CN112674031B - 新型冠状病毒感染的啮齿动物模型的构建方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及动物模型构建技术领域，具体提供了一种新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染的啮齿类动物模型及其构建方法和用途，所述构建方法包括如下步骤：肺损伤动物模型的构建：选用免疫缺陷的动物作为对象构建肺损伤动物模型；细胞移植：将人源肺上皮细胞移植入所述肺损伤动物模型的肺部；SARS‑CoV‑2病毒感染：将SARS‑CoV‑2病毒移植入经细胞移植步骤处理之后的动物肺部进行感染，建立新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染的啮齿类动物模型，该方法不仅构建过程简便，容易操作，构建成本低，而且能够最大程度上模拟正常的人肺组织结构和人ACE2受体蛋白表达情况。
Description
技术领域
本发明涉及动物模型构建技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型及其构建方法和用途。
背景技术
新型冠状病毒病（coronavirus disease 2019, COVID-19）是一种新的传染病，是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus2, SARS-CoV-2）引起的一种呼吸道疾病，在全球范围内暴发流行，其高传染率和死亡率威胁全球。SARS-CoV-2感染人体后，最常见的症状有咳嗽、发热、气促和呼吸困难等，严重感染时可能导致严重急性呼吸综合征、肾衰竭甚至出现死亡。研究发现，SARS、MERS、SARS-CoV-2等冠状病毒感染会引起机体免疫调控网络失衡，引发细胞因子风暴综合征（cytokinestorm syndrome, CSS），使靶细胞如肺泡上皮细胞出现弥漫性损伤，从而使人体出现急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）、脓毒性休克及多器官功能障碍，甚至导致死亡。
SARS-CoV-2病毒通过其包膜上携带的S蛋白特异性识别人体细胞ACE2受体蛋白进入细胞，但由于ACE2蛋白在不同物种间存在较大的差异，所以目前能够作为COVID-19动物模型的物种多为非人灵长类动物。尽管非人灵长类动物模型在形态学、生理学、病理学和临床疾病与人有较高的相似性等诸多优势，但是由于价格昂贵、不易得到和数量有限等使用并不广泛。啮齿类动物由于价格便宜、易获得和使用、数量充足，常常作为药物和疫苗的研发的动物模型的首选物种。然而，由于人和啮齿类ACE2之间的差异，SARS-CoV-2病毒无法识别啮齿类ACE2，进而无法直接利用啮齿类动物建立COVID-19动物模型。
目前，COVID-19的发病机制不完全清楚，仍然没有针对SARS-CoV-2特异的治疗方法及药物和疫苗面市。针对COVID-19的基础研究集中在致病机制、抗SARS-CoV-2药物及疫苗的开发。动物模型的发展有助于深入了解其发病机制，以及加快药物和疫苗的研发，对于阻止 COVID-19 流行蔓延至关重要。同时在药物和疫苗进入临床研究之前，也需要严格、合适的模型以针对感染的人源肺脏细胞，验证药品和疫苗在体内环境下的安全性和有效性等问题。
为此，中国专利文献CN111621523A公开了一种ACE2细胞人源化的小鼠模型及其构建方法和应用，其构建方法包括（1）采用携带ACE2基因的慢病毒与包装细胞混合，制成慢病毒悬液，再将所述慢病毒悬液与母细胞混合，得到所述过表达ACE2受体的人源细胞；（2）通过尾静脉注射将所述过表达ACE2受体的人源细胞转移至免疫缺陷小鼠体内，培养得到所述ACE2人源化的小鼠模型。通过该方法构建得到的小鼠模型采用过表达ACE2受体的人源细胞株，如BCG823、A549、Huh7、Jurkat和293T等，这些细胞并非正常人体肺脏中存在的细胞类型，不具有健康肺脏细胞的形态和表达谱特征；此外，这些细胞株一旦定植到免疫缺陷小鼠体内，具有较强的增殖能力，可能生长成肿瘤组织，最终导致小鼠死亡。以上不足导致移植的细胞不能很好地模拟正常人肺生理状态和肺内实际ACE2受体的表达情况，从而导致该小鼠模型不能很好地发挥模拟作用。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中构建的新型冠状病毒模型无法正常表达人源ACE2受体蛋白以及模拟正常人肺生理状态的缺陷，从而提供了一种新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型及其构建方法和用途。
本发明提供了一种新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，包括如下步骤：
肺损伤动物模型的构建：选用免疫缺陷的动物作为对象构建肺损伤动物模型；
细胞移植：将人源肺上皮细胞移植入所述肺损伤动物模型的肺部；
SARS-CoV-2病毒感染：将SARS-CoV-2病毒移植入经细胞移植步骤处理之后的肺损伤动物模型的肺部进行感染，建立新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型。
优选地，所述人源肺上皮细胞选自人源肺上皮干细胞，例如，可以但不局限于选自人源支气管基底层细胞、人源远端气道干细胞、人源II型肺泡上皮细胞等。人源肺上皮干细胞的主要特征为能够自我更新，且能够在一定程度上分化成其他类型的肺上皮细胞，在原有上皮细胞受损或丢失的情况下，将外源性的这类细胞移植到损伤肺脏中，其能够整合到受损区域，通过增殖和分化，参与肺损伤后修复再生。
其中，支气管基底层细胞是在人体的支气管上皮基底层位置天然存在的一类具有干细胞特性的细胞，可通过纤维支气管镜刷取支气管上皮层样本获得。这类细胞具有自我更新和多向分化潜能。在肺脏受到损伤时，其一方面能够分化成分泌细胞和纤毛细胞，修复再生支气管上皮；另一方面, 也可分化为成熟的I型肺泡上皮及II型肺泡上皮细胞，完成肺实质的损伤修复。
远端气道干细胞是位于气道远端的一类支气管基底层细胞，可通过肺活检组织分离获得。其特征与支气管基底层类似，在肺脏受到损伤后，能够分化为多种成熟肺上皮细胞，从而主导肺损伤后修复再生的过程。
II型肺泡上皮细胞是肺内末端气道组织中主要行使分泌功能的细胞。近来的研究表明，II型肺泡上皮细胞中有一类Axin2基因高表达的细胞类群，其具有肺干细胞的特性，在特定条件下能够分化成为成熟的I型肺泡上皮及II型肺泡上皮细胞。
进一步地，在细胞移植步骤中，可以采用气管插管或者从声门处滴注的方式将人源肺上皮细胞移植入动物的肺部。也可以采用经鼻滴注的方式移植入动物的肺部。为了提高移植效率，优选采用经气管插管或者从声门处滴注的方式将人源肺上皮细胞移植入动物的肺部。
进一步地，在SARS-CoV-2病毒感染步骤中，可以采用气管插管或者从声门处滴注的方式经气管感染动物的肺部；也可以采用经鼻滴注的方式感染动物的肺部。
进一步地，所述肺损伤动物模型选自急性肺损伤动物模型或慢性肺损伤动物模型中的一种；优选地，所述肺损伤动物模型选自博来霉素诱导的肺损伤动物模型、熏烟法构建的肺损伤动物模型、机械通气导致的肺损伤动物模型、脂多糖联合猪胰蛋白酶诱导的肺损伤动物模型、油酸诱导的肺损伤动物模型或者高氧诱导的肺损伤动物模型。
进一步地，在肺损伤动物模型构建1天之内或者1天后进行细胞移植处理。
不同的肺损伤模型可以在不同的时间后进行细胞移植，也可以在相同的时间后进行细胞移植。例如博来霉素诱导的肺损伤模型优选在3天后进行细胞移植处理；更优选地，在肺损伤模型构建3-14天后进行细胞移植处理。其他肺损伤模型进行细胞移植的时间可以与博来霉素诱导的肺损伤模型相同，也可以不同。例如熏烟模型，可以在肺损伤模型构建完成后次日即进行细胞移植。
进一步地，在细胞移植步骤中，给予肺损伤动物模型的人源上皮细胞的细胞剂量不低于1×105个/只；优选地，细胞剂量为0.5-5×106个/只。
当采用人源肺上皮细胞悬液进行移植时，以不低于1×105个/只的剂量注入所述肺损伤动物模型的肺部。优选地，以0.5-5×106个/只的剂量注入所述肺损伤动物模型的肺部。
进一步地，在细胞移植至少1天后进行SARS-CoV-2病毒感染处理；优选地，在细胞移植7-21天后进行SARS-CoV-2病毒感染处理。
本发明验证过程中，采用SARS-CoV-2假病毒悬液进行感染，可以以不低于102TU的剂量，注入动物的肺部，优选地，以104TU、105TU、106TU、107TU的剂量注入动物肺部。
实际使用过程中，当采用SARS-CoV-2真病毒悬液进行感染时，可以以不低于102TCID50（半数组织培养感染剂量）的剂量注入动物的肺部，优选地，以103TCID50、104TCID50、105TCID50、106 TCID50的剂量注入动物肺部。
将SARS-CoV-2病毒悬液注入动物肺部之后即可构建得到新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型，本领域技术人员可以根据实验目的即刻使用或者感染若干天之后使用，例如，可以在感染4天之后使用，或者在感染7天之后使用，或者在感染14天之后使用，或者在感染21天之后使用，或者在感染大于21天之后使用。
进一步地，所述啮齿类动物选自免疫缺陷的小鼠、免疫缺陷的大鼠、免疫缺陷的豚鼠中的一种。
优选地，所述啮齿类动物选自NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl小鼠和/或NOD/SCIDIL2rg-/-Foxn1-/-型小鼠和/或NOD/SCID IL2rg-/-型小鼠。
本发明还提供了上述任一所述的构建方法制备得到的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型。
本发明还提供了上述任一所述的构建方法制备得到的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的用途，该模型用于筛选或鉴定能够预防、缓解或者治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的药物；和/或，将该模型用于筛选或鉴定能够预防新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的疫苗。
需要说明的是，无论人源细胞是否进行荧光蛋白或报告基因标记，该动物模型均能够成功被构建，且荧光蛋白或报告基因标记仅作为后续对移植的人源细胞进行示踪的技术手段，并不影响模型构建的效率。荧光蛋白或报告基因可选择绿色荧光蛋白eGFP、红色荧光蛋白Tdtomato、红色荧光蛋白mCheery、Luciferase报告基因系统等。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，选用免疫缺陷的动物作为对象构建肺损伤动物模型；将人源肺上皮细胞移植入所述肺损伤动物模型的肺部；使其生长成具有人肺组织结构的嵌合肺动物，将SARS-CoV-2病毒移植入经细胞移植步骤处理之后的肺损伤动物模型的肺部进行感染，建立新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型，该动物模型能够最大程度上模拟正常的人肺组织结构和ACE2受体表达情况，从而模拟SARS-CoV-2病毒通过ACE2受体蛋白识别、入侵人肺细胞的实际过程，成功构建得到新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型。
而且，与来源于肿瘤或胚胎的其他细胞类型相比，本发明采用的人源肺上皮细胞还具有成瘤风险低的优点，将人源肺上皮细胞移植到小鼠肺脏的损伤区域，完成损伤修复过程、再生出人肺组织后，移植的细胞即进入静息状态。再生的组织能够长时间地存在于免疫缺陷的动物模型的肺部，且几乎不存在移植细胞不受控地扩增、最终生成肿瘤导致小鼠死亡的风险，从而提高了模型的稳定性；此外还具有构建过程简便，容易操作，构建成本低，且感染效率高的优点。
2.本发明提供的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，通过采用经气管或鼻腔注入的方式将人源肺上皮细胞悬液移植到动物的肺部，移植的细胞能够定植在肺部损伤的区域，并逐渐增殖、分化，形成人支气管和肺泡组织结构，而且，与经循环系统输注的方式移植细胞相比，采用经气管或鼻腔注入的方式的人源细胞无法穿过气道与肺部微血管之间的屏障，因此仅能够特异性地分布在小鼠肺脏中，不会出现细胞随血液循环分布到其他组织器官中的风险，排除了细胞非特异性定植对后续实验结果的干扰，使构建的模型具有更高的稳定性。
3.本发明提供的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，通过采用气管注入或者鼻腔注入的方式将SARS-CoV-2病毒悬液感染动物模型的肺部，这在最大程度上模拟了病毒通过呼吸道传播感染人体的过程，保证新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的成功构建，具有更高的感染效率和稳定性。
4.本发明提供的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，当采用博来霉素诱导的肺损伤动物模型时，优选在肺损伤动物模型构建3-14天后进行细胞移植处理，通常在此时间段内，肺内损伤达到较为严重的程度，且小鼠肺脏自有的各种内源性肺干细胞尚未完成修复再生过程，此时移植人源细胞能够确保其大面积地整合到小鼠肺脏受损的区域，人肺组织的占比更多，从而进一步提高感染效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实验例1中实施例1构建的嵌合造模组小鼠肺的免疫荧光染色图；
图2是实验例2中实施例1构建的无移植对照组和感染造模组小鼠肺的荧光图；
图3是实验例3中实施例2构建的无移植对照组、感染后4天组和感染后21天组小鼠肺的的免疫荧光染色图；
图4是实验例4中实施例5构建的感染造模组小鼠肺的免疫荧光染色图；
图5是实验例4中实施例5构建的感染造模组和无移植对照组被病毒感染的人源细胞百分数对比结果；
图6是实验例5中实施例6构建的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的动物模型的免疫荧光染色图；
图7是实验例6中对比例1构建的模型小鼠肺的荧光图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
其中，慢病毒包装质粒pHIV-dTomato（#21374）、psPAX2（#12260）和pMD2.G（#12259），由美国Addgene质粒保藏中心提供。带有GFP标记的SARS-Cov-2S蛋白假病毒悬液，购自广州派真生物技术有限公司，型号：LV-nCov2。包装细胞293T由美国菌种保藏中心ATCC提供，编号ATCC® CRL-11268™。NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，品系代码：406。人特异性ACE2蛋白一抗购自Novus，货号AF933。GFP蛋白一抗购自Abcam，货号ab6673。人特异性LaminA+C蛋白一抗购自Abcam，货号40567。
实施例1
本实施例提供了一种采用博来霉素损伤模型和Tdtomato荧光蛋白标记的人支气管基底层细胞构建新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的方法，包括如下步骤：
（1）人类支气管基底层细胞的标记：将慢病毒包装质粒pHIV-dTomato、psPAX2和pMD2.G，按照质量比为5：3.75：1.25的比例混合，转染包装细胞293T，共培养72小时后，收取含有Tdtomato慢病毒的培养上清液，于4℃，2000g离心10分钟，除去细胞碎片。采用0.45μm滤器过滤上清液，收集于超速离心管中。4℃，25000g超速离心浓缩，得到Tdtomato慢病毒悬液。在测定Tdtomato慢病毒滴度后，按照每1×106个人支气管基底细胞中加入107TU的Tdtomato慢病毒进行共培养，12小时后换液，继续培养，期间持续观察荧光信号，确定细胞被Tdtomato荧光蛋白稳定标记后，继续扩增使细胞量达到1.5×106个以上时，消化收集细胞，采用无菌PBS重悬，得到经Tdtomato荧光蛋白标记的人支气管基底层细胞悬液。
（2）肺损伤模型的构建：准备6-8周龄NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl小鼠，分为无移植对照组、嵌合造模组、感染造模组，每组4只小鼠。分别使用异氟烷进行吸入式麻醉后进行气管插管，取博来霉素-PBS溶液，通过注射器经导管向无移植对照组、嵌合造模组和感染造模组的肺部给药，每只小鼠给药体积为40μL，给药剂量为30μg博来霉素/只。
（3）细胞移植：博来霉素给药7天后，对无移植对照组、嵌合造模组和感染造模组的小鼠，再次使用异氟烷麻醉小鼠后进行气管插管。取步骤（1）得到的Tdtomato荧光蛋白标记的人支气管基底层细胞悬液，通过注射器经导管注入小鼠肺部，给予的细胞剂量为1×106个细胞/只，给药体积为50μl/只。无移植对照组小鼠，在使用同样的方法进行麻醉插管后，仅经导管给予50μl无菌PBS溶液。
细胞移植处理14天后，取嵌合造模组小鼠，进行安乐死后取其肺组织，进行病理组织学切片和染色，确定其嵌合肺内人源ACE2受体蛋白的表达，具体实验步骤和试验结果见实验例1。
（4）SARS-CoV-2病毒感染：细胞移植14天后，将感染造模组小鼠使用异氟烷麻醉并进行气管插管，将浓度为1.67×107TU/mL的带有GFP标记的SARS-Cov-2S蛋白假病毒悬液通过导管注入小鼠肺部，感染肺脏，给予体积为50μl/只，即得新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型。对无移植对照组小鼠，在使用同样的方法进行麻醉插管后，仅经导管给予50μl无菌PBS溶液。
在SARS-CoV-2病毒感染处理14天后，取感染造模组和无移植对照组小鼠肺组织进行观察，具体实验步骤和试验结果见实验例2。
其中，人类支气管基底层细胞悬液可以采用本领域的常规方法培养制备，例如专利文献CN111944737A公开的方法，本实施例中的人类支气管基底层细胞悬液的制备方法如下：
取离体活性支气管刷检组织备用，在本实施例中选择取位于支气管两个不同部位的组织。
取组织消化液和终止液备用；其中组织消化液中，99v%为DMEM/F12，其余为10ng/mL的DNA酶，1mg/mL蛋白酶XIV和100ng/mL胰酶；终止液中90v%为DMEM，10v%为FBS。
利用组织消化液对上述刷检组织进行消化处理，利用终止液对经消化处理后的组织进行终止消化后收集细胞。
取培养基备用，其中培养基中225mL DMEM，225mL F12，50mL FBS，1mM L-谷氨酰胺（L-glutamine），10ng/mL 胰岛素，0.2ng/mL表皮生长因子，15μg/mL 腺嘌呤，10μg/mL 氢化可的松。
取部分经消化处理后的细胞，用培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞（经丝裂霉素C处理的NIH/3T3 细胞）的6孔培养板一孔中，在37℃，CO2浓度为7.5%条件下培养，隔天更换培养基，待细胞呈克隆状生长至细胞聚集成团，细胞克隆长大至超过80%的克隆中有40-100个细胞时，收集细胞。
利用铺被滋养层细胞的6cm培养皿对收集细胞进行培养，待长满至细胞培养板表面积的50%-90%时，消化培养的细胞再次进行传代培养。方法为：去细胞培养上清，1×DPBS洗涤一次，加入1mL 0.25%（质量体积比0.25g／100mL）胰酶37℃消化5分钟，待大部分细胞变圆变亮后，将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液，终止消化，收集细胞悬液，1200rpm离心3分钟去上清，并用培养基重悬细胞，最后将约5-10×105细胞铺于1个铺被滋养层细胞的6cm培养皿上进行培养，隔天换液。随后每当传代细胞长满至培养皿表面积的50%-90%时，进行下一次传代培养，直至培养至106个细胞后，进行荧光蛋白标记的操作。
实施例2
本实施例提供了一种采用博来霉素损伤模型和人支气管基底层细胞构建新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的方法，包括如下步骤：
（1）肺损伤模型的构建：准备6-8周龄NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl小鼠，分为无移植对照组、感染后4天组和感染后21天组，每组1只小鼠。分别使用异氟烷进行吸入式麻醉后进行气管插管，取博来霉素-PBS溶液，通过注射器经导管向3组小鼠肺部给药，每只小鼠给药体积为50μL，给药剂量为50μg博来霉素/只。
（2）细胞移植：博来霉素给药7天后，对感染后4天组和感染后21天组的小鼠，再次使用异氟烷麻醉小鼠后进行气管插管。取按照实施例1的方法制得的人类支气管基底层细胞悬液（未经人类支气管基底层细胞的标记步骤处理），通过注射器经导管注入小鼠肺部，剂量为3×106个细胞/只，体积为150μl/只。对无移植对照组小鼠，在使用同样的方法进行麻醉插管后，仅经导管给予150μl无菌PBS溶液。
（3）SARS-CoV-2病毒感染：细胞移植14天后，将3组小鼠均使用异氟烷麻醉并进行气管插管，将浓度为1.67×107TU/mL的带有GFP标记的SARS-Cov-2 S蛋白假病毒悬液通过气管注入小鼠肺部，感染肺脏，给予体积为50μl/只，即得新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型。
其中感染4天后取感染后4天组小鼠和无移植对照组小鼠，感染21天后取感染后21天组小鼠，进行安乐死后取其肺组织，进行病理组织学切片和染色，具体实验方法和结果见实验例3。
实施例3
本实施例提供了一种采用脂多糖联合猪胰蛋白酶诱导的肺损伤模型和人支气管基底层细胞构建新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的方法，包括如下步骤：
（1）肺损伤模型的构建：准备3只6-8周龄NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl小鼠。使用异氟烷麻醉后每只小鼠经声门处向气管滴注给予40μL猪胰蛋白酶 (10 U/mL) 和0.8μL脂多糖 (10 mg/mL) 的预混液（溶剂为无菌PBS）。所有小鼠连续滴注损伤3天，每天1次，每次滴注预混液的体积为40.8μL 肺损伤模型构建完成。
（2）细胞移植：肺损伤模型构建完成后第2天进行细胞移植，使用异氟烷麻醉后，取按照实施例1的方法制得的人类支气管基底层细胞悬液（未经人类支气管基底层细胞的标记步骤处理），经声门处向气管滴注，给予细胞的剂量为3×106个细胞/只，给予体积为150μl/只。
（3）SARS-CoV-2病毒感染：细胞移植14天后，使用异氟烷麻醉小鼠后，将浓度为1.67×107TU/mL的带有GFP标记的SARS-Cov-2 S蛋白假病毒悬液经声门处向气管滴注，感染肺脏，给予体积为50μl/只，即得新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型。
实施例4
本实施例提供了一种采用熏烟肺损伤模型和人支气管基底层细胞构建新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，包括如下步骤：
（1）肺损伤模型的构建：准备6只6-8周龄NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl小鼠，放置于熏烟箱中进行慢性熏烟肺损伤。熏烟造模总周期为24周，每周熏烟不少于5次。其中每天熏烟两次，上午和下午各一次，且时间间隔不少于4小时，每次60分钟。每次熏烟使用4-6只香烟，且对熏烟箱内空气的质量要求需满足：CO浓度约为1000ppm，O2浓度≥18%，CO2浓度≤5%。除熏烟外其他时间，实验动物饲养在常规SPF级饲养箱中。
（2）细胞移植：熏烟损伤周期结束后第3天进行细胞移植，使用异氟烷麻醉小鼠后进行气管插管。取按照实施例1的方法制得的人类支气管基底层细胞悬液（未经人类支气管基底层细胞的标记步骤处理），通过注射器经气管注入小鼠肺部，给予剂量为2×106个细胞/只，给予体积为100μl。
（3）SARS-CoV-2病毒感染：细胞移植14天后，使用异氟烷麻醉小鼠并进行气管插管，将浓度为1.67×107TU/mL的带有GFP标记的SARS-Cov-2 S蛋白假病毒悬液通过气管注入小鼠肺部，感染肺脏，给予体积为50μl/只，即得新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型。
实施例5
本实施例提供了一种新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，包括如下步骤：
（1）肺损伤模型的构建：准备6-8周龄NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl小鼠，分为无移植对照组、感染造模组，每组4只小鼠。分别使用异氟烷麻醉后进行气管插管，取博来霉素-PBS溶液，通过注射器经导管向肺部给药，每只小鼠给药体积为60μL，给药剂量为30μg博来霉素/只。
（2）细胞移植：博来霉素给药7天后，对感染造模组的小鼠，再次使用异氟烷麻醉小鼠后进行气管插管。取按照实施例1的方法制得的人支气管基底层细胞悬液（未经人类支气管基底层细胞的标记步骤处理），通过注射器经气管注入小鼠肺部，剂量为2.5×106个细胞/只，体积为60μl/只。对无移植对照组小鼠，在使用同样的方法进行麻醉插管后，仅经导管给予50μl 无菌PBS溶液。
（3）SARS-CoV-2病毒感染：细胞移植7天后，将无移植对照组和感染造模组小鼠使用异氟烷麻醉并进行气管插管，将浓度为1.67×107TU/mL的带有GFP标记的SARS-Cov-2S蛋白假病毒悬液通过气管注入小鼠肺部，感染肺脏，给予体积为50μl/只，即得。
实施例6
本实施例提供了一种采用博来霉素损伤模型和Tdtomato荧光蛋白标记的人远端气道干细胞构建新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的方法，包括如下步骤：
（1）人远端气道干细胞的培养和标记：取肺穿刺活检组织（在其他实施例中可以采用胸腔镜活检组织代替肺穿刺活检组织），在无菌环境下分离得到远端气道组织（细支气管和终末支气管）。利用组织消化液对上述远端气道组织进行消化处理，利用终止液对经消化处理后的组织进行终止消化后收集细胞。取经消化处理后的细胞，用培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞（经丝裂霉素C处理的NIH/3T3 细胞）的培养皿中，在37℃，CO2浓度为5%条件下培养，每两天更换培养基，待细胞呈克隆状生长至细胞聚集成团，细胞克隆长大至超过80%的克隆中有40-100个细胞时，对细胞进行传代培养。方法为：去细胞培养上清，用无菌PBS洗涤一次，加入1mL 0.25%胰酶37℃消化10分钟，待大部分细胞变圆变亮后，将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液，终止消化，收集细胞悬液，1200rpm离心3分钟去上清，并用培养基重悬细胞，最后按照约3×105细胞铺于1个铺被滋养层细胞的6cm培养皿的比例进行培养，隔天换液。随后每当传代细胞长满至培养皿表面积的70%-80%时，进行下一次传代培养。直至培养至106个细胞后，进行荧光蛋白标记的操作。组织消化液、终止液和培养基配方同实施例1。
（2）人远端气道干细胞的标记：将慢病毒包装质粒pHIV-dTomato、psPAX2和pMD2.G，按照质量比为5：3.75：1.25的比例混合，转染包装细胞293T，共培养72小时后，收取含有Tdtomato慢病毒的培养上清液，于4℃，2000g离心10分钟，除去细胞碎片。采用0.45μm滤器过滤上清液，收集于超速离心管中。4℃，25000g超速离心浓缩，得到Tdtomato慢病毒悬液。在测定Tdtomato慢病毒滴度后，按照每1×106个人远端气道干细胞中加入107TU的Tdtomato慢病毒进行共培养，12小时后换液，继续培养，期间持续观察荧光信号，确定细胞被Tdtomato荧光蛋白稳定标记后，继续扩增使细胞量达到1.5×106个以上时，消化收集细胞，采用无菌PBS重悬，得到浓度为1×107个/mL经Tdtomato荧光蛋白标记的人远端气道干细胞悬液。
（3）肺损伤模型的构建：准备1只6-8周龄NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl小鼠。使用异氟烷进行吸入式麻醉后进行气管插管，取博来霉素-PBS溶液，通过注射器经导管向小鼠肺部给药，每只小鼠给药体积为50μL，给药剂量为40μg博来霉素/只。
（4）细胞移植：博来霉素给药7天后，再次使用异氟烷麻醉小鼠后进行气管插管。取步骤（2）得到的Tdtomato荧光蛋白标记的人远端气道干细胞悬液，通过注射器经导管注入小鼠肺部，注入细胞的剂量为1×106个细胞/只，体积为100μl。
（5）SARS-CoV-2病毒感染：细胞移植10天后，使用异氟烷麻醉小鼠并进行气管插管，将浓度为1.67×107TU/mL的带有GFP标记的SARS-Cov-2S蛋白假病毒悬液通过气管注入小鼠肺部，感染肺脏，给予体积为50μl/只，即得。
对比例1
本对比例提供了一种模型构建方法，包括如下步骤：
（1）人类支气管基底层细胞的标记：与实施例1的“人类支气管基底层细胞的标记”的操作相同。
（2）细胞移植：准备3只6-8周龄NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl小鼠，使用异氟烷麻醉后进行气管插管。取步骤（1）得到的Tdtomato荧光蛋白标记的人支气管基底层细胞悬液，通过注射器经导管注入小鼠肺部，每只小鼠的给予体积为50μl，剂量为1×106个细胞/只。
（3）SARS-CoV-2病毒感染：细胞移植7天后，将细胞移植处理后的小鼠使用异氟烷麻醉并进行气管插管，将浓度为1.67×107TU/mL的带有GFP标记的SARS-Cov-2 S蛋白假病毒悬液通过气管注入小鼠肺部，感染肺脏，给予体积为50μl/只，即得。SARS-CoV-2病毒感染14天后对其进行安乐死，取其肺组织，进行病理组织学切片和染色，具体实验步骤和试验结果见实验例6。
实验例1
对实施例1中嵌合造模组的小鼠，在细胞移植14天后进行肺脏取材，具体步骤为：将小鼠脱颈处死，剪开胸腔，离断食管，经气管反复灌洗3.7%多聚甲醛溶液，离断气管，取出小鼠肺组织，放入3.7%多聚甲醛溶液中，置于4度冰箱过夜。然后置于OCT中冷冻并切片。切片后，将冰冻切片进行免疫荧光染色，针对的标志物分别为人特异性ACE2蛋白（仅在人源细胞的细胞膜表达）和人特异性LaminA+C（仅在人源细胞的细胞核中表达），随后进行DAPI复染（人源和鼠源所有细胞的细胞核均能着色）。
结果如图1所示，在免疫缺陷小鼠肺脏中有大量人特异Lamin A+C蛋白的表达，说明在移植后14天，人源的细胞能够大量定植到小鼠肺部。而人特异ACE2蛋白在相同区域表达，说明移植的细胞能够广泛表达人源性ACE2蛋白，为冠状病毒提供了识别的表面受体。
实验例2
SARS-CoV-2病毒感染处理14天后，对于实施例1的感染造模组和无移植对照组进行肺脏取材，荧光体视镜观察。具体步骤为：将两组小鼠脱颈处死，剪开胸腔，离断食管，经气管反复灌洗3.7%多聚甲醛溶液，离断气管，取出小鼠肺组织，置于荧光体视镜下观察Tdtomato和GFP信号。
如图2所示，图中白色线条表示小鼠肺叶所处的位置，明场视野表示取材的小鼠肺叶的外观图，红色荧光视野表示移植的Tdtomato+人源支气管基底层细胞的子代细胞，可见在感染造模组中，红色荧光广泛分布于小鼠肺脏中，面积较大；而在无移植对照组中，没有观察到特异性红色荧光。说明Tdtomato+人支气管基底层细胞能够成功地定植到肺损伤小鼠肺中，并广泛分布。绿色荧光视野表示被携带GFP表达基因的假病毒感染的细胞，可见在感染造模组中，绿色荧光在Tdtomato+人源细胞的局部区域出现信号，说明这些细胞被病毒感染，说明采用实施例1的方法可以成功构建新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型。而无移植对照组中，没有绿色荧光信号。
实验例3
取实施例2制得的感染4天组、感染21天组和无移植对照组的小鼠肺部进行免疫荧光染色，具体步骤为：将各组小鼠脱颈处死，剪开胸腔，离断食管和气管，取出小鼠肺组织。放入3.7%多聚甲醛溶液中，置于4度冰箱过夜。然后置于OCT中冷冻并切片。切片后，将冰冻切片进行免疫荧光染色，针对的标志物分别为GFP蛋白（仅在表达GFP的细胞中表达）和人特异性LaminA+C（仅在人源细胞的细胞核中表达），随后进行DAPI复染（人源和鼠源所有细胞的细胞核均能着色）。结果如图3所示。
免疫荧光染色结果证实，感染后4天组和感染后21天组的小鼠接受了人支气管基底层细胞移植，其肺组织切片染色能够观察到人支气管基底层细胞（Lamin A+C阳性细胞）成功地定植到免疫缺陷小鼠肺中；而未移植的对照组小鼠，其肺中没有观察到人的细胞（Lamin A+C阳性细胞）。
而且，感染4天组和感染21天组的小鼠的肺脏中均有广泛的绿色荧光信号分布，对采集的两组小鼠肺组织免疫荧光染色的图像进行定量分析，在感染4天后，有21.5%的LaminA+C阳性细胞能够表达绿色荧光蛋白，而在感染21天后，有52.6%的Lamin A+C阳性细胞能够表达绿色荧光蛋白。这些绿色的细胞被携带GFP表达基因片段的假病毒感染，因此被假病毒感染的细胞能够表达绿色荧光蛋白，说明采用实施例2的方法可以成功构建新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型，而且在病毒感染后随时间延长，被感染的人源细胞百分比逐渐升高。根据荧光染色未移植的对照组小鼠的肺中没有观察到GFP信号，证实小鼠肺不能被假病毒感染。
实验例4
SARS-CoV-2病毒感染4天后，取实施例5处理后的感染造模组和无移植对照组进行小鼠肺脏取材，置于荧光体视镜观察。具体步骤为：将小鼠脱颈处死，剪开胸腔，离断食管和气管，取出小鼠肺组织，置于荧光体视镜下观察GFP信号。
其中，4只无对照移植组小鼠肺内全部没有GFP绿色荧光信号（感染效率为0%），4只感染造模组小鼠均发现GFP信号（感染效率为100%），说明感染造模组100%能够被携带GFP的假病毒感染。
随后，取所有小鼠肺脏进行切片和免疫荧光染色。具体步骤为：将肺组织放入3.7%多聚甲醛溶液中，置于4℃冰箱过夜。然后置于OCT中冷冻并切片。切片后，将冰冻切片进行免疫荧光染色，针对的标志物分别为GFP蛋白（仅在表达GFP的细胞中表达）和人特异性LaminA+C（仅在人源细胞的细胞核中表达），随后进行DAPI复染（人源和鼠源所有细胞的细胞核均能着色）。对采集的两组小鼠肺组织免疫荧光染色的图像进行定量分析，结果如图4和5所示。图4为感染造模组具有代表性的用于定量分析的图像，图5为经统计分析后的定量结果。
经统计分析，感染造模组的小鼠肺中，以人源细胞总个数为基准，有21.4±2.89%的人源细胞能够被假病毒感染；无移植对照组的小鼠肺中，由于没有人源细胞，所以不能被假病毒感染。
实验例5
SARS-CoV-2病毒感染4天后，对于实施例6的小鼠进行肺脏取材，置于荧光体视镜观察。具体步骤为：将小鼠脱颈处死，剪开胸腔，离断食管，经气管反复灌洗3.7%多聚甲醛溶液，离断气管，取出小鼠肺组织，置于荧光体视镜下观察Tdtomato和GFP信号。
如图6所示，明场视野是取材的小鼠肺的外观图，红色荧光视野表示移植的Tdtomato+人远端气道干细胞的子代细胞，绿色荧光视野表示被携带GFP表达基因的假病毒感染的细胞，可见一部分Tdtomato+人源细胞能够被SARS-CoV-2病毒感染，说明采用实施例6的方法可以构建采用人远端气道干细胞构建的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的模型。
实验例6
SARS-CoV-2病毒感染14天后，对于对比例1的小鼠进行肺脏取材，置于荧光体视镜观察。具体步骤为：将小鼠脱颈处死，剪开胸腔，离断食管，经气管反复灌洗3.7%多聚甲醛溶液，离断气管，取出小鼠肺组织，置于荧光体视镜下观察Tdtomato和GFP信号。
如图7所示，图中白色线条表示小鼠肺叶所处的位置，明场视野表示取材的小鼠肺叶的外观图，红色荧光视野表示移植的Tdtomato+人源支气管基底层细胞，绿色荧光视野表示被携带GFP表达基因的假病毒感染的细胞，由图4可知，红色荧光视野和绿色荧光视野均无可见信号。可见如果没有预先进行小鼠肺脏损伤造模，则移植的Tdtomato+人源细胞不能整合到小鼠肺脏，小鼠肺脏不能被病毒感染。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (15)
1.一种新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：肺损伤动物模型的构建：选用免疫缺陷的动物作为对象构建肺损伤动物模型；
细胞移植：将人源肺上皮细胞移植入所述肺损伤动物模型的肺部；
SARS-CoV-2病毒感染：将SARS-CoV-2病毒移植入经细胞移植步骤处理之后的肺损伤动物模型的肺部进行感染，建立新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型；
其中所述人源肺上皮细胞为人源肺上皮干细胞。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，其特征在于，所述人源肺上皮干细胞选自人源支气管基底层细胞、人源远端气道干细胞、人源Ⅱ型肺泡上皮细胞中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，其特征在于，在所述细胞移植步骤中，采用经气管或鼻腔注入的方式将人源肺上皮细胞移植入动物的肺部。
4.根据权利要求1或2所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，其特征在于，在所述SARS-CoV-2病毒感染步骤中，采用经气管或鼻腔注入的方式将SARS-CoV-2病毒移植入动物的肺部。
5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，其特征在于，在肺损伤动物模型构建1天之内或者1天后进行细胞移植处理。
6.根据权利要求5所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，其中在肺损伤动物模型构建3-7天后进行细胞移植处理。
7.根据权利要求1所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，其特征在于，在细胞移植步骤中，给予肺损伤动物模型的人源肺上皮细胞的细胞剂量不低于1×105个/只。
8.根据权利要求7所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，其中在细胞移植步骤中，给予肺损伤动物模型的人源肺上皮细胞的细胞剂量为0.5-5×106个/只。
9.根据权利要求1所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，其特征在于，在细胞移植至少1天后进行SARS-CoV-2病毒感染处理。
10.根据权利要求9所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，其中在细胞移植7-21天后进行SARS-CoV-2病毒感染处理。
11.根据权利要求1所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，其特征在于，所述啮齿类动物选自免疫缺陷的小鼠、免疫缺陷的大鼠和免疫缺陷的豚鼠中的一种。
12.根据权利要求11所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，其中所述啮齿类动物选自NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl小鼠、NOD/SCID IL2rg-/-Foxn1-/-型小鼠和NOD/SCID IL2rg-/-型小鼠中的一种。
13.根据权利要求1所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，其特征在于，所述肺损伤动物模型选自急性肺损伤动物模型或慢性肺损伤动物模型中的一种。
14.根据权利要求13所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的构建方法，其中所述肺损伤动物模型选自博来霉素诱导的肺损伤动物模型、熏烟法构建的肺损伤动物模型、机械通气导致的肺损伤动物模型、脂多糖联合猪胰蛋白酶诱导的肺损伤动物模型、油酸诱导的肺损伤动物模型或者高氧诱导的肺损伤动物模型。
15.一种根据权利要求1-14中任一所述的构建方法制备得到的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的啮齿类动物模型的用途，其特征在于，将该模型用于筛选或鉴定能够预防、缓解或者治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的药物；和/或，将该模型用于筛选或鉴定能够预防新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的疫苗。
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