肽段TCCEPTVCQSTCYQPTPCVSSPVR、SHSAWSILPR的检测信号。

三、结果

如图1～4所示，山羊绒成分标志性肽段YAVPVVTVSSPE、CGPCSSYVR 仅在山羊绒标准品(图1)及含山羊绒纤维的混合样品(图3)中鉴定到，细羊毛纤维以及兔绒纤维的存在对山羊绒的鉴定结果未产生干扰(图2，图4)；细羊毛标志性肽段TCCEPTVCQSTCYQPTPCVSSPVR、SHSAWSILPR仅在细羊毛标准品(图2)及含细羊毛纤维的混合样品(图3)中鉴定到，山羊绒纤维以及兔绒纤维的存在对细羊毛的鉴定结果未产生干扰(图1，图4)。因此本发明的山羊绒与细羊毛标志性肽段检测方法显示很好的特异性。

实施例2(建立山羊绒成分标志肽段定量标准曲线)

一、材料

山羊绒纤维标准品、细羊毛纤维标准样品。

二、方法

分别取标准山羊绒样品按不同比例分别与细羊毛纤维标准样品混合，获得山羊绒含量分别为5％、10％、25％、50％、75％、100％的一系列标准样品，提取总蛋白质，加入等量的牛血清白蛋白(BSA)，以牛血清白蛋白肽段LVNELTEFAK 作为内标，检测山羊绒标志性肽段YAVPVVTVSSPE相对于内标肽段的质谱信号，根据不同比例混合样本中该肽段的不同质谱信号，建立用于实际样本定量的标准曲线。

三、结果

如图5及表1所示，基于对山羊绒标志性肽段YAVPVVTVSSPE的分析，山羊绒定量标准曲线线性范围为5％～100％，线性相关系数(R2)在0.99以上。上述结果表明，建立的山羊绒定量检测方法的灵敏度及线性范围已足够满足羊绒纺织行业的质量检测要求。

表1山羊绒成分标志肽段标准曲线测定结果

实施例3(供试材料中山羊绒、细羊毛的鉴定分析)

一、材料

市售羊绒衣料S1、S2。经纤维细度仪鉴定S1、S2的山羊绒比例约为70～85％

二、方法

分别处理各供试品，提取总蛋白质，加入等量的牛血清白蛋白(BSA)，以牛血清白蛋白肽段LVNELTEFAK作为内标，检测山羊绒标志性肽段 YAVPVVTVSSPE和细羊毛标志性肽段TCCEPTVCQSTCYQPTPCVSSPVR或 SHSAWSILPR相对于内标的质谱信号，根据鉴定结果判断供试品种是否含有山羊绒或细羊毛以及山羊绒的相关含量。

三、结果

如图6～7所示，供试品S1、S2中山羊绒成分标志性肽段YAVPVVTVSSPE 均为鉴定阳性，说明供试品S1、S2中均含有山羊绒成分；供试品S1、S2中细羊毛成分标志性肽段TCCEPTVCQSTCYQPTPCVSSPVR和SHSAWSILPR均为鉴定阴性，说明供试品S1、S2中均不含有细羊毛成分或含量较低，未达到检测下限。供试品S1、S2中山羊绒检测结果列于表2，可见检测结果重复性好且供试品S1、S2山羊绒含量测定与用纤维细度仪鉴定结果一致。

表2受试纺织衣料样品中山羊绒含量检测结果

实施例4

一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法，包括以下步骤：

1)自待测样品中提取总蛋白质；

2)检测步骤1)所述的总蛋白质中序列为SEQ ID NO1的肽段含量；

3)检测步骤1)所述的总蛋白质中序列为SEQ ID NO3的肽段含量。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

还包括步骤4)：利用与步骤2)相同的检测方法确定纺织品中山羊绒含量与序列为SEQ ID NO1的肽段含量之间对应关系标准曲线，而后利用该标准曲线和步骤2)所检测得到的序列为SEQ ID NO1的肽段含量确定出待测样品中山羊绒含量。

还包括以下步骤5)：利用与步骤3)相同的检测方法确定纺织品中细羊毛含量与序列为SEQ ID NO3的肽段含量之间对应关系标准曲线，而后利用该标准曲线和步骤3)所检测得到的序列为SEQ ID NO3的肽段含量确定出待测样品中细羊毛含量。

步骤1)包括以下步骤：将待测样品分别通过乙醇、氯仿-甲醇溶液浸泡；收集固形物干燥，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀、取上清液待用。

步骤2)和步骤3)所述的检测，是将步骤1)所述的总蛋白质利用胰蛋白酶和金黄色葡萄球菌V8蛋白酶共同酶解，而后利用生物质谱分析酶解产物。

所述共同酶解包括以下步骤：将步骤1)得到的总蛋白溶解后加入三(2-羧乙基)膦孵育，而后加入碘乙酸，最后加入胰蛋白酶和金黄色葡萄球菌V8蛋白酶于 35℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，即得到酶解产物。

