CN117402816A - spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型建立方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种spike蛋白诱导COVID‑19急性肺损伤的细胞模型建立方法及应用，包括以下步骤：S10、获取人肺巨噬细胞和人肺泡上皮细胞及SARS‑CoV‑2重组spike蛋白；S20、将人肺巨噬细胞和人肺泡上皮细胞共培养第一预设时间，得共培养体系；S30、将spike蛋白加入共培养体系共培养第二预设时间，得COVID‑19急性肺损伤的细胞模型。其中共培养体系可模拟更为符合实际的肺部结构和急性肺损伤病理特征。此外，使用无传染性的spike蛋白替代传染性的SARS‑CoV‑2活病毒，无需使用生物安全3级(BSL‑3)实验室，在避免实验人员感染同时可诱导明显的病毒性肺炎病理生理改变和急性肺损伤。本建模方法符合减少使用实验动物的伦理愿望，实验条件要求不高，周期短，价格低廉，适于在COVID‑19急性肺损伤的治疗药物筛选中推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及细胞模型技术领域，特别涉及spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型建立方法及其应用技术领域。
背景技术
近年来，严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)诱导的急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是重症COVID-19的主要死亡原因，其病理生理基础和发病机制仍存在大量未解决问题。与传统意义上的典型ARDS相比，“炎症因子风暴”相关的弥漫性肺泡损伤是COVID-19急性肺损伤/ARDS的最鲜明特征，目前临床上尚缺乏相应的有效治疗手段。因此，建立合适的疾病模型，从全新的角度探讨其发病机制，寻找新的有效治疗靶点具有现实的紧迫性。
宿主-病原体相互作用的动物模型对于了解COVID-19急性肺损伤/ARDS发病机制和评估治疗效果至关重要。适当的动物模型会产生所需的疾病特征，其临床症状与在人类中观察到的极其相似。实验研究表明，小鼠、仓鼠、猫、雪貂和非人类灵长类动物都可感染SARS-CoV-2而可能出现急性肺损伤/ARDS。人血管紧张素转换酶2 (hACE2) 转基因小鼠和仓鼠是小型动物模型，容易获得，但将啮齿动物研究的知识转化为临床应用可能具有挑战性。雪貂是病毒传播、发病机制和治疗对策测试的优秀模型，但它们在某些国家的可用性可能是一个问题，并且需要特殊的饲养场所和繁殖设施。猫是SARS-CoV-2的天然宿主，可以很好地传播病毒，但不会表现出典型的疾病症状。非人类灵长类动物构成了遗传上最接近人类的模型，然而这种模型的建立既昂贵又耗时。总体而言，活病毒感染诱导COVID-19急性肺损伤/ARDS的动物模型存在以下限制：试验可能是困难和危险的，必须在生物安全3级(BSL-3)实验室中进行，实验技术条件复杂，实验周期相对较长，难重复，费用昂贵而难以大范围应用。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型的建立方法以及应用，旨在解决现有技术中模型建立较为困难和危险，必须在生物安全3级(BSL-3)实验室中进行，实验技术条件复杂，实验周期长，费用昂贵的问题。
为实现上述目的，本发明提出一种spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型建立方法，包括以下步骤：
S10、获取人肺巨噬细胞和人肺泡上皮细胞及SARS-CoV-2重组spike蛋白；
S20、将人肺巨噬细胞和人肺泡上皮细胞共培养第一预设时间，得共培养体系；
S30、将SARS-CoV-2重组spike蛋白加入共培养体系共培养第二预设时间，得COVID-19急性肺损伤细胞模型。
可选地，步骤S20中，人肺巨噬细胞与人肺泡上皮细胞的细胞数量比为1:（2~8）。
可选地，步骤S20中，第一预设时间为12~48h。
可选地，步骤S30中，spike蛋白在共培养体系中的质量浓度为5~15μg/mL。
可选地，步骤S30中，第二预设时间为3~5天。
本发明还提出了所述方法建立的细胞模型在COVID-19急性肺损伤的治疗药物筛选中的应用。
