CN109988809A - 一种电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性测试方法 - Google Patents
一种电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性测试方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109988809A CN109988809A CN201910342200.8A CN201910342200A CN109988809A CN 109988809 A CN109988809 A CN 109988809A CN 201910342200 A CN201910342200 A CN 201910342200A CN 109988809 A CN109988809 A CN 109988809A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- electronics smoke
- smoke sol
- electronic cigarette
- exposure
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000779 smoke Substances 0.000 title claims abstract description 90
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000010998 test method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 title claims abstract description 17
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims abstract description 13
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims abstract description 9
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims abstract description 9
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 claims abstract description 8
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims abstract description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000003571 electronic cigarette Substances 0.000 claims description 62
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 58
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 23
- KVYRCBOUKXJXDK-UHFFFAOYSA-N 3,4-dimethylphenazine-1,2-diamine hydrochloride Chemical compound Cl.C1=CC=CC2=NC3=C(C)C(C)=C(N)C(N)=C3N=C21 KVYRCBOUKXJXDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 claims description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 11
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 claims description 10
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 claims description 10
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 claims description 10
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 claims description 10
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 8
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 8
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 claims description 8
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 claims description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 7
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 claims description 7
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 6
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 5
- 239000003546 flue gas Substances 0.000 claims description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 4
- 239000003517 fume Substances 0.000 claims description 4
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 claims description 4
