CN107586822A - 一种检测电子烟气溶胶水提物细胞毒性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测电子烟气溶胶水提物细胞毒性的方法。包括样品前处理、单细胞悬浮液制备、细胞浓度计算、细胞接种、加样和受试物分组、孵育受试物、染料孵育、吸光值测定、细胞存活率计算、绘制细胞存活率曲线等步骤。本发明综合考察了电子烟制品的使用特点和作用方式，建立了全新的样品前处理方法，选取人肺成纤维细胞HPF作为试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本发明方法能够准确有效的检测电子烟烟雾的气溶胶水提物的细胞毒性。

Description

一种检测电子烟气溶胶水提物细胞毒性的方法

技术领域

本发明属于烟草及烟草制品的安全性生物学评价技术领域，具体是涉及一种针对电子烟烟雾的气溶胶水提物检测其潜在细胞毒性的方法。

背景技术

中性红细胞毒性法和噻唑蓝法(MTT)具有简便、快捷、灵敏等特点，是目前应用较多的两种毒理学检测细胞毒性的方法。国际烟草科学研究合作中心CORESTA组织于2002年成立了卷烟烟气体外毒理测试工作组，经过大量的文献调研及研究工作，该工作组推荐采用中性红细胞毒性试验对卷烟烟气冷凝物潜在的细胞毒性进行检测，该检测方法目前已经被国内外烟草公司广泛采用。

烟草监管立法的日趋严格以及吸烟与健康研究的深入，导致了烟草公司寻求风险更低、无环境烟气的新型烟草制品。电子烟制品避免了传统卷烟制品燃烧时产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。电子烟使用过程中不燃烧，不产生烟气，其使用方式显著有别于传统卷烟。检测对象的改变导致样品的前处理方法、检测用细胞、检测剂量等出现很大差异，这些差异会对试验结果的准确性产生较大影响，现有的用于检测卷烟烟气细胞毒性的中性红细胞毒性法已经不能满足电子烟制品遗传毒性检测的需要。目前，国内外研究机构及烟草公司尚未有针对电子烟制品细胞毒性进行准确检测的有效方法。

电子烟制品通过电加热或者电子雾化方式使由烟碱、香味物质等组成的烟液转化为类似于卷烟烟雾的混合物，再将雾化后的丙三醇/尼古丁等混合“烟雾”传送至消费者，使人吸入剂量不等的尼古丁而获得类似于抽吸传统卷烟的生理感受。电子烟烟液经雾化后进入口腔和呼吸道，经由唾液及呼吸道粘液迁移作用于机体。而现有技术通常是直接对电子烟液本身进行分析测试，未考虑其抽吸时的形态、迁移等过程，导致分析测试的结果不能准确反应电子烟烟雾真实的细胞毒性。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测电子烟烟雾潜在细胞毒性的方法，以电子烟烟雾的气溶胶水提物作为检测基础，能够增强检测结果的准确性，进而更为有效地评价电子烟制品的安全性。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为体积百分数。

一种检测电子烟气溶胶水提物细胞毒性的方法，具体为以下步骤：

(1)样品前处理：

采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集电子烟烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，-80℃保存待用；

(2)单细胞悬浮液的制备：

人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm²细胞培养瓶中,加入10mLFM细胞培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：

用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)细胞接种：

将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，再按接种量为200μL/孔接种到96孔细胞培养板中，然后将96孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱内培养24h；

(5)加样，受试物分组：

移除96孔细胞培养板内的培养基，将受试物分为四组：空白组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；空白组不种植细胞，只加FM细胞培养基；细胞对照组种植细胞并加FM细胞培养基；阳性对照组加入200μg/mL的十二烷基硫酸钠200μl；检测样品组加入步骤(1)所得待测液，控制终浓度为10个非零剂量，分别为：10％待测液、20％待测液、30％待测液、40％待测液、50％待测液、60％待测液、70％待测液、80％待测液、90％待测液和100％待测液；用FM细胞培养基将细胞培养板中每孔的液体体积补足至200μl/孔；做8孔平行，为了避免边缘效应，数据统计时去除边缘2孔采用中间6孔的数据；

