CN205691542U - 一种用于基质辅助激光解析电离质谱的阵列芯片及质谱仪 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种用于基质辅助激光解析电离质谱的阵列芯片及质谱仪。该阵列芯片包括由基底层和微孔阵列层组成的微坑阵列层；其特征在于：在所述基底层上，每个微坑的底部为具有锥孔的多孔结构，所述微坑的底部的表面上负载有金纳米粒子，所述锥孔的底部沉积有银纳米粒子。本实用新型阵列芯片可以简便快速地从样品中将含有巯基的化合物谷胱甘肽富集出来；所负载的金纳米颗粒和银纳米颗粒可以吸收激光能量并有效传递给分析物，可以辅助分析物的解吸电离，避免了传统基质的使用，进而避免了传统基质在小分子范围内的背景干扰峰，拓展了基质辅助激光解析电离质谱在小分子范围内的应用。
Description
技术领域
本实用新型涉及细胞代谢物的样品前处理及质谱分析技术领域，尤其涉及一种用于基质辅助激光解析电离质谱的阵列芯片及质谱仪。
背景技术
众所周知，基质辅助激光解析电离质谱(MALDI-MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其无论是理论上还是设计上都是十分简单和高效的。MALDI-MS适用于生物大分子如蛋白质和聚合物等的检测分析，但是在小分子范围内却有来自有机基质的杂峰，这就干扰了基质辅助激光解吸电离质谱对小分子的分析检测，限制了该分析方法的应用。
此外，谷胱甘肽是一种含有巯基的小分子化合物，它在人体内含量十分丰富，是体内所有细胞中浓度最大的多肽，尤其是在肝脏当中，几乎存在于所有的生物组织中。谷胱甘肽含有特征官能团巯基，这使得这个三肽参与到生命活动中的很多过程中来，在人体内扮演着很重要的生理作用，比如，可以调节体内活性氧簇的代谢平衡，激活细胞内的基因转录等。
鉴于此，人们已经开发了多种谷胱甘肽的分析检测方法。常见的分离方法有高效液相色谱法、气相色谱法、探针法等，常见的检测方法有荧光光谱法、紫外检测法、质谱法等。由于巯基在空气中很容易被氧化，因此这些常见的谷胱甘肽的分析方法都需要对谷胱甘肽进行衍生化，文献Küster,A.；Tea,I.；Sweeten,S.；Rozé,J-C.；Richard J.Robins,R.J.；Darmaun,D.Anal Bioanal Chem 2008,390,1403-12中报导开发了一种快速有效的用气相色谱质谱联用的方法分析血液中的谷胱甘肽，他们用N，S-羧乙基二甲基酯将谷胱甘肽进行衍生化，分析脐带血样品中的谷胱甘肽。但是衍生化存在弊端，首先对谷胱甘肽进行衍生化就是一个比较复杂的步骤，其次部分衍生化试剂是很容易分解的，这就干扰了谷胱甘肽的检测，有的衍生化过程需要比较长的时间并且放热导致溶液温度比较高。因此除了依托衍生化方法分析谷胱甘肽，新的检测方法及相应的检测工具亟待开发。
实用新型内容
本实用新型的目的是提供一种用于基质辅助激光解析电离质谱的阵列芯片及质谱仪，该阵列芯片既可以特异性富集含有巯基的小分子化合物谷胱甘肽，又可以接收激光能量并将能量传递给分析物谷胱甘肽辅助其解吸电离，避免了传统有机基质的使用及传统基质而带来的在小分子范围内的干扰峰。
本实用新型提供的用于基质辅助激光解析电离质谱的阵列芯片，它包括由基底层和微孔阵列层组成的微坑阵列层；在所述基底层上，每个微坑的底部为具有锥孔的多孔结构，所述微坑的底部的表面上负载有金纳米粒子，所述锥孔的底部沉积有银纳米粒子。
上述的阵列芯片中，所述锥孔的高度可为100～150nm，直径可为100～200nm，孔间距可为10～50nm。所述锥孔可由所述银纳米粒子向所述基底层内陷形成。
上述的阵列芯片中，所述银纳米粒子的直径可为100～200nm；所述金纳米粒子的直径可为10～20nm。
上述的阵列芯片中，所述基底层可为硅基底层；所述微孔阵列层可由光刻胶制成。由于微坑阵列及其之间的间隙亲疏水性会有差别，这种差异性保证了样品分析时不会交叉污染，同时又做到了高通量分析。
上述的阵列芯片中，所述微孔阵列层的厚度可为0.1～1mm，微孔的直径可为0.1～2mm，微孔的间距可为1～5mm。
