CN107828850A - 一种针对电子烟气溶胶水提物的体外微核检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种针对电子烟气溶胶水提物的体外微核检测方法。包括样品前处理、单细胞悬浮液制备、细胞浓度计算、细胞接种、加样和受试物分组、孵育受试物、收获细胞、低渗、滴片、染色、微核观察、结果判定等步骤。本发明综合考察了电子烟制品的使用特点和作用方式，建立了全新的样品前处理方法，选取人肺成纤维细胞HPF作为试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本发明方法能够准确有效的检测电子烟气溶胶水提物对细胞微核率的影响程度，进而确定电子烟制品的遗传毒性。

Description

一种针对电子烟气溶胶水提物的体外微核检测方法

技术领域

本发明属于烟草及烟草制品的安全性生物学评价技术领域，具体是涉及一种针对电子烟烟雾的气溶胶水提物，检测其对细胞微核率的影响程度，进而确定其遗传毒性的方法。

背景技术

微核试验检测终点明确，且方法简便，易于开展，是遗传毒性标准组合试验之一，在食品、医药产品、工农业产品等健康相关产品的安全评价、遗传损害的监测、特定人群的突变损伤检测和早期预报等方面得到了广泛的应用。2009年经济合作与发展组织(OECD)公布了哺乳动物体外微核试验指导文件，初步建立了哺乳动物体外微核试验的统一标准。国际烟草科学研究合作中心CORESTA组织于2002年成立了卷烟烟气体外毒理测试工作组，经过工作组大量的文献调研及研究工作，该工作组推荐采用体外微核试验对卷烟烟气冷凝物潜在的遗传毒性进行检测。该检测方法目前已经被国内外烟草公司广泛采用。

烟草监管立法的日趋严格以及吸烟与健康研究的深入，导致了烟草公司寻求风险更低、无环境烟气的新型烟草制品，电子烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。电子烟制品其使用过程中通过电加热或者电子雾化方式使由烟碱、香味物质等组成的液体转化为类似于卷烟烟雾的混合物，再将汽化丙三醇/尼古丁等混合“烟雾”传送至消费者，使人吸入剂量不等的尼古丁而获得类似于抽吸传统卷烟的生理感受。使用过程中不产生烟气，其使用方式显著有别于传统卷烟，检测对象的改变导致样品前处理方法、检测用细胞、检测剂量也有所不同，用于检测传统卷烟遗传毒性的体外微核试验已不能满足电子烟制品遗传毒性检测的需要，且目前国内外研究机构及烟草公司尚未制定电子烟制品体外微核试验的标准方法。

电子烟制品通过电加热或者电子雾化方式使由烟碱、香味物质等组成的烟液转化为类似于卷烟烟雾的混合物，再将雾化后的丙三醇/尼古丁等混合“烟雾”传送至消费者，使人吸入剂量不等的尼古丁而获得类似于抽吸传统卷烟的生理感受。电子烟烟液经雾化后进入口腔和呼吸道，经由唾液及呼吸道粘液迁移作用于机体。而现有技术通常是直接对电子烟液本身进行分析测试，未考虑其抽吸时的形态、迁移等过程，导致分析测试的结果不能准确反应电子烟烟雾真实的遗传毒性。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种针对电子烟烟雾的气溶胶水提物的体外微核检测方法。通过检测气溶胶水提物对细胞微核率的影响程度，以确定电子烟制品的遗传毒性。能够增强检测结果的准确性，进而更为有效地评价电子烟制品的安全性。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为体积百分数。

一种针对电子烟气溶胶水提物的体外微核检测方法，具体为以下步骤：

(1)样品前处理：

采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，-80℃保存待用；

(2)单细胞悬浮液的制备：

人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm²细胞培养瓶中,加入10mLFM细胞培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：

用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)细胞接种：

将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，再按接种量为2mL/孔接种到6孔细胞培养板中，然后将6孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱内培养24h；

