CN107574221A - 一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞dna损伤水平影响的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞DNA损伤水平影响的方法。包括样品前处理、单细胞悬浮液制备、细胞浓度计算、细胞接种、受试物暴露、收集细胞、细胞固定、封闭、细胞破膜、染色和流式检测与分析等步骤。本发明综合考察了电子烟制品的使用特点和作用方式，建立了全新的样品前处理方法，选取人肺成纤维细胞HPF作为试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本发明方法能够准确有效地检测电子烟气溶胶水提物对细胞DNA损伤水平的真实影响。

Description

一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞DNA损伤水平影响的 方法

技术领域

本发明属于烟草及烟草制品的安全性生物学评价技术领域，具体是涉及一种针对电子烟烟雾的气溶胶水提物检测其对细胞DNA损伤水平影响的方法。

背景技术

DNA损伤有多种形式，如DNA单链断裂、DNA与DNA的交联、DNA与蛋白质的交联、DSBs等。其中，DSBs会影响DNA双螺旋结构，被认为是DNA损伤最严重的形式，这种损伤若不被及时修复或被错误修复，会导致DNA遗传物质发生转变从而引发肿瘤及遗传性损伤。DSBs发生后，位于DSBs附近的磷脂酸激酶3肌醇家族成员迅速聚集于DNA断裂发生位点磷酸化形成γH2AX，它被认为是一种早期检测DSBs的最有效的生物学标志物。

电子烟制品通过电加热或者电子雾化方式使由烟碱、香味物质等组成的烟液转化为类似于卷烟烟雾的混合物，再将雾化后的丙三醇/尼古丁等混合“烟雾”传送至消费者，使人吸入剂量不等的尼古丁而获得类似于抽吸传统卷烟的生理感受。电子烟烟液经雾化后进入口腔和呼吸道，经由唾液及呼吸道粘液迁移作用于机体。而现有技术通常是直接对电子烟液本身进行分析测试，未考虑其抽吸时的形态、迁移等过程，导致分析测试的结果不能准确反应电子烟烟雾对细胞DNA损伤的真实影响。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞DNA损伤水平影响的方法，为电子烟的安全性评估提供参考。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为体积百分数。

一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞DNA损伤水平影响的方法，具体为以下步骤：

(1)样品前处理：

采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集电子烟烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，-80℃保存待用；

(2)单细胞悬浮液的制备：

人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm²细胞培养瓶中,加入10mL FM细胞培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：

用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)细胞接种：

将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，再按接种量为2mL/孔接种到6孔细胞培养板中，然后将6孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱内培养24h；

(5)受试物暴露

取出6孔细胞培养板，去除细胞培养液，按照表1将不同剂量的待测液加入细胞培养板中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h；

表1细胞γH2AX水平检测加样表

(6)收集细胞

取出细胞培养板，将同一培养孔中的细胞培养液和消化后的细胞收集到同一个15ml离心管中，不同培养孔分开收集，1000r/min转速下离心5分钟，弃上清；

(7)细胞固定：在每支离心管中加入1ml、4℃预冷的70％的乙醇，轻轻吹打均匀，4℃固定1h；1000r/min转速下离心5分钟，弃上清，加入500μl、4℃预冷的PBS缓冲液，重悬细胞，1000r/min转速下再次离心5分钟，弃上清，获得细胞；

(8)封闭：取步骤(7)获得的细胞加入分别含0.2％TritonX-100和10％FBS的PBS200μL，1000r/min转速下离心5分钟，弃上清，获得细胞；

(9)细胞破膜：取步骤(8)获得的细胞，分别加入体积百分比0.2％的TritonX-100和质量体积比0.1％的BSA的PBS溶液1ml重悬细胞，处理固定细胞20min以使细胞膜通透；1000r/min转速下离心5分钟，弃上清；加入5ml PBS重悬细胞，1000r/min转速下再次离心5分钟，获得细胞；

(10)细胞染色：加入FITC标记的γH2AX抗体工作液100μL，避光孵育3h；1000r/min转速下离心5分钟，弃上清；加入300μL PBS重悬细胞；

(11)流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测，进行荧光强度分析。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：综合考察了电子烟制品的暴露途径，作用方式，建立了全新的电子烟制品烟雾前处理方法(气溶胶水提物捕集法)，且根据电子烟制品作用靶细胞选取了人肺成纤维细胞HPF作为细胞DNA损伤试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合电子烟气溶胶水提物对细胞DNA损伤水平影响的检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本发明方法能够准确有效地检测电子烟气溶胶水提物对细胞DNA损伤水平的真实影响。

具体实施方式：

以下通过实施例对本发明做进一步的详细说明，但实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所作出的变化或等同替换均应属于本发明的保护范围。

实施例1

配制3种电子烟烟液，通过捕集瓶捕集获得烟液雾化后的气溶胶水提物作为检测样品，测试其对细胞DNA损伤水平的影响。

3种电子烟烟液分别为：1#、2#、3#号烟液。3种电子烟烟液的烟碱及溶剂含量见表2。

表2. 3种电子烟烟液主要成分

具体检测过程如下：

(1)样品前处理：

采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集电子烟烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，-80℃保存待用；

(2)单细胞悬浮液的制备：

人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm²细胞培养瓶中,加入10mL FM细胞培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：

用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)细胞接种：

将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，再按接种量为2mL/孔接种到6孔细胞培养板中，然后将6孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱内培养24h；

(5)受试物暴露

取出6孔细胞培养板，去除细胞培养液，按照表1将不同剂量的待测液加入细胞培养板中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h；

表1细胞γH2AX水平检测加样表

(6)收集细胞

取出细胞培养板，将同一培养孔中的细胞培养液和消化后的细胞收集到同一个15ml离心管中，不同培养孔分开收集，1000r/min转速下离心5分钟，弃上清；

(7)细胞固定：在每支离心管中加入1ml 4℃预冷的70％的乙醇，轻轻吹打均匀，4℃固定1h；1000r/min转速下离心5分钟，弃上清，加入500μl 4℃预冷的PBS缓冲液，重悬细胞，1000r/min转速下再次离心5分钟，弃上清，获得细胞；

(8)封闭：取步骤(7)获得的细胞加入分别含0.2％TritonX-100和10％FBS的PBS200μL，1000r/min转速下离心5分钟，弃上清，获得细胞；

(9)细胞破膜：取步骤(8)获得的细胞，分别加入体积百分比0.2％的TritonX-100和质量体积比0.1％的BSA的PBS溶液1ml重悬细胞，处理固定细胞20min以使细胞膜通透；1000r/min转速下离心5分钟，弃上清；加入5ml PBS重悬细胞，1000r/min转速下再次离心5分钟，获得细胞；

(10)细胞染色：加入FITC标记的γH2AX抗体工作液100μL，避光孵育3h；1000r/min转速下离心5分钟，弃上清；加入300μL PBS重悬细胞；

(11)流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测，进行荧光强度分析。

结果如表4所示：由表4可以看出，随着对照样品受试剂量的增高，电子烟1#、2#、3#样品在检测剂量范围内对HPF细胞DNA损伤标志物γH2AX荧光值无影响，与细胞对照相比无显著差异，阳性对照与细胞对照存在显著差异(p<0.05)，证明试验体系正常。由此可见，本方法能够有效的测定电子烟气溶胶水提物对受试细胞DNA损伤水平的影响。

捕集瓶捕集方法通过模拟抽吸模式及电子烟烟雾暴露方式最大限度的反映了真实抽吸状态，能够准确有效的检测电子烟气溶胶水提物对细胞对细胞DNA损伤水平的真实影响。

表4. 3种电子烟气溶胶水提物对HPF细胞DNA损伤标志物γH2AX荧光值的影响

综上所述，本发明综合考察了电子烟制品的暴露途径，作用方式，建立了全新的电子烟制品烟雾前处理方法(气溶胶水提物捕集法)，且根据电子烟制品作用靶细胞选取了人肺成纤维细胞HPF作为细胞DNA损伤试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合电子烟气溶胶水提物对细胞DNA损伤水平影响的检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本发明方法能够准确有效地检测电子烟制品对细胞DNA损伤水平的影响。

Claims (1)

1.一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞DNA损伤水平影响的方法，具体为以下步骤：

(1)样品前处理：

采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集电子烟烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，-80℃保存待用；

(2)单细胞悬浮液的制备：

人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm²细胞培养瓶中,加入10mL FM细胞培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：

用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)细胞接种：

将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，再按接种量为2mL/孔接种到6孔细胞培养板中，然后将6孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱内培养24h；

(5)受试物暴露

取出6孔细胞培养板，去除细胞培养液，按照表1将不同剂量的待测液加入细胞培养板中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h；

表1细胞γH2AX水平检测加样表

(6)收集细胞

取出细胞培养板，将同一培养孔中的细胞培养液和消化后的细胞收集到同一个15ml离心管中，不同培养孔分开收集，1000r/min转速下离心5分钟，弃上清；

(7)细胞固定：在每支离心管中加入1ml、4℃预冷的70％的乙醇，轻轻吹打均匀，4℃固定1h；1000r/min转速下离心5分钟，弃上清，加入500μl、4℃预冷的PBS缓冲液，重悬细胞，1000r/min转速下再次离心5分钟，弃上清，获得细胞；

(8)封闭：取步骤(7)获得的细胞加入分别含0.2％TritonX-100和10％FBS的PBS200μL，1000r/min转速下离心5分钟，弃上清，获得细胞；

(9)细胞破膜：取步骤(8)获得的细胞，分别加入体积百分比0.2％的TritonX-100和质量体积比0.1％的BSA的PBS溶液1ml重悬细胞，处理固定细胞20min以使细胞膜通透；1000r/min转速下离心5分钟，弃上清；加入5ml PBS重悬细胞，1000r/min转速下再次离心5分钟，获得细胞；

(10)细胞染色：加入FITC标记的γH2AX抗体工作液100μL，避光孵育3h；1000r/min转速下离心5分钟，弃上清；加入300μL PBS重悬细胞；

(11)流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测，进行荧光强度分析。