本发明提出一种spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型建立方法，通过人肺巨噬细胞(AM)和人肺泡上皮细胞(HPAEpic)的共培养，再暴露于spike蛋白诱导炎症反应和氧化应激，其中人肺巨噬细胞(AM)和人肺泡上皮细胞(HPAEpic)在实际的人体COVID-19肺炎中是与SARS-CoV-2直接接触的两类最主要细胞，通过病毒-宿主以及细胞间的相互作用在清除病毒同时，可能诱导过度的炎症反应，即“炎症因子风暴”，以及氧化应激造成急性肺损伤。人肺巨噬细胞(AM)和人肺泡上皮细胞(HPAEpic)的共培养可以维持细胞模型的免疫稳态，且二者可以相互作用，可以模拟出更为符合实际的肺部结构和急性肺损伤病理特征。此外，SARS-CoV-2重组spike蛋白，即刺突蛋白，是没有传染性的病毒蛋白，在避免实验人员感染同时可诱导明显的病毒性肺炎病理生理改变和急性肺损伤，因此规避了的SARS-CoV-2活病毒的传染风险，使得COVID-19急性肺损伤的细胞模型可以在普通实验室中建立，而无需安全级别更高的实验室条件。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，值得注意的是，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的内容获得其他的附图。
图1为本发明一实施例所提供的spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型建立方法的流程示意图；
图2为本发明一实施例所提供的spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型建模验证图。
本发明目的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
近年来，严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)诱导的急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是重症COVID-19的主要死亡原因，其病理生理基础和发病机制仍存在大量未解决问题。与传统意义上的典型ARDS相比，“炎症因子风暴”相关的弥漫性肺泡损伤是COVID-19急性肺损伤/ARDS的最鲜明特征，目前临床上尚缺乏相应的有效治疗手段。因此，建立合适的疾病模型，从全新的角度探讨其发病机制，寻找新的有效治疗靶点具有现实的紧迫性。
宿主-病原体相互作用的动物模型对于了解COVID-19急性肺损伤/ARDS发病机制和评估治疗效果至关重要。适当的动物模型会产生所需的疾病特征，其临床症状与在人类中观察到的极其相似。实验研究表明，小鼠、仓鼠、猫、雪貂和非人类灵长类动物都可感染SARS-CoV-2而可能出现急性肺损伤/ARDS。人血管紧张素转换酶2 (hACE2)转基因小鼠和仓鼠是小型动物模型，容易获得，但将啮齿动物研究的知识转化为临床应用可能具有挑战性。雪貂是病毒传播、发病机制和治疗对策测试的优秀模型，但它们在某些国家的可用性可能是一个问题，并且需要特殊的饲养场所和繁殖设施。猫是SARS-CoV-2的天然宿主，可以很好地传播病毒，但不会表现出典型的疾病症状。非人类灵长类动物构成了遗传上最接近人类的模型，然而这种模型的建立既昂贵又耗时。总体而言，活病毒感染诱导COVID-19急性肺损伤/ARDS的动物模型存在以下限制：试验可能是困难和危险的，必须在生物安全3级(BSL-3)实验室中进行；实验技术条件复杂；实验周期相对较长，难重复；费用昂贵而难以大范围应用。
体外模型包括基于原代或永生化细胞培养的细胞模型、外植体和类器官。它们符合减少动物模型使用的伦理愿望，允许研究特定的细胞标靶，这在体内宏观系统中是无法实现的。患者器官来源的外植体(离体模型)或由诱导干细胞产生的类器官具有保留组织结构和复杂性的优势，从组织中获得的结果有利于描述它们对SARS-CoV-2感染的可能反应和寻找新的治疗靶点。但缺点是技术难度较大和伦理限制。人气道上皮原代细胞是从人类肺供体或接受肺移植的个体中分离出来的，具有分化的纤毛细胞、杯状细胞和基底细胞，在体内与人气道上皮的生理状况保持着最高的相似性。使用原代细胞模型的优势主要在于更真实的病毒-宿主相互作用，但基于永生化细胞系单层培养的模型更易于使用，耗时更少，价格低廉，易重复，并且绕过了与使用动物和人体组织相关的伦理问题。然而，单个永生化细胞系(Vero E6、Huh-7、A549-ACE2等)构建的细胞模型功能较单一，并不能充分模拟COVID-19急性肺损伤发病的复杂过程。
其中，图1为本发明一实施例的制备方法流程图。为实现上述目的，本发明提出一种spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型建立方法，包括以下步骤：
S10、获取人肺巨噬细胞和人肺泡上皮细胞及SARS-CoV-2重组spike蛋白；
S20、将人肺巨噬细胞和人肺泡上皮细胞共培养第一预设时间，得共培养体系；
S30、将SARS-CoV-2重组spike蛋白加入共培养体系共培养第二预设时间，得spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型。
本发明的技术方案中，通过人肺巨噬细胞(AM)和人肺泡上皮细胞(HPAEpic)的共培养，再暴露于spike蛋白诱导炎症反应和氧化应激，其中人肺巨噬细胞(AM)和人肺泡上皮细胞(HPAEpic)在实际的人体COVID-19肺炎中是与SARS-CoV-2直接接触的两类最主要细胞，通过病毒-宿主以及细胞间的相互作用在清除病毒同时，可能诱导过度的炎症反应，即“炎症因子风暴”，以及氧化应激造成急性肺损伤。人肺巨噬细胞(AM)和人肺泡上皮细胞(HPAEpic)的共培养可以维持细胞模型的免疫稳态，且二者可以相互作用，可以模拟出更为符合实际的肺部结构和急性肺损伤病理特征。此外，SARS-CoV-2重组spike蛋白，即刺突蛋白，是没有传染性的病毒蛋白，在避免实验人员感染同时可诱导明显的病毒性肺炎病理生理改变和急性肺损伤，因此规避了的SARS-CoV-2活病毒的传染风险，使得COVID-19急性肺损伤的细胞模型可以在普通实验室中建立，而无需安全级别更高的实验室条件，实验周期短，方便快捷，价格低廉，适于推广应用。
进一步地，步骤S20中，人肺巨噬细胞与人肺泡上皮细胞的共培养细胞数量比为1:（2~8）。在此数量比下，可以维持细胞模型的免疫稳态以及模拟出更符合实际的肺部结构和急性肺损伤病理特征。
进一步地，步骤S20中，第一预设时间为12~48h。在此时间范围内，可以使活化的人肺巨噬细胞和人肺上皮细胞充分相互作用，利于共培养体系在暴露于spike蛋白后诱导炎症反应和氧化应激，而造成急性肺损伤。
进一步地，步骤S30中，spike蛋白在共培养体系中的质量浓度为5~15μg/mL。在此浓度范围内，可以诱导明显的炎症反应和氧化应激，更接近真实的人体COVID-19急性肺损伤的发病过程。spike蛋白在共培养体系中的质量浓度可以是5μg/mL、10μg/mL或15μg/mL。
进一步地，步骤S30中，第二预设时间为3~5天。在此时间范围内，可以诱导明显的炎症反应和氧化应激，更真实地模拟COVID-19急性肺损伤的自然病程。
本发明还提出了所述spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型建立方法建立的细胞模型在COVID-19急性肺损伤的治疗药物筛选中的应用。本发明所建立的spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型可以应用于筛选COVID-19急性肺损伤的治疗药物，简化了实验程序，无需严格的使用人体组织相关的伦理审批，保存条件也较简便。用重组spike蛋白替代传染性的SARS-CoV-2活病毒，建模实验室条件要求不高，无需使用生物安全3级 (BSL-3)实验室和昂贵的仪器设备，实验周期短，易重复，价格低廉，适于在普通生物实验室推广应用。使用此方法建立的细胞模型能充分模拟COVID-19急性肺损伤的弥漫性肺泡损伤、过度的炎症反应和氧化应激的发病过程。
本发明所提供的spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型可以通过以下方式进行验证，如图1及图2所示：
细胞复苏与培养
取-80℃冰箱冻存的人肺AM、HPAEpic细胞，39℃水浴锅复苏，将冻存管中的细胞连同冻存液一同转入一新的无菌EP管中，于室温1000rpm离心5min，弃上清。取少量（提前30min于37℃预热）细胞培养液轻轻重悬细胞，转入T25细胞瓶（已加入少量细胞培养液）中，补充培养液至细胞瓶中培养液总体积为5mL，放置于5% CO2培养箱中，37℃培养。
实验分组
以不同浓度的SARS-CoV-2重组S1蛋白(0.1μg/mL，1μg/mL，10μg/mL)分别加入共培养的(共培养比例1:5)人肺巨噬细胞(AM)+人肺泡上皮细胞(HPAEpic)，处理后1d、3d、5d收样，并以LPS（1μg/mL）处理作为阳性对照，建立细胞损伤率、炎症和氧化应激指标的量效和时效曲线。
BCA蛋白定量
蛋白标准品的准备
1)取0.6mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准品(15mg BSA牛血清白蛋白)中，充分溶解后配制成25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。
2)蛋白样品和标准品可以用PBS稀释标准品，稀释后的标准品可-20℃长期保存。
3)以PBS（磷酸盐缓冲液）作为稀释液将标准品浓度按0mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL进行稀释及分装。
BCA工作液的配制
采用常规BCA试剂盒，测定一个样本BCA工作液需要200μL，根据样品的数量，按照BCA试剂A和BCA试剂B体积比为50:1（例如5mL BCA试剂A和100μL BCA试剂B混匀，配制成5.1mL BCA工作液）配制适量BCA工作液，充分混匀。
蛋白浓度检测
1)标曲的制作：每个标准品设3个平行样，取3个平行样的平均值来制作标曲，将不同浓度的标准品各取1管，以20μL/孔加到96孔板的标准品孔中。
2)每个样品设3个平行样，取3个平行样的平均值来计算浓度。
3)各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置30分钟。
4)用酶标仪测定595nm波长的吸光度。
根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。通过BCA蛋白定量，可以实现实验数据标准化，减少因细胞数量差异导致的结果偏差，使相同条件下不同实验的结果具有可比性和可重复性。
细胞损伤率检测-乳酸脱氢酶（LDH）释放实验
乳酸脱氢酶（LDH）在胞浆内含量丰富，当细胞受损或死亡时可释放到细胞外，释放出的LDH在培养基上清中，可通过酶反应来检测。使用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(LDHCytotoxicity Assay Kit)检测LDH水平。
1)取处在对数生长期且生长状态良好的不同组的AM、HPAEpic细胞，常规消化后用含有10% FBS的DMEM完全培养基重悬细胞，将细胞悬液的浓度调整为2×104cells/mL。
2)将100μL上述细胞悬液对应96孔板的每个孔中加入，即2000cells/孔，将96孔板放进培养箱中培养。
3)吸去培养液，PBS液洗涤一次。更换新鲜培养液将各培养孔分成如下几组：分成培养基空白组、NC组（对照组，即未处理组）、S蛋白处理组（0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL）、LPS组（1μg/mL），最大裂解液组。按照实验需要给予适当药物处理加10μL特定的药物刺激，继续在细胞培养箱中孵育。
4)从细胞培养箱里取出细胞培养板，最大裂解液组加入细胞裂解液，加入量为原培养液体积10%，反复吹打数次混匀，继续在细胞培养箱中孵育。
5)将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min，分别取各孔的上清液120μL，加入到一新的96孔板相应孔中。
6)各孔分别加入60μL LDH检测工作液，混匀，室温(约25℃)避光孵育30min。使用多功能酶标仪在490nm处测定吸光度。使用600nm波长作为参考波长进行双波长测定。
标准化细胞损伤率计算方法：
①测得的各组吸光度均应减去背景空白对照孔组吸光度的平均值。
②A细胞损伤率(%)=处理样品组每孔吸光度/细胞最大酶活性组吸光度平均值×100。
③B计算总蛋白比例=每孔总蛋白/所有孔总蛋白的平均值。
④标准化细胞损伤率=A/B。
炎症指标：炎症因子(IL-6、TNF-α)的检测
1)将各处理组的细胞在1000g下离心20分钟，取上清液进行检测。
2)取出酶标板，弃去液体，每孔直接加入生物素化抗体工作液，盖上封板膜后37℃温育1小时。
3)弃去液体，每孔加入300μL1x洗涤液，静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，重复3次。
4)然后每孔加入酶结合物工作液100μL，盖上封板膜后37℃温育30分钟。弃去液体后再次洗涤5次，接着每孔加入底物 (TMB) 90 μL，盖上封板膜，37℃避光温育15分钟。
5)取出酶标板，每孔直接加入终止液50μL，使用多功能酶标仪在450nm条件下测定各孔吸光度。
6)根据标准曲线计算每孔IL-6、TNF-α浓度，并用每孔总蛋白/所有孔总蛋白的平均值标准化。
氧化应激指标：细胞内谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的检测
采用人谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)酶联免疫检测试剂盒检测细胞内谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）水平。
1)将各处理组的细胞在2000-3000rpm/分，离心20分钟，收集上清液。
2)加入准备好的样品和标准品50μL，然后再加入生物素抗原工作液50μL，轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30分钟。
3)弃去液体，加入洗涤液，洗涤5次后各孔加入亲和素HRP 50μL，37℃培养箱中孵育30分钟，洗涤5次。
4)再加入显色液A、B各50μL，37℃避光显色10分钟，然后每孔加终止液50μL，终止反应，使用多功能酶标仪在450nm条件下测定各孔吸光度。
5)根据标准曲线计算每孔GPX4浓度，并用每孔总蛋白/所有孔总蛋白的平均值标准化。
氧化应激指标：细胞内丙二醛（MDA）含量的检测
Malondialdehyde（MDA，丙二醛）是一种由脂肪酸和脂肪酸酯等化合物的过 氧化作用而产生的一种多不饱和脂肪酸分解产物，由于氧化应激而在人体内形成。氧化应激会导致自由基产生过多，细胞和组织损伤加剧。采用MDA试剂盒检测MDA含量水平。
1)将各处理组细胞上清液于2-8℃，2500rpm离心5min后。向相应孔中加入50μL待测样品，然后立即向每孔中加入50μL生物素标记的检测抗体工作液，轻轻震荡酶标板混匀1分钟，贴上覆膜，并在37℃静置孵育45分钟。
2)取下覆膜，弃掉酶标板内的液体，在洁净的吸水纸上拍2-3次，然后每孔加入洗涤缓冲液350μL，浸泡1分钟，弃掉孔内液体，在吸水纸上拍3次。重复3次。
3)再向每孔加入100μL SABC工作液。贴上覆膜，37℃静置孵育30分钟后洗涤5次。
4)然后向每孔加入90μL TMB显色底物，贴上覆膜，在37℃避光静置孵育20分钟。显色后，向每孔加入50μL反应终止液。在450nm处测定各孔OD值。
根据标准曲线计算每孔MDA浓度，并用每孔总蛋白/所有孔总蛋白的平均值标准化。
将细胞损伤率、炎症因子(IL-6、TNF-α)、细胞内谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、细胞内丙二醛（MDA）的检测数据绘制成图，如图2所示。
由图2可知，人肺AM、HPAEpic细胞比例1:5共培养24h后用S1蛋白10μg/mL处理，3~5d后可产生明显的细胞损伤、炎症反应和氧化应激，效果优于1μg/mL的LPS诱导（阳性对照组）的相应变化。处理时间1d时，诱导的急性肺损伤细胞模型还不满足要求。本发明建立的COVID-19急性肺损伤细胞模型具有非常好的应用前景。S1蛋白为1μg/mL以下时，诱导的细胞损伤不够明显。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (6)
1.一种spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10、获取人肺巨噬细胞和人肺泡上皮细胞及SARS-CoV-2重组spike蛋白；
S20、将人肺巨噬细胞和人肺泡上皮细胞共培养第一预设时间，得共培养体系；
S30、将SARS-CoV-2重组spike蛋白加入共培养体系共培养第二预设时间，得spike蛋白诱导的COVID-19急性肺损伤细胞模型。
2.如权利要求1所述的spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型建立方法，其特征在于，步骤S20中，人肺巨噬细胞与人肺泡上皮细胞的细胞数量比为1:（2~8）。
3.如权利要求1所述的spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型建立方法，其特征在于，步骤S20中，第一预设时间为12~48h。
4.如权利要求1所述的spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型建立方法，其特征在于，步骤S30中，spike蛋白在共培养体系中的质量浓度为5~15μg/mL。
5.如权利要求1所述的spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型建立方法，其特征在于，步骤S30中，第二预设时间为3~5天。
6.如权利要求1至5任意一项所述的spike蛋白诱导COVID-19急性肺损伤的细胞模型建立方法建立的细胞模型在COVID-19急性肺损伤的治疗药物筛选中的应用。
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