(5)加样，受试物分组：

移除6孔细胞培养板内的培养基，将受试物分为三组：细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；细胞对照组种植细胞并加FM细胞培养基；阳性对照组加入1mg/mL的环磷酰胺溶液0.5μl；检测样品组加入步骤(1)所得待测液，控制终浓度为4组非零剂量，分别为：12.5％待测液、25％待测液、50％待测液和100％待测液；细胞对照组、阳性对照组和检测样品组均加入1mg/mL的细胞松弛素B溶液6μl；用FM细胞培养基将细胞培养板中每孔的液体体积补足至2mL/孔；

(6)孵育受试物：

将加样后的6孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h；

(7)收获细胞：

加入浓度0.25％(W/V)的胰蛋白酶溶液将细胞从6孔细胞培养板的孔内消化下来；

(8)低渗：

将消化后收获的细胞置于离心管内，离心机离心5min，转速1000rpm，取出离心管并移除上清液，加入氯化钾溶液3mL并轻轻吹打细胞，混匀后立刻加入甲醇冰醋酸溶液2mL，置于离心机上离心5min，转速1000rpm；

(9)滴片：

取出离心管并移除上清液，加入300μl甲醇冰醋酸溶液，轻轻吹打使之形成细胞悬浮液，将细胞悬浮液滴在载玻片上，并放置于玻片架上自然晾干，每个检测剂量滴3张玻片；

(10)染色：

将晾干后的玻片放置于Gimsa染液中染色15min后，用水冲洗玻片并将其放置于玻片架上自然晾干后保存备用；

(11)微核的观察：

取染色后所得微核玻片，选择良好且细胞密度适宜的视野，观察1000个双核细胞计数微核率，选择观察的双核细胞应为细胞质保存完好，细胞膜边界清晰，细胞核相互分开，微核易于分辨；

(12)结果判定：

将检测样品组与细胞对照组相比，微核率有显著性增加并有剂量反应关系的即可确认为阳性结果；若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验，能重复者可确定为阳性。

本发明方法与现有技术相比，优点在于：综合考察了电子烟制品的使用特点和作用方式，建立了全新的电子烟烟雾样品前处理方法(捕集瓶捕集法)，且根据电子烟制品作用靶细胞选取人肺成纤维细胞HPF作为电子烟制品遗传毒性试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合电子烟制品的遗传毒性试验检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本发明方法能够准确有效地检测电子烟烟雾的气溶胶水提物对细胞微核率的影响程度，进而确定电子烟制品的遗传毒性。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步的详细说明，但实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所作出的变化或等同替换均应属于本发明的保护范围。

实施例1

配制3种电子烟烟液，以捕集瓶捕集到的气溶胶水提物作为前处理样品，检测其遗传毒性。

3种电子烟烟液分别为：1#、2#、3#烟液。3种电子烟烟液的烟碱及溶剂含量见表1。

表1. 3种电子烟烟液主要成分

具体检测过程如下：

(1)样品前处理：

采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，-80℃保存待用；

(2)单细胞悬浮液的制备：

人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm²细胞培养瓶中,加入10mLFM细胞培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：

用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)细胞接种：

将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，再按接种量为2mL/孔接种到6孔细胞培养板中，然后将6孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱内培养24h；

(5)加样，受试物分组：

移除6孔细胞培养板内的培养基，将受试物分为三组：细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；细胞对照组种植细胞并加FM细胞培养基；阳性对照组加入1mg/mL的环磷酰胺溶液0.5μl；检测样品组加入步骤(1)所得待测液，控制终浓度为4组非零剂量，分别为：12.5％待测液、25％待测液、50％待测液和100％待测液；细胞对照组、阳性对照组和检测样品组均加入1mg/mL的细胞松弛素B溶液6μl；用FM细胞培养基将细胞培养板中每孔的液体体积补足至2mL/孔；

(6)孵育受试物：

将加样后的6孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h；

(7)收获细胞：

加入浓度0.25％(W/V)的胰蛋白酶溶液将细胞从6孔细胞培养板的孔内消化下来；

(8)低渗：

将消化后收获的细胞置于离心管内，离心机离心5min，转速1000rpm，取出离心管并移除上清液，加入氯化钾溶液3mL并轻轻吹打细胞，混匀后立刻加入甲醇冰醋酸溶液2mL，置于离心机上离心5min，转速1000rpm；

(9)滴片：

取出离心管并移除上清液，加入300μl甲醇冰醋酸溶液，轻轻吹打使之形成细胞悬浮液，将细胞悬浮液滴在载玻片上，并放置于玻片架上自然晾干，每个检测剂量滴3张玻片；

(10)染色：

将晾干后的玻片放置于Gimsa染液中染色15min后，用水冲洗玻片并将其放置于玻片架上自然晾干后保存备用；

(11)微核的观察：

取染色后所得微核玻片，选择良好且细胞密度适宜的视野，观察1000个双核细胞计数微核率，选择观察的双核细胞应为细胞质保存完好，细胞膜边界清晰，细胞核相互分开，微核易于分辨；

(12)结果判定：

将检测样品组与细胞对照组相比，微核率有显著性增加并有剂量反应关系的即可确认为阳性结果；若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验，能重复者可确定为阳性。

表2 电子烟溶剂气溶胶(捕集瓶捕集法)体外微核试验检测结果

由表2可以看出，阳性对照微核率与细胞对照微核率之间有显著差异，证明此次试验成功。而3种电子烟烟液对人肺成纤维细胞HPF细胞的微核率不存在剂量效应关系，受试的3种电子烟烟液无遗传毒性。

捕集瓶捕集方法通过模拟抽吸模式及电子烟烟雾暴露方式最大限度地反映了真实抽吸状态，从而能够准确有效地检测电子烟气溶胶水提物的遗传毒性。

综上所述，本发明综合考察了电子烟制品的暴露途径，作用方式，建立了电子烟制品样品前处理方法，且根据电子烟制品作用靶细胞选取了人肺成纤维细胞HPF作为电子烟制品遗传毒性试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合电子烟制品的遗传毒性试验检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测电子烟气溶胶水提物对细胞微核率的影响程度，进而确定电子烟制品的遗传毒性。

Claims (1)

1.一种针对电子烟气溶胶水提物的体外微核检测方法，具体为以下步骤：

(1)样品前处理：

采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，-80℃保存待用；

(2)单细胞悬浮液的制备：

人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm²细胞培养瓶中,加入10mLFM细胞培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：

用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)细胞接种：

将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，再按接种量为2mL/孔接种到6孔细胞培养板中，然后将6孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱内培养24h；

(5)加样，受试物分组：

移除6孔细胞培养板内的培养基，将受试物分为三组：细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；细胞对照组种植细胞并加FM细胞培养基；阳性对照组加入1mg/mL的环磷酰胺溶液0.5μl；检测样品组加入步骤(1)所得待测液，控制终浓度为4组非零剂量，分别为：12.5％待测液、25％待测液、50％待测液和100％待测液；细胞对照组、阳性对照组和检测样品组均加入1mg/mL的细胞松弛素B溶液6μl；用FM细胞培养基将细胞培养板中每孔的液体体积补足至2mL/孔；

(6)孵育受试物：

将加样后的6孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h；

(7)收获细胞：

加入浓度0.25％(W/V)的胰蛋白酶溶液将细胞从6孔细胞培养板的孔内消化下来；

(8)低渗：

将消化后收获的细胞置于离心管内，离心机离心5min，转速1000rpm，取出离心管并移除上清液，加入氯化钾溶液3mL并轻轻吹打细胞，混匀后立刻加入甲醇冰醋酸溶液2mL，置于离心机上离心5min，转速1000rpm；

(9)滴片：

取出离心管并移除上清液，加入300μl甲醇冰醋酸溶液，轻轻吹打使之形成细胞悬浮液，将细胞悬浮液滴在载玻片上，并放置于玻片架上自然晾干，每个检测剂量滴3张玻片；

(10)染色：

将晾干后的玻片放置于Gimsa染液中染色15min后，用水冲洗玻片并将其放置于玻片架上自然晾干后保存备用；

(11)微核的观察：

取染色后所得微核玻片，选择良好且细胞密度适宜的视野，观察1000个双核细胞计数微核率，选择观察的双核细胞应为细胞质保存完好，细胞膜边界清晰，细胞核相互分开，微核易于分辨；

(12)结果判定：

将检测样品组与细胞对照组相比，微核率有显著性增加并有剂量反应关系的即可确认为阳性结果；若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验，能重复者可确定为阳性。