BG64326B1 - Използване на едномерен ядреномагнитен резонанс за идентифициране на лиганди с таргет биомолекули - Google Patents

Използване на едномерен ядреномагнитен резонанс за идентифициране на лиганди с таргет биомолекули Download PDF

Info

Publication number
BG64326B1
BG64326B1 BG103856A BG10385699A BG64326B1 BG 64326 B1 BG64326 B1 BG 64326B1 BG 103856 A BG103856 A BG 103856A BG 10385699 A BG10385699 A BG 10385699A BG 64326 B1 BG64326 B1 BG 64326B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
target molecule
compound
compounds
ligand
ligands
Prior art date
Application number
BG103856A
Other languages
English (en)
Other versions
BG103856A (bg
Inventor
Stephen W. Fesik
Philip J. Hajduk
Edward T. Olejniczak
Original Assignee
Abbott Laboratories
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25291882&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BG64326(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Abbott Laboratories filed Critical Abbott Laboratories
Publication of BG103856A publication Critical patent/BG103856A/bg
Publication of BG64326B1 publication Critical patent/BG64326B1/bg

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
    • G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
    • G01N24/087—Structure determination of a chemical compound, e.g. of a biomolecule such as a protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
    • G01R33/00—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables
    • G01R33/20—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance
    • G01R33/44—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance using nuclear magnetic resonance [NMR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
    • G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01V—GEOPHYSICS; GRAVITATIONAL MEASUREMENTS; DETECTING MASSES OR OBJECTS; TAGS
    • G01V3/00—Electric or magnetic prospecting or detecting; Measuring magnetic field characteristics of the earth, e.g. declination, deviation
    • G01V3/14—Electric or magnetic prospecting or detecting; Measuring magnetic field characteristics of the earth, e.g. declination, deviation operating with electron or nuclear magnetic resonance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • High Energy & Nuclear Physics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Geology (AREA)
  • Remote Sensing (AREA)
  • General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Geophysics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Област на техниката
Изобретението се отнася до метод за скрининг на съединения, свързващи се с таргет биомолекули използващ едномерна ядреномагнитна резонансна (ЯМР) спектроскопия.
Предшестващо състояние на техниката
Едно от най-мощните средства за откриване на нови лекарства е произволен скрининг на база данни синтетични химични и природни продукти за откриване на съединения, които се свързват с конкретна таргет молекула (т.е. идентифициране на лигандите на тази молекула). При използване на този метод, може да се идентифицират лиганди въз основа на способността им да образуват физическо свързване с таргет молекулата или способността им да променят функцията на таргет молекулата.
При търсене на физическо свързване таргет молекулата се подлага на въздействието на едно или повече вещества, за които се предполага, че са лиганди, и с анализа се определя дали се образуват комплекси между таргет молекулата и едно или повече от тези съединения. Такъв анализ, както е добре известно, е тест за големи промени в таргет молекулите (напр. промени в големината, товара, подвижността) , което показва образуване на комплекс.
При измерване на функционални промени условията на анализа се подбират така, че да се позволи измерване на биологичното или химично явление, свързано с таргет молекулата (например ензимно катализирана реакция, ензимно активиране на рецептор медиатор). За идентифициране на промяната, функцията на таргет молекулата се определя преди и след въздействието на изпитваните съединенията.
Съществуващите понастоящем физични и функционални анализи се използват успешно при проектиране на терапевтични съединения за идентифициране на водещи нови лекарства. Присъщите на такива анализи ограничения се отнасят до тяхната точност, достъпност и ефективност.
Основният недостатък на съществуващите анализи е свързан с проблема “привидно положително” съединение. При типичен функционален анализ “привидно положително’” е такова съединение, което реагира при анализа, но което не е способно да предизвика желания физиологичен отговор. При типичен физичен анализ, “привидно положително” е съединение, което например се свързва с таргет, но по неспецифичен начин (напр. неспецифична връзка). Привидно положителните по-специално са преобладаващи и проблематични при използване на по-високи концентрации на предполагаеми лиганди, защото много съединения имат неспецифично действие при тези концентрации.
Аналогично, съществуващите анализи се затрудняват, когато съединението при анализ дава отрицателен отговор, т.е. възниква проблемът на така наречения “привидно отрицателен” отговор, докато в действителност съединението е лиганд за таргета. “Привидно отрицателен” отговор е характерен за анализи, при които използваните концентрации на изпитваните съединенията са или твърде високи (водят до токсичност) или твърде ниски спрямо свързването или дисоциационната константа на съединението спрямо таргета.
Напоследък е демонстрирано, че двумерен 13N/‘H спектрален анализ може да се използва за идентифициране на съединения, свързали се с таргет протеин. При този подход се преодоляват много от проблемите, възникващи при съществуващите анализи за идентифициране на лиганди. Подходът изисква обаче протеинът да е 15Ь(-белязан, да е разтворим и да се отнася добре при концентрация под 0.3 тМ или по-висока от нея. Освен това, този метод изисква да се използват само такива протеини, l5N/‘H корелационните спектри на които могат да се анализират, което при сегашната технология ограничава молекулната маса на таргет протеина до 40 kDa. Освен това, методът е продължителен по време, тъй като се анализират съединенията в комбинации по 10, като за определяне на поне едно активно съединение в сместа е необходимо да се анализира свързването на всяко индивидуално съединение с таргет протеина.
Проблемите, присъщи на съществуващите методи за скрининг, налагат необходимостта от разработване на бързи, ефективни, точни и достъпни методи за скрининг на съединения за идентифициране и проектиране на лиганди, специфично свързани с конкретен таргет.
Същност на изобретението
В едно изпълнение настоящото изобретение предоставя метод съгласно претенциите от 1 до 8 за скрининг на съединения за биологична активност за идентифициране на присъствието на съединения, които са лиганди, свързани с конкретна таргет молекула. Методът включва стадиите: а) получаване на първи Т2- или дифузионно-филтриран ЯМР спектър на едно съединение или смес химични съединения; Ь) подлагане на едно съединение или смес химични съединения на въздействието на таргет молекулата; с) получаване на втори Т2или дифузионно-филтриран ЯМР спектър на едно или смес химични съединения при въздействие на таргет молекулата в стадий (Ь); и d) сравняване на първия и втория Т2- или дифузионно-филтриран ЯМР спектър за определяне на разликите между първия и вторите ЯМР спектри, разлики, идентифициращи присъствието на едно или повече съединения, между съединението и сместа химични съединения, респ., които са лиганди, свързали се с таргет молекулата.
Когато с метода от изобретението се провежда скрининг на повече от едно съединение в стадий (Ь) т.е. на смес съединения, и когато разликата между първия спектър, получен от сместа, и този, получен от сместа в присъствие на таргет молекула, активното съединение може да се идентифицира веднага, ако е познат спектърът на активното съединение в от-> съствие на таргет молекула. Това е така, защото разликата, наблюдавана в спектрите при етап (d), се отразява върху химичните отмествания на активното съединение. Могат да се проведат допълнителни стъпки да се определи кое конкретно съединение или съединения в сместа се свързва с таргет молекулата, когато отсъства информация за химичните отмествания на съединенията в сместа, или да се потвърди свързването. Тези допълнителни стъпки включват следните стадии: е) получаване на Т2- или дифузионно-филтриран ЯМР спектър за всяко съединение в сместа; f) подлагане на всяко съединение в сместа индивидуално на въздействието на таргет молекулата; g) полу чаване на Т2- или дифузионен-филтриран протонен спектър на всяко съединение в сместа след подлагане на въздействие на таргет молекулата; h) сравняване на всеки спектър, получен в етан (g), с първия спектър, получен само с таргет молекулата за определяне на разликите за всеки от сравняваните спектри, като разликите идентифицират присъствие на съединение, което е лиганд, свързал се с таргет молекулата.