实施例5

一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法，包括以下步骤：

1)自待测样品中提取总蛋白质；

2)检测步骤1)所述的总蛋白质中序列为SEQ ID NO2的肽段含量；

3)检测步骤1)所述的总蛋白质中序列为SEQ ID NO4的肽段含量。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

所述共同酶解包括以下步骤：将步骤1)得到的总蛋白溶解后加入二硫键还原剂孵育，而后加入巯基封闭试剂，最后加入胰蛋白酶和金黄色葡萄球菌V8蛋白酶于39℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，即得到酶解产物。

最终检测结果显示，待测样品总蛋白中序列为SEQ ID NO2的肽段处具有明显的吸收峰，而序列为SEQ ID NO4的肽段处没有吸收峰，从而表明该待测样品中含有山羊绒成分而不含有细羊毛成分。

实施例6

一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法，包括以下步骤：

1)自待测样品中提取总蛋白质；

2)检测步骤1)所述的总蛋白质中序列为SEQ ID NO1的肽段含量；

3)检测步骤1)所述的总蛋白质中序列为SEQ ID NO4的肽段含量。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

最终检测结果显示，待测样品总蛋白中序列为SEQ ID NO1的肽段处、序列为SEQID NO4的肽段处各自具有明显的吸收峰，从而表明该待测样品中同时含有山羊绒成分和细羊毛成分。

实施例7

一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法，包括以下步骤：

1)自待测样品中提取总蛋白质；

2)检测步骤1)所述的总蛋白质中序列为SEQ ID NO2的肽段含量；

3)检测步骤1)所述的总蛋白质中序列为SEQ ID NO3的肽段含量。

最终检测结果显示，待测样品总蛋白中序列为SEQ ID NO2的肽段处、序列为SEQID NO3的肽段处均没有吸收峰，从而表明该待测样品中既不含有山羊绒成分也不含有细羊毛成分。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法

<160> 4

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 天然序列（山羊绒标志性肽段）

<400> 1

YAVPVVTVSS PE 12

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 天然序列（山羊绒标志性肽段）

<400> 2

CGPCSSYVR 9

<210> 3

<211> 24

<212> PRT

<213> 天然序列（细羊毛标志性肽段）

<400> 3

TCCEPTVCQS TCYQPTPCVS SPVR 24

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 天然序列（细羊毛标志性肽段）

<400> 4

SHSAWSILPR 10

Claims

1.一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)自待测样品中提取总蛋白质；

2.根据权利要求1所述的一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法，其特征在于还包括步骤4)：利用与步骤2)相同的检测方法确定纺织品中山羊绒含量与序列为SEQ ID NO1的肽段含量之间对应关系标准曲线，而后利用该标准曲线和步骤2)所检测得到的序列为SEQ ID NO1的肽段含量确定出待测样品中山羊绒含量。

3.根据权利要求1所述的一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法，其特征在于还包括步骤4)：利用与步骤2)相同的检测方法确定纺织品中山羊绒含量与序列为SEQ ID NO2的肽段含量之间对应关系标准曲线，而后利用该标准曲线和步骤2)所检测得到的序列为SEQ ID NO2的肽段含量确定出待测样品中山羊绒含量。

4.根据权利要求1所述的一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法，其特征在于还包括步骤4)：利用与步骤3)相同的检测方法确定纺织品中细羊毛含量与序列为SEQ ID NO3的肽段含量之间对应关系标准曲线，而后利用该标准曲线和步骤3)所检测得到的序列为SEQ ID NO3的肽段含量确定出待测样品中细羊毛含量。

5.根据权利要求1所述的一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法，其特征在于还包括步骤4)：利用与步骤3)相同的检测方法确定纺织品中细羊毛含量与序列为SEQ ID NO4的肽段含量之间对应关系标准曲线，而后利用该标准曲线和步骤3)所检测得到的序列为SEQ ID NO4的肽段含量确定出待测样品中细羊毛含量。

6.根据权利要求1所述的一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法，其特征在于步骤1)包括以下步骤：将待测样品分别通过乙醇、氯仿-甲醇溶液浸泡；收集固形物干燥，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀、取上清液待用。

7.根据权利要求1所述的一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法，其特征在于步骤2)和步骤3)所述的检测，是将步骤1)所述的总蛋白质利用胰蛋白酶和金黄色葡萄球菌V8蛋白酶共同酶解，而后利用生物质谱分析酶解产物。

8.根据权利要求7所述的一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法，其特征在于所述共同酶解包括以下步骤：将步骤1)得到的总蛋白溶解后加入二硫键还原剂孵育，而后加入巯基封闭试剂，最后加入胰蛋白酶和金黄色葡萄球菌V8蛋白酶于35～39℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，即得到酶解产物。

9.根据权利要求8所述的一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法，其特征在于所述二硫键还原剂是二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦。

10.根据权利要求8所述的一种鉴别山羊绒与细羊毛的方法，其特征在于所述巯基封闭试剂是碘乙酰胺或碘乙酸。