CN102735804B - 仅鼻拟人吸烟大鼠免疫功能评价指标的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种仅鼻拟人吸烟大鼠免疫功能评价指标的筛选方法，包括步骤：以吸空气大鼠血清、脾淋巴细胞、脾淋巴细胞培养上清液、腹腔巨噬细胞及血液作为正常对照组，经鼻连续抽吸卷烟大鼠血清脾淋巴细胞、脾淋巴细胞培养上清液、腹腔巨噬细胞及血液作为吸烟组；检测各组淋巴细胞增殖能力、腹腔巨噬细胞吞噬情况、IL-6、TNF-α、Ig、IgG、IgE含量和白细胞分类计数；最终筛选出淋巴细胞增殖的刺激指数、IL-6、IgG、IgE含量、白细胞分类计数五个指标作为敏感稳定的评价指标反应吸烟大鼠免疫功能的变化。该方法科学全面，筛选出的评价指标具有良好的敏感稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学评价指标筛选领域，具体涉及一种仅鼻拟人吸烟大鼠免疫功能评价指标的筛选方法。
背景技术
卷烟烟气是一种复杂的混合物，它含有6000多种化学物质，卷烟燃烧是一个非常复杂的物理化学过程，由于烟草组分的热分解和燃烧等反应会生成大量化学物质，其中有CO、自由基、多环芳烃(PAHs)、杂环化合物、醌类、酚类、醛类、酮类、酸类、酯类、脂肪族化合物等有机成分，还包含有痕量的无机元素如Fe、Cu、Cr、Cd、Zn等。而高浓度的自由基以及可与其他物质反应而生成活性物质的化学成分如CO、醛类及多环芳烃类等活性物质可损伤细胞，攻击DNA，形成共价的DNA加合物，引起DNA碱基错配，DNA单链或双链断裂，导致DNA损伤，从而引起机体各种机能的变化。
因此吸烟是一个主要的健康风险因素，会增加包括呼吸道感染、慢性阻塞性肺炎、肺癌、心脏病等各种疾病的发病率(Talhout R，Schulz T，FlorekE，et al.Hazardous compounds in tobacco smoke.Int J Environ Res PublicHealth.2011，8(2)：613-28.)。卷烟点燃时所释放的焦油和一氧化碳等化学物质，可以刺激呼吸道，损伤血管内膜，降低红血球输氧能力，增加心脑血管疾病的发病率和死亡率，促进癌症的发生。吸烟是一种损伤和促炎反应，及免疫抑制因素(Patel RR，Ryu JH，Vassallo R.Cigarette smoking anddiffuse lung disease.Drugs 2008；68：1511-1527；Kim V，Rogers TJ，Criner GJ.New concepts in the pathobiology of chronic obstructive pulmonary disease.Proc Am Thorac Soc 2008；5：478-485.)，有证据显示烟草烟雾会破坏呼吸道上皮的屏障功能，巨噬细胞功能被抑制，淋巴细胞凋亡增加，炎症局部淋巴细胞和嗜酸性粒细胞浸润增加，毒性T淋巴细胞比例增加(Tc)，炎性细胞因子分泌活跃(包括IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α)，最终影响机体的天然和获得性免疫功能(Domagala-Kulawik J.Effects of cigarette smoke onthe lung and systemic immunity.J Physiol Pharmacol.2008，59Suppl6：19-34.)。其中，IL-6是由激活的T(Th2)细胞、B细胞、单核-巨噬细胞、纤维母细胞、内皮细胞以及某些肿瘤细胞所分泌的致炎因子，在炎症和急相性反应中起重要作用。
这些免疫功能的改变与烟草中大量有害成分含量密切相关。焦油是卷烟烟气中主要的有害物质，由多种烃及烃的氧化物、硫化物和氮化物等复杂化合物组成。焦油进入生物活体后，引起细胞中如DNA、RNA、蛋白质的损伤，从而干扰细胞正常机能。体外研究显示焦油含量越高，对细胞的毒性作用也越强。体内研究中，高焦油和低焦油香烟对机体的免疫损伤是否存在差异，这种差异与哪些因素相关，目前尚不清楚，也没有相应的报道。
烟草对人体健康的不利影响已在全世界被广泛报道，寻找稳定敏感的免疫监测指标对监测保护人群健康至关重要，监测有害物质含量与免疫功能变化的相关性对于减少和控制吸烟引起的相关疾病具有重要意义，但目前尚缺乏敏感稳定的免疫评价指标。因此，研究免疫功能评价指标，筛选出敏感稳定的免疫评价指标对科学降低卷烟的危害性具有重大的意义。
发明内容
本发明提供了一种仅鼻拟人吸烟大鼠免疫功能评价指标的筛选方法，筛选结果比较科学全面。
一种仅鼻拟人吸烟大鼠免疫功能评价指标的筛选方法，包括以下步骤：
(1)以吸空气大鼠的血清、脾淋巴细胞、脾淋巴细胞培养上清液、腹腔巨噬细胞及血液作为正常对照组，经鼻连续抽吸卷烟的大鼠的血清、脾淋巴细胞、脾淋巴细胞培养上清液、腹腔巨噬细胞及血液作为吸烟组；
(2)利用MTT增殖法检测步骤(1)中各组脾淋巴细胞增殖能力，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃；
(3)利用鸡红细胞吞噬实验法检测步骤(1)中各组腹腔巨噬细胞吞噬百分比(即吞噬百分率)和吞噬指数，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃；
(4)利用ELISA法检测步骤(1)中各组脾淋巴细胞培养上清液和血清中IL-6及TNF-α细胞因子浓度，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃；
(5)检测步骤(1)中各组血清中总免疫球蛋白(Ig)含量、IgG含量及IgE含量，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃；
(6)利用瑞氏染液染色法检测步骤(1)中各组血液中白细胞分类计数，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃。步骤(2)具体步骤包括：将步骤(1)中各组脾淋巴细胞1×106个/ml加入培养板，每孔0.1ml，再加入刺激细胞伴刀豆蛋白，使伴刀豆蛋白终浓度为10μg/ml，作为加刺激细胞组，并设不加伴刀豆蛋白的阴性对照组和不加脾淋巴细胞和ConA的空白对照组，均置于5％CO2培养箱，37℃培养68h，每孔加入10μlMTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)溶液，放回培养箱孵育后加入MTT溶媒100μl/孔，在570nm波长处测OD值，淋巴细胞的增值能力以刺激指数表示，刺激指数＝加刺激细胞组OD值/阴性对照组OD值，比较各组刺激指数，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该刺激指数作为评价指标，反之，放弃。
步骤(3)具体步骤包括：将步骤(1)中各组纯化的腹腔巨噬细胞用RPMI-1640培养液配制成106个/ml，加入5％的鸡红细胞悬液0.04ml，其中鸡红细胞107个/ml，置于37℃水浴中孵育15-30min，离心，弃上清，将沉淀的鸡红细胞涂片，干燥后甲醇固定，瑞氏染色，显微镜下观察100个巨噬细胞，计数吞噬百分比和吞噬指数，吞噬百分率＝吞有鸡红细胞的巨噬细胞数×100/100个巨噬细胞，吞噬指数＝100个巨噬细胞中所吞噬的鸡红细胞数×100/100个巨噬细胞，比较各组吞噬百分比和吞噬指数，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该吞噬百分比和吞噬指数作为评价指标，反之，放弃。
步骤(4)具体步骤包括：将步骤(1)中各组脾淋巴细胞1×106个/ml加入培养板，每孔1ml，再加入伴刀豆蛋白，使伴刀豆蛋白终浓度为10μg/ml，并设不加伴刀豆蛋白的阴性对照组和不加脾淋巴细胞和ConA的空白对照组，均置于5％CO2培养箱，37℃培养68h，离心收集上清液即脾淋巴细胞培养上清液，收集的上清液与步骤(1)中各组大鼠血清中IL-6与TNF-α采用大鼠细胞因子检测试剂盒进行ELISA法检测，细胞因子浓度依照已知浓度的标准品绘制的标准曲线进行计算，比较各组细胞因子浓度，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该IL-6和/或TNF-α细胞因子作为评价指标，反之，放弃。
步骤(5)具体步骤包括：培养板每孔加入步骤(1)中各组大鼠血清稀释液100μl，复孔，血清样本用磷酸盐缓冲液进行稀释，用HRP-羊抗大鼠Ig、HRP--羊抗大鼠IgG、HRP--羊抗大鼠IgE抗体作为二抗，四甲基联苯胺作为底物，在450nm波长处测光吸收值；血清中总Ig含量、IgG含量及IgE含量依照已知浓度的标准品绘制的标准曲线进行计算；比较各组总Ig含量、IgG含量及IgE含量，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该总Ig、IgG、IgE中的一种或几种作为评价指标，反之，放弃。
步骤(6)具体步骤包括：将步骤(1)中各组大鼠血液加入适量肝素钠，制备血涂片，待血涂片干透后用瑞氏染液染色，自然温度下染色10分钟-15分钟后用流水冲去染液，待干燥后镜检，记录各类白细胞所占的百分数；比较各组各类白细胞所占的百分数，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该各类白细胞所占的百分数作为评价指标，反之，放弃。
步骤(1)中，经鼻连续抽吸卷烟的时间为30天、60天、90天以及经鼻连续抽吸卷烟90天停止吸烟42天后的恢复期，如经鼻连续抽吸卷烟30天大鼠的血清、脾淋巴细胞、脾淋巴细胞培养上清液、腹腔巨噬细胞及血液，经鼻连续抽吸卷烟60天大鼠的血清、脾淋巴细胞、脾淋巴细胞培养上清液、腹腔巨噬细胞及血液，经鼻连续抽吸卷烟90天大鼠的血清、脾淋巴细胞、脾淋巴细胞培养上清液、腹腔巨噬细胞及血液，以及经鼻连续抽吸卷烟90天停止吸烟42天后的恢复期大鼠的血清、脾淋巴细胞、脾淋巴细胞培养上清液、腹腔巨噬细胞及血液。
步骤(1)中，所述卷烟包括焦油含量为8mg/支的低焦油卷烟和/或焦油含量为12mg/支或13mg/支的普通卷烟。
所述的大鼠为SD大鼠。
本发明试剂均采用市售产品。
本发明显示，相比于细胞免疫反应，体液免疫更容易受到吸烟的损伤，也更容易恢复至正常水平；低焦油卷烟组在短期内免疫损伤不及普通卷烟，但长期吸食，对机体造成的免疫损伤和普通卷烟相似甚至更为严重。
综上，最终筛选出脾淋巴细胞增殖的刺激指数(SI)、脾淋巴细胞培养上清液中IL-6含量、血清中IgG含量、血清中IgE含量及血液中各类白细胞比例五个指标作为敏感稳定的评价指标反应吸烟大鼠免疫功能的变化。
本发明具有如下优点：
本发明通过对经鼻连续抽吸卷烟大鼠血清、脾淋巴细胞培养上清液、腹腔巨噬细胞及血液等体液免疫功能和细胞免疫功能的变化情况的分析，研究卷烟烟气对机体免疫功能的影响，筛选出若干免疫监测指标。筛选出的指标敏感稳定好，可作为反应吸烟大鼠免疫功能的变化的评价指标，反映吸烟这一外来的理化刺激引起的机体免疫功能损伤。
本发明进一步通过对不同吸烟时间(30、60、90天)大鼠脾淋巴细胞、腹腔巨噬细胞的功能测定，血清中总免疫球蛋白(Ig)含量、免疫球蛋白亚类IgG及IgE含量等测定，脾淋巴细胞培养上清液和血清中炎症因子(IL-6、TNF-α)含量等测定以及血液中各种白细胞含量的测定，反映吸烟大鼠体液和细胞免疫功能的变化，及高低焦油量卷烟引起免疫损伤的差异，进行指标筛选，获得简便敏感的免疫功能评价指标。
本发明筛选方法可重复操作多次，经多次重复操作，得出相同的筛选结果，表明本发明筛选方法准确性较好，所筛选出的评价指标可以全面科学的反应卷烟烟气对免疫功能的影响。
具体实施方式
实施例1
材料与方法
1.材料
1.1实验动物，SD大鼠购自上海市西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号码SCXK(沪)：2008-0016。No.1低焦油卷烟(焦油含量8mg/支)；No.2普通卷烟(焦油含量13mg/支)由浙江中烟工业有限责任公司技术中心提供。
1.2试剂：Rat IL-6ELISA kit和Rat TNF-αELISA kit购自R&D公司，MTT增殖检测试剂盒购自SIGMA，Rat Ig ELISAkit购自蓝基生物，一次性细胞计数板购自英俊公司，其他试剂为试剂级试剂。
1.3设备：鼠经鼻暴露吸烟系统(参考美国西北毒理研究中心Battelle公司的CSES系统)，这个系统可直接与JJS-II型自动吸烟机连接。
2.方法
2.1动物实验
2.1.1实验动物
5周龄的健康Sprague-Dawley大鼠160只。随机分为3组。A组，正常对照组，吸空气，B组，吸No.1低焦油卷烟(焦油8mg/支)，C组，吸No.2普通卷烟(焦油13mg/支)。实验材料及烟气产生按ISO3308和国家标准。在JJS-II型自动吸烟机上，按常规拟人吸烟条件下，每分钟抽吸1口，每口抽吸2秒。吸烟机房间环境温度22±2℃、湿度60±5％。每一孔道处气流的测定风速值200±50mm/s。每次试验前须检查每一通道的抽吸容量必须调整至35±0.30ml。B，C组大鼠以仅鼻吸烟方式每天吸烟20支连续90天，停止吸烟42天。
依据卫生毒理学实验方法，大鼠吸烟30天、60天和90天，相当于人吸烟3年、6年和9年。
2.2脾淋巴细胞功能检测
实验动物中的动物分别于吸烟30天、60天、90天和恢复期(吸烟90天后停吸，自然恢复42天，convalescence)取三组大鼠共108只，麻醉后眼球采血，分离血清，分装后-80℃保存。
大鼠断颈处死后，置体积百分浓度为75％乙醇水溶液中浸泡1-2min，右卧位，无菌取脾脏，称重。在35mm培养皿中放入5mlEZ-SepTMMouse 1×淋巴细胞分离液，用注射器活塞轻轻研磨大鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。把悬有脾脏细胞的分离液转移到10ml离心管中，离心前再覆盖200μl的RPMI-1640培养基。800g离心30分钟，吸出淋巴细胞层，再加入10ml1640培养基，250g离心10分钟，倾倒上清液，加入3-5ml无血清培养基重悬，得到脾淋巴细胞，Invitrogen公司提供的countess细胞计数仪进行细胞计数。
将1×106个/ml的脾淋巴细胞加入96孔培养板，每孔0.1ml。再加入伴刀豆蛋白(concanavalin A，ConA)，使其终浓度为10μg/ml，并设不加ConA的阴性对照和不加脾淋巴细胞和ConA的空白对照组，每组设3个复孔。将细胞置于5％(体积百分比)CO2培养箱，37℃培养68h，加入MTT溶液(Sigma公司)，每孔10μl，将培养物放回培养箱孵育3-4小时，加入MTT溶媒(Sigma公司)100μl/孔，在570nm波长处测光吸收值(OD值)，淋巴细胞的增殖能力以刺激指数(stimulating index，SI)表示，SI＝加刺激细胞ConA孔OD值/不加刺激细胞ConA的阴性对照孔OD值。OD值大于等于2提示淋巴细胞具有增殖功能。
2.3腹腔巨噬细胞功能测定
实验动物中的动物分别于吸烟30天，60天，90天，取大鼠12只(每组4只)，麻醉后眼球采血，分离血清，分装后-80℃保存。大鼠断颈处死后，置75％(质量百分比)乙醇水溶液中浸泡1-2min，剪开腹部皮毛，在腹腔左下角注入10ml冷生理盐水，轻揉大鼠腹部3-5min，无菌剪开腹腔，吸取腹腔液至15ml离心管中，1000rpm，离心5min。将细胞置于5％CO2培养箱，37℃培养2h，去除淋巴细胞。将纯化的巨噬细胞用RPMI-1640培养液配制成106个/ml，加入5％(体积百分比)的鸡红细胞悬液0.04ml(鸡红细胞107个/ml)，置于37℃水浴中孵育15-30min，期间每2-3min轻轻摇晃试管1次。500g离心5min，弃上清。将试管底部的鸡红细胞涂片，干燥后甲醇固定，瑞氏染色。显微镜下(油镜)观察100个巨噬细胞，计数吞噬百分比和吞噬指数。吞噬百分率＝吞有鸡红细胞的巨噬细胞数×100/100个巨噬细胞；吞噬指数＝100个巨噬细胞中所吞噬的鸡红细胞数×100/100个巨噬细胞。
2.4ELISA检测IL-6、TNF-α及免疫球蛋白(Ig)含量
将实验动物中的动物在不同时间点剖杀后取脾淋巴细胞，得到脾淋巴细胞，调整浓度至1×106个/ml加入24孔培养板，每孔1ml。再加入ConA，使其终浓度为10μg/ml，并设不加ConA的阴性对照，以及不加脾淋巴细胞和ConA的空白对照。将细胞置于5％CO2培养箱，37℃培养68h，14000rpm离心10min，收集上清液，-80℃冻存待检。收集的上清液与血清中IL-6与TNF-α采用大鼠细胞因子检测试剂盒(BD Biosciences，San Jose，CA)进行ELISA法检测，细胞因子浓度依照已知浓度的标准品绘制的标准曲线进行计算。
每孔加入吸烟大鼠及对照组大鼠血清稀释液100μl，复孔。血清样本用磷酸盐缓冲液进行稀释(PBS，pH7.4)。HRP-羊抗大鼠Ig抗体(Bio-Rad，Hercules，CA)、HRP-羊抗大鼠IgG抗体(Bio-Rad，Hercules，CA)、HR-羊抗大鼠IgE抗体(Bio-Rad，Hercules，CA)作为二抗，四甲基联苯胺作为底物，在450nm波长处测光吸收值。血清中总Ig含量、IgG含量及IgE含量依照已知浓度的标准品绘制的标准曲线进行计算。
2.5血涂片的检测
将实验动物中的动物的血液加入肝素钠少量，制备血涂片。待血涂片干透后，用蜡笔在两端划线，以防染色时染液外溢。血涂片用瑞氏染液进行染色，室温染色10分钟后用流水冲去染液，待干燥后镜检。记录各类白细胞所占的百分数。
2.6统计方法：
统计方法采用SAS软件的方差分析和t-检验分析数据，p＜0.05认为有显著性差异。
3.结果
3.1.脾脏淋巴细胞功能检测
淋巴细胞增殖及刺激指数见表1。
表1各组期淋巴细胞刺激指数(SI)
| 组别 | 30天 | 60天 | 90天 | 恢复期 |
| 正常对照组 | 2.09±0.65 | 2.03±0.43 | 2.01±0.45 | 2.18±0.76 |
| 低焦油卷烟组 | 2.72±0.96a | 1.48±0.35a | 0.88±0.09a | 0.97±0.12a |
| 普通卷烟组 | 1.16±0.24a，b | 1.22±0.26a | 0.93±0.19a | 1.37±0.48a |
注：SI为ConA刺激指数，各组n＝36。SI≥2，认为细胞具有增殖功能。a表示与正常对照组相比具有显著性差异(p＜0.05)；b表示与低焦油卷烟组相比具有显著性差异(p＜0.05)。
在吸烟后30天，与正常对照组相比，普通卷烟对脾脏淋巴细胞增殖具有显著的抑制作用(p＜0.05)，而低焦油卷烟对脾脏淋巴细胞增殖没有显著的影响；吸烟后2个月、3个月及恢复期，吸烟组脾脏淋巴细胞增殖均低于正常对照组(全部p＜0.05)。综合上述结果，吸烟组包括低焦油卷烟组和普通卷烟组与正常对照组相比细胞增殖有显著性差异，采用该指标。
3.2.腹腔巨噬细胞功能检测
表2各组的吞噬百分率和吞噬指数
注：数值以表示，a表示与正常对照组相比具有显著性差异(p＜0.05)；b表示与普通卷烟组相比具有显著性差异(p＜0.05)。
吸烟30天，吸烟组鸡红细胞吞噬百分率和吞噬指数与正常对照组相比没有显著性差异(p＞0.05)；烟60天和90天，低焦油卷烟组鸡红细胞吞噬百分率和吞噬指数都低于正常对照组和普通卷烟组(p＜0.05)，普通卷烟组和正常对照组没有显著性差异。恢复期，三个组吞噬百分率(TPP)没有显著性差异，但吸烟组吞噬指数(TPI)都升高，显著高于正常对照组。短期吸烟组(低焦油卷烟组和普通卷烟组)与正常对照组相比无显著性差异；且由于目前市场上多为焦油含量较高的普通卷烟，而普通卷烟组与正常对照组相比无显著性差异；放弃该指标。
3.3.血清中细胞因子及免疫球蛋白的变化
表3实验动物各组中IL-6含量
注：数值单位为ng/L，以表示，a表示与正常对照组相比具有显著性差异(p＜0.05)。
脾淋巴细胞培养上清液比血清中细胞因子变化更敏感。吸烟组脾淋巴细胞培养上清液中IL-6含量显著低于正常对照组(p＜0.05)，且普通卷烟组与低焦油卷烟组间没有显著性差异(p＞0.05)。各月份间无显著性差异。吸烟组恢复期血清中IL-6含量已恢复至正常对照组水平。各组TNF-α含量未检出(结果未显示)，主要是由于吸烟时间较长，在吸烟后30、60和90天单核-巨噬细胞被大量损伤或功能被显著抑制，导致检测不到TNF-α。吸烟组脾淋巴细胞培养上清液IL-6显著低于正常对照组，吸烟组(低焦油卷烟组和普通卷烟组)与正常对照组相比有显著性差异，筛选出脾淋巴细胞培养上清液中IL-6含量作为评价指标。
表4大鼠血清中总免疫球蛋白数量
注：数值单位为mg/ml，以表示，a表示与正常对照组相比具有显著性差异(p＜0.05)。
在吸烟后的30、60和90天，低焦油卷烟组大鼠血清免疫球蛋白总含量(即总Ig含量)与正常对照组免疫球蛋白总量有显著性差异(p＜0.05)，但普通卷烟组与正常对照组没有显著性差异，各月份间没有显著性差异。恢复期三个组免疫球蛋白总量没有显著性差异(p＞0.05)，意味着吸烟组在恢复期免疫球蛋白量已恢复至正常水平。且由于目前市场上多为焦油含量较高的普通卷烟，而普通卷烟组与正常对照组相比无显著性差异。放弃该指标。
3.4.血清免疫球蛋白亚类IgG及IgE的变化
表5吸烟大鼠血清中IgG和IgE水平
| 组 | IgG | IgE |
| 正常对照组 | 63.0±17.1 | 5.75±0.88 |
| 低焦油卷烟组 | 64.44±17.4a | 4.65±0.55a |
| 普通卷烟组 | 101.1±15.9a，b | 8.20±1.91a，b |
注：数值单位为μg/ml，以表示，a表示与正常对照组相比具有显著性差异(p＜0.05)；b表示与低焦油卷烟组相比具有显著性差异(p＜0.001)。
实验动物中的动物在吸烟后，吸烟组大鼠血清IgG含量和IgE含量显著高于正常对照组(P＜0.05)，筛选出血清中IgG含量和血清中IgE含量作为评价指标。卷烟焦油含量较低时，血清IgE含量不如血清IgG含量敏感。
3.5.血片白细胞分类计数
表6吸烟大鼠血涂片白细胞计数
注：数值单位为％，以表示，a表示与正常对照组相比具有显著性差异(p＜0.05)；b表示与低焦油卷烟组相比具有显著性差异(p＜0.001)。
实验动物中的动物，血片白细胞分类计数结果显示：低焦油卷烟组与正常对照组相比各种白细胞数量没有显著性差异(p＞0.05)；普通卷烟组与正常对照组中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及单核细胞数量上有显著性差异，普通卷烟组与低焦油卷烟组相比在五种类型白细胞数量上有显著性差异；结果见表6。表明：低焦油卷烟在短期内对免疫功能的损伤不及普通卷烟，但长期吸食，低焦油卷烟和普通卷烟危害相似。且由于目前市场上多为焦油含量较高的普通卷烟，而普通卷烟组与正常对照组相比有显著性差异。筛选出血液中各类白细胞比例作为评价指标。
最终筛选出反映脾淋巴细胞增殖的刺激指数、脾淋巴细胞培养上清液中IL-6含量、血清中IgG含量、血清中IgE含量及血液中白细胞分类计数这五个指标作为敏感稳定的评价指标反应吸烟大鼠免疫功能的变化。
实施例2
除了实验动物采用：80只健康的SD大鼠，每只体重在150±10克，被随机分成3个组，D组，正常对照组，吸空气；E组，低焦油卷烟组，吸No.3低焦油卷烟(焦油8mg/支)；F组，普通卷烟组，吸No.4普通卷烟(焦油12mg/支)。E，F组大鼠以仅鼻吸烟方式每天吸烟20支连续90天，停止吸烟42天。No.3低焦油卷烟(焦油含量8mg/支)；No.4普通卷烟(焦油含量12mg/支)由浙江中烟工业有限责任公司技术中心提供。其它同实施例1。
吸烟组与正常对照组相比的差异结果与实施例1一致，验证了本发明筛选方法筛选结果的稳定性。
最终筛选出反映脾淋巴细胞增殖的刺激指数、脾淋巴细胞培养上清液中IL-6含量、血清中IgG含量、血清中IgE含量及血液中白细胞分类计数这五个指标作为敏感稳定的评价指标反应吸烟大鼠免疫功能的变化。
Claims (9)
1.一种拟人吸烟大鼠免疫功能评价指标的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以吸空气大鼠的血清、脾淋巴细胞、脾淋巴细胞培养上清液、腹腔巨噬细胞及血液作为正常对照组，经鼻连续抽吸卷烟的大鼠的血清、脾淋巴细胞、脾淋巴细胞培养上清液、腹腔巨噬细胞及血液作为吸烟组；
(2)利用MTT增殖法检测步骤(1)中各组脾淋巴细胞增殖能力，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃；
(3)利用鸡红细胞吞噬实验法检测步骤(1)中各组腹腔巨噬细胞吞噬百分比和吞噬指数，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃；
(4)利用ELISA法检测步骤(1)中各组脾淋巴细胞培养上清液和血清中IL-6及TNF-α细胞因子浓度，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃；
(5)检测步骤(1)中各组血清中总Ig含量、IgG含量及IgE含量，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃；
(6)利用瑞氏染液染色法检测步骤(1)中各组血液中白细胞分类计数，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)具体步骤包括：将步骤(1)中各组脾淋巴细胞1×106个/ml加入培养板，每孔0.1ml，再加入刺激细胞伴刀豆蛋白，使伴刀豆蛋白终浓度为10μg/ml，作为加刺激细胞组，并设不加伴刀豆蛋白的阴性对照组和不加脾淋巴细胞和ConA的空白对照组，均置于5％CO2培养箱，37℃培养68h，每孔加入10μl MTT溶液，放回培养箱孵育后加入MTT溶媒100μl/孔，在570nm波长处测OD值，淋巴细胞的增值能力以刺激指数表示，刺激指数＝加刺激细胞组OD值/阴性对照组OD值，比较各组刺激指数，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该刺激指数作为评价指标，反之，放弃。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)具体步骤包括：将步骤(1)中各组纯化的腹腔巨噬细胞用RPMI-1640培养液配制成106个/ml，加入5％的鸡红细胞悬液0.04ml，其中鸡红细胞107个/ml，置于37℃水浴中孵育15-30min，离心，弃上清，将沉淀的鸡红细胞涂片，干燥后甲醇固定，瑞氏染色，显微镜下观察100个巨噬细胞，计数吞噬百分比和吞噬指数，吞噬百分率＝吞有鸡红细胞的巨噬细胞数×100/100个巨噬细胞，吞噬指数＝100个巨噬细胞中所吞噬的鸡红细胞数×100/100个巨噬细胞，比较各组吞噬百分比和吞噬指数，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该吞噬百分比和吞噬指数作为评价指标，反之，放弃。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(4)具体步骤包括：将步骤(1)中各组脾淋巴细胞1×106个/ml加入培养板，每孔1ml，再加入伴刀豆蛋白，使伴刀豆蛋白终浓度为10μg/ml，并设不加伴刀豆蛋白的阴性对照组和不加脾淋巴细胞和ConA的空白对照组，均置于5％CO2培养箱，37℃培养68h，离心收集上清液即脾淋巴细胞培养上清液，收集的上清液与步骤(1)中各组大鼠血清中IL-6与TNF-α采用大鼠细胞因子检测试剂盒进行ELISA法检测，细胞因子浓度依照已知浓度的标准品绘制的标准曲线进行计算，比较各组细胞因子浓度，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该IL-6和/或TNF-α细胞因子作为评价指标，反之，放弃。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(5)具体步骤包括：培养板每孔加入步骤(1)中各组血清的稀释液100μl，复孔，血清样本用磷酸盐缓冲液进行稀释，用HRP-羊抗大鼠Ig、HRP-羊抗大鼠IgG、HRP-羊抗大鼠IgE抗体作为二抗，四甲基联苯胺作为底物，在450nm波长处测光吸收值；血清中总Ig含量、IgG含量及IgE含量依照已知浓度的标准品绘制的标准曲线进行计算；比较各组总Ig含量、IgG含量及IgE含量，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该Ig、IgG、IgE中的一种或几种作为评价指标，反之，放弃。
6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(6)具体步骤包括：将步骤(1)中各组大鼠血液加入适量肝素钠，制备血涂片，待血涂片干透后用瑞氏染液染色，自然温度下染色10分钟-15分钟后用流水冲去染液，待干燥后镜检，记录各类白细胞所占的百分数；比较各组各类白细胞所占的百分数，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该各类白细胞所占的百分数作为评价指标，反之，放弃。
7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，经鼻连续抽吸卷烟的时间为30天、60天、90天以及经鼻连续抽吸卷烟90天后停止吸烟的42天恢复期。
8.根据权利要求1或7所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述卷烟包括焦油含量为8mg/支的低焦油卷烟和/或焦油含量为12mg/支或13mg/支的普通卷烟。
9.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的大鼠为SD大鼠。
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