CN104101524A - 一种快速提取纯化检测毛样蛋白方法 - Google Patents

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王小龙
陈玉林
周光现
牛怡源
师丙波
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Abstract

本发明公开了一种快速提取纯化检测毛样蛋白方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品分类，分别剪成小段；(2)0.15％壬基酚聚氧乙烯(9)醚60℃清洗20min，吸干；(3)dd水60℃清洗5min，吸干；(4)二氯甲烷和乙醇洗常温清洗20min，吸干；(5)dd水60℃清洗5min，吸干；(6)0.1M甲醇碱KOH，室温30min，吸干；(7)dd水60℃清洗5min，吸干；(8)磨碎：用水浸湿，液氮研磨；(9)提取：200μL of7M尿素，2M硫脲，50mM Tris，and50mM TCEP，pH4，室温，过夜消化；.(10)纯化步骤。

Description

一种快速提取纯化检测毛样蛋白方法
技术领域
本发明属于化学技术领域，涉及一种快速提取纯化检测毛样蛋白方法。
背景技术
毛发蛋白主要是角蛋白组成，而角蛋白分子间主要是靠二硫键形成稳定的空间网状结构。溶解毛发中的蛋白主要是使二硫键(-S-S)断裂，此外蛋白质分子间高密度的氢键、盐式键等也不能忽视。目前国内现有蛋白质提取技术时间相对较长，程序繁琐，不利于实验室高通量大规模地应用，制备角蛋白主要有一下几种方法：1)机械法，有高压水解法、膨化法、挤压法和挤出法。主要是加热(100～200℃)、加压(0.294～0.98MPa)的方法使角蛋白内部的二硫键断裂水解，从而使其变为可溶、易消化的多肽混合物。2)化学法，有酸碱法、还原法、氧化法和金属盐法。机械法不仅能够让二硫键发生断裂，还能让多肽链发生断裂，得率不高，不利于对蛋白质组成份分析。化学法中的酸碱法提取过程中会产生碱性废水和废酸的蒸汽，污染环境，并对人体有害。近年人们更多地采用还原法制备可溶性角蛋白研究蛋白质。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种快速提取纯化检测毛样蛋白方法。其具体技术方案为：
一种快速提取纯化检测毛样蛋白方法，包括以下步骤：
(1)样品分类，分别剪成小段；
(2)0.15％壬基酚聚氧乙烯(9)醚60℃清洗20min，吸干；
(3)dd水60℃清洗5min，吸干；
(4)二氯甲烷和乙醇洗常温清洗20min，吸干；
(5)超纯水60℃清洗5min，吸干；
(6)0.1M甲醇碱KOH，室温30min，吸干；
(7)超纯水60℃清洗5min，吸干；
(8)磨碎：用水将毛绒浸湿后在液氮中研磨粉碎；
(9)提取：取粉末200mg加入500μL of7M尿素、2M硫脲、50mM Tris和50mMTCEP溶液(pH4)，37℃，振荡消化过夜；.
(10)纯化步骤
1).取0.1ml消化液至2ml离心管，加入0.4ml甲醇，涡旋混匀；
2).再加入0.2ml氯仿，涡旋混匀；
3)再加入0.3ml超纯水，剧烈震荡，10000g离心，1min；
4).小心弃掉上清；
5).加入0.3ml甲醇，涡旋混匀，10000g，离心2min；
6).弃掉上清，倒置室温干燥，备下一步使用；
7).50-100微升1X蛋白上样缓冲液溶解，沸水浴5min，备SDS-PAGE跑胶使用。
进一步优选，步骤(4)中所述二氯甲烷和乙醇洗的体积比为V/V2∶1。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明采用的“壬基酚聚氧乙烯(9)醚”非离子表面活性剂，能够有效的清洗毛样表面污渍，再用二氯甲烷和乙醇祛除内部脂质，再用甲醇碱祛除结合脂肪酸。通过物理粉碎，采用还原法，Tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)还原角蛋白二硫键，再利用利用高浓度尿素和硫脲使其蛋白膨胀溶解，最终得到可溶性蛋白质，该方法反应活性温和易溶、毒性小，而更容易操作和应用后续蛋白质谱分析。
附图说明
图1为SDS-PAGE检测结果，其中：M为预染蛋白marker(14.4-120KD)；1为陕北白绒山羊A的毛样，2、3为陕北白绒山羊A的绒毛羊；4为陕北白绒山羊B的毛样，5、6为陕北白绒山羊B的绒毛羊。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
一种快速提取纯化检测毛样蛋白方法，包括以下步骤：
(1)样品分类，分别剪成小段；
(2)0.15％壬基酚聚氧乙烯(9)醚60℃清洗20min，吸干；
(3)dd水60℃清洗5min，吸干；
(4)二氯甲烷和乙醇洗常温清洗20min，吸干；
(5)超纯水60℃清洗5min，吸干；
(6)0.1M甲醇碱KOH，室温30min，吸干；
(7)超纯水60℃清洗5min，吸干；
(8)磨碎：用水将毛绒浸湿后在液氮中研磨粉碎；
(9)提取：取粉末200mg加入500μL of7M尿素、2M硫脲、50mM Tris和50mMTCEP溶液(pH4)，37℃，振荡消化过夜；.
(10)纯化步骤
1).取0.1ml消化液至2ml离心管，加入0.4ml甲醇，涡旋混匀；
2).再加入0.2ml氯仿，涡旋混匀；
3)再加入0.3ml超纯水，剧烈震荡，10000g离心，1min；
4).小心弃掉上清；
5).加入0.3ml甲醇，涡旋混匀，10000g，离心2min；
6).弃掉上清，倒置室温干燥，备下一步使用；
7).50-100微升1X蛋白上样缓冲液溶解，沸水浴5min，备SDS-PAGE跑胶使用。
步骤(4)中所述二氯甲烷和乙醇洗的体积比为V/V2∶1。
将得到的胶条送至华大公司测序得到如下结果：
陕北白绒山羊A：毛样检测出205种毛蛋白，绒样检测出252种毛蛋白。