- 230000001007 puffing effect Effects 0.000 claims description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 2
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 claims description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 2
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims description 2
- 238000005086 pumping Methods 0.000 claims description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 claims 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 claims 1
- 230000006749 inflammatory damage Effects 0.000 claims 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract description 15
- 231100000821 endpoints of toxicity testing Toxicity 0.000 abstract description 8
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 abstract description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 7
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000759 toxicological effect Toxicity 0.000 description 3
- SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N (-)-Nicotine Chemical compound CN1CCC[C@H]1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- 231100000750 In vitro toxicology Toxicity 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229960002715 nicotine Drugs 0.000 description 2
- SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N nicotine Natural products CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 231100000300 cellular toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000009688 liquid atomisation Methods 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- VSIVTUIKYVGDCX-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].COC1=CC([N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 VSIVTUIKYVGDCX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[N+](C=2C=CC(I)=CC=2)=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=N1 JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009602 toxicology test Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
- G01N33/6869—Interleukin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/52—Assays involving cytokines
- G01N2333/54—Interleukins [IL]
- G01N2333/5412—IL-6
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/52—Assays involving cytokines
- G01N2333/54—Interleukins [IL]
- G01N2333/5421—IL-8
Abstract
一种电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性测试方法，其特征在于：该方法可以进行多种细胞毒性终点测试，以及多种炎症因子释放水平的检测，更加全面反映电子烟气溶胶的体外毒性效应，具体包括以下步骤：电子烟气溶胶发生、细胞直接暴露、细胞毒性测试、炎症因子检测。本发明建立了电子烟气溶胶的体外毒性测定方法，整合了电子烟气溶胶的体外细胞直接暴露实验，细胞毒性终点测试和炎症因子释放水平的检测。一次暴露后，细胞可进行细胞毒性终点检测，而细胞上清液可进行炎症因子检测，评价的毒性终点多且高效，通量高，可从多方面综合表征电子烟气溶胶的体外毒性效应。
Description
技术领域
本发明涉及电子烟的体外毒理学评价研究领域，具体说是一种电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性测试方法。
背景技术
电子烟又名电子烟碱传送系统，是一种将电子烟液经雾化器雾化向呼吸系统传送烟碱和/或其他物质的产品。电子烟与传统卷烟相比，其烟气气溶胶发生方式不同，没有燃烧裂解过程。电子烟的出现和使用也引起了公众对健康的关注，然而，目前关于电子烟的临床前毒理学评价研究非常少。现有的关于电子烟的体外毒理学评价主要是针对电子烟液进行毒理学测试实验，并没有对电子烟液雾化后产生的气溶胶进行毒性评价。经检索到的相关专利有 “一种电子烟烟液体外细胞毒性WST-1测试方法（ZL201410094989.7）”、“用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法（ZL201410094933.1）”、“一种电子烟烟液体外细胞毒性WST-8测试方法（ZL201410094934.6）”、“一种基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法（ZL201410094851.7）”等，这些专利都是针对电子烟液的细胞毒性测试方法，不涉及电子烟气溶胶的细胞毒性评价，而且测试方法是评价一个毒性终点，不能进行多种毒性终点的测试。检索到公开的专利申请“检测电子烟气溶胶水提物对细胞炎症因子分泌量影响的方法（公开号CN 107828849 A）”，该专利申请检测的电子烟气溶胶水提物染毒细胞后炎症因子的释放水平，测试的是电子烟气溶胶的水溶液提取物，染毒细胞是溶液间接染毒方式，而且气溶胶经水溶液提取后非水溶性的烟气化学成分则没有溶解在提取液中，这样的水溶性提取物的测试结果不能真实、完全反映实际的电子烟气溶胶的毒性效应。检索到文献主要有“电子烟烟液及其主要化学成分的体外细胞毒性评价（烟草科技，http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1137.TS.20181106.1057.003.html）”、“电子烟烟液体外毒理学评价用细胞筛选研究（中国烟草学报,24(5):84-90）”等，这些文献研究使用的方法是对电子烟液的细胞毒性评价，是间接染毒，没有研究电子烟气溶胶直接暴露的毒性效应，电子烟气溶胶自然状态下本身的毒性效应。因此，以往的方法专利和文献研究都是针对电子烟液或水溶液提取物进行的细胞毒性测试，采用的染毒方法是细胞浸没式的间接染毒，评价的是电子烟液或水溶液提取物的生物学效应。而实际上，电子烟在抽吸时，电子烟液首先经雾化成气溶胶后进入体内，雾化后的气溶胶中的化学组成发生了变化，而且抽吸时电子烟气溶胶与细胞是直接接触的。评价新鲜产生的电子烟气溶胶，更能反映实际暴露环境下的电子烟烟气的生物学效应，而以往采用电子烟液溶液染毒的方式无法评价实际吸入的电子烟气溶胶成分的毒理学效应。
电子烟毒性较低，在进行体外毒性评价时，需要灵敏度高的测试方法模拟实际吸入暴露条件，更加真实反映电子烟气溶胶的生物学效应。
发明内容
本发明的目的正是针对上述存在的问题，建立了针对电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性评价方法，综合评价电子烟气溶胶的细胞毒性和致炎症效应。基于该方法可以进行多种细胞毒性终点测试，以及多种炎症因子释放水平的检测，综合评价指标更加全面反映电子烟气溶胶的体外毒性效应。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性测试方法，可以进行多种细胞毒性终点测试，以及多种炎症因子释放水平的检测，更加全面反映电子烟气溶胶的体外毒性效应，包括以下步骤：电子烟气溶胶发生、细胞直接暴露、细胞毒性测试、炎症因子检测，具体方式如下：
1）电子烟气溶胶发生
吸烟机抽吸电子烟，抽吸参数（包括：抽吸曲线、每口抽吸持续时间、每口抽吸容量、每口抽吸间隔时间）可根据实验目的进行设置。电子烟连续抽吸适量口数，以电子烟抽吸口数作为后续体外毒性测试的暴露剂量，为保证毒性指标测试结果的稳定性，一般情况下，抽吸10~200口以上。电子烟与吸烟机通过夹持器连接，夹持器接口可适配各种规格的电子烟，包括：一次性电子烟、烟弹式电子烟和蓄液式电子烟。
2）细胞直接暴露
电子烟液经雾化后新鲜产生的电子烟气溶胶在真空负压下导入至烟气暴露舱内，烟气暴露仓具有烟气进气口和废气排出口，可保证暴露仓内的大气压平衡。暴露舱内放置有培养的细胞，细胞生长在聚碳酸酯半透膜上，半透膜的孔径为0.4 μm，可保证细胞培养液穿过半透膜为细胞提供营养，半透膜下方为细胞培养液，上方为电子烟气溶胶环境，细胞与进入暴露舱内的电子烟气溶胶直接接触暴露。实验中设置合成空气暴露组作为对照组，对应于每一组电子烟抽吸口数（即一个电子烟气溶胶暴露剂量），分别设置相应暴露时长的合成空气暴露组。
所述细胞可为人支气管上皮细胞BEAS-2B、人肺腺癌细胞A549。
3）细胞毒性测试
经电子烟气溶胶暴露后的细胞以及成空气暴露组细胞更换新鲜细胞培养基后恢复培养24 h，随后将细胞培养基吸出冻存在-80℃用于后续的炎症因子检测实验，细胞经预热的磷酸缓冲盐溶液洗一次，加入中性红染液，于37℃、5% CO2条件下培养3 h，吸去中性红染液，加入磷酸缓冲盐溶液洗一次，加入中性红提取液，室温下快速振荡20~40 min，将中性红提取液转入96孔板中（150 μl/孔），使用酶标仪检测96孔板上中性红提取液在540 nm波长处的吸光值。
4）炎症因子检测
炎症因子的检测目标为白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素8（IL-8）。将收集冻存的细胞培养液于室温下进行复融，经离心后收集上清液，样品上清液加入到经抗IL-6或IL-8的小鼠单克隆抗体包被的96孔板中，贴上封板膜室温孵育2 h，吸去96孔板孔中的液体，磷酸缓冲盐溶液洗涤2~4次，加入经辣根过氧化物酶标记的二抗（即抗IL-6的多克隆抗体，或抗IL-8的单克隆抗体），室温孵育1~2 h，磷酸缓冲盐溶液洗涤2~4次，加入辣根过氧化物酶底物溶液，室温避光孵育30~40 min，加入终止液，于30 min内使用酶标仪检测在450 nm波长处的吸光值，校正波长540 nm。
所述炎症因子还可包括IL-1、IL-10、TNF-α、INF-γ多种炎症相关细胞因子。
