JPH03224481A - ワサビから分離された新規ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ） - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は、退化現象の現れたワサビから分離されたラブ
ドウィルス（ＰＩｌａｎＬ　ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）
に属する新規ウィルス及びその変異株に関する。

本発明のウィルスは、退化現象の原因となるこれらのウ
ィルスにワサビが感染しているか否かを検定するための
抗体作製用の抗原として利用することができる。さらに
、これらのワサビウィルス病を予防乃至治療するための
検体として利用することもできる。

〔従来の技術］ ワサビ（Ｗａｓａｂｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）の多くの
品種は実生で増殖されているが、「真妻」等の優良品種
は株分けで増殖されている。しかし株分けを繰り返すこ
とによって根茎の肥大が悪くなり、子株もほとんど採れ
なくなるという、いわゆる退化現象が現われるので、優
良株分は品種は絶滅の危機に瀕している。この退化現象
の主な原因となっているのがウィルス感染によるウィル
ス病と考えられている。［鈴木春夫ら、静岡屡試研法η
２，５５〜６６（１９７６）　］ワサビから分離されて
いるウィルスはＴ？１Ｖ−Ｗ　（ワサビ系タバコモザイ
クウィルス）　ＣＭＶ（キュウリモザイクウィルス）及
びＴｕＭＶ　（カブモザイクウィルス）の３種が報告さ
れている〔上掲誌、小室康雄ら、植物防疫酋、４８６〜
４８８（１９６６）　、栃原比呂志ら、関東東山病虫研
報１１，４６（１９６４）　）。現在のところ、植物に
感染しているウィルスを殺滅し、ウイルス病を治療する
農薬はまだ見出されていない。

ウィルスに感染した植物からウィルスを除去するいわゆ
るウィルスフリー化のためのほとんど唯一の方法として
組織培養技術を利用した茎頂生長点培養法がラン、ユリ
、カーネーション等の花卉、ブドウ、リンゴ、ミカン等
の果樹、イチゴ、ヤマノイモ等の野菜、センキョウ、ジ
オウ等の薬用植物において実用化されている。ワサビに
おいても茎頂生長点培養法が適用され、ノリクロン法や
苗条原基法により実用化が進められている。

しかし茎頂生長点培養法により作出した苗が全てウィル
スフリーになるわけではなく、茎頂生長点培養法により
作出した苗のウィルス検定は必須である。ウィルス検定
法には、生物検定法、電子顕微鏡法及び抗血清試験法が
あり、対照とする植物とウィルスの種類により、これら
の方法を組合せて検定することが必要である。ワサビに
おいては前述のごとく３種類のウィルスすなわちＴＭＶ
−ＷＣＭＶ及びＴｕＭＶにのみ感染していることが知ら
れていたため、茎頂培養法により作出した培養菌がウィ
ルスフリーか否かの検定は当然これら３種類のウィルス
のみを対照として行なわれてきた。しかし、検定の結果
、ウィルスフリーと判断されても実際にはウィルスに感
染されていることが見出されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、ワサビのウィルス検定を確実なものとし、完
全にウィルスフリーなワサビを得ることを目的としてワ
サビに感染する新規なウィルスを検索し、これを獲得し
ようとするものである。そして得られたウィルスは、ワ
サビウィルス検定を行うための抗体作製用の抗原として
、またこれらのウィルス病の予防ないし治療のための検
体として利用しようとするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、ワサビの新規ウィルスを取得することを
目的として静岡県湯ケ島町のワサビ田から得られたワサ
ビ（品種：真妻）について新規ウィルスの検索を行った
。その結果、棒状ウィルス、ひも状ウィルス及び桿菌状
〜弾丸状ウィルスの３種のウィルスが検出された。この
うち棒状ウィルスは、３００ｒｖＸ１８ｒｖの大きさで
ＴＭＶ−の抗血清とよく反応したので、公知のｔａｂａ
ｃｏ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓのワサビ系と同定した
。そして、ひも状ウィルス及び桿菌状〜弾丸状ウィルス
については後述するような検定の結果、文献未載の新種
のウィルスであることが確認され、本発明をなすに至っ
た。

