CN107828854A - 检测电子烟气溶胶水提物对细胞过氧化氢酶活性影响的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞过氧化氢酶活性影响的方法。包括样品前处理、单细胞悬浮液制备、细胞浓度计算、细胞接种、受试物暴露、收集细胞、细胞裂解、标准品配制、样品配制、吸光度测定、蛋白浓度测定和过氧化氢酶酶活力计算等步骤。本发明综合考察了电子烟制品的暴露途径，作用方式，建立了全新的电子烟制品烟雾前处理方法，选取人肺成纤维细胞HPF作为检测用细胞，并确定了样品检测剂量。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确检测电子烟制品对过氧化氢酶酶活力的影响，进而能够有效地评价电子烟制品对细胞的氧化性损伤。

Description

检测电子烟气溶胶水提物对细胞过氧化氢酶活性影响的方法
技术领域
本发明属于烟草及烟草制品的安全性生物学评价技术领域，具体是涉及一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞过氧化氢酶活性影响的方法。
背景技术
随着人们对健康的关注越来越高，对烟草产品提出了更高的要求，不但要有较好的口感，而且要尽可能的减少人体的不良感受。电子烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。电子烟制品其使用过程中通过电加热或者电子雾化方式使由烟碱、香味物质等组成的液体转化为类似于卷烟烟雾的混合物，再将雾化后的丙三醇/尼古丁等混合“烟雾”传送至消费者，使人吸入剂量不等的尼古丁而获得类似于抽吸传统卷烟的生理感受。电子烟研发人员在烟液产品配方设计初期，将不同组份按照不同比例组合调配，形成具有不同风格的初选配方，再结合化学评价和感官评价对配方进行不断筛选调整，形成最终的产品配方。但初选配方数量众多，全部进行感官评价耗时耗力，且感官评价侧重于对产品的风格口感进行筛选，如何利用生物学测试技术对产品初选配方进筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方，目前尚属探索阶段，并无统一的标准方法。
人的机体在遭受各种不利刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基(reactiveoxygen species,ROS)产生过多，当氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织的氧化性损伤。过氧化氢(H2O2)是活性氧自由基中的重要一种，过氧化氢酶(CAT)能够催化过氧化氢分解成氧和水，对其进行测定，可用于产品初选配方的进一步筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方。
同时，电子烟烟液经雾化后进入口腔和呼吸道，经由唾液及呼吸道粘液迁移作用于机体。而现有技术通常是直接对电子烟液本身进行分析测试，未考虑其抽吸时的形态、迁移等过程，导致分析测试的结果出现误差，不能准确反应电子烟烟雾对细胞过氧化氢酶酶活力的真实影响。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞过氧化氢酶活性影响的方法，为准确评价电子烟制品对细胞的氧化性损伤影响提供技术支持。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为体积百分数。
一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞过氧化氢酶活性影响的方法，具体为以下步骤：
(1)样品前处理：
采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集电子烟烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，-80℃保存待用；
(2)单细胞悬浮液的制备：
人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm2细胞培养瓶中,加入10mL FM细胞培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：
用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)细胞接种：
将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，接种到100mm细胞培养皿中，每皿6ml，然后将细胞培养皿置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h；
(5)受试物暴露
取出细胞培养皿，去除细胞培养液，按照表1将不同剂量的待测液加入细胞培养皿中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；
表1细胞过氧化氢酶活性检测加样表
(6)收集细胞：
移除细胞培养皿中的培养基，培养皿中的细胞用PBS磷酸盐缓冲液洗一遍，加入质量浓度0.25％的胰蛋白酶溶液；每孔中的细胞用HPF细胞培养基悬起，分别收集到15ml离心管中，1000rpm，4℃条件下离心10min，去上清；
(7)细胞裂解
在每支离心管中加入100μL细胞裂解液，0℃冰浴1min，1600rpm，4℃条件下离心10min，取上清液待测；
(8)标准溶液配制：分别取0、12.5、25、50、75μL的5mM过氧化氢标准品溶液，置于不同的1.5mL离心管中，分别加入过氧化氢酶检测缓冲液定容至100μL并混匀；
(9)样品配制：按照表2配制各样品检测液，迅速混匀，25℃反应5min；再分别加入450μL过氧化氢酶反应终止液振荡混匀终止反应；取新的离心管加入40μL过氧化氢酶检测缓冲液，再加入10μL已终止并混匀的上述反应体系，混匀；
表2测试体系配制表
(10)吸光度测定：标准曲线组分别取步骤(8)中配制好的标准溶液，每个离心管中各取4μL加入96孔板；空白对照组和样品检测组分别取步骤(9)中配制好的检测液10μL加入96孔板；标准曲线组、空白对照组、样品检测组均加入200μL配制好的显色工作液，25℃孵育15min后酶标仪测定520nm处吸光度；
(11)蛋白浓度测定：测定步骤(7)待测上清液的蛋白浓度；
(12)过氧化氢酶酶活力计算：
a.根据步骤(10)所得标准溶液吸光度值绘制标准曲线，A520＝k[过氧化氢微摩尔数]+b，由标准曲线计算出k和b的值；
b.计算样品中残余的过氧化氢微摩尔数：残余过氧化氢微摩尔数＝(A520-b)/k；
c.过氧化氢酶酶活力计算：[样品过氧化氢酶酶活力]＝([空白对照残余过氧化氢微摩尔数]－[样品残余过氧化氢微摩尔数])×[稀释倍数]/(5min×40μl×[蛋白浓度])。
相对于现有技术，本发明的优点在于：综合考察了电子烟制品的暴露途径，作用方式，建立了全新的电子烟制品烟雾前处理方法(气溶胶水提物捕集法)，且根据电子烟制品作用靶细胞选取人肺成纤维细胞HPF作为检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合电子烟气溶胶水提物的过氧化氢酶活性检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确检测电子烟气溶胶水提物对过氧化氢酶酶活力的影响，进而能够有效地评价电子烟制品对细胞的氧化性损伤。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步的详细说明，但实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所作出的变化或等同替换均应属于本发明的保护范围。
实施例1
配制4种电子烟烟液，通过捕集瓶捕集获得电子烟气溶胶水提物作为检测样品，测试其对细胞过氧化氢酶活性的影响。
4种电子烟烟液分别为：1#、2#、3#、4#号烟液。4种电子烟烟液的烟碱及溶剂含量见表3。
表3.4种电子烟烟液主要成分
具体检测过程如下：
(1)样品前处理：
采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集电子烟烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，-80℃保存待用；
(2)单细胞悬浮液的制备：
人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm2细胞培养瓶中,加入10mLFM细胞培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：
用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)细胞接种：
将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，接种到100mm细胞培养皿中，每皿6ml，然后将细胞培养皿置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h；
(5)受试物暴露
取出细胞培养皿，去除细胞培养液，按照表4将不同剂量的待测液加入细胞培养皿中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；
表4细胞过氧化氢酶活性检测加样表
(6)收集细胞：
移除细胞培养皿中的培养基，培养皿中的细胞用PBS磷酸盐缓冲液洗一遍，加入质量浓度0.25％的胰蛋白酶溶液；每孔中的细胞用HPF细胞培养基悬起，分别收集到15ml离心管中，1000rpm，4℃条件下离心10min，去上清；
(7)细胞裂解
在每支离心管中加入100μL细胞裂解液，0℃冰浴1min，1600rpm，4℃条件下离心10min，取上清液待测；
(8)标准溶液配制：分别取0、12.5、25、50、75μL的5mM过氧化氢标准品溶液，置于不同的1.5mL离心管中，分别加入过氧化氢酶检测缓冲液定容至100μL并混匀；
(9)样品配制：按照表5配制各样品检测液，迅速混匀，25℃反应5min；再分别加入450μL过氧化氢酶反应终止液振荡混匀终止反应；取新的离心管加入40μL过氧化氢酶检测缓冲液，再加入10μL已终止并混匀的上述反应体系，混匀；
表5测试体系配制表
(10)吸光度测定：标准曲线组分别取步骤(8)中配制好的标准溶液，每个离心管中各取4μL加入96孔板；空白对照组和样品检测组分别取步骤(9)中配制好的检测液10μL加入96孔板；标准曲线组、空白对照组、样品检测组均加入200μL配制好的显色工作液，25℃孵育15min后酶标仪测定520nm处吸光度；