本发明建立了电子烟气溶胶的体外毒性测定方法，整合了电子烟气溶胶的体外细胞直接暴露实验，细胞毒性终点测试和炎症因子释放水平的检测。本发明可以针对不同类型的电子烟（包括一次性电子烟、烟弹式电子烟和蓄液式电子烟）的实时发生气溶胶进行体外毒理学效应评价。在进行电子烟气溶胶细胞暴露实验时，是将新鲜产生的电子烟气溶胶直接暴露于细胞，可以模拟实际抽吸条件下的暴露微环境，更加真实地反映电子烟的生物学效应。而以往采用电子烟液或气溶胶水提取物的评价方法是一种间接的暴露实验，细胞浸没于电子烟烟液或水提取物中，测试的毒性是电子烟液或水提取物的生物学效应，不能测试实际雾化的电子烟气溶胶中的化学成分对细胞的毒性影响，与实际电子烟抽吸时的状态完全不同。电子烟抽吸时电子烟液首先进行雾化形成气溶胶后进入体内，气溶胶中的化学组成和电子烟液是有差异的，测试电子烟气溶胶的生物学效应更加真实反映实际的暴露情况。同时，电子烟气溶胶经水溶液提取后非水溶性的烟气化学成分则没有溶解在提取液中，这样的水溶性提取物的测试结果不能真实、完全反映实际的电子烟气溶胶的毒性效应。经过电子烟气溶胶暴露后的细胞可进行多种毒性终点的细胞毒性检测，同时，经暴露后细胞的上清液收集后可进行多种炎症因子的检测，通过炎症因子的检测可表征电子烟致细胞炎症效应，并可准确有效地判断电子烟对受试细胞炎症效应的影响，以此全面地判别电子烟气溶胶的毒理学效应。炎症是烟气暴露诱导机体发生生理性和病理性改变的重要前期事件，炎症因子释放水平的变化反映了机体在暴露电子烟气溶胶的损伤情况，通过整合暴露细胞毒性终点的指标以及炎症因子的指标，可以较为全面的评价电子烟气溶胶直接暴露细胞后对细胞的损伤效应和影响程度。
本发明的实质性特点在于：
1、建立了电子烟气溶胶的细胞直接暴露方法，不同于电子烟液或气溶胶水提取物的间接暴露，且电子烟液和其雾化后的电子烟气溶胶的化学组成也存在差异。此外，电子烟气溶胶经水溶液提取后非水溶性的烟气化学成分则没有溶解在提取液中，这样的水溶性提取物的测试结果不能真实、完全反映实际的电子烟气溶胶的毒性效应。
2、整合了电子烟气溶胶直接暴露方法和细胞毒性终点测试以及炎症因子检测实验，一次暴露后，细胞可进行细胞毒性终点检测，而细胞上清液可进行炎症因子检测，评价的毒性终点多且高效，通量高，可从多方面综合表征电子烟气溶胶的体外毒性效应。
附图说明
图1为某一次性电子烟气溶胶暴露细胞后的细胞毒性测试结果。
图2为某一次性电子烟气溶胶暴露细胞后的细胞炎症因子IL-6测试结果。
图3、为某一次性电子烟气溶胶暴露细胞后的细胞炎症因子IL-8测试结果。
具体实施方式
本发明以下结合实施例（附图）做进一步描述：
某一次性电子烟进行体外毒性测试。吸烟机抽吸电子烟，新鲜产生的电子烟气溶胶在真空负压下导入至烟气暴露舱内，暴露舱内放置有培养的细胞，细胞生长在半透膜上，半透膜下方为细胞培养液，细胞与进入暴露舱内的电子烟气溶胶直接接触暴露，电子烟每个剂量分别抽吸10、20、50、100、200口。设置合成空气暴露组作为对照组。经电子烟气溶胶暴露后的细胞以及成空气暴露组细胞更换新鲜细胞培养基后恢复培养24 h，细胞进行中性红细胞毒性测试，收集细胞培养液进行IL-6和IL-8的检测。测试结果见图1-3。
图1所示为电子烟气溶胶直接暴露细胞后的细胞毒性测试结果，显示随着电子烟抽吸口数的增加，电子烟气溶胶暴露组细胞的存活率与合成空气暴露组相比有下降趋势。
图2 所示为电子烟气溶胶直接暴露细胞后细胞培养液中IL-6释放水平的变化情况，显示随着电子烟抽吸口数的增加，电子烟气溶胶暴露组细胞的IL-6释放水平与合成空气暴露组相比有增加趋势。
图3 所示为电子烟气溶胶直接暴露细胞后细胞培养液中IL-8释放水平的变化情况，显示随着电子烟抽吸口数的增加，电子烟气溶胶暴露组细胞的IL-8释放水平与合成空气暴露组相比有增加趋势。
Claims (10)
1.一种电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性测试方法，其特征在于：该方法可以进行多种细胞毒性终点测试，以及多种炎症因子释放水平的检测，更加全面反映电子烟气溶胶的体外毒性效应，包括以下步骤：
电子烟气溶胶发生；
细胞直接暴露；
细胞毒性测试；
炎症因子检测。
2.根据权利要求1所述的电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性测试方法，其特征在于：步骤（1）中电子烟气溶胶发生的具体方式如下：
吸烟机抽吸电子烟，包括抽吸曲线、每口抽吸持续时间、每口抽吸容量、每口抽吸间隔时间的抽吸参数可根据实验目的进行设置；电子烟连续抽吸适量口数，以电子烟抽吸口数作为后续体外毒性测试的暴露剂量。
3.根据权利要求2所述的电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性测试方法，其特征在于：为保证毒性指标测试结果的稳定性，一般情况下，抽吸口数在10~200口之间。
4.根据权利要求1所述的电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性测试方法，其特征在于：步骤（2）中细胞直接暴露的具体方式如下：
电子烟液经雾化后新鲜产生的电子烟气溶胶在真空负压下导入至烟气暴露舱内，烟气暴露仓具有烟气进气口和废气排出口，可保证暴露仓内的大气压平衡；
暴露舱内放置有培养的细胞，细胞生长在半透膜上，半透膜的孔径为0.4 μm，可保证细胞培养液穿过半透膜为细胞提供营养，半透膜下方为细胞培养液，上方为电子烟气溶胶环境，细胞与进入暴露舱内的电子烟气溶胶直接接触暴露；
实验中设置合成空气暴露组作为对照组，对应于每一组电子烟抽吸口数即一个电子烟气溶胶暴露剂量，分别设置相应暴露时长的合成空气暴露组。
5.根据权利要求1所述的电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性测试方法，其特征在于：步骤（3）中细胞毒性测试的具体方式如下：
经电子烟气溶胶暴露后的细胞以及成空气暴露组细胞更换新鲜细胞培养基后恢复培养24 h，随后将细胞培养基吸出冻存在-80℃用于后续的炎症因子检测实验；
细胞经预热的磷酸缓冲盐溶液洗一次，加入中性红染液，于37℃、5% CO2条件下培养3h，吸去中性红染液，加入磷酸缓冲盐溶液洗一次，加入中性红提取液，室温下快速振荡20~40 min，将中性红提取液转入96孔板中，每孔150 μl/孔；
使用酶标仪检测96孔板上中性红提取液在540 nm波长处的吸光值，用于检测细胞受损或存活情况。
6.根据权利要求1所述的电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性测试方法，其特征在于：步骤（4）中炎症因子检测的具体方式如下：
炎症因子的检测目标为白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素8（IL-8）；
将收集冻存的细胞培养液于室温下进行复融，经离心后收集上清液，样品上清液加入到经抗IL-6或IL-8的小鼠单克隆抗体包被的96孔板中，贴上封板膜室温孵育2 h；
吸去96孔板孔中的液体，磷酸缓冲盐溶液洗涤2~4次
加入经辣根过氧化物酶标记的二抗，即抗IL-6的多克隆抗体，或抗IL-8的单克隆抗体，室温孵育1~2 h；
磷酸缓冲盐溶液洗涤2~4次，加入辣根过氧化物酶底物溶液，室温避光孵育30~40 min，加入终止液；
于30 min内使用酶标仪检测在450 nm波长处的吸光值，校正波长540 nm；
以检测所释放的炎症因子的浓度来判断电子烟气溶胶的致细胞炎症损伤效应。
7.根据权利要求1或3或4或5或6所述的电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性测试方法，其特征在于：所述细胞为人支气管上皮细胞BEAS-2B、人肺腺癌细胞A549。
8.根据权利要求4所述的电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性测试方法，其特征在于：所述半透膜为聚碳酸酯膜，膜上微孔直径为0.4 μm。
9.根据权利要求1或2或4或5所述的电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性测试方法，其特征在于：所述电子烟与吸烟机通过夹持器连接，该夹持器的接口可适配各种规格的电子烟，包括：一次性电子烟、烟弹式电子烟和蓄液式电子烟。
10.根据权利要求1或5或6所述的电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性测试方法，其特征在于：所述炎症因子还可包括IL-1、IL-10、TNF-α、INF-γ多种炎症相关细胞因子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910342200.8A CN109988809A (zh) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | 一种电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性测试方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910342200.8A CN109988809A (zh) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | 一种电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性测试方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109988809A true CN109988809A (zh) | 2019-07-09 |
Family
ID=67133211
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910342200.8A Pending CN109988809A (zh) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | 一种电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性测试方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109988809A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110702891A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-01-17 | 江西中烟工业有限责任公司 | 一种天然本草提取物对长期吸烟危害的减害作用的测试方法 |
| CN111351922A (zh) * | 2020-04-27 | 2020-06-30 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种体外抽吸烟气多通道暴露染毒方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102140489A (zh) * | 2011-01-24 | 2011-08-03 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 卷烟全烟气染毒的细胞毒性测试方法 |
| CN107828849A (zh) * | 2017-09-21 | 2018-03-23 | 云南中烟工业有限责任公司 | 检测电子烟气溶胶水提物对细胞炎症因子分泌量影响的方法 |
-
2019
- 2019-04-26 CN CN201910342200.8A patent/CN109988809A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102140489A (zh) * | 2011-01-24 | 2011-08-03 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 卷烟全烟气染毒的细胞毒性测试方法 |
| CN107828849A (zh) * | 2017-09-21 | 2018-03-23 | 云南中烟工业有限责任公司 | 检测电子烟气溶胶水提物对细胞炎症因子分泌量影响的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DAVID THORNE等: "The comparative in vitro assessment of e-cigarette and cigarette smoke aerosols using the gH2AX assay and applied dose measurements", 《TOXICOLOGY LETTERS》 * |
| E.BISHOP等: "An approach to testing undiluted e-cigarette aerosol in vitro using 3D reconstituted human airway epithelium", 《TOXICOLOGY IN VITRO》 * |
| LOUISE NEILSON等: "Development of an in vitro cytotoxicity model for aerosol exposure using 3D reconstructed human airway tissue; application for assessment of e-cigarette aerosol", 《TOXICOLOGY IN VITRO》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110702891A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-01-17 | 江西中烟工业有限责任公司 | 一种天然本草提取物对长期吸烟危害的减害作用的测试方法 |
| CN111351922A (zh) * | 2020-04-27 | 2020-06-30 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种体外抽吸烟气多通道暴露染毒方法 |
| CN111351922B (zh) * | 2020-04-27 | 2023-09-08 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种体外抽吸烟气多通道暴露染毒方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lerner et al. | Electronic cigarette aerosols and copper nanoparticles induce mitochondrial stress and promote DNA fragmentation in lung fibroblasts | |
| Li | In vitro toxicity testing of cigarette smoke based on the air-liquid interface exposure: A review | |
| Weber et al. | Comet assay and air–liquid interface exposure system: a new combination to evaluate genotoxic effects of cigarette whole smoke in human lung cell lines | |
| Su et al. | Sensors and analytical technologies for air quality: particulate matters and bioaerosols | |
| CN109988809A (zh) | 一种电子烟气溶胶的直接暴露体外毒性测试方法 | |
| CN102140489A (zh) | 卷烟全烟气染毒的细胞毒性测试方法 | |
| CN104726532A (zh) | 一种检测口含烟制品对细胞早期凋亡影响的方法 | |
| Chen et al. | Inhalation toxicology methods: the generation and characterization of exposure atmospheres and inhalational exposures | |
| Deschl et al. | Development of an in vitro exposure model for investigating the biological effects of therapeutic aerosols on human cells from the respiratory tract | |
| Patterson et al. | Cough-independent production of viable Mycobacterium tuberculosis in bioaerosol | |
| Steiner et al. | A new fluorescence-based method for characterizing in vitro aerosol exposure systems | |
| CN102735804B (zh) | 仅鼻拟人吸烟大鼠免疫功能评价指标的筛选方法 | |
| CN106556692B (zh) | 一种用于检测电子烟制品对细胞活性氧分泌影响的方法 | |
| CN106498021A (zh) | 一种检测口含烟制品对细胞炎症效应因子分泌量影响方法 | |
| CN107586822A (zh) | 一种检测电子烟气溶胶水提物细胞毒性的方法 | |
| Ritter et al. | Exposure of human lung cells to inhalable substances: a novel test strategy involving clean air exposure periods using whole diluted cigarette mainstream smoke | |
| CN106544393A (zh) | 一种检测电子烟制品对细胞炎症效应因子分泌量影响方法 | |
| CN109781982B (zh) | 一种赤星病孢子在线捕集检测方法及捕集检测系统 | |
| CN107828849A (zh) | 检测电子烟气溶胶水提物对细胞炎症因子分泌量影响的方法 | |
| CN107828851A (zh) | 检测电子烟气溶胶水提物对细胞活性氧分泌量影响的方法 | |
| CN107828850A (zh) | 一种针对电子烟气溶胶水提物的体外微核检测方法 | |
| Al-Awaida et al. | Structural characterization of rat ventricular tissue exposed to the smoke of two types of waterpipe | |
| CN111929115A (zh) | 一种加热卷烟烟气捕集装置和加热卷烟样品前处理方法 | |
| Wallaert et al. | Experimental systems for mechanistic studies of toxicant induced lung inflammation | |
| CN106434832A (zh) | 一种用于检测节球藻毒素生物毒性的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190709 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |