CN106546722A - 一种用于检测电子烟制品对细胞微核率影响的方法 - Google Patents

一种用于检测电子烟制品对细胞微核率影响的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于检测电子烟制品对细胞微核率影响的方法，包括如下步骤：受试物前处理、人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备、人肺成纤维细胞单细胞悬浮液浓度计算、人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种、受试物分组、受试物检测剂量的设定、受试物培养品的制备、受试物培养品的低渗、受试物培养品滴片的制备等步骤。本发明综合考察电子烟制品的使用特点、作用方式，建立了电子烟制品样品前处理方法，且根据电子烟制品作用靶细胞选取了人肺成纤维细胞作为电子烟制品细胞毒性试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合电子烟制品的体外微核试验检测方法。

Description

一种用于检测电子烟制品对细胞微核率影响的方法
技术领域
本发明属于生物技术应用领域，特别涉及一种用于检测电子烟制品对细胞微核率影响的方法。
背景技术
微核试验检测终点明确，且方法简便，易于开展，是遗传毒性标准组合试验之一，在食品、医药产品、工农业产品、等健康相关产品的安全评价、遗传损害的监测、特定人群的突变损伤检测和早期预报等方面得到了广泛的应用。2009年经济合作与发展组织(OECD)公布了哺乳动物体外微核试验指导文件，初步建立了哺乳动物体外微核试验的统一标准。国际烟草科学研究合作中心CORESTA组织于2002年成立了卷烟烟气体外毒理测试工作组，经过工作组大量的文献调研及研究工作，该工作组推荐采用体外微核试验对卷烟烟气冷凝物潜在的遗传毒性进行检测。该检测方法目前已经被国内外烟草公司广泛采用。
烟草监管立法的日趋严格以及吸烟与健康研究的深入，导致了烟草公司寻求风险更低、无环境烟气的新型烟草制品，电子烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。电子烟制品其使用过程中通过电加热或者电子雾化方式使由烟碱、香味物质等组成的液体转化为类似于卷烟烟雾的混合物，再将汽化丙三醇/尼古丁等混合“烟雾”传送至消费者，使人吸入剂量不等的尼古丁而获得类似于抽吸传统卷烟的生理感受。使用过程中不产生烟气，其使用方式显著有别于传统卷烟，检测对象的改变导致样品前处理方法、检测用细胞、检测剂量也有所不同，用于检测传统卷烟遗传毒性的体外微核试验不能满足电子烟制品遗传毒性检测的需要，且目前国内外研究机构及烟草公司尚未制定电子烟制品体外微核试验的标准方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测电子烟制品对细胞微核率影响的方法，为电子烟制品的安全性评估提供参考。
本发明公开一种用于检测电子烟制品对细胞微核率影响的方法，包括以下步骤：
(1)受试物的前处理；
(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备；
(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算；
(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种；
(5)受试物的分组；
(6)受试物检测剂量的设定；
(7)受试物培养品的制备；
(8)受试物培养品的低渗；
(9)受试物培养品滴片的制备；
(10)受试物培养品滴片的染色；
(11)受试物培养品的微核观察；
(12)受试物培养品的结果判定。
本发明优选的实施方案中，包括以下具体步骤：
(1)受试物的前处理：吸取一定量的电子烟原液，按照电子烟原液与无血清细胞培养基的体积比为10～90％的比例进行混合稀释后，放置24h-48h，无菌过滤器过滤除菌，得到待测液，-80℃保存待用；
(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备：人肺成纤维细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约1-2min，用成纤维成纤维细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人肺成纤维细胞单细胞悬浮液加入成纤维细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为2mL/孔，接种到6孔细胞培养板中，将6孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱内培养24h；
(5)受试物的分组：将受试物分为三组：细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；各组的构成为：细胞对照组只加成纤维细胞培养基；阳性对照组为在成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞并添加环磷酰胺溶液；检测样品组为在成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞并添加受试物；
(6)受试物检测剂量的设定：根据细胞毒性测定的IC50值设定检测剂量，将受试物，即电子烟原液分为4个非零剂量：IC50、1/2IC50、1/4IC50、1/8IC50；
(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中6孔细胞培养板内的成纤维细胞培养基，再按步骤(5)进行分组，各组的构成为：细胞对照组只加成纤维细胞培养基；阳性对照组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞+环磷酰胺溶液；检测样品组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞+受试物，每孔总体积为2mL，将加好样的6孔板置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养24h，之后加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液将细胞从6孔细胞培养板的孔内消化下来，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；
(8)受试物培养品的低渗：将步骤(7)收集的受试物培养品置于离心管内，离心机离心5min，转速1000rpm，取出离心管并移除上清液，加入氯化钾溶液3mL并轻轻吹打细胞，混匀后立刻加入甲醇冰醋酸溶液2mL，置于离心机上离心5min，转速1000rpm；
(9)受试物培养品滴片制备：取出步骤(8)中的离心管并移除大部分上清液，留少许上清液并轻轻吹打使之形成细胞悬浮液，将细胞悬浮液滴在载玻片上，并放置于玻片架上自然晾干，每一孔滴3张玻片；
(10)受试物培养品滴片的染色：将步骤(9)晾干后的玻片放置于新配制的Gimsa染液中染色15min后，用自来水冲洗玻片并将其放置于玻片架上自然晾干后保存备用；
(11)受试物培养品微核的观察：根据步骤(10)所得到的微核玻片，选择良好且细胞密度适宜的视野，观察1000个双核细胞计数微核率，选择观察的双核细胞应为细胞质保存完好，细胞膜边界清晰，细胞核相互分开，微核易于分辨；
(12)受试物培养品结果判定：将受试物培养品与对照组相比，微核率有显著性增加并有剂量反应关系，即可确认为阳性结果；若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验，能重复者可确定为阳性。
本发明优选的实施方案中，IC50为是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度。它能指示某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物程序(或者是包含在此程序中的某些物质，比如酶，细胞受体或是微生物)的半量。在凋亡方面，可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50％，该浓度称为50％抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50％时所对应的浓度，IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低，当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。
本发明优选的实施方案中，步骤(1)中受试物的前处理方法还可以为剑桥滤片捕集法：
采用直线型吸烟机，连续抽吸100口电子烟，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前，抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照如下公式(1)计算电子烟总粒相物的质量mTPM，电子烟总粒相物的英文名称为Total particulate matter，简称TPM：
mTPM＝m1-m0 (1)
式中：
m0：抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；
m1：抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；
捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入三角瓶中，加入二甲基亚砜，使电子烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/mL；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1ml冻存管中，-80℃保存待用。
本发明优选的实施方案中，步骤(1)中受试物的前处理方法还可以为全烟气暴露瓶捕集法：
采用直线型吸烟机，连续抽吸100口电子烟，采用装有无血清细胞培养基的全烟气暴露瓶捕集，捕集浓度为20口/mL，捕集后用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到待测液，-80℃保存待用。
本发明优选的实施方案中，步骤(10)Gimsa染液购买于索莱宝公司。
本发明有益效果：
综合考察电子烟制品的使用特点，作用方式，建立了电子烟制品样品前处理方法，且根据电子烟制品作用靶细胞选取了人肺成纤维细胞作为电子烟制品体外微核试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合电子烟制品的体外微核试验检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测电子烟制品对细胞微核率的影响。
具体实施方式
本实施例针对4种国外市售电子烟原液对人肺成纤维细胞微核测试如下：
(1)受试物的前处理：吸取一定量的电子烟原液，按照电子烟原液与无血清细胞培养基的体积比为70％的比例进行混合稀释后，放置32h，无菌过滤器过滤除菌，得到待测液，-80℃保存待用；
(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备：人肺成纤维细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约2min，用成纤维成纤维细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人肺成纤维细胞单细胞悬浮液加入成纤维细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为2mL/孔，接种到6孔细胞培养板中，将6孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱内培养24h；
(5)受试物的分组：将受试物分为三组：细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；各组的构成为：细胞对照组只加成纤维细胞培养基；阳性对照组为在成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞并添加环磷酰胺溶液；检测样品组为在成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞并添加受试物；
(6)受试物检测剂量的设定：根据细胞毒性测定的IC50值设定检测剂量，将受试物，即电子烟原液分为4个非零剂量：IC50、1/2IC50、1/4IC50、1/8IC50；
(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中6孔细胞培养板内的成纤维细胞培养基，再按步骤(5)进行分组，各组的构成为：细胞对照组只加成纤维细胞培养基；阳性对照组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞+环磷酰胺溶液；检测样品组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞+受试物，每孔总体积为2mL，将加好样的6孔板置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养24h，之后加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液将细胞从6孔细胞培养板的孔内消化下来，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；
(8)受试物培养品的低渗：将步骤(7)收集的受试物培养品置于离心管内，离心机离心5min，转速1000rpm，取出离心管并移除上清液，加入氯化钾溶液3mL并轻轻吹打细胞，混匀后立刻加入甲醇冰醋酸溶液2mL，置于离心机上离心5min，转速1000rpm；
(9)受试物培养品滴片制备：取出步骤(8)中的离心管并移除大部分上清液，留少许上清液并轻轻吹打使之形成细胞悬浮液，将细胞悬浮液滴在载玻片上，并放置于玻片架上自然晾干，每一孔滴3张玻片；
(10)受试物培养品滴片的染色：将步骤(9)晾干后的玻片放置于新配制的Gimsa染液中染色15min后，用自来水冲洗玻片并将其放置于玻片架上自然晾干后保存备用；
(11)受试物培养品微核的观察：根据步骤(10)所得到的微核玻片，选择良好且细胞密度适宜的视野，观察1000个双核细胞计数微核率，选择观察的双核细胞应为细胞质保存完好，细胞膜边界清晰，细胞核相互分开，微核易于分辨；
(12)受试物培养品结果判定：将受试物培养品与对照组相比，微核率有显著性增加并有剂量反应关系，即可确认为阳性结果；若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验，能重复者可确定为阳性。
本实施例经过改进样品前处理方法、检测用细胞、检测剂量后对4种国外市售电子烟烟液的细胞毒性进行了检测，结果见表1。
表1 4种国外市售电子烟烟液的体外微核试验检测结果
由以上试验结果可以看出，在本发明方法给出的样品处理方法、检测用细胞、检测剂量条件下，四种国外市售电子烟产品在受试剂量范围内诱导细胞产生的微核率与受试剂量间无剂量效应关系，且与空白对照相比微核率未有显著性增加，制品致突变性呈阴性。阳性对照组微核率与阴性对照组相比微核率显著性增加，证明本次试验体系正常，检测数据有效。

Claims (4)

1.一种用于检测电子烟制品对细胞微核率影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)受试物的前处理；
(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备；
(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算；
(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种；
(5)受试物的分组；
(6)受试物检测剂量的设定；
(7)受试物培养品的制备；
(8)受试物培养品的低渗；
(9)受试物培养品滴片的制备；
(10)受试物培养品滴片的染色；
(11)受试物培养品的微核观察；
(12)受试物培养品的结果判定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
(1)受试物的前处理：吸取一定量的电子烟原液，按照电子烟原液与无血清细胞培养基的体积比为10～90％的比例进行混合稀释后，放置24h-48h，无菌过滤器过滤除菌，得到待测液，-80℃保存待用；
(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备：人肺成纤维细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约1-2min，用成纤维成纤维细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人肺成纤维细胞单细胞悬浮液加入成纤维细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为2mL/孔，接种到6孔细胞培养板中，将6孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱内培养24h；
(5)受试物的分组：将受试物分为三组：细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；各组的构成为：细胞对照组只加成纤维细胞培养基；阳性对照组为在成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞并添加环磷酰胺溶液；检测样品组为在成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞并添加受试物；
(6)受试物检测剂量的设定：根据细胞毒性测定的IC50值设定检测剂量，将受试物，即电子烟原液分为4个非零剂量：IC50、1/2IC50、1/4IC50、1/8IC50；
(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中6孔细胞培养板内的成纤维细胞培养基，再按步骤(5)进行分组，各组的构成为：细胞对照组只加成纤维细胞培养基；阳性对照组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞+环磷酰胺溶液；检测样品组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞+受试物，每孔总体积为2mL，将加好样的6孔板置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养24h，之后加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液将细胞从6孔细胞培养板的孔内消化下来，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；
(8)受试物培养品的低渗：将步骤(7)收集的受试物培养品置于离心管内，离心机离心5min，转速1000rpm，取出离心管并移除上清液，加入氯化钾溶液3mL并轻轻吹打细胞，混匀后立刻加入甲醇冰醋酸溶液2mL，置于离心机上离心5min，转速1000rpm；
(9)受试物培养品滴片制备：取出步骤(8)中的离心管并移除大部分上清液，留少许上清液并轻轻吹打使之形成细胞悬浮液，将细胞悬浮液滴在载玻片上，并放置于玻片架上自然晾干，每一孔滴3张玻片；
(10)受试物培养品滴片的染色：将步骤(9)晾干后的玻片放置于新配制的Gimsa染液中染色15min后，用自来水冲洗玻片并将其放置于玻片架上自然晾干后保存备用；
(11)受试物培养品微核的观察：根据步骤(10)所得到的微核玻片，选择良好且细胞密度适宜的视野，观察1000个双核细胞计数微核率，选择观察的双核细胞应为细胞质保存完好，细胞膜边界清晰，细胞核相互分开，微核易于分辨；
(12)受试物培养品结果判定：将受试物培养品与对照组相比，微核率有显著性增加并有剂量反应关系，即可确认为阳性结果；若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验，能重复者可确定为阳性。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中受试物的前处理方法还可以为剑桥滤片捕集法：
采用直线型吸烟机，连续抽吸100口电子烟，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前，抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照如下公式(1)计算电子烟总粒相物的质量mTPM，电子烟总粒相物的英文名称为Total particulate matter，简称TPM：
mTPM＝m1-m0 (1)
式中：
m0：抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；
m1：抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；
捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入三角瓶中，加入二甲基亚砜，使电子烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/mL；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1ml冻存管中，-80℃保存待用。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中受试物的前处理方法还可以为全烟气暴露瓶捕集法：
采用直线型吸烟机，连续抽吸100口电子烟，采用装有无血清细胞培养基的全烟气暴露瓶捕集，捕集浓度为20口/mL，捕集后用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到待测液，-80℃保存待用。
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