(11)蛋白浓度测定：测定步骤(7)待测上清液的蛋白浓度；
(12)过氧化氢酶酶活力计算：
a.根据步骤(10)所得标准溶液吸光度值绘制标准曲线，A520＝k[过氧化氢微摩尔数]+b，由标准曲线计算出k和b的值；
b.计算样品中残余的过氧化氢微摩尔数：残余过氧化氢微摩尔数＝(A520-b)/k；
c.过氧化氢酶酶活力计算：[样品过氧化氢酶酶活力]＝([空白对照残余过氧化氢微摩尔数]－[样品残余过氧化氢微摩尔数])×[稀释倍数]/(5min×40μl×[蛋白浓度])。
表6.4种电子烟气溶胶水提物对HPF细胞过氧化氢酶酶活性的影响
由试验结果可以看出，在本发明方法给出的样品处理方法、检测剂量条件下，样品1#、2#、3#、4#与0剂量组相比无显著差异(p＞0.05)，在检测剂量范围内与HPF细胞的过氧化氢酶酶活性无剂量效应关系；以上结果显示，受试的电子烟气溶胶水提物并未引起HPF细胞的过氧化氢酶酶活性的改变。
捕集瓶捕集方法通过模拟抽吸模式及电子烟烟雾暴露方式最大限度的反映了真实抽吸状态，能够准确有效的检测电子烟气溶胶水提物对细胞过氧化氢酶酶活力的影响。
综上所述，本发明综合考察了电子烟制品的暴露途径，作用方式，建立了全新的电子烟制品烟雾前处理方法(气溶胶水提物捕集法)，且根据电子烟制品作用靶细胞选取人肺成纤维细胞HPF作为检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合电子烟制品对细胞过氧化氢酶活性影响的方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确检测电子烟气溶胶水提物对细胞过氧化氢酶酶活力的影响，进而能够有效地评价电子烟制品对细胞的氧化性损伤。

Claims (1)

1.一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞过氧化氢酶活性影响的方法，具体为以下步骤：
(1)样品前处理：
采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集电子烟烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，-80℃保存待用；
(2)单细胞悬浮液的制备：
人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm2细胞培养瓶中,加入10mL FM细胞培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：
用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)细胞接种：
将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，接种到100mm细胞培养皿中，每皿6ml，然后将细胞培养皿置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h；
(5)受试物暴露
取出细胞培养皿，去除细胞培养液，按照表1将不同剂量的待测液加入细胞培养皿中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；
表1细胞过氧化氢酶活性检测加样表
(6)收集细胞：
移除细胞培养皿中的培养基，培养皿中的细胞用PBS磷酸盐缓冲液洗一遍，加入质量浓度0.25％的胰蛋白酶溶液；每孔中的细胞用HPF细胞培养基悬起，分别收集到15ml离心管中，1000rpm，4℃条件下离心10min，去上清；
(7)细胞裂解
在每支离心管中加入100μL细胞裂解液，0℃冰浴1min，1600rpm，4℃条件下离心10min，取上清液待测；
(8)标准溶液配制：分别取0、12.5、25、50、75μL的5mM过氧化氢标准品溶液，置于不同的1.5mL离心管中，分别加入过氧化氢酶检测缓冲液定容至100μL并混匀；
(9)样品配制：按照表2配制各样品检测液，迅速混匀，25℃反应5min；再分别加入450μL过氧化氢酶反应终止液振荡混匀终止反应；取新的离心管加入40μL过氧化氢酶检测缓冲液，再加入10μL已终止并混匀的上述反应体系，混匀；
表2测试体系配制表
(10)吸光度测定：标准曲线组分别取步骤(8)中配制好的标准溶液，每个离心管中各取4μL加入96孔板；空白对照组和样品检测组分别取步骤(9)中配制好的检测液10μL加入96孔板；标准曲线组、空白对照组、样品检测组均加入200μL配制好的显色工作液，25℃孵育15min后酶标仪测定520nm处吸光度；
(11)蛋白浓度测定：测定步骤(7)待测上清液的蛋白浓度；
(12)过氧化氢酶酶活力计算：
a.根据步骤(10)所得标准溶液吸光度值绘制标准曲线，A520＝k[过氧化氢微摩尔数]+b，由标准曲线计算出k和b的值；
b.计算样品中残余的过氧化氢微摩尔数：残余过氧化氢微摩尔数＝(A520-b)/k；
c.过氧化氢酶酶活力计算：[样品过氧化氢酶酶活力]＝([空白对照残余过氧化氢微摩尔数]－[样品残余过氧化氢微摩尔数])×[稀释倍数]/(5min×40μl×[蛋白浓度])。
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