CN110452880A - 急性肺损伤细胞模型的制备方法及其应用 - Google Patents

急性肺损伤细胞模型的制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110452880A
CN110452880A CN201910865738.7A CN201910865738A CN110452880A CN 110452880 A CN110452880 A CN 110452880A CN 201910865738 A CN201910865738 A CN 201910865738A CN 110452880 A CN110452880 A CN 110452880A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
ali
preparation
cell model
culture medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910865738.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110452880B (zh
Inventor
叶进燕
卢瑶
张丹
李成业
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University filed Critical First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University
Priority to CN201910865738.7A priority Critical patent/CN110452880B/zh
Publication of CN110452880A publication Critical patent/CN110452880A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110452880B publication Critical patent/CN110452880B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/05—Adjuvants
    • C12N2501/052—Lipopolysaccharides [LPS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种急性肺损伤细胞模型的制备方法及其应用，属于医药生物领域。其包括：1)将A549细胞置于诱导培养基中进行诱导培养，然后弃去培养基，消化收获细胞；2)将收获的A549细胞用培养基悬浮，置于培养皿中，添加炎性物质刺激激发炎症反应，继续培养12‑48小时后，即可用于ALI药物筛选。

Description

急性肺损伤细胞模型的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种急性肺损伤细胞模型的制备方法及其应用，属于医药生物领域。
背景技术
急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)是临床常见急重症，以进行性加重的呼吸困难、顽固的低氧血症为临床特征，其严重阶段可发展为成人呼吸窘迫综合征(Acuterespiratory distress syndrome，ARDS)，ARDS是临床危重症发生急性呼吸衰竭的主要原因，病死率高达50％。常见的致病因素主要有：感染、有害物质吸入、外伤、休克、中毒等。ALI的发病机制较为复杂，其病理基础是肺内失控的炎症反应所致的肺泡毛细血管膜损伤，进而导致肺水肿及透明膜形成。肺泡II型上皮细胞作为肺泡主要结构细胞，在炎症因子和氧化应激的攻击下，其凋亡或坏死的数量直接决定了ALI的严重程度及预后走向，ALI/ARDS缺乏特效治疗，发病率及病死率均处于高水平，因而其发病机制以及药物筛选是本领域内的研究热点。
细胞层面的药物筛选是药物研发中最基础环节，虽然细胞模型的试验结果与动物模型结果、人的临床结果存在较大差别，但是其可以节省大量的试验工作量和成本，排除大量活性较差的候选药物，因此细胞模型仍是目前药物研发或机制研究初级阶段中最为常用的实验手段。
对于ALI的细胞模型来说，由于原代培养肺泡II型上皮细胞(alveolarepithelial type II cells，ATII)在体外培养过程中很快失去表达表面活性质的情况一直存在，从而导致其很难作为大规模的药物筛选细胞模型来进行使用。人肺细胞系A549是人肺腺癌细胞系，同时其也具备类肺泡II型上皮细胞的部分特性；因此本领域一直采用A549作为细胞模型，进行关于ALI的药物筛选以及作用机制的相关研究。为了模拟体内的炎症及氧化应激反应，本领域通常采用LPS、TNF-a添加到A549中来模拟体内的炎症反应，进而激发细胞内的氧化损伤，从而进行药物筛选或机制研究。
出人意料的是，由于A549的肺癌细胞特性，其也作为肺癌细胞模型进行药物筛选；因此我们经常看到较为矛盾的结果。例如，非专利文献：刘斌[1],许可[2],韩宏斌[5],etal.白藜芦醇诱导A549细胞凋亡的实验研究[J].中华肿瘤防治杂志,2014,21(10):740-743.公开了白藜芦醇通过下调Bcl-2的表达来促进A549细胞的凋亡，从而抑制其增殖；而非专利文献：崔立春,耿会生,杜建飞,et al.白藜芦醇对脂多糖诱导的人肺泡上皮细胞A549凋亡的保护作用机制[J].现代肿瘤医学,2014,22(7):1550-1553.公开了白藜芦醇通过提高Bcl-2的表达来保护A549所受到的炎症损伤。对于同一作用靶点来说，药物极少见到具有双重的调节活性，因此这就导致了采用A549作为ALI细胞药物筛选模型的客观性存在质疑。
究其原因可能是A549具有双重细胞特性，使用时其所表达的ATII型细胞特征不明显，从而导致其作为ALI的药物筛选细胞模型仍然存在明显缺陷，容易导致评价结果客观性较差。
发明内容
本发明的第一方面提供一种ALI细胞模型的制备方法，其包括：
1)将A549细胞置于诱导培养基中进行诱导培养，然后弃去培养基，消化收获细胞；
2)将收获的A549细胞用培养基悬浮，置于培养皿中，添加炎性物质刺激激发炎症反应，继续培养12-48小时后，即可用于ALI药物筛选。
在一个实施方案中，所述诱导培养基为SABM培养基(small airway basalmedium)，其中添加：2-10g/L的牛血清白蛋白、0.5-4g/L的转铁蛋白以及0.001-0.05ug/L的FGF。所述A549细胞在诱导培养基中培养2-4天。
在进一步地实施方案中，所述诱导培养基为SABM培养基(small airway basalmedium)，其中添加：4-6g/L的牛血清白蛋白、1-3g/L的转铁蛋白以及0.005-0.01ug/L的FGF。所述A549细胞在诱导培养基中培养3天。优选地，在A549细胞经过诱导培养后，弃去上清液，反复用PBS溶液清洗5-10次，然后再进行下一步骤。
在另一个实施方案中，所述炎性物质为LPS和PAF(血小板凝集因子)。具体地讲，所述炎性物质在细胞培养液中的终浓度为10-100ug/L的LPS和0.1-10ng/L的PAF；优选的，所述炎性物质在细胞培养液中的终浓度为15-30ug/L的LPS和0.5-2ng/L的PAF。
在步骤2)中，所述培养基选自F12K培养基、DMEM培养基和RPMI1640培养基中的一种或多种。
在进一步地实施方案中，所述步骤2)为：将收获的A549细胞用培养基悬浮，置于培养皿中在孵箱培养1-3天后，添加终浓度10-100ug/L的LPS和0.1-10ng/L的PAF，继续培养12-48小时后，即可用于ALI药物筛选。
本发明的第二方面是提供一种上述制备方法所制备的细胞模型。
在一个实施方案中，所述细胞模型可用于治疗急性肺损伤的药物筛选，对于筛选过程来讲，一种方式是可以在步骤1)之后，添加炎性物质之前，添加药物对A549细胞进行预处理，然后添加炎性物质，进行造模以及后续的药效评价，也就是相当于动物实验中的预防性给药。另一种方式是在添加炎性物质培养12-48小时后，在向培养基中添加药物，再继续培养一段时间后进行药效评价，也就是相当于动物实验中的预防性给药。在此本发明不进行特殊的限制，对于所述ALI细胞模型来说，加药方式是可以灵活选择的，以上仅是作为示例，其他不同时间节点的加药方式也包含在本发明的保护范围内。
本发明的第三方面是提供所述细胞模型在筛选治疗ALI疾病药物中的应用。
本发明的第四方面是提供所述细胞模型在研究ALI发病机制中的应用。
本发明发现A549细胞的类AT II细胞特性较弱，因此直接将其作为ALI细胞模型有待商榷。在此基础上，尝试采用诱导剂使A549细胞进一步向AT II细胞方向分化，使其类ATII细胞特性增强，从而成为一种更加适合作为ALI细胞模型的工作细胞。
在进一步地的造模环节本发明发现，单独的LPS炎症诱发很难降低激发A549细胞内部的炎症反应，以及后续的ROS产生以及细胞凋亡。为了后续更加准确的评价细胞模型炎症反应，在不添加其他炎症因子的情况下，本发明对炎症诱导剂进行了筛选，从而获得了LPS+PAF这种最佳的炎症诱导剂组合，获得的细胞模型状态稳定，适合作为ALI药物筛选以及病理机制研究的细胞模型。
具体实施方式
还可进一步通过实施例来理解本发明，其中所述实施例说明了一些制备或使用方法。然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。
实施例1 A549细胞诱导培养
实验方法：
A549细胞购自中国科学院上海细胞库，在37℃下，95％O2和5％CO2的条件培养传代，每隔两天传代一次，取对数生长期的A549细胞，消化收集细胞，其中一部分用SABM培养基(small airway basalmedium，Lonza)混悬，另一部分用RPMI 1640培养基(Hyclone，含10％体积的FBS)混悬(对照组)，然后分别用培养基混悬调整浓度至1×105个/ml铺于6孔板中，每孔2ml，置于孵箱中培养1天后，对采用SABM培养基培养的A549细胞进行随机分组，每组添加不同的诱导组合物，对照组给予等量RPMI1640培养基，培养3天后，进行检测。
检测指标：
1)测定SABM培养基各组细胞增殖率
采用MTT法对各组细胞进行活性检测。
2)测定各组细胞中SPA和SPC蛋白的含量
表面活性物质关联蛋白(SP)是ATII型细胞的关键特性指标，尤其是SPC是ATII型细胞特异表达的表面活性物质关联蛋白，而其他3种表面活性蛋白SP-A、SP-B、SP-D在其它细胞中也有表达；因此我们选择SPA和SPC作为A549细胞向类ATII型细胞转化的评价指标。具体为将收集的细胞在液氮条件下研磨破碎，离心收集蛋白悬液，BCA定量至4mg/L，然后进行ELISA测定(人表面活性物质关联蛋白ELISA相关试剂盒均购自Biolegend)。
具体结果如下：
1)测定SABM培养基各组细胞增殖率
组别 OD值
对照组 0.67±0.014
SABM组1 0.63±0.031
SABM组2 0.65±0.023
SABM组3 0.61±0.027
SABM组1添加的诱导组合物为(终浓度)：4ml/L牛脑垂体提取液、10ug/L表皮生长因子、5ng/L胰岛素、0.5ng/L肾上腺素、0.5ng/L氢化可的松、10ng/L运铁蛋白、0.06ng/L三碘甲状腺原氨酸、0.1g/L维A酸、2.5g/L牛血清白蛋白。
SABM组2添加的诱导组合物为(终浓度)：5g/L的牛血清白蛋白、2g/L的转铁蛋白以及0.008ug/L的FGF。
SABM组3添加的诱导组合物为(终浓度)：4ml/L牛脑垂体提取液、10ug/L表皮生长因子、5ng/L胰岛素、0.5ng/L肾上腺素、10ng/L运铁蛋白、2.5g/L牛血清白蛋白。
从上述结果看出，经诱导培养的A549细胞增殖速度与对照组常规培养的A549细胞略低，但统计学上无明显差异，可见诱导培养对A549细胞增殖没有影响。
2)各组细胞中SPA和SPC蛋白的含量
组别 SPA(ng/L) SPC(ng/L)
对照组 57.2±6.9 11.8±5.1
SABM组1 101.8±10.3** 32.5±6.4**
SABM组2 98.9±8.7** 41.1±5.8**
SABM组3 73.6±9.9** 16.7±4.6
经Oneway-ANOVA检验，**代表与对照组相比p<0.01
从上述结果看出，对照组细胞的SPA和SPC含量较低，说明虽然A549就有一定的ATII型细胞特性，但是不是特别明显。在经过诱导培养的A549细胞中SPA和SPC含量明显提高；尤其是组1和组2的提高效果最为明显，但是考虑后续需要制备ALI模型，尽量控制诱导组合物中化学物质添加，因此采用组2的诱导组合物效果最佳。
实施例2炎性物质诱导A549细胞凋亡模型的制备
按照实施例1组2的方法对A549细胞进行培养，然后消化收集细胞，用PBS对细胞反复离心清洗5次，确保无诱导培养基残留，然后用无血清RPMI 1640培养基悬浮，按1×105个/ml铺于6孔板中，每孔2ml，用于凋亡和ROS检测，再按1×105个/ml铺于96孔板中，每孔100ul，用于细胞活性检测。另取未经诱导的A549细胞同样铺于6孔板及96孔板中。
对诱导后的A549细胞进行分组，96孔板每组5孔，6孔板每组3孔；分别为LPS组、PAF组、LPS+PAF组和诱导对照组。LPS组、PAF组和LPS+PAF组添加相应的炎性诱导剂，诱导对照组添加等量的培养基。
对未诱导后的A549细胞进行分组，分为LPS对照组和对照组，LPS对照组添加LPS，对照组添加等量的培养基。
各组培养24h后进行相关检测。
检测指标：
1)对96孔板细胞测定各组细胞活性(MTT法)
2)对96孔板细胞上清液测定TNF-α含量
吸取细胞上清液，然后采用ELISA试剂盒检测上清液中TNF-α含量。
3)对6孔板细胞采用流式细胞仪测定凋亡情况
采用Anexin V-FITC/PI试剂盒按照试剂盒说明书对细胞进行标记，然后上流式细胞仪进行检测，其中Anexin V-FITC单标记的细胞为凋亡细胞，Anexin V-FITC和PI双标记的细胞为坏死细胞。
4)对6孔板细胞采用流式细胞仪测定细胞内ROS产生情况
采用DCFH-DA探针对细胞进行孵育标记，然后上流式细胞仪检测。
具体结果如下：
1)各组细胞活性
经Oneway-ANOVA检验，**代表与对照组相比p<0.01
从结果可以看出，对于未经诱导的A549细胞，LPS对增殖抑制效果较差，再考虑到A549细胞较弱的类AT II细胞特性，很难作为ALI细胞模型进行应用。而诱导后的A549细胞，对LPS敏感度更差，继续添加PAF后抑制增殖效果大幅增强，可以为药物筛选或机制研究提供较大的治疗窗。
2)上清液中TNF-α含量
经Oneway-ANOVA检验，**代表与对照组相比p<0.01
3)各组细胞凋亡率情况
组别 凋亡率(％) 坏死率(％)
对照组 2.7±0.6 0.9±0.7
LPS对照组 10.9±2.1 3.9±1.4
诱导对照组 1.3±0.5 0.8±0.6
LPS组 21.6±3.8 7.2±1.8
PAF组 3.4±0.9 1.7±0.8
LPS+PAF组 45.8±5.3 9.6±1.3
4)各组细胞ROS产生情况
组别 ROS标记率(％)
对照组 0.5±0.3
LPS对照组 4.6±3.7**
诱导对照组 0.9±0.6
LPS组 15.7±4.1**
PAF组 1.8±0.5
LPS+PAF组 21.4±4.6**
从上述结果可以看出，无论是诱导后还是未经诱导的A549细胞，均可以激发细胞内的炎症反应，可以看到细胞在经LPS孵育后分泌TNF-α的量大幅增加，但是对于未经诱导的细胞组来说，这种炎症因子并未导致大规模的细胞凋亡，这无疑对药物筛选不利，无法客观评价候选化合物对细胞的实质保护作用。而经过诱导的细胞不仅炎症因子分泌量大幅增加并且凋亡率也明显提高。另外，炎症诱发凋亡的一个重要原因是炎症因子导致细胞内氧自由基(ROS)含量大幅增加，进而ROS激发细胞内的凋亡级联通路，从而导致细胞凋亡，因此我们又考察了各组细胞ROS含量情况，结果与凋亡结果类似，说明本发明的ALI模型明显触发了炎症相关各种机制通路，为后续的疾病机制考察提供了良好的研究背景。
本发明的ALI模型经多次重复试验，稳定性好，重现性高，适于用作ALI疾病相关的药物筛选模型或疾病机制研究模型。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (10)

1.一种ALI细胞模型的制备方法，其包括：
1)将A549细胞置于诱导培养基中进行诱导培养，然后弃去培养基，消化收获细胞；
2)将收获的A549细胞用培养基悬浮，置于培养皿中，添加炎性物质刺激激发炎症反应，继续培养12-48小时后，即用。
2.根据权利要求1所述的ALI细胞模型的制备方法，其特征在于，所述诱导培养基为SABM培养基(small airway basal medium)，其中添加：2-10g/L的牛血清白蛋白、0.5-4g/L的转铁蛋白以及0.001-0.05ug/L的FGF。
3.根据权利要求1所述的ALI细胞模型的制备方法，其特征在于，所述诱导培养基为SABM培养基(small airway basal medium)，其中添加：2-10g/L的牛血清白蛋白、0.5-4g/L的转铁蛋白以及0.001-0.05ug/L的FGF。
4.根据权利要求3所述的ALI细胞模型的制备方法，其特征在于，所述诱导培养基为SABM培养基(small airway basal medium)，其中添加：4-6g/L的牛血清白蛋白、1-3g/L的转铁蛋白以及0.005-0.01ug/L的FGF。
5.根据权利要求1所述的ALI细胞模型的制备方法，其特征在于，所述炎性物质为LPS和PAF(血小板凝集因子)；具体地讲，所述炎性物质在细胞培养液中的终浓度为10-100ug/L的LPS和0.1-10ng/L的PAF。
6.根据权利要求5所述的ALI细胞模型的制备方法，其特征在于，所述炎性物质在细胞培养液中的终浓度为15-30ug/L的LPS和0.5-2ng/L的PAF。
7.根据权利要求1所述的ALI细胞模型的制备方法，在步骤2)中，所述培养基选自F12K培养基、DMEM培养基和RPMI 1640培养基中的一种或多种。
8.权利要求1-7任一项所述制备方法所制备的细胞模型。
9.权利要求8所述细胞模型在筛选治疗ALI疾病药物中的应用。
10.权利要求8所述细胞模型在研究ALI发病机制中的应用。
CN201910865738.7A 2019-09-09 2019-09-09 急性肺损伤细胞模型的制备方法及其应用 Active CN110452880B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910865738.7A CN110452880B (zh) 2019-09-09 2019-09-09 急性肺损伤细胞模型的制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910865738.7A CN110452880B (zh) 2019-09-09 2019-09-09 急性肺损伤细胞模型的制备方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110452880A true CN110452880A (zh) 2019-11-15
CN110452880B CN110452880B (zh) 2021-09-21

Family

ID=68491894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910865738.7A Active CN110452880B (zh) 2019-09-09 2019-09-09 急性肺损伤细胞模型的制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110452880B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112674031A (zh) * 2020-12-03 2021-04-20 同济大学 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型及其构建方法和用途
CN117402816A (zh) * 2023-10-27 2024-01-16 深圳市第三人民医院(深圳市肝病研究所) spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型建立方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018201192A1 (en) * 2017-05-03 2018-11-08 The University Of Melbourne Compounds for the treatment of respiratory diseases
CN109172560A (zh) * 2018-10-15 2019-01-11 佛山喜鹊医药有限公司 氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐在预防和/或治疗肺部疾病中的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018201192A1 (en) * 2017-05-03 2018-11-08 The University Of Melbourne Compounds for the treatment of respiratory diseases
CN109172560A (zh) * 2018-10-15 2019-01-11 佛山喜鹊医药有限公司 氨基金刚烷硝酸酯类化合物或其药学上可接受的盐在预防和/或治疗肺部疾病中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YAQING LI等: "Differentiation of human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells into type II alveolar epithelial cells in vitro", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE》 *
吴炜景等: "以TNF-α刺激A549细胞构建急性肺损伤细胞模型", 《中国医药科学》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112674031A (zh) * 2020-12-03 2021-04-20 同济大学 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型及其构建方法和用途
CN112674031B (zh) * 2020-12-03 2021-11-30 同济大学 新型冠状病毒感染的啮齿动物模型的构建方法和用途
CN117402816A (zh) * 2023-10-27 2024-01-16 深圳市第三人民医院(深圳市肝病研究所) spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型建立方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110452880B (zh) 2021-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Swenson-Fields et al. Macrophages promote polycystic kidney disease progression
O'Connor et al. A combinatorial role for NFAT5 in both myoblast migration and differentiation during skeletal muscle myogenesis
Li et al. Steatosis induced CCL5 contributes to early-stage liver fibrosis in nonalcoholic fatty liver disease progress
Le et al. Amyloid β42 activates a G-protein-coupled chemoattractant receptor, FPR-like-1
Daniels et al. Imatinib mesylate inhibits the profibrogenic activity of TGF-β and prevents bleomycin-mediated lung fibrosis
Danahay et al. Interleukin-13 induces a hypersecretory ion transport phenotype in human bronchial epithelial cells
Gray et al. Regulation of MUC5AC mucin secretion and airway surface liquid metabolism by IL-1β in human bronchial epithelia
Chen et al. Influenza virus inhibits ENaC and lung fluid clearance
Wachtel et al. Down‐regulation of occludin expression in astrocytes by tumour necrosis factor (TNF) is mediated via TNF type‐1 receptor and nuclear factor‐κB activation
Korpi-Steiner et al. Human rhinovirus induces robust IP-10 release by monocytic cells, which is independent of viral replication but linked to type I interferon receptor ligation and STAT1 activation
Chambers et al. Functional effects of protease-activated receptor-2 stimulation on human airway smooth muscle
Wang et al. Basic fibroblast growth factor protects against influenza A virus-induced acute lung injury by recruiting neutrophils
CN103520724B (zh) Hsd17b13蛋白或其编码基因的抑制剂的新用途
Vuorinen et al. Imatinib mesylate inhibits fibrogenesis in asbestos-induced interstitial pneumonia
Tseng et al. Innate immune responses of human tracheal epithelium to Pseudomonas aeruginosa flagellin, TNF-α, and IL-1β
Huang et al. The natural compound andrographolide inhibits human aortic valve interstitial cell calcification via the NF-kappa B/Akt/ERK pathway
CN110452880A (zh) 急性肺损伤细胞模型的制备方法及其应用
Gauvreau et al. Expression of functional cysteinyl leukotriene receptors by human basophils
Halajian et al. Activation of TLR4 by viral glycoproteins: A double-edged sword?
Pai et al. Role of tumor necrosis factor-alpha on mesangial cell MCP-1 expression and monocyte migration: mechanisms mediated by signal transduction.
Sekulovski et al. Endometriotic inflammatory microenvironment induced by macrophages can be targeted by niclosamide
Joubert et al. Expression and regulation of CCR1 by airway smooth muscle cells in asthma
Mullett et al. Adhesive capsulitis: human fibroblast response to shoulder joint aspirate from patients with stage II disease
Maheshwari et al. Interleukin-8/CXCL8 forms an autocrine loop in fetal intestinal mucosa
Xie et al. Glial-derived neurotrophic factor regulates enteric mast cells and ameliorates dextran sulfate sodium-induced experimental colitis

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant