CN106498021A - 一种检测口含烟制品对细胞炎症效应因子分泌量影响方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种检测口含烟制品对细胞炎症效应因子分泌量影响方法，包括以下步骤：(1)受试物的前处理；(2)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的制备；(3)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算；(4)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞接种；(5)受试物的分组；(6)受试物检测剂量的设定；(7)受试物培养品的制备；(8)受试物的孵育；(9)受试物孵育品的收集；(10)标准溶液配制；(11)添加待测样；(12)添加抗体；(13)添加结合液；(14)显色；(15)测量吸光值；(16)细胞因子分泌量测定。本发明的方法能够准确有效的检测卷烟烟气总粒相物对细胞炎症效应因子分泌影响。
Description
技术领域
本发明属于烟草制品生物学效应评价技术领域，特别涉及一种检测口含烟制品对细胞炎症效应因子分泌影响的方法。
背景技术
随着人们对健康的关注越来越高，对烟草产品提出了更高的要求，不但要有较好的口感，而且要尽可能的减少人体的不良感受。口含烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。根据产品的组分及形态特点，口含烟制品分为传统含烟叶原料的Snus型口含烟制品和不含烟叶原料的新型口含烟制品(如烟草含片)。口含烟研发人员在产品配方设计初期将不同组份按照不同比例组合调配，形成具有不同风格的初选配方，再结合化学评价和感官评价对配方进行不断筛选调整形成最终的产品配方。然而初选配方数量众多，全部进行感官评价耗时耗力，且感官评价侧重于对产品的风格口感进行筛选，如何利用生物学测试指标对产品初选配方进筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方，目前尚属探索阶段，无统一的标准方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测口含烟制品对细胞炎症效应因子分泌量影响方法，为电子烟制品的安全性评估提供参考。
一种检测口含烟制品对细胞炎症效应因子分泌量影响方法，包括以下步骤：
(1)受试物的前处理；
(2)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的制备；
(3)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算；
(4)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞接种；
(5)受试物的分组；
(6)受试物检测剂量的设定；
(7)受试物培养品的制备；
(8)受试物的孵育；
(9)受试物孵育品的收集；
(10)标准溶液配制；
(11)添加待测样；
(12)添加抗体；
(13)添加结合液；
(14)显色；
(15)测量吸光值；
(16)细胞因子分泌量测定。
本发明优选的实施方案中，上述的方法，包括以下具体步骤：
(1)受试物的前处理：准确称取1.0g口含烟制品，加入30mL无血清培养基，于37℃下，静置24h萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌，得到待测液；
(2)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的制备：人口腔角质细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约1-2min，用口腔角质口腔角质细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)人口腔角质细胞HOK单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人口腔角质细胞单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)人口腔角质细胞HOK单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人口腔角质细胞单细胞悬浮液加入口腔角质细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为1mL/孔，接种到12孔细胞培养板中，将12孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱内培养24h；
(5)受试物的分组：将受试物分为两组：细胞对照组和检测样品组；各组的构成为：细胞对照组为OKM细胞生长培养基上种植人口腔角质细胞；检测样品组为在OKM细胞生长培养基上种植人口腔角质细胞并添加受试物；
(6)受试物检测剂量的设定：将受试物，即口含烟样品萃取液设5个非零剂量，分别为：12.5％样品萃取液、25％样品萃取液、50％样品萃取液、75％样品萃取液、100％样品萃取液；
(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中12孔细胞培养板内的口腔角质细胞培养基，再按步骤(5)进行分组，各组的构成为：细胞对照组为OKM细胞培养基+人口腔角质细胞；检测样品组为OKM细胞培养基+人口腔角质细胞+受试物，并使检测样品组的最终浓度分别为步骤(6)设定的剂量；并且2组培养品用口腔角质细胞培养基将每孔中的液体体积补足到1mL/孔；
(8)受试物的孵育：将步骤(7)加样后的12孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱中孵育24h；
(9)受试物孵育品的收集：吸取步骤(8)细胞板中的上清液，离心20min，转速1000rpm，取上清液待测；
(10)标准溶液配制：梯度稀释法配制炎症效应因子的标准曲线溶液；
(11)添加待测样：空白对照孔加蒸馏水100μL，其余孔分别加步骤(10)配制的标准品或步骤(9)获得的待测样品100μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育90分钟；
(12)添加抗体：将步骤(11)中的固液进行分离，取分离的液体，甩干，每孔加入抗体工作液100μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育60分钟；
(13)添加结合液：将步骤(12)中的固液进行分离，取分离的液体，甩干，用磷酸盐缓冲液洗板三次，每次浸泡大约2分钟，350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干，每孔加酶结合工作液100μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育30分钟；
(14)显色：将步骤(13)中的固液进行分离，取分离的液体，甩干，用清洗液洗板五次，每次浸泡大约2分钟，350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干，每孔加底物工作液90μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育，观察每孔颜色变化，加入终止液50μL/孔；
(15)测量吸光值：于酶标仪450nm下检测吸光度；
(16)细胞因子分泌量测定：根据标准溶液吸光度值绘制标准曲线，计算细胞因子分泌量。
本发明优选的实施方案中，步骤(10)中的标准曲线溶液的配制过程为：将抗体用抗体工作液配制成相应浓度，其中IL-6标准曲线范围为0-500pg/mL，IL-8标准曲线范围为0-2000pg/mL,IL-10标准曲线范围为0-500pg/mL，TGF-β1标准曲线范围为0-2000pg/mL，TNF-α标准曲线范围为0-500pg/mL，GM-CSF标准曲线范围为0-500pg/mL，抗体购买于伊莱瑞特公司。
本发明优选的实施方案中，步骤(12)中的抗体工作液为商品化商品，能够在市场上购买伊莱瑞特公司。
本发明优选的实施方案中，步骤(13)中的酶结合工作液属于商品化商品，能够在市场上购买于伊莱瑞特公司。
本发明优选的实施方案中，步骤(5)中所述的OKM细胞为Oral KeratinocyteMedium细胞。
本发明有益效果：
本发明对口含烟制品细胞炎症效应因子分泌影响进行了综合研究，确定了口含烟制品的检测剂量，以及口含烟制品前处理方法，制定了一种适用于检测口含烟制品对细胞炎症效应因子分泌影响的方法。本发明对样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测不同口含烟制品对细胞炎症效应因子分泌影响。
附图说明
图1为6种口含烟产品对HOK细胞IL-6细胞因子分泌的影响；
图2为6种口含烟产品对HOK细胞IL-8细胞因子分泌的影响；
图3为6种口含烟产品对HOK细胞IL-10细胞因子分泌的影响；
图4为6种口含烟产品对HOK细胞TGF-β1细胞因子分泌的影响；
图5为6种口含烟产品对HOK细胞TNF-α细胞因子分泌的影响；
图6为6种口含烟产品对HOK细胞GM-CSF细胞因子分泌的影响；
具体实施方式
下面将结合具体实例对本发明做详细描述，但并不限制本发明。
本实施例针对6种国外市售口含烟产品对人口腔角质细胞IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β1、TNF-α、GM-CSF六个炎症效应因子分泌量的影响测试。
本实施例包括如下具体步骤：
(1)受试物的前处理：准确称取1.0g口含烟制品，加入30mL无血清培养基，于37℃下，静置24h萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌，得到待测液；
(2)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的制备：人口腔角质细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约1-2min，用口腔角质口腔角质细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人口腔角质细胞单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人口腔角质细胞单细胞悬浮液加入口腔角质细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为1mL/孔，接种到12孔细胞培养板中，将12孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱内培养24h；
(5)受试物的分组：将受试物分为两组：细胞对照组和检测样品组；各组的构成为：细胞对照组为OKM细胞生长培养基上种植人口腔角质细胞；检测样品组为在OKM细胞生长培养基上种植人口腔角质细胞并添加受试物；
(6)受试物检测剂量的设定：将受试物，即口含烟样品萃取液设5个非零剂量，分别为：12.5％样品萃取液、25％样品萃取液、50％样品萃取液、75％样品萃取液、100％样品萃取液；
(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中12孔细胞培养板内的口腔角质细胞培养基，再按步骤(5)进行分组，各组的构成为：细胞对照组为OKM细胞培养基+人口腔角质细胞；检测样品组为OKM细胞培养基+人口腔角质细胞+受试物，并使检测样品组的最终浓度分别为步骤(6)设定的剂量；并且2组培养品用口腔角质细胞培养基将每孔中的液体体积补足到1mL/孔；
(8)受试物的孵育：将步骤(7)加样后的12孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱中孵育24h；
(9)受试物孵育品的收集：吸取步骤(8)细胞板中的上清液，离心20min，转速1000rpm，取上清液待测；
(10)标准溶液配制：梯度稀释法配制炎症效应因子的标准曲线溶液；
(11)添加待测样：空白对照孔加蒸馏水100μL，其余孔分别加步骤(10)配制的标准品或步骤(9)获得的待测样品100μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育90分钟；
(12)添加抗体：将步骤(11)中的固液进行分离，取分离的液体，甩干，每孔加入抗体工作液100μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育60分钟；
(13)添加结合液：将步骤(12)中的固液进行分离，取分离的液体，甩干，用磷酸盐缓冲液洗板三次，每次浸泡大约2分钟，350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干，每孔加酶结合工作液100μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育30分钟；
(14)显色：将步骤(13)中的固液进行分离，取分离的液体，甩干，用清洗液洗板五次，每次浸泡大约2分钟，350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干，每孔加底物工作液90μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育，观察每孔颜色变化，加入终止液50μL/孔；
(15)测量吸光值：于酶标仪450nm下检测吸光度；
(16)细胞因子分泌量测定：根据标准溶液吸光度值绘制标准曲线，计算细胞因子分泌量。