Предимство на изобретението е способността чрез метода да се определи свързването на потенциални лиганди с небелязана таргет молекула с какъвто и да е размер или състав, при условие, че големината на избрания таргет е достатъчно по-голяма от тази на потенциалния лиганд, за да се предизвикат промени в релаксационните или дифузионни скорости при свързване с таргет молекулата.
Друго предимство на изобретението е способността чрез метода да се определят дори слабо свързани лиганди с таргет молекулата.
Друго преимущество на изобретението е способността чрез метода да се идентифицира активно съединение или съединения в смес съединения чрез директно сравнение на химичните отмествания в диферентните спектри с познати химични отмествания на съединенията, включени в сместа, в отсъствие на таргет биомолекула.
В това предпочитано изпълнение методът за определяне свързването на лиганда включва присъствие на втори свързан лиганд. Съгласно изпълнението таргет молекулата се свързва с втори лиганд, преди таргета да се подложи на въздействието на изпитваните съединения.
Този метод използва Т2- или дифузионен-филтриран протонен спектрален метод за скрининг, както е изложено по-горе, за да се идентифицира първият и следващи лиганди, които се свързват с таргет молекулата. Образува се комплекс на таргет молекулата с два или повече лиганди, като се предпочита структурните данни да бъдат получени чрез използване на ЯМР спектроскопия или рентгеноструктурна кристалография. Структурните данни се използват да се определи пространственото ориентиране на лигандите един спрямо друг и спрямо таргет молекула.
Въз основа на пространственото ориен тиране лигандите се свързват помежду си, като се образува лиганд с голям афинитет, подходящ като лиганд за конкретна таргет молекула и съответно като потенциално фармацевтично активно лекарство. Изборът на подходящи свързващи групи се постига чрез поддържане на пространственото ориентиране на лигандите един спрямо друг и към таргет молекулата въз основа на данни за валентните ъгли и дължината на връзките, добре известни в органичната химия. Процедурата на свързване или синтетичната схема за комбиниране поне на два лиганда и образуване на лиганд с висок афинитет се извършва по добре известни синтетични процедури и/или ретросинтезен анализ. Лиганд с голям афинитет може да се получи по всеки метод, по който се получава краен лиганд, като не се ограничава до просто свързване на два лиганда посредством свързваща група. Всеки линеен синтез или конвергентен синтетичен метод може да се използва за получаване на краен продукт. Когато се намерят поне два лиганда, които имат афинитет спрямо таргет молекулата (за предпочитане протеин), се проектира лигандът с голям афинитет, който се получава по добре познати на специалистите методи в тази област. Лигандите се избират от разнообразен пул малки молекули с различни атоми и подреждане в молекулата, стереохимия и други. Ограничаващ фактор е изискването поне два лиганда да имат афинитет като лиганд поне на едно място в полипептида или таргет молекулата. С помощта на предоставения тук метод за скрининг може да се идентифицира и единичен лиганд или множество лиганди, които могат да се манипулират и по традиционни методи за проектиране на лекарства за получаването на фармацевтично активни продукти или да се използва при предоставения тук метод за проектиране на лекарства за свързване поне на два лиганда и получаване на лиганд с висок афинитет.
Така че методът за проектиране на молекули включва идентифициране на първото множество лиганди, свързано с таргет молекулата чрез използване на едномерна Т2- или дифузионно-филтрирана ЯМР спектроскопия чрез използване на метода, дефиниран в претенция 1; идентифициране на един или повече допълнителни лиганди спрямо таргет молекулата при използване на едномерна Т2- или дифузионнофилтрирана ЯМР спектроскопия; образуване на комплекс на първия идентифициран лиганд и един или повече допълнително идентифицирани лиганди с таргет молекулата; определяне на тридименсионалната структура поне на тази част от комплекса, където първият и един или повече допълнителни лиганди се свързват с таргет молекулата и по този начин на пространственото ориентиране на първия и един или повече допълнителни лиганди спрямо таргет молекулата; свързване на първия и един или повече допълнителни лиганди и образуване на лиганд с голям афинитет, който може да бъде и фармацевтично активно лекарство със запазено пространствено ориентиране на лигандите.
Идентифицирането на следващи лиганди множества може да се извърши в отсъствие или присъствие на първия лиганд (т.е. таргет молекулата може да се свърже с първия лиганд преди въздействието на изпитваните съединения за идентифициране на втория лиганд).
В предпочитано изпълнение таргет молекулата, използвана при скрининга или проектирането на метода, е полипептид. Полипептидния таргет се предпочита да се получи в рекомбинантна форма от клетки на гостоприемника, трансформирана с експресен вектор, съдържащ полинуклеотид, кодиращ полипетида.
Кратко описание на фигурите
Фигурите са част от описанието на изобретението и са предназначени да го поясняват.
Фигура 1 показва (А) Т2-филтриран спектър на съединение 1 във воден буфер, (В) Т2-филтриран спектър на съединение 1 в присъствие на FKBP, (С) Т2-филтриран спектър на FKBP, (D) диференциален спектър, получен чрез изваждане на (С) от (В) и (Е) диференциален спектър, получен чрез изваждане на (D) от (А). За всички експерименти са използвани Т2-филтър спин лок време 200 ms, изчакване на спин-ехото 1 ms, концентрацията на съединение 1 100 μΜ, концентрацията на FKBP 50 μΜ, буфер 50 mM РО4, 100 тМ NaCl, pH 6.5 (95% D2O).
Фигура 2 показва (А) Т2-филтриран спектър на смес съединения 1 -9, (В) Т2-филтриран спектър на смес съединения 1-9 в присъствие на FKBP, (С) Т.-филтриран спектър на
FKBP, (D) диференциален спектър, получен чрез изваждане на (С) от (В), (Е) диференциален спектър, получен чрез изваждане на (D) от (А) и (F) котролен Т2-филтриран спектър само на съединение 1. За всички експерименти: Т2-филтър спин-лок време 200 ms, изчакване при спин-ехо 1 ms, концентрация на всички химични съединения 100 μΜ, концентрация на FKBP 50 μΜ, буфер 50 тМ РО4, 100 тМ NaCl, pH 6,5 (95% D20).
Фигура 3 показва (А) Т2-филтриран спектър на смес съединения 2-9, (В) Т2-филтриран спектър на смес съединения 2-9 в присъствие на FKBP, (С) Т2-филтриран спектър на смес съединени 1-9, (D) диференциален спектър, получен чрез изваждане на (С) от (В) и (Е) ) диференциален спектър, получен чрез изваждане на (D) от (А). За всички експерименти Т2-филтър спин-лок време 200 ms, изчакване при спин-ехо 1 ms, концентрация на всички химични съединения 100 μΜ, концент-рация на FKBP 50 μΜ, буфер 50 mM РО4, 100 тМ NaCl, pH 6.5 (95% D2O).