本発明は、上記２種のウィルスのうち桿菌状〜弾丸状ウ
ィルスであるラブドウィルス（Ｐｊ！ａｎｔ　ｒｈａｂ
ｄｏｖｉｒｕｓ）に属する新規ウィルスに関する。

また、本発明のラブドウィルスは３５〜３７℃で５〜１
５日程度さらす高温処理、亜硝酸、ヒドロキシアミンで
処理する化学処理及びＩｎν１ｔｒｏ　ｎｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ−ｒｅｖｅｒｓｅ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ法等によ
る遺伝子操作等で変異させることができるがこのような
変異株も本発明は包含する。

本発明のウィルスについて採取法及び形態等を示すと次
のとおりである。

ａ）　ウィルスの採取及び検出 静岡県湯ケ島町のワサビ田から得られたワサビ（品種：
「真妻」）を１０ａｓＸ１ｍ程度に細切し、さらにそれ
を切りきざんだ、スライドグラス上に０、１　ｓｏ　Ｉ
ｌ／１２リン酸緩衝液を一滴たらし、その中に上記切り
きざんだワサビを入れ、汁液をしみ出させた。

次いで、コロジオン支持膜を張り、カーボン補強した銅
製グリッドの膜面をこのワサビ汁液に接触させ、速やか
に余分の液を濾紙で吸いとり膜面を上にして風乾させた
。スライドグラス上に０．１ｔｏｏｌ／ｌリン酸緩衝液
に１％グルタルアルデヒドを溶かした固定液を数滴たら
し、その液面に風乾させたグリッドの試料面を下にして
３〜５分間浮かべ、固定させた。固定させた試料の乗っ
たグリッドを脱イオン蒸留水で３回洗浄した後、染色液
（２％リンタングステン酸水溶液、ドライウェル０．５
％添加ｐＨ７，０）で３０秒間染色し、濾紙で余分の染
色液を吸いとり、膜面を上にして風乾させて検出のため
の試料とした。

ｂ）　ウィルスの形態の観察 この様にして作成した試料を透過型電子顕微鏡で検鏡し
、ウィルスの形態を観察した。

その結果、棒状ウィルス、ひも状ウィルス及び桿菌状〜
弾丸状の３種のウィルスが検出された。

棒状ウィルスは３００ｎｍ　Ｘ　１８ｎ閣の大きさで、
ＴＭＶ−Ｈの抗血清とよく反応したことから既知のＴＭ
Ｖ−と同定した。ワサビに感染していることが報告され
ているひも状ウィルスとしてはＴｕＭＶがあるが、Ｔｕ
ＭＶの大きさが７５０ｎｍ　Ｘ　ｌｌｎｍであるのに対
し検出されたひも状ウィルスの大きさは６５０〜７００
ｎｍ　Ｘ　１３ｊｌｌｌｌと大きく異なり、また、Ｔｕ
ＭＶに感染した植物に特異的に見出される風車状封入体
は見出されなかった。さらに、ＴｕＭＶの抗血清と全く
反応しなかった。以上のことからひも状ウィルスはＴｕ
ＭＶとは異なるカルラウィルス（Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ
）に属するウィルスであると判断した。一方、本発明の
埠菌状〜弾丸状のウィルスは約２３０〜２５０ｎＩ１１
×８５〜９ｏｎＩｌｌで内部に約４．５ｎｍのら旋構造
のヌクレオキャプシドと外部に被膜を有することから、
このウィルスはラブドウィルス（Ｐ　ｌ　ａｎｔ　ｒｈ
ａｂｄｏｖｉｒｕｓ）に属するウィルスであると判断し
た。

Ｃ）　超薄切片法によるウィルスの細胞内所見グルタル
アルデヒドとオスミウム酸による二重固定法により固定
したワサビ試料をエポキシ樹脂に包埋・固化後、超薄切
片を作成した。この超薄切片を銅製グリッドにのせ酢酸
ウランとクエン酸鉛による二重染色法で染色した。この
様に作成した試料を透過型電子顕微鏡で検鏡し、ウィル
スの細胞内存在様式及びウィルス感染細胞の変化につい
て観察した。

本発明のラブドウィルス（Ｐ　ｊ！　ａｎｔ　ｒｈａｂ
ｄｏｖｉｒｕｓ）に属する桿菌状〜弾丸状ウィルスは、
核、核膜間隙及び細胞質に見出された。核内にはウィル
ス粒子と共に被膜をかぶっていないヌクレオキャプシド
が認められた。以上の所見から、このウィルスは核内増
殖型のウィルスであることがわかった。

ｄ）寄生範囲 本発明のラブドウィルス（Ｐ　ｌ　ａｎｔ　ｒｈａｂｄ
ｏｖｉｒｕｓ）が他の植物に感染するかどうかについて
アブラナ科植物を中心に６科２９種の植物について接種
試験を行った。

すなわち、ラブドウィルス（Ｐ　１　ａｎｔ　ｒｈａｂ
ｄｏｖｉｒｕｓ）カルラウィルス（Ｃａｒｌａｖｉｒｕ
ｓ）及びＴＭＶ−に混合感染している親ワサビ［真妻」
　（品種名）を接種源としてアブラナ科植物を中心に６
科２９種の植物に汁液接種した。その結果を第１表及び
第２表に示す。いずれの植物に対してもラブドウィルス
（Ｐ　Ｒ−ａｎｔ　ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）もカルラ
ウィルス（Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ）も感染を認められな
かった。ラブドウィルス（ＰＲ−ａｎｔ　ｒｈａｂｄｏ
ｖｉｒｕｓ）がアブラナ科植物に感染することはヨーロ
ッパで、ブロッコリーネタロティツクイエロウスウィル
スとブラジルで、ラファナスＳＰ、からの２種が報告さ
れているだけであり、本発明のラブドウィルス（Ｐ　ｅ
　ａｎｔ　ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）は、第１表に示し
た通り、 ブロッコリーにもラフアナ ス （ダイコン）にも感染せず、 このことから零つ ィルスは新種のウィルスであることが明らかとなった。

Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓす Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ ＴＭＶ ひかり νａｒ匹囮江■１吐 クリスマススノー Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ”Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ　　Ｔ
ＭＶタバコ（Ｘａｎｔｈｉ ｎｃ） ＋ （Ｓｕｎｓｕｎ） ＋ Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ ■し±細息影し ＋ トマト （福寿２号） ＋ 乃ヱ挫土ｈ ｆｌｏｒｉｄａｎａ ＋ センニチコウ ± キュウリ（画集） Ｃｈｅｎｏ　ｏｄｉｕａ＋　　ａｍａｒａｎｔｉｃｏｌ
ｏｒＣ，脛止坦 ササゲ（十人ササゲ） （ブラックアイカラピー） インゲン（ｔｏｐｃｒｏｐ） （大手亡） ソラマメ（−寸） エントウ（ウスイ） （Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ）（Ｐｅ
ｒｆｅｃｔｅｄ　Ｗａｌｅｓ） ＋ ＋ ＋ ｅ）新種ウィルスの現地発生調査 ワサビ栽培現地のウィルス発生調査を行なった。すなわ
ち、ワサビ５品種３１検体についてＤＮ法で検定を行な
ったところ、ラブドウィルス（Ｐｆａｎｔ　ｒｈ−ａｂ
ｄｏｖｉｒｕｓ）は「真妻」のみから検出され、退化現
象による収量低下が問題となっているこのワサビ品種に
とって、このウィルスは重要な影響を与えるウィルスで
あることが明らかとなった。

〔発明の効果〕

本発明は、退化現象の現れたワサビから分離されたラブ
ドウィルス（Ｐ　ｌ１ａｎｔ　ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ
）に属する新種のウィルスを提供するものである。本発
明の新種ウィルスは、栽培中のワサビがこのウィルスに
感染しているか否かの検定あるいは、組織培養により作
出した培養体がウィルスフリーになっているか否かの検
定のための抗体作製用抗原として利用することができる
。また、このウィルスに感染したワサビの治療乃至感染
予防のための研究の検体として利用することもできる。

その結果、ワサビの退化現象を予防し、ワサビの品質を
向上することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の微生物ラブドウィルス（ＰＲ−ａｎ
ｔ　ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）の形態を示す電子顕微鏡
写真である。（倍率２２０，０００倍）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ワサビから分離され、ダイレクトネガティヴ法（
   ＤＮ法）で約２３０〜２５０×８５〜９０ｎｍの桿菌状
   〜弾丸状形態を示し、内部にら旋構造のヌクレオキャプ
   シドと外部に被膜とを有するラブドウイルス（Ｒｈａｂ
   ｄｏｖｉｒｕｓ）に属するウィルスまたはその変異株