(6)孵育受试物：

将加样后的96孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h；

(7)染料孵育：

在孵育后的空白组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组中加入浓度为5mg/mL的MTT溶液，20μL/孔，再置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育4h后移除96孔细胞培养板中的液体，加入DMSO溶液200μL/孔，置于微板振荡器内振荡10min；

(8)测定吸光值：

将染料孵育后的空白组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组，用酶标仪在490nm波长下检测吸光值；

(9)计算细胞存活率：

根据所得吸光值，按照下列公式计算细胞存活率：

式中：

X——细胞存活率；

OD_n——检测样品组多孔平均的吸光值；

OD_o——空白组多孔平均的吸光值；

OD_c——细胞对照组多孔平均的吸光值；

(10)绘制细胞存活率曲线：

根据10个非零剂量及0剂量对应的细胞存活率绘制曲线，即可确定所检测的电子烟烟雾气溶胶水提物的细胞毒性。

本发明方法与现有技术相比，优点在于：综合考察了电子烟制品的使用特点和作用方式，建立了全新的电子烟制品烟雾前处理方法(气溶胶水提物捕集法)，且根据电子烟制品作用靶细胞选取人肺成纤维细胞HPF作为细胞毒性试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合电子烟的细胞毒性试验检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本发明方法能够准确有效地检测电子烟烟雾的气溶胶水提物的细胞毒性。

附图说明

图1为实施例1检测四种电子烟气溶胶水提物细胞毒性的细胞存活率曲线图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，但附图和实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所作出的变化或等同替换均应属于本发明的保护范围。

实施例1

配制4种电子烟烟液，以烟液雾化后的气溶胶水提物作为样品，检测其细胞毒性。

4种电子烟烟液分别为：1#、2#、3#、4#号烟液。4种电子烟烟液的烟碱及溶剂含量见表1。

表1.4种电子烟烟液主要成分

具体检测过程如下：

(1)样品前处理：

采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集电子烟烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，-80℃保存待用；

(2)单细胞悬浮液的制备：

人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm²细胞培养瓶中,加入10mLFM细胞培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：

用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)细胞接种：

将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，再按接种量为200μL/孔接种到96孔细胞培养板中，然后将96孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱内培养24h；

(5)加样，受试物分组：

移除96孔细胞培养板内的培养基，将受试物分为四组：空白组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；空白组不种植细胞，只加FM细胞培养基；细胞对照组种植细胞并加FM细胞培养基；阳性对照组加入200μg/mL的十二烷基硫酸钠200μl；检测样品组加入步骤(1)所得待测液，控制终浓度为10个非零剂量，分别为：10％待测液、20％待测液、30％待测液、40％待测液、50％待测液、60％待测液、70％待测液、80％待测液、90％待测液和100％待测液；用FM细胞培养基将细胞培养板中每孔的液体体积补足至200μl/孔；做8孔平行，为了避免边缘效应，数据统计时去除边缘2孔采用中间6孔的数据；

(6)孵育受试物：

将加样后的96孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h；

(7)染料孵育：

在孵育后的空白组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组中加入浓度为5mg/mL的MTT溶液，20μL/孔，再置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育4h后移除96孔细胞培养板中的液体，加入DMSO溶液200μL/孔，置于微板振荡器内振荡10min；

(8)测定吸光值：

将染料孵育后的空白组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组，用酶标仪在490nm波长下检测吸光值；

(9)计算细胞存活率：

根据所得吸光值，按照下列公式计算细胞存活率：

式中：

X——细胞存活率；

OD_n——检测样品组多孔平均的吸光值；

OD_o——空白组多孔平均的吸光值；

OD_c——细胞对照组多孔平均的吸光值；

(10)绘制细胞存活率曲线：

根据10个非零剂量及0剂量对应的细胞存活率绘制曲线，即可确定所检测的电子烟烟雾气溶胶水提物的细胞毒性。

由图1可以看出，在相同剂量下，待测试样品间比较，细胞存活率越高，细胞毒性越小。4种电子烟烟液对人肺成纤维细胞HPF细胞存活率与检测剂量间存在剂量效应关系，气溶胶水提物捕集法获得的4个电子烟受试样品间对细胞的细胞毒性有显著差异(p<0.05)，其中样品2#的细胞毒性在检测剂量范围内显著高于其余3个样品，样品4#的细胞细胞毒性在检测剂量范围内显著低于其余3个样品。由此可见，本方法能够有效的区分不同检测样品间的毒性差异。

气溶胶水提物捕集方法通过模拟人群抽吸模式及电子烟烟雾暴露途径，最大限度的反映真实抽吸状态，从而能够准确有效的检测电子烟烟雾的细胞毒性。

综上所述，本发明综合考察了电子烟制品的暴露途径，作用方式，建立了电子烟制品样品前处理方法，且根据电子烟制品作用靶细胞选取了人肺成纤维细胞HPF作为电子烟制品细胞毒性试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合电子烟制品的细胞毒性试验检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测电子烟烟雾的气溶胶水提物的细胞毒性。

Claims (1)

1.一种检测电子烟气溶胶水提物细胞毒性的方法，具体为以下步骤：

(1)样品前处理：

采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集电子烟烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，-80℃保存待用；

(2)单细胞悬浮液的制备：

人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm²细胞培养瓶中,加入10mLFM细胞培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：

用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)细胞接种：

将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，再按接种量为200μL/孔接种到96孔细胞培养板中，然后将96孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱内培养24h；

(5)加样，受试物分组：

移除96孔细胞培养板内的培养基，将受试物分为四组：空白组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；空白组不种植细胞，只加FM细胞培养基；细胞对照组种植细胞并加FM细胞培养基；阳性对照组加入200μg/mL的十二烷基硫酸钠200μl；检测样品组加入步骤(1)所得待测液，控制终浓度为10个非零剂量，分别为：10％待测液、20％待测液、30％待测液、40％待测液、50％待测液、60％待测液、70％待测液、80％待测液、90％待测液和100％待测液；用FM细胞培养基将细胞培养板中每孔的液体体积补足至200μl/孔；做8孔平行，为了避免边缘效应，数据统计时去除边缘2孔采用中间6孔的数据；

(6)孵育受试物：

将加样后的96孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h；

(7)染料孵育：

在孵育后的空白组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组中加入浓度为5mg/mL的MTT溶液，20μL/孔，再置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育4h后移除96孔细胞培养板中的液体，加入DMSO溶液200μL/孔，置于微板振荡器内振荡10min；

(8)测定吸光值：

将染料孵育后的空白组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组，用酶标仪在490nm波长下检测吸光值；

(9)计算细胞存活率：

根据所得吸光值，按照下列公式计算细胞存活率：

<mrow> <mi>X</mi> <mo>=</mo> <mfrac> <mrow> <mi>O</mi> <mi>D</mi> <mi>n</mi> <mo>-</mo> <mi>O</mi> <mi>D</mi> <mi>o</mi> </mrow> <mrow> <mi>O</mi> <mi>D</mi> <mi>c</mi> <mo>-</mo> <mi>O</mi> <mi>D</mi> <mi>o</mi> </mrow> </mfrac> <mo>&amp;times;</mo> <mn>100</mn> <mi>%</mi> </mrow>

式中：

X——细胞存活率；

OD_n——检测样品组多孔平均的吸光值；

OD_o——空白组多孔平均的吸光值；

OD_c——细胞对照组多孔平均的吸光值；

(10)绘制细胞存活率曲线：

根据10个非零剂量及0剂量对应的细胞存活率绘制曲线，即可确定所检测的电子烟烟雾气溶胶水提物的细胞毒性。