本实用新型进一步提供了一种用于检测含巯基化合物的质谱仪，它包括上述用于基质辅助激光解析电离质谱的阵列芯片和基质辅助激光解析电离质谱仪。使用时，可将所述阵列芯片固定在所述基质辅助激光解析电离质谱仪的靶托上。
本实用新型具有如下有益效果：(1)本实用新型阵列芯片可以简便快速地从样品中将含有巯基的化合物谷胱甘肽富集出来；(2)本实用新型阵列芯片所负载的金纳米颗粒和银纳米颗粒可以吸收激光能量并有效传递给分析物，可以辅助分析物的解吸电离，因此避免了传统基质的使用，进而避免了传统基质在小分子范围内的背景干扰峰，拓展了基质辅助激光解析电离质谱在小分子范围内的应用；(3)本实用新型阵列芯片可以检测到10μg/ml的谷胱甘肽；(4)本实用新型阵列芯片的阵列结构，保证了高通量分析检测。
附图说明
图1为本实用新型实施例的硅阵列芯片的整体结构示意图。
图2为本实用新型实施例的基于多孔硅芯片的检测装置的局部结构示意图。
图3为本实用新型实施例的检测谷胱甘肽标准物的质谱图与传统使用基质所检测的谷胱甘肽的质谱图对比。
图4为本实用新型实施例的Caco-2细胞中的谷胱甘肽的质谱图。
图1和图2中，各标记如下：
1SU-8光刻胶层、2硅基板、3金纳米粒子、4银纳米粒子、5基质辅助激光解析电离质谱中波长为337nm的激光。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合说明书附图对本实用新型作进一步说明，但本实用新型并不局限于下述实施例。
实施例1、硅阵列芯片
一、硅阵列芯片
如图1所示，本实用新型阵列芯片，它包括2.6cm×2.6cm的微坑阵列芯片层，每个微坑的直径为1.5mm，微坑间距为3mm，该微坑阵列芯片层由作为微孔阵列层的SU-8光刻胶层(1)和作为基底层的硅基板(2)组成，在硅基板(2)上，如图1中的局部放大图所示，每个微坑的底部为具有高度为100～150nm，孔径为100～200nm，锥孔间距为10～50nm的锥孔的多孔结构，每个微坑的底部的表面上负载有直径为10～20nm的金纳米粒子(3)，每个锥孔的底部沉积有直径为100～200nm的银纳米粒子(4)，锥孔的立体结构图见图2。
使用时，每次只需要2μL的样品量即可，将样品点在硅芯片表面，10min后冲洗，即可实现样品中谷胱甘肽的特异性富集。这是因为，将含有巯基化合物的复杂样品滴在硅阵列芯片上孵育一段时间后，冲洗芯片，鉴于巯基和金纳米形成金硫键，因此含有巯基的化合物即可被富集在含有银和金纳米颗粒的锥孔硅材料表面，而不含巯基的化合物则被冲洗下来，这样该芯片就特异性的富集了含巯基化合物，如谷胱甘肽。
将富集了谷胱甘肽的芯片引入基质辅助激光解吸电离质谱仪，不添加任何基质，进行质谱检测。银纳米颗粒和金纳米颗粒比较容易吸收337nm的激光(5)，进而将激光能量传递给与金纳米颗粒结合在一起的谷胱甘肽，谷胱甘肽接收金属传递的能量，就很容易解吸激发并离子化。这个过程，传统的MALDI-MS质谱分析时，为了促进分析物质的解吸电离，会加入基质CHCA，而有机基质在小分子范围内常带来很多背景峰。
二、制备方法
按照如下步骤制备硅阵列芯片：
(1)制备由硅基底层和微孔阵列层组成的微坑阵列层，具体步骤如下：将硅片裁剪成2.6cm×2.6cm大小的硅片，保持硅片表面的洁净。在硅片表面甩涂一层SU8-2050胶，将其放在60℃的恒温箱中前烘约40min，用牙签试戳甩涂的SU-8胶至固化成型为止。将甩涂了SU-8胶的硅片放在曝光机下曝光，所用的掩膜为阵列微孔结构，每一个小孔的直径是1.5mm，小孔之间的间距是3mm。曝光结束后，将硅片置于60℃的恒温箱中后烘1小时左右，使SU-8胶固化完全。后烘结束的硅片置于显影液中浸泡，同时不停的晃动，将未发生固化反应的光刻胶彻底洗去，至此，表面阵列化的硅片制备完成了。
(2)将步骤(1)中微坑阵列层浸泡在5wt％的氢氟酸的水溶液中20min进行酸化处理，在硅片表面形成大量的Si-H键，具有还原性；然后立即放入新制备的5mM的硝酸银和10％的氢氟酸混合溶液(V/V＝1:1)中3min，硅片表面即可沉积一层直径约为100nm的银纳米粒子。
(3)将经步骤(2)处理的微坑阵列层浸泡于10％的氢氟酸和0.4M的过氧化氢的混合溶液(V/V＝1:1)中8min，腐蚀过程中保持溶液静止不动，以使银纳米粒子垂直向下陷入硅片里面，进而形成具有锥孔的多孔结构的硅片，每一个孔洞的底部是下陷的银纳米粒子。
(4)将经步骤(3)中处理的微坑阵列层再次浸泡在5wt％的氢氟酸的水溶液中20min进行酸化处理，使得锥孔硅片表面尚裸露的硅材料形成具有还原性的Si-H键；新制备浓度为0.1mM的HAuCl4溶液，并放入恒温箱中保持60℃，然后将经上述酸化处理的微坑阵列层置于氯金酸的水溶液中，轻轻晃动，保持6min，在所述微坑的底部的表面原位生成金纳米粒子，得到硅阵列芯片。
实施例2、硅阵列芯片用于谷胱甘肽标准品的检测
以水为溶剂，配备浓度为1mg/mL的谷胱甘肽的标准品溶液，作为待测溶液。按照实施例1中的方法制备硅阵列芯片，取1μL谷胱甘肽的标准品滴在所制备的硅材料分析点处，自然晾干。对照试验为传统的MALDI-MS质谱分析，将1mg/mL的谷胱甘肽及基质CHCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)在离心管内混合均匀，取1uL点靶并自然晾干。最后送入质谱仪进行样品测试。
实验结果如图3所示。图3显示了用传统MALDI-MS检测谷胱甘肽的质谱图(上)和用本发明阵列芯片检测谷胱甘肽的质谱图(下)，其中传统方法所测得的质谱图中明显可以看到质荷比为274.3、318.3和379.1的常见背景干扰峰，而下图中谷胱甘肽的质谱峰308.2清晰可见，且干扰峰很少。
实施例3、硅阵列芯片用于细胞中的谷胱甘肽的富集与检测
Caco-2细胞购自中国医学科学院肿瘤研究所，ATCC编号为HTB-37TM。培养方法如下：在直径为10cm的培养皿上将Caco-2细胞用混有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(Gibco,Grand Island,NY)培养在细胞培养箱中，其中二氧化碳的浓度为5％，在36℃的条件下孵育24小时后，用胰蛋白酶将胞消化下来，在1200r/min的转速下离心3min，去掉上清液，将细胞重悬于1ml水中。将Caco-2细胞水溶液用超声波细胞破碎仪打碎，立即将细胞破碎液用按照实施例1中的方法制备得到的负载有银和金纳米粒子的具有锥孔结构的硅阵列芯片进行谷胱甘肽的富集及质谱检测。取2μL的细胞裂解液，滴在复合硅材料分析点表面，孵育10min以后，小心地用10μL的枪头将剩余尚未蒸发干的样品取出。冲洗时，用10μL的枪头取5μL的水迅速滴在样品表面并迅速吸取冲洗液，如此反复清洗三次。此时，含有巯基的谷胱甘肽就保留在了含有金纳米的硅材料表面，细胞中不含有巯基的其它分子由于不能与金纳米结合而被冲洗下来。待多孔硅阵列芯片晾干，将其固定在MALDI-MS靶托上，即可进样质谱检测，所测得的细胞中的谷胱甘肽的质谱峰如图4所示，图中m/z 308.4的质谱峰即为细胞代谢产物中谷胱甘肽的峰。本实用新型阵列芯片集特异性富集和辅助解吸电离的功能于一体，可以对细胞中的代谢产物进行简便、快速的富集检测分析。
Claims (6)
1.一种用于基质辅助激光解析电离质谱的阵列芯片，它包括由基底层和微孔阵列层组成的微坑阵列层；其特征在于：在所述基底层上，每个微坑的底部为具有锥孔的多孔结构，所述微坑的底部的表面上负载有金纳米粒子，所述锥孔的底部沉积有银纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的阵列芯片，其特征在于：所述锥孔的高度为100～150nm，孔径为100～200nm，孔间距为10～50nm。
3.根据权利要求1所述的阵列芯片，其特征在于：所述银纳米粒子的直径为100～200nm；所述金纳米粒子的直径为10～20nm。
4.根据权利要求1所述的阵列芯片，其特征在于：所述微孔阵列层的厚度为0.1～1mm，微孔的直径为0.1～2mm，微孔的间距为1～5mm。
5.根据权利要求1所述的阵列芯片，其特征在于：所述基底层是由硅制成的；所述微孔阵列层是由光刻胶制成的。
6.一种用于检测含巯基化合物的质谱仪，它包括权利要求1-5中任一项所述的用于基质辅助激光解析电离质谱的阵列芯片和基质辅助激光解析电离质谱仪。
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