Фигура 4 показва (А) дифузионен-филтриран спектър на съединение 1 в присъствие на FKBP, при използване на малък градиент на силата на полето. (В) дифузионен-филтриран спектър на съединение 1 в присъствие на FKBP и използване на голям градиент на силата на полето, (С) диференциален спектър, получен чрез изваждане на (В) от (A), (D) дифузионен-филтриран спектър на съединение 1 при използване на малък градиент на силата на полето и (Е) дифузионен-филтриран спектър, получен чрез изваждане на (С) от (D). За всички опити силата на полето с малък и голям градиент отговаря съответно на 3 и 48 Gauss/cm. Силата на полето с голям градиент е достатъчна да елиминира остатъчния HDO сигнал в пробата. Използвано е дифузионно време за изчакване 300 ms. Концентрацията на всички химични съединения е 100 μΜ, концентрацията на FKBP 50 μΜ, буферът е 50 тМ РО4, 100 тМ NaCl, pH 6.5 (95% D2O).
Фигура 5 показва (А) дифузионен-филтриран спектър на смес химични съединения от 1 до 9 в присъствие на FKBP и използване на малък градиент на силата на полето, (В) дифузионен-филтриран спектър на смес химични съединения от 1 до 9 в присъствие на FKBP и използване на голям градиент на силата на полето. (С) диференциален спектър, получен чрез изваждане на (В) от (A), (D) дифузионен-филтриращ спектър на смес химични съединения от 1 до 9 и използване на малък градиент на силата на полето и (Е) дифузионенфилтриран спектър, получен чрез изваждане на (С) от (D) и (F) контролен спектър само на съединение 1. За всички опити силата на полето с малък и голям градиент е съответно 3 до 48 Gauss/cm. Сила на полето при голям градиет е достатъчна да елиминира остатъчния HDO сигнал в пробата. Използвано е дифузионно време на изчакване 300 ms, концентрацията на всички химични съединения 100 μΜ, концентрация на FKBP 50 μΜ, буфер е 50 тМ РО4 100 тМ NaCl, pH 6.5 (95% D2O).
На фигура 6 е даден дифузионно-филтриран ЯМР спектър на смес химични съединения от 2 до 9 в присъствие на FKBP при използване на малък градиент на силата на полето, (В) дифузионно-филтриран ЯМР спектър на смес химични съединения от 2 до 9 в присъствие на FKBP при използване на голям градиент на силата на полето, (С) диференциален спектър, получен чрез изваждане на (В) от (A), (D) дифузионно-филтриран ЯМР спектър на смес химични съединения от 2 до 9 при използване на малък градиент на силата на полето и (Е) дифузионно-филтриран ЯМР спектър, получен чрез изваждане на (С) от (D). При всички експерименти силата на полето при малък и голям градиент отговаря съответно на 3 и 48 Gauss/cm. Сила на полето с голям градиент е достатъчна да се елиминира остатъчният HDO сигнал в пробата. Използвано е дифузионно време на изчакване 300 ms, концентрация на всички химични съединения 100 μΜ, концентрация на FKBP 50 μΜ, буфер 50 mM РО4, 100 тМ NaCl, pH 6.5 (95% D2O).
Техническа същност на изобретението
Настоящото изобретение предоставя метод за бърз и ефективен скрининг за идентифициране на лиганди, свързани с терапевтични таргет молекули.
Лигандите се идентифицират чрез изследване на свързването на лигандите с таргет молекула (например протеин, нуклеинова киселина, други) и проследяване чрез ядреномагнитна резонансна (ЯМР) спектроскопия на промените или скоростите на релаксацията или дифузия на резонанса на лигандите след приба вяне на таргет. Пулът на изпитваните молекули се избира от колекция съединения, каквито понастоящем са налични в повечето фармацевтични компании или университетски лаборатории.
Информацията относно зависимостта структура/активност на идентифицираните с такъв метод лиганди може да бъде използвана за проектиране на нови лекарства, играещи ролята на лиганди спрямо таргет молекулата. Например, когато се идентифицират два или повече лиганда с дадена таргет молекула, се образува комплекс на тези лиганди и таргет молекулата. Пространственото ориентиране на лигандите един спрямо друг, както и спрямо таргет молекула, се определя от структурните данни. Пространственото ориентиране определя разстоянието между местата на свързване на двата лиганда и ориентацията на всеки лиганд при тези места.
Въз основа на данни за пространственото ориентиране, два и повече лиганди се свързват един с друг и образуват нов лиганд. Свързването се осъществява по такъв начин, че да се запази пространствено ориентиране на лигандите един спрямо друг и спрямо таргет молекулата.
Едномерният ЯМР метод на настоящото изобретение има многобройни предимства. Първо с метода на настоящото изобретение се идентифицират лиганди чрез директно измерване на свързването с таргет молекулата, с което проблемът “привидни положителни” отговори се намалява значително.
Второ, проблемът “привидните отрицателни” отговори се редуцира значително поради това, че с настоящия метод се идентифицират съединения, които се свързват специфично с таргет молекулата при широк обхват от дисоциационни константи.
Трето, изискването |3М-белязаните протеини да имат ниска молекулна маса (< 40 kDa) и да са стабилни при високи концентрации, както се изисква при методите, използващи 15N/1Н корелационна спектроскопия, се елиминира при използване на настоящото изобретение.
Четвърто, възможността за директно идентифициране на активните съединения в смес съединения чрез сравняване на познати химични отмествания, значително намалява времето за скрининг и идентифицирането на активните съединения, които се свързват с таргет молекулата.
Тъй като се провежда мониторинг на сигналите на потенциалните лиганди за откриване на свързване с таргет молекулата, могат да се идентифицират два или повече лиганди, свързващи се едновременно с таргет молекулата. Възможността едновременно да се идентифицират местата на свързване на различни лиганди позволява на опитен оператор 1) да определи отрицателните и положителни съвместни свързвания между лигандите и 2) да се проектират нови лекарства чрез свързване на два или повече лиганда в едно съединение при запазено ориентиране на лигандите един спрямо друг и спрямо местата на свързване.
В конкретен аспект настоящото изобретение предоставя метод за скрининг на съединения за идентифициране на присъствието на съединения, които са лиганди, свързващи се с конкретна таргет молекула. Методът включва следните стадии: а) получаване на първи Т2или дифузионно-филтриран ЯМР спектър на едно съединение или смес химични съединения; Ь) подлагане на едно съединение или смес химични съединения на въздействието на таргет молекулата; с) получаване на втори Т2или дифузионно-филтриран ЯМР спектър на едно или смес химични съединения при въздействие на таргет молекулата в стадий (Ь); и d) сравняване на първия и втори Т2- или дифузионно-филтриран ЯМР спектър за определяне на разликите между първия и втория ЯМР спектър, разлики, идентифициращи присъствието на едно или повече съединения между съединението и сместа химични съединения, респективно, които са лиганди, свързали се с таргет молекулата.
Когато с метод от изобретението се провежда скрининг на повече от едно съединение в етап (Ь) и когато се наблюдава разлика в спектрите, активното съединение може да се идентифицира, ако предварително се познават химичните отмествания на съединенията в сместа в отсъствие на таргет молекулата. При отсъствие на такава информация се провеждат допълнителни стъпки да се идентифицира кое конкретно съединение се свързва с таргет молекулата. Тези допълнителни стъпки включват е) получаване на Т2- или дифузионно-филтриран протонен спектър за всяко съединение в сместа; f) подлагане на всяко съединение в сместа на въздействието на таргет молекула та; g) получаване на Т2- или дифузионно-филтриран протонен спектър на всяко съединение в сместа след въздействие на таргет молекулата; h) сравняване на всеки спектър, получен в етап g), с първия спектър, получен само с таргет молекулата, за определяне на разликите във всеки от сравняваните спектри, като разликите идентифицират присъствието на съединение, което е лиганд, свързал се с таргет молекула.
Всяка таргет молекула може да се използва при метода от изобретението, при условие, че таргет молекулата е достатъчно поголяма от изпитваните съединения, за да се предизвикат големи разлики в релаксацията или дифузионните скорости на изпитваното съединение при свързване с таргет молекулата. Поради значението на протеините за медицинската химия, предпочитана таргет молекула е полипептид. В предпочитано изпълнение таргет молекулата е полипептид с молекулна маса над 5 kDa.
Методът за скрининг от изобретението започва с получаване или търсене, или на Т2филтриран или дифузионно-филтриран едномерен протонен спектър на съединението или сместа съединения. Процедурите за получаване на Т2-филтрирани или дифузионно-филтрирани едномерни протонни спектри са добре познати в областта (вж например S. Meiboom and D. Gill, Rev. Sci. Instrum. 29:688 (1958), S. L. Gibbs and C. S. Jihnson, Jr. J. Magn. Reson., 93:395-402 (1991) и A. S. Altieri, et al. J. Am. Chem. Soc) 117:7566-7567 (1995)).
За да се улесни получаването на ЯМР данни за голям брой съединения (например база данни на синтетични или природни органични съединения, които са малки молекули) се използва приспособление за смяна на пробите. При използване на такова устройство могат да се обработват общо до 60 проби без обслужване. При използване на основни параметри (128 скана на разпад на свободната индукция (fid), могат да се получат 100-120 спектра за 24 h.
Получаването на ЯМР данни може да се улесни, като се използват компютърни програми за трансфер и автоматично обработване на многобройните едномерни ЯМР данни.
Характерен едномерен Т2-филтриран спектър на смес съединения е показан на фиг. 1 А. Типичен едномерен дифузионно-филтри ран спектър на смес съединения е даден на фиг. 2А.
След получаване на първия спектър, белязаната таргет молекула се подлага на въздействието на едно или повече от изпитваните съединения. Когато е необходимо да се изпитат едновременно повече от едно съединение, се предпочита да се използва база данни за съединения (множество малки молекули). Такива молекули обикновено се разтварят в пердеутериран диметилсулфоксид. Съединенията в базата данни може да се закупят или да се получат при необходимост.
Индивидуалните съединения може да се изберат inter alia на базата на големина (молекулна маса - 100-300) и молекулно разнообразие. Съединенията в колекцията могат да имат различна форма (например, плоски ароматни пръстен (и), нагънати алифатни пръстен (и), алифатни съединения с прави и разклонени вериги с прости, двойни и тройни връзки) и различни функционални групи (например, карбоксилови киселини, естери, етери, амини, алдехиди, кетони и различни хетероциклени пръстени) за оптимизиране на възможността за откриване на съединения, които взаимодействат в много различни места на свързване.
ЯМР методът за скрининг на настоящото изобретение използва концентрации на лигандите от около 0.05 до около 1.0 тМ. При тези концентрации кисели или основни съединения могат значително да променят pH на буферни разтвори на протеините. Химичните отмествания са чувствителни към промени на pH, както и при директни взаимодействия на свързване и затова може да се наблюдават “привидни положителни” промени в химичните отмествания, които не са резултат на свързване на лигандите, а на промени на pH. Затова е необходимо да се осигури pH на буферния разтвор да не се променя след прибавяне на лиганда. Начин за контролиране на pH е изложен по-долу.
Съединения се съхраняват при 263К като 1.0 и 0.1 М основни разтвори в диметилсулфоксид (DMSO). Това е необходимо, поради ограничената разтворимост на лигандиге във водни разтвори. Не е възможно директно да се коригира pH на DMSO разтвора. Освен това, НС1 и NaOH образуват неразтворими соли в DMSO, така че трябва да се използват алтер нативни киселини и основи. Намерено е, че стабилно pH се постига по следният начин:
1.0 М основен разтвор в DMSO се разрежда 1:10 в 50 тМ фосфат, pH 7.0. Измерва се pH на този разреден аликвотен разтвор. Ако pH на аликвота не се променя (т.е. остава 7.0), работният разтвор се получава чрез разреждане на основния разтвор в DMSO 1:10 до 0.1 М разтвор и този разтвор се съхранява.
Ако pH на разредената аликвотна част е по-малко от 7.0, се прибавя етаноламин към основния 1.0 М DMSO разтвор, след което основният разтвор се разрежда 1:10 с фосфатен буфер, за да се получи друга аликвотна част и отново се определя нейното pH.
Ако pH на разредената аликвотна част е по-голяма от 7.0, се прибавя оцетна киселина към основния 1.0 М DMSO разтвор, след което се разрежда 1:10 с фосфатен буфер, като се получава друга аликвотна част и се определя нейното pH.
Етаноламин и оцетна киселина са разтворими в DMSO. Прибавят се подходящи еквиваленти, за да се осигури при прехвърляне във воден буфер pH да не се променя. Корекцията на pH е процес па взаимодействие, който се повтаря до получаване на желания резултат.
Трябва да се отбележи, че тази процедура се извършва с 1:10 разреждания на 1.0 М основните разтвори (100 тМ лиганд), за да се осигури pH да не се променя при използване на ниски концентрации при експериментите (0.1 до 10 шМ) или при други различни/по-слаби буферни системи.
Следва изпитваните съединения да се подложат на въздействието на таргет молекулата и да се получи втори едномерен Т2- или дифузионен филтриран спектър. За Т2-метода, този втори спектър се получава по същия начин, както е изложено по-горе. Първият и вторият спектър се сравняват, за да се определи дали има някаква разлика между двата спектъра. Разлики в едномерните Т2-филтрирани спектри показват, че лигандът се е свързал с таргет молекула. Разликите се определят, като се използват стандартни процедури, добре познати в областта. За метода с дифузионно филтриране вторият спектър се получава от спектралните разлики при малък и голям градиент на силата на полето. По този начин се подбират съединения, чиито скорости на дифузия са срав ними с тези, наблюдавани в отсъствие на мишена молекула.
Например на фиг. 1 е показано сравнение на едномерни Т2-филтрирани спектри преди и след подлагане на въздействието на различни таргет молекули върху смес изпитвани съединения и следващо идентифициране на активното съединение. Подробно описание как се провеждат тези изследвания може да се намери в пример 1.
Друг пример е фиг. 2, на която са показани сравнения на едномерни дифузионнифилтрирани спектри преди и след подлагане на въздействието на различни таргет молекули върху смес изпитваните съединения и следващо идентифициране на активното съединение. Подробно описание как се извършват тези изследвания може да се намери в пример 2.
За да се открият допълнителни молекули, свързващи се с протеина, изпитваните молекули се избират на база на зависимостта структура/активност от първоначалния скрининг и/или структурна информация от първоначалните резултати за свързване с протеина. Например с първоначалния скрининг може да се идентифицират лиганди, всички съдържащи еднакъв ароматен пръстен. Тогава във втория етап на скрининга се изпитват съединения с други ароматни молекули.
Поради значението, което има в медицинската химия, предпочитана таргет молекула за използване в този метод, е полипептидът. В предпочитано изпълнение методът за откриване на свързването на един лиганд с таргет молекула може да се проведе в присъствие на втори лиганд. В съгласие с това изпълнение таргет молекулата се свързва с втори лиганд, преди да бъде изложена на въздействието на изпитваните съединения.
Предпочитани са същите таргет молекули, начини за получаване на спектрите и начини за сравняване на спектрите, каквито са изложени по горе.
Първоначалният етап в метода на проектиране е идентифицирането на два или повече лиганда, които се свързват със специфична таргет молекула. Идентифицирането на такива лиганди се извършва чрез едномерна Т2- или дифузионна-филтър спектроскопия, както е изложено по-горе.
След идентифициране на два или повече лиганда, които се свързват с таргет моле кулата на различни места, се образува комплекс между таргет молекулата и лигандите. При наличие на два лиганда комплексът е троен. Четвъртични и други комплекси се образуват при три и повече лиганди.
Комплексите се образуват при смесване на таргет молекулата едновременно или последователно с различни лиганди при условия, които позволяват тези лиганди да се свържат с таргета. Начините за определяне на тези условия са добре известни.
След образуване на комплекса се получават структурните данни. Може да се използва всеки начин за получаване на структурни данни. Такива методи са добре известни в областта. Например, предпочитани методи са ЯМР и рентгеноструктурната кристалография.
Анализът на структурните данни може да покаже пространственото ориентиране на лигандите относително един към друг, както и спрямо конформацията на таргет молекулата. Първо, пространственото ориентиране на всеки лиганд към таргет молекулата позволява да се идентифицират тези части от лиганда, които са директно включени в свързването (т.е. тези части взаимодействат на мястото на свързване с таргет) и тези части на всеки лиганд, които са проектирани извън мястото на свързване, и които може да се използват при следващи процедури на свързване.
Второ, данните за пространственото ориентиране се използват за определяне на позициите на всеки един лиганд спрямо всеки друг. С други думи, може да се изчислят дискретните разстояния между пространствено ориентираните лиганди.
Трето, данните за пространственото ориентиране определят също тридименсионалната зависимост между лигандите и таргета. Така, освен да се изчислят абсолютните разстояния между лигандите, може да се определят и ангуларно ориентираните лиганди.
Познаване на пространствените ориентации на лигандите и таргет се използва и за избор на линкери за свързване на два или повече лиганда един с друг в едно цяло, което съдържа всички лиганди. Проектирането на линкери се основава на разстоянията и ангуларното ориентиране, необходими за поддържане на всички части на лиганда в единичното цяло в подходяща ориентация спрямо таргета.
Тридименсионалната конформация на подходящи линкери е добре позната или лесно се определя по тривиален начин. Докато теоретично е възможно да се свържат два или повече лиганда на каквото и да е разстояние и тридименсионални проекции, то на практика се предпочитат известни ограничения по отношение на разстоянието и проекцията. В предпочитано изпълнение, лигандите са на разстояние, по-малко от около 15 А, по предпочитани са тези около 10 А и най-много предпочитани са тези, по-малки от около 5 А.
След като се идентифицира подходяща група за свързване, лигандите се свързват с този линкер. Начините за свързване на лигандите са добре познати и зависят от химичната структура на лиганда и самата свързваща група. Лигандите се свързват един с друг, като се използват тези части на лиганда, които не са директно включени в свързването с таргет молекулата.
Следващите примери илюстрират предпочитаните изпълнения на изобретението, без да го ограничават.
Примери за изпълнение на изобретението
Пример 1.
Изпитване на съединенията чрез използване на Т2-филтър спектроскопия A. FKBP
Рекомбинантен човешки FK свързващ протеин (FKBP) се получава, както е описано от Logan et al., J. Mol. Biol. 236: 637-648 (1994).
Използваната импулсна поредица за определяне на времето на напречна релаксация (Т2) на потенциални лиганди в присъствието на таргет молекула е поредицата на СаггPurcell-Meiboom-Gill (CPMG), описана от S. Meiboom and D. Gill, Rev. Sci. Instrum.x 29:688 (1958).
Предимството на настоящото изобретение се основа на факта, че големи молекули или комплекси молекули се движат бавно в разтвор и имат по-малки времена на напречна релаксация (Т2) спрямо малка молекула, която се движи бързо в разтвор. Това е добре известно. Настоящото изобретение използва предимството, че една малка молекула, която обикновено се движи бързо свободно в разтвор, ще се движи по-бавно, когато се свърже с по-голяма молекула. Така че времето на напречна релаксация (Т2) на малката молекула ще се променя (намалява) при свързване с таргет молекулата.
Това е демонстрирано на фиг. 1 за FKBP и съединение 1, което се свързва с FKBP с афинитет 200 μΜ. На фиг.1 А към съединението в отсъствие на FKBP се прилага CPMG поредица и спин-лок време 200 ms. Тъй като времената на напречна релаксация на малки молекули, които са свободни в разтвор, обикновено са от порядъка на секунди, протича незначителна релаксация по време на спин-лок-времето и се наблюдават сигнали на свободните лиганди. В присъствие на FKBP обаче, сигналите на лигандите намаляват значително след спин-лок времето и в спектъра остават само остатъчни пикове за протеина и лиганда, както е показано на фиг. 1 В. Тези разлики могат да се открият или чрез директно измерване или чрез спектрален диференциален метод, при който спектърът на FKBP (след спин-лок, фиг.1С) се изважда от спектъра на съединението в присъствие на FKBP (също след спин-лок, фиг.1 В), в резултат на което се получава спектърът на фиг. 1D.
Пример 2.
Изпитване, скрининг на съединенията чрез дифузионна-филтърспектроскопия
A. FKBP
Използвана е импулсна поредица за определяне на промените в скоростта на дифузия на потенциални лиганди в присъствие на таргет молекула, описано от S. J. Gibbs and C.S. Johnson, Jr. J. Magn, Reson.± 93:395-402 (1991) и A. S. Altieri, et al., J. Am. Chem. Soc. 117:75667567 (1995).
Предимството на настоящото изобретение се основава на факта, че малките молекули имат по-голяма дифузия в разтвор от поголеми молекули. Това е добре известно. Предимството на настоящото изобретение се основава на факта, че малките молекули, които дифундират по-бързо, когато са свободни в разтвор, ще дифундират по-бавно, когато се свържат с по-голяма таргет молекула. Така, скоростта на дифузия на малката молекула ще се промени при свързване с таргет молекула.
Възможността да се открие свързване на лиганди при използване на дифузионни филтри е демонстрирано за FKBP, свързан със съединение 1, както е показано на фиг. 4. Първо, дифузионни филтрирани спектри на проба на съединение 1 в присъствие на FKBP (съответно фиг.4А и 4В). се получават при малък и голям градиент на силата на полето. Тези спектри след това се изваждат, като се получава спектърът, показан на фиг.4С. Този спектър съдържа остатъчния резонанс на лиганда на съединение 1. След това този спектър се изважда от контролния спектър само на съединение 1 (след малък градиент, фиг.4О), като се получава спектър, съдържащ резонансите на лиганда, който се свързва с протеина (фиг.4Е). Както и при Т2-филтър експеримента, положителните пикове във фиг. 4Е отговарят на химичните отмествания на лиганда в отсъствие на протеин, докато отрицателните пикове отговарят на химичните отмествания на съединението при свързване с FKBP. Тази информация може да се използва да се идентифицира активното съединение.
Същите експерименти могат да се извършат със смес съединения. В тези опити, съединенията от 2 до 9, за които се знае, че не се свързват с FKBP, се свързват със съединение 1. Фиг.ЗА и 5В показват спектри на смес съединения в присъствие на FKBP съответно след малък и голям градиент на силата на полето. Разликите между тези спектри дават спектъра от фиг.5С. При изваждане на този спектър от контролен спектър на смес лиганди в отсъствие на FKBP (след малък градиент, фиг.5О). се получава спектър (фиг. 5Е), който съдържа положителните резонанси на химичните отмествания на съединение 1 в отсъствие на FKBP (фиг.5Р). Информацията за химичните отмествания, съдържаща се във фиг. 5Е, не се използва само за откриване на присъствието на лиганд, свързан с протеина, но може да се използва и да се идентифицира кое съединение в сместа съединения се свързва, при условие, че предварително е известна информация за химичните отмествания на свободни лиганди.
Фиг.6 показва същата серия експерименти само със смес съединения от 2 до 9, които не се свързват с FKBP. Както е посочено на фиг.бЕ, положителен резонанс на лиганда не се наблюдава в диференчните спектри, което показва, че лигандите не се свързват с FKBP.
Всички ЯМР спектри са снети на ЗООК на Broker АМХ500 NMR спектрометър. Всички спектри са снети с 256 скана и протонен спектрален обхват 88333.3 Hz и дължина на протонен 90-градусов импулс 7 ps. За Т2-фил тър експериментите: спин-лок време 200 ms и изчакване при спин-ехо 1 ms. За градиентните-филтър спектри са използвани малък и голям градиент на силата на полето, съответно 3 и 48 Gauss/cm и време за дифузионно изчак- 5 ване 300 ms. Във всички експерименти е използвана концентрация 100 μΜ за всеки лиганд, концентрацията на FKBP 50 μΜ, буфер тМ РО4, 100 тМ NaCI, pH 6.5 (95% D2O). ЯМР данните са получени и анализирани със Silicon компютри.
Описаните експерименти не ограничават и изобретението, което се отнася и до метод за проектиране на лиганд с голям афинитет, който е свързващото съединение най-малко на два лиганда, както е посочено в горния пример.
Таблнна I
aKD за съединение 1 от S. Shuker et al., Sciencei 274:1531-1534, (1996), а за съединения от 2 до 9 е определено от l5N-HSQC спектри на FKBP при концентрация на съединенията 1.0 тМ при отсъствие на наблюдаване на промени в химичните отмествания, както е описано в същата публикация.

Claims (26)

  1. Патентни претенции
    1. Метод за скрининг на съединения, характеризиращ се с това, че се отнася до идентифициране на присъствието на съединения лиганди, свързани с конкретна таргет молекула, включващ стадиите:
    a) получаване на първи едномерен Т2или дифузионно-филтриран ЯМР спектър на едно съединение или смес химични съединения;
    b) подлагане на съединението или сместа химични съединения на въздействието на таргет молекула;
    c) получаване на втори едномерен Т2или дифузионно-филтриран ЯМР спектър на съединението или на сместа химични съединения, подложени на въздействието на таргет молекулата в стадий (Ь); и (d) сравняване на първия и втори едномерни Т2- или дифузионно-филтрирани ЯМР спектри за определяне на разликите между първия и втория ЯМР спектър, разлики, идентифициращи присъствието на едно съединение или смес химични съединения, респективно, които са лиганди, свързали се с таргет молекулата.
  2. 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че се използва смес химични съединения в стадий (Ь), по-нататък включващ стадиите, следващи стадий d):
    e) получаване на първи едномерен Т2или дифузионно-филтриран ЯМР спектър на всяко съединение в сместа;
    f) подлагане на всяко съединение в сместа индивидуално на въздействието на таргет молекула;
    g) получаване на втори едномерен Т2или дифузионно-филтриран ЯМР спектър на всяко съединение, подложено на въздействието на таргет молекулата в стадий (f); и
    h) сравняване на всеки ЯМР спектър, получен в етап g), с първия ЯМР спектър за определяне на разликите във всеки от тези сравнявани ЯМР спектри, разлики, идентифициращи присъствието на съединение лиганд, свър зал се с таргет молекулата.
  3. 3. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че по-нататък включва стадий на свързване на таргет молекулата с втори лиганд преди стадий (а).
  4. 4. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че изпитваните съединения се избират от колекция съединения, които са различни малки молекули.
  5. 5. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че таргет молекулата се избира от полипептид.
  6. 6. Метод съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че полипептидът се избира от ензим или рецептор.
  7. 7. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че таргет молекулата се избира от полинуклеинова киселина.
  8. 8. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че таргет молекулата е небелязана.
  9. 9. Метод за проектиране на лиганд с голям афинитет спрямо таргет молекулата, характеризиращ се с това, че включва следните стадии:
    (a) идентифициране на първия лиганд, свързан с таргет молекулата, чрез използване на едномерна Т2- или дифузионно-филтрирана ЯМР спектроскопия по метода съгласно претенция 1;
    (b) идентифициране на един или повече допълнителни лиганди с таргет молекулата чрез използване на едномерна Т2- или дифузионнофилтрирана ЯМР спектроскопия;
    (c) образуване на комплекс между първия идентифициран лиганд и един или повече допълнително идентифицирани лиганди с таргет молекулата;
    (d) определяне на тридименсионална структура поне на тази част на комплекса, където първият и един или повече допълнителни лиганди са свързани с таргет молекулата, и по този начин на пространственото ориентиране на първия и един или повече допълнителни лиганди спрямо таргет молекулата; и (e) свързване на първия с един или повече допълнителни лиганди при запазване на пространственото ориентиране, определено в стадий (d), и образуване на лиганд с голям афинитет.
  10. 10. Метод съгласно претенция 9, характеризираш се с това, че таргет молекулата се избира от полипептид.
  11. 11. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че таргет молекулата е небелязана.
  12. 12. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че лигандът и един или повече допълнителни лиганди са свързват чрез конвергентен или линеен органичен синтез, като образуват лиганд с голям афинитет.
  13. 13. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че лигандът с голям афинитет е фармацевтично активно множество.
  14. 14. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че първият или един или повече допълнителни лиганди се избират от пул с различни малки молекули.
  15. 15. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че малките молекули се избират от колекция съединения.
  16. 16. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че комплексът се образува чрез свързване на първия и един или повече допълнителни лиганди с таргет молекулата в разтвор.
  17. 17. Метод съгласно претенция 16, характеризиращ се с това, че образуваният в разтвор комплекс, е подобен или идентичен на комплекса, образуван от лиганда или един или повече допълнителни лиганди при физиологични условия.
  18. 18. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че по-нататък включва стадиите:
    (f) използване на сравнението в помощ на идентифициране на химично съединение, което е лиганд за таргет молекулата, и (g) получаване на съединението.
  19. 19. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че по-нататък включва, преди стадий (а), стадий за избор на таргет молекула с биологична активност, която е от значение за медицинската химия, и след стадий (е) включва стадий за получаване на химично съединение със структура, която се получава чрез свързване на първия и допълнително идентифицираните лиганди така, че да се запази пространственото ориентиране, определено в стадии (d).
  20. 20. Метод съгласно претенция 18 или претенция 19, характеризиращ се с това, че таргет молекулата е полипептид.
  21. 21. Метод съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че полипептидът има молекулна маса, по-голяма от 5 kDa.
  22. 22. Фармацевтично активно съединение с голям афинитет спрямо таргет биомолекула, съставено от първия лиганд и един или повече допълнителни лиганди, като първият или един или повече допълнителни лиганди са свързани, а съединението се получава по метода съгласно претенция 19.
  23. 23. Фармацевтично активно съединение с голям афинитет спрямо таргет биомолекула съгласно претенция 22, където таргет биомолекулата е нуклеинова киселина.
  24. 24. Фармацевтично активно съединение с голям афинитет спрямо таргет биомолекула съгласно претенция 22, където таргет биомолекулата е полипептид.
  25. 25. Фармацевтично активно съединение с голям афинитет спрямо таргет биомолекулата съгласно претенция 24, където таргет биомолекулата е полипетид с молекулна маса над 5 kDa.
  26. 26. Фармацевтично активно съединение с голям афинитет спрямо таргет биомолекула съгласно претенция 24, където таргет биомолекулата е човешки FK свързващ протеин (FKBP).
BG103856A 1997-04-18 1999-11-04 Използване на едномерен ядреномагнитен резонанс за идентифициране на лиганди с таргет биомолекули BG64326B1 (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/844,124 US6043024A (en) 1997-04-18 1997-04-18 Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules
PCT/US1998/007907 WO1998048264A1 (en) 1997-04-18 1998-04-17 Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG103856A BG103856A (bg) 2000-07-31
BG64326B1 true BG64326B1 (bg) 2004-09-30

Family

ID=25291882

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG103856A BG64326B1 (bg) 1997-04-18 1999-11-04 Използване на едномерен ядреномагнитен резонанс за идентифициране на лиганди с таргет биомолекули

Country Status (29)

Country Link
US (1) US6043024A (bg)
EP (1) EP0975954B2 (bg)
JP (1) JP2002507277A (bg)
KR (1) KR100542420B1 (bg)
CN (1) CN1225648C (bg)
AR (1) AR004651A1 (bg)
AT (1) ATE259061T1 (bg)
AU (1) AU7138098A (bg)
BG (1) BG64326B1 (bg)
BR (1) BR9808079A (bg)
CA (1) CA2286795C (bg)
CO (1) CO5060446A1 (bg)
CZ (1) CZ297275B6 (bg)
DE (1) DE69821475T3 (bg)
DK (1) DK0975954T4 (bg)
ES (1) ES2215296T5 (bg)
HK (1) HK1027158A1 (bg)
HU (1) HU228433B1 (bg)
IL (1) IL131726A0 (bg)
NO (1) NO995078L (bg)
NZ (1) NZ337126A (bg)
PL (1) PL194184B1 (bg)
PT (1) PT975954E (bg)
SI (1) SI0975954T1 (bg)
SK (1) SK285411B6 (bg)
TR (1) TR199902167T2 (bg)
TW (1) TW574502B (bg)
WO (1) WO1998048264A1 (bg)
ZA (1) ZA982919B (bg)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001503646A (ja) * 1996-03-29 2001-03-21 ローレンス バークレー ナショナル ラボラトリィ 過分極化希ガス存在下でのｎｍｒまたはｍｒｉの増強
US20030143757A1 (en) * 1997-06-13 2003-07-31 Jonathan Moore Methods for identifying drug cores
US6111066A (en) 1997-09-02 2000-08-29 Martek Biosciences Corporation Peptidic molecules which have been isotopically substituted with 13 C, 15 N and 2 H in the backbone but not in the sidechains
US6344330B1 (en) 1998-03-27 2002-02-05 The Regents Of The University Of California Pharmacophore recombination for the identification of small molecule drug lead compounds
JP2002534687A (ja) * 1998-12-30 2002-10-15 アメルシャム・パブリック・リミテッド・カンパニー 過分極を使用したｎｍｒ分光学アッセイ
US6333149B1 (en) 1999-06-04 2001-12-25 Triad Biotechnology, Inc. NMR-solve method for rapid identification of bi-ligand drug candidates
WO2001014886A2 (en) * 1999-08-23 2001-03-01 Polaris Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of binding between proteins and macromolecular ligands
US6677160B1 (en) 1999-09-29 2004-01-13 Pharmacia & Upjohn Company Methods for creating a compound library and identifying lead chemical templates and ligands for target molecules
US6764858B2 (en) 1999-09-29 2004-07-20 Pharmacia & Upjohn Company Methods for creating a compound library
US20010051333A1 (en) * 2000-04-17 2001-12-13 Pharmacia & Upjohn Company Nuclear magnetic resonance methods for identifying sites in papillomavirus E2 protein
US7146277B2 (en) * 2000-06-13 2006-12-05 James H. Prestegard NMR assisted design of high affinity ligands for structurally uncharacterized proteins
US20030165431A1 (en) * 2000-07-13 2003-09-04 The Regents Of The University Of California Method for detecting macromolecular conformational change and binding information
US7061237B2 (en) * 2000-07-13 2006-06-13 The Regents Of The University Of California Remote NMR/MRI detection of laser polarized gases
EP1320387B1 (en) * 2000-09-13 2012-04-11 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Pharmaceutical compositions for sustained delivery of peptides
AU1106902A (en) 2000-09-27 2002-04-08 Univ Leiden Method for applying nmr for ligand discovery or as a drug screening tool
CA2432924A1 (en) * 2000-12-21 2002-06-27 Triad Therapeutics, Inc. Sea-trosy and related methods
GB0031566D0 (en) * 2000-12-22 2001-02-07 Mets Ometrix Methods for spectral analysis and their applications
US20030092027A1 (en) * 2001-06-01 2003-05-15 Luciano Mueller Nuclear magnetic resonance method for identifying ligands to target compounds
EP1423427A2 (en) * 2001-08-27 2004-06-02 Novartis AG Nogo receptor homologues and their use
US7653490B2 (en) 2001-09-10 2010-01-26 Triad Liquidating Company LLC Nuclear magnetic resonance assembly of chemical entities
US20050221420A1 (en) * 2001-10-22 2005-10-06 Carmen Barske Nogo receptor homologues and their use
US7037660B2 (en) * 2001-11-06 2006-05-02 Message Pharmaceuticals Methods for detecting and quantifying binding and inhibition of binding of species to nucleic acids
KR100888805B1 (ko) * 2002-06-14 2009-03-16 크리스탈지노믹스(주) 특정 아미노산이 표지된 단백질과 1ｄ ｎｍｒ 기법을이용하여 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을검색하는 방법
KR100901309B1 (ko) * 2002-06-15 2009-06-09 크리스탈지노믹스(주) 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 선별하는 방법
NO20025738D0 (no) * 2002-11-29 2002-11-29 Amersham Health As Metode
CA2466792A1 (en) * 2003-05-16 2004-11-16 Affinium Pharmaceuticals, Inc. Evaluation of spectra
US7595170B2 (en) * 2004-08-05 2009-09-29 Modrovich Ivan E Apparatus and method for measuring concentrations of molecules through a barrier
US8933209B2 (en) 2006-04-26 2015-01-13 Abbvie Inc. Dep2 and its uses in major depressive disorder and other related disorders
US20070256148A1 (en) * 2006-04-26 2007-11-01 Katz David A DEP2 and its uses in major depressive disorder and other related disorders
FR2954830A1 (fr) * 2009-12-31 2011-07-01 Nmrtec Methode d'analyse comparative par resonance magnetique nucleaire
CA2848520C (en) * 2011-09-29 2019-11-26 Seattle Genetics, Inc. Intact mass determination of protein conjugated agent compounds
CN102507627B (zh) * 2011-11-14 2014-10-01 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种高通量筛选药物的核磁共振方法
US9678185B2 (en) 2013-03-15 2017-06-13 Pepsico, Inc. Method and apparatus for measuring physico-chemical properties using a nuclear magnetic resonance spectrometer
CN104198517B (zh) * 2014-09-23 2017-02-08 中国科学院昆明植物研究所 联合使用不同核的一维核磁共振混合物定量方法
CN104897826B (zh) * 2015-06-16 2016-06-22 广西师范大学 一种用于细胞原位检测小分子化合物与靶蛋白相互作用的方法
CN107328804B (zh) * 2017-07-21 2019-02-05 中国科学院山西煤炭化学研究所 一种甘油加氢反应混合物的核磁共振检测方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4789832A (en) * 1987-01-14 1988-12-06 Jeol Ltd. Three-dimensional NMR spectroscopy
JPH05503691A (ja) * 1989-12-29 1993-06-17 ユニバーシティ・テクノロジーズ・インターナショナル・インコーポレイテッド アゴニストおよびアンタゴニストを含む生物学的に活性なリガンドの３次構造モデルの設計方法およびアンギオテンシンに基づいた新規合成アンタゴニスト
US5270163A (en) * 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5698401A (en) * 1995-11-14 1997-12-16 Abbott Laboratories Use of nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules

Also Published As

Publication number Publication date
BG103856A (bg) 2000-07-31
HUP0003956A3 (en) 2002-04-29
SK285411B6 (sk) 2007-01-04
PL336299A1 (en) 2000-06-19
HK1027158A1 (en) 2001-01-05
BR9808079A (pt) 2000-03-08
DE69821475T3 (de) 2009-07-23
EP0975954B2 (en) 2009-03-18
CZ9903683A3 (cs) 2001-02-14
HUP0003956A2 (en) 2001-03-28
JP2002507277A (ja) 2002-03-05
HU228433B1 (en) 2013-03-28
IL131726A0 (en) 2001-03-19
SK141699A3 (en) 2000-06-12
CZ297275B6 (cs) 2006-10-11
AU7138098A (en) 1998-11-13
ZA982919B (en) 1998-10-12
US6043024A (en) 2000-03-28
CN1225648C (zh) 2005-11-02
NO995078L (no) 1999-12-06
AR004651A1 (es) 1999-03-10
DE69821475D1 (de) 2004-03-11
PL194184B1 (pl) 2007-05-31
TR199902167T2 (xx) 2000-07-21
EP0975954B1 (en) 2004-02-04
NO995078D0 (no) 1999-10-18
DK0975954T4 (da) 2009-05-18
TW574502B (en) 2004-02-01
ES2215296T5 (es) 2009-07-06
CA2286795A1 (en) 1998-10-29
DE69821475T2 (de) 2004-11-25
WO1998048264A1 (en) 1998-10-29
KR20010006454A (ko) 2001-01-26
NZ337126A (en) 2001-05-25
CN1252868A (zh) 2000-05-10
CA2286795C (en) 2010-06-29
DK0975954T3 (da) 2004-06-07
PT975954E (pt) 2004-06-30
CO5060446A1 (es) 2001-07-30
EP0975954A1 (en) 2000-02-02
SI0975954T1 (en) 2004-08-31
ATE259061T1 (de) 2004-02-15
ES2215296T3 (es) 2004-10-01
KR100542420B1 (ko) 2006-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG64326B1 (bg) Използване на едномерен ядреномагнитен резонанс за идентифициране на лиганди с таргет биомолекули
Lucas et al. Measuring ligand‐protein binding using NMR diffusion experiments
Fielding NMR methods for the determination of protein–ligand dissociation constants
Vanwetswinkel et al. TINS, target immobilized NMR screening: an efficient and sensitive method for ligand discovery
Beckonert et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts
Nicholson et al. High resolution nuclear magnetic resonance spectroscopy of biological samples as an aid to drug development
Ye et al. Chemoselective 15N tag for sensitive and high-resolution nuclear magnetic resonance profiling of the carboxyl-containing metabolome
Tengel et al. Use of 19F NMR spectroscopy to screen chemical libraries for ligands that bind to proteins
DE69613146T3 (de) Verwendung von kernspinresonanz zur bestimmung von liganden für zielbiomoleküle
Wang et al. Amplification of nuclear Overhauser effect signals by hyperpolarization for screening of ligand binding to immobilized target proteins
Dalvit et al. Competition binding experiments for rapidly ranking lead molecules for their binding affinity to human serum albumin
CA2388216A1 (en) Use of double-quantum 1h-nmr spectroscopy for the identification of ligands interacting with target biomolecules
KR20050008788A (ko) 고처리량 스크리닝을 위한 불소 ｎｍｒ의 용도
US20030077628A1 (en) Method of screening compounds for biological activity
AU772620B2 (en) Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules
JP5129424B2 (ja) リガンドの発見または薬物スクリーニング手段としてのｎｍｒ利用法
KR101211971B1 (ko) 핵자기공명 분광기를 이용한 동등생물의약품 구조의 비교 평가 방법
US20220091128A1 (en) System and method for ligand thermal analysis
Marincin et al. New approaches to track chemoenzymatic loading reactions of NRPS carrier protein domains using NMR
MXPA99009558A (en) Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules
Castiglione NMR analysis of unnatural amino acids in natural antibiotics
IL149514A (en) Use of two dimensional &lt;15&gt;n/&lt;1&gt;n nmr correlation spectroscopy in a process for designing high-affinity ligands to target biomolecules