Claims (2)

1.一种快速提取纯化检测毛样蛋白方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品分类，分别剪成小段；
(2)0.15％壬基酚聚氧乙烯(9)醚60℃清洗20min，吸干；
(3)超纯水60℃清洗5min，吸干；
(4)二氯甲烷和乙醇洗常温清洗20min，吸干；
(5)超纯水60℃清洗5min，吸干；
(6)0.1M甲醇碱KOH，室温30min，吸干；
(7)超纯水60℃清洗5min，吸干；
(8)磨碎：用水浸湿，液氮研磨；
(9)提取：200μL of7M尿素，2M硫脲，50mM Tris，and50mM TCEP，pH4，室温，过夜消化；.
(10)纯化步骤
1).向0.1ml蛋白溶液中加入0.4ml甲醇，涡旋，瞬时离心，10s；
2).再加入0.2ml氯仿，涡旋，瞬时离心，10s；
3)再加入0.3ml ddH2O，剧烈震荡，瞬时离心，1min；
4).小心弃掉上清，用枪吸；
5).加入0.3ml甲醇，涡旋，瞬时离心，2min，沉淀；
6).弃掉上清，倒置室温干燥，干燥完成后保存备用；
7).50-100微升5％SDS溶解蛋白，不容物可用蛋白上样buffer溶解，备用，跑SDS-PAGE。
2.快速提取纯化检测毛样蛋白方法，其特征在于，步骤(4)中所述二氯甲烷和乙醇洗的体积比为V/V2∶1。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106198163A (zh) * 2016-06-23 2016-12-07 环境保护部华南环境科学研究所 确定人体持久性有机污染物暴露标志物清洗方式的方法
CN110044670A (zh) * 2019-03-27 2019-07-23 广州市圣鑫生物科技有限公司 毛发中毒品提取试剂盒、提取方法和检测方法
CN110208072A (zh) * 2019-05-10 2019-09-06 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 一种用于痕量毒品检测的人体毛发快速裂解液及其应用
CN113125546A (zh) * 2020-11-06 2021-07-16 郑州安图生物工程股份有限公司 一种毛发质谱检测芯片及毛发快速鉴定方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0331750A1 (en) * 1987-09-14 1989-09-13 Nippon Chemical Industrial Company Limited Agent and method for treating animal hair fibers
CN1435432A (zh) * 2002-12-11 2003-08-13 内蒙古鄂尔多斯羊绒集团有限责任公司 一种角蛋白溶液和固体制备技术
CN101979428A (zh) * 2010-10-09 2011-02-23 天津工业大学 一种动物毛发溶解剂及角蛋白溶液的制备方法和用途
WO2011094942A1 (en) * 2010-02-04 2011-08-11 Rhodia (China) Co., Ltd. Cleaning composition for wool scouring and felting
CN103102695A (zh) * 2013-03-07 2013-05-15 河南鼎大生物科技有限公司 再生角蛋白溶液的制备及湿法纺丝的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0331750A1 (en) * 1987-09-14 1989-09-13 Nippon Chemical Industrial Company Limited Agent and method for treating animal hair fibers
CN1435432A (zh) * 2002-12-11 2003-08-13 内蒙古鄂尔多斯羊绒集团有限责任公司 一种角蛋白溶液和固体制备技术
WO2011094942A1 (en) * 2010-02-04 2011-08-11 Rhodia (China) Co., Ltd. Cleaning composition for wool scouring and felting
CN101979428A (zh) * 2010-10-09 2011-02-23 天津工业大学 一种动物毛发溶解剂及角蛋白溶液的制备方法和用途
CN103102695A (zh) * 2013-03-07 2013-05-15 河南鼎大生物科技有限公司 再生角蛋白溶液的制备及湿法纺丝的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
凌文婷等: "动物滥用药物的毛发分析", 《药物分析杂志》 *
刘尚俊等: "羊毛角蛋白的分离与纯化", 《饲料研究》, no. 10, 31 October 2007 (2007-10-31), pages 30 - 32 *
卜旺雨等: "凝胶电泳蛋白质组学蛋白样品纯化方法比较", 《解剖学报》, vol. 44, no. 6, 31 December 2013 (2013-12-31), pages 865 - 868 *
曲斌等: "动物毛发中兽药残留检测进展", 《畜牧与兽医》 *
王江波等: "TCEP在羊毛角蛋白上的应用", 《毛纺科技》, vol. 40, no. 8, 31 August 2012 (2012-08-31), pages 61 - 64 *
龙新: "中国农科院发现检测反刍动物瘦肉精新技术", 《中国畜牧兽医报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106198163A (zh) * 2016-06-23 2016-12-07 环境保护部华南环境科学研究所 确定人体持久性有机污染物暴露标志物清洗方式的方法
CN110044670A (zh) * 2019-03-27 2019-07-23 广州市圣鑫生物科技有限公司 毛发中毒品提取试剂盒、提取方法和检测方法
CN110208072A (zh) * 2019-05-10 2019-09-06 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 一种用于痕量毒品检测的人体毛发快速裂解液及其应用
CN113125546A (zh) * 2020-11-06 2021-07-16 郑州安图生物工程股份有限公司 一种毛发质谱检测芯片及毛发快速鉴定方法

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