结果如图1-6所示，由试验结果可以看出，在本发明方法给出的样品处理方法、检测剂量条件下，样品1#、2#、3#、4#、5#、6#在检测剂量范围内对HOK细胞IL-6炎症效应因子的分泌量存在影响，且有剂量效应关系，6个样品的非零剂量与0剂量组相比存在显著差异(p<0.05)，且3#、4#样品与1#、2#、5#、6#样品相比存在显著差异(p<0.05)；而对HOK细胞IL-8、IL-10、TGF-β1、TNF-α、GM-CSF炎症效应因子的分泌量无影响，且与0剂量组相比无显著差异(p>0.05)；以上结果显示不同的口含烟产品对HOK细胞不同的炎症效应因子的分泌量的影响存在差异。
Claims (2)
1.一种检测口含烟制品对细胞炎症效应因子分泌量影响方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)受试物的前处理；
(2)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的制备；
(3)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算；
(4)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞接种；
(5)受试物的分组；
(6)受试物检测剂量的设定；
(7)受试物培养品的制备；
(8)受试物的孵育；
(9)受试物孵育品的收集；
(10)标准溶液配制；
(11)添加待测样；
(12)添加抗体；
(13)添加结合液；
(14)显色；
(15)测量吸光值；
(16)细胞因子分泌量测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
(1)受试物的前处理：准确称取1.0g口含烟制品，加入30mL无血清培养基，于37℃下，静置24h萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌，得到待测液；
(2)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的制备：人口腔角质细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约1-2min，用口腔角质口腔角质细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人口腔角质细胞单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)人口腔角质细胞单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人口腔角质细胞单细胞悬浮液加入口腔角质细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为1mL/孔，接种到12孔细胞培养板中，将12孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱内培养24h；
(5)受试物的分组：将受试物分为两组：细胞对照组和检测样品组；各组的构成为：细胞对照组为OKM细胞生长培养基上种植人口腔角质细胞；检测样品组为在OKM细胞生长培养基上种植人口腔角质细胞并添加受试物；
(6)受试物检测剂量的设定：将受试物，即口含烟样品萃取液设5个非零剂量，分别为：12.5％样品萃取液、25％样品萃取液、50％样品萃取液、75％样品萃取液、100％样品萃取液；
(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中12孔细胞培养板内的口腔角质细胞培养基，再按步骤(5)进行分组，各组的构成为：细胞对照组为OKM细胞培养基+人口腔角质细胞；检测样品组为OKM细胞培养基+人口腔角质细胞+受试物，并使检测样品组的最终浓度分别为步骤(6)设定的剂量；并且2组培养品用口腔角质细胞培养基将每孔中的液体体积补足到1mL/孔；
(8)受试物的孵育：将步骤(7)加样后的12孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱中孵育24h；
(9)受试物孵育品的收集：吸取步骤(8)细胞板中的上清液，离心20min，转速1000rpm，取上清液待测；
(10)标准溶液配制：梯度稀释法配制炎症效应因子的标准曲线溶液；
(11)添加待测样：空白对照孔加蒸馏水100μL，其余孔分别加步骤(10)配制的标准品或步骤(9)获得的待测样品100μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育90分钟；
(12)添加抗体：将步骤(11)中的固液进行分离，取分离的液体，甩干，每孔加入抗体工作液100μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育60分钟；
(13)添加结合液：将步骤(12)中的固液进行分离，取分离的液体，甩干，用磷酸盐缓冲液洗板三次，每次浸泡大约2分钟，350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干，每孔加酶结合工作液100μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育30分钟；
(14)显色：将步骤(13)中的固液进行分离，取分离的液体，甩干，用清洗液洗板五次，每次浸泡大约2分钟，350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干，每孔加底物工作液90μL，盖酶标板覆膜，37℃孵育，观察每孔颜色变化，加入终止液50μL/孔；
(15)测量吸光值：于酶标仪450nm下检测吸光度；
(16)细胞因子分泌量测定：根据标准溶液吸光度值绘制标准曲线，计算细胞因子分泌量。
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| CN201611055891.6A CN106498021A (zh) | 2016-11-25 | 2016-11-25 | 一种检测口含烟制品对细胞炎症效应因子分泌量影响方法 |
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|---|---|
| CN106498021A true CN106498021A (zh) | 2017-03-15 |
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ID=58327508
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| CN201611055891.6A Pending CN106498021A (zh) | 2016-11-25 | 2016-11-25 | 一种检测口含烟制品对细胞炎症效应因子分泌量影